JPH0692971B2 - 細胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する検定方法 - Google Patents
細胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する検定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 試料中に含まれる分析物を検出する検定方法の改良は、
常に必要である。分析物とは、一般にリガンドとその同
種受容体から成る特異的結合対の構成要素である。特異
的結合対の代表例は抗原と抗体である。
常に必要である。分析物とは、一般にリガンドとその同
種受容体から成る特異的結合対の構成要素である。特異
的結合対の代表例は抗原と抗体である。
哺乳動物の赤血球細胞は数多くの抗原を有し、そのうち
あるものは輸血等の医療手段に際し、患者と供血者の双
方について正確に同定しなければならない。Ａ、Ｂ、A
B、ＯおよびＤ（Rho）の血液型を正確に決定することは
非常に重要である。また、血中に存在しているこれら抗
原の抗体も診断学的興味の対象となる。
あるものは輸血等の医療手段に際し、患者と供血者の双
方について正確に同定しなければならない。Ａ、Ｂ、A
B、ＯおよびＤ（Rho）の血液型を正確に決定することは
非常に重要である。また、血中に存在しているこれら抗
原の抗体も診断学的興味の対象となる。
通常、顕微鏡スライドガラスまたは試験管内における凝
集法が用いられている。試験しなければならない多数の
試料がある場合においては、迅速で、且つ正確な血液ス
クリーニングの改良方法が望まれる。
集法が用いられている。試験しなければならない多数の
試料がある場合においては、迅速で、且つ正確な血液ス
クリーニングの改良方法が望まれる。
（先行技術の説明） 凝集法による赤血球細胞抗原の同定が基本である〔例え
ば、ハドソンおよびヘイ、プラクティカル・イムノロジ
ー（Practical Immunology）、第２版、ブラックウェ
ル、サイエンテイフイック、パブリケーションズ（Blac
kwell Scientific Publications）、オックスホード
（Oxford）（1980年）、139頁〕。米国特許第3,862,303
号は、ラテックス・ビーズ等を担体粒子として使用する
血清学的因子の免疫学的検出法および同定法の代表例で
ある。スミス〔エフイービーエス・レターズ（FEBS Le
tters）、77巻、25頁（1977年）〕は蛍光免疫学的測定
法を記載している。米国特許出願番号第434,761号（198
2年10月15日提出）は、血液型の蛍光スクリーニング法
に関するものである。
ば、ハドソンおよびヘイ、プラクティカル・イムノロジ
ー（Practical Immunology）、第２版、ブラックウェ
ル、サイエンテイフイック、パブリケーションズ（Blac
kwell Scientific Publications）、オックスホード
（Oxford）（1980年）、139頁〕。米国特許第3,862,303
号は、ラテックス・ビーズ等を担体粒子として使用する
血清学的因子の免疫学的検出法および同定法の代表例で
ある。スミス〔エフイービーエス・レターズ（FEBS Le
tters）、77巻、25頁（1977年）〕は蛍光免疫学的測定
法を記載している。米国特許出願番号第434,761号（198
2年10月15日提出）は、血液型の蛍光スクリーニング法
に関するものである。
比較的多量の試料量においては、蛍光変動と相関する粒
子の相対的寸法により粒子を分別するために、レーザー
光束および細隙灯を使用することが、ブリッグスら〔サ
イエンス（Science）、212巻、1266〜1267頁（1981
年）〕およびニコリら、プロシージングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、USA〔Proc.
Natl.Acad.Sci.USA〕により記載されている。
子の相対的寸法により粒子を分別するために、レーザー
光束および細隙灯を使用することが、ブリッグスら〔サ
イエンス（Science）、212巻、1266〜1267頁（1981
年）〕およびニコリら、プロシージングズ・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、USA〔Proc.
Natl.Acad.Sci.USA〕により記載されている。
多くのスクアレート染料が論じられている〔スプレンガ
ーら、アンゲバンテ・ヘミー（Angew.Chem.）、80巻、5
41頁（1968年）、スプレンガーら、アンゲバンテ・ヘミ
ー（Ang.Chem.）、79巻、581頁（1967年）、スプレンガ
ーら、アンゲバンテ・ヘミー、インターナショナル・エ
ジション・イン・イングリッシュ（Angew.Chem.interna
t.Edit.）、第５巻、894頁（1966年）およびマークス
ら、同誌、第５巻、888頁（1966年）〕。
ーら、アンゲバンテ・ヘミー（Angew.Chem.）、80巻、5
41頁（1968年）、スプレンガーら、アンゲバンテ・ヘミ
ー（Ang.Chem.）、79巻、581頁（1967年）、スプレンガ
ーら、アンゲバンテ・ヘミー、インターナショナル・エ
ジション・イン・イングリッシュ（Angew.Chem.interna
t.Edit.）、第５巻、894頁（1966年）およびマークス
ら、同誌、第５巻、888頁（1966年）〕。
悪性白血球細胞の検出にメロシアニン染料を使用するこ
とが米国特許第4,424,201号に記載されている。
とが米国特許第4,424,201号に記載されている。
米国特許第3,853,987号は免疫学的試薬と放射線免疫検
定を開示している。この特許は、試薬の凝集を検出する
好ましい方法として、反応混合物浮遊液を希釈し、これ
を蛍光分光光度計のフロー・セルへかける態様を示して
いる。
定を開示している。この特許は、試薬の凝集を検出する
好ましい方法として、反応混合物浮遊液を希釈し、これ
を蛍光分光光度計のフロー・セルへかける態様を示して
いる。
［発明の要旨］ この発明は、試料中に存在する、リガンドとその同種受
容体から成る特異的結合対の構成要素（「sbp構成要
素」）を検出する方法を提供するものである。水性媒質
中で試料を、もし当該試料が細胞を含まない場合は少な
くとも１種の細胞とともに（１）少なくともsbp構成要
素または相補的sbp構成要素が試料中のもしくは加えら
れた細胞の表面と結合している、相補的sbp構成要素お
よび（２）細胞内にとり込み可能な蛍光剤を合わせる。
sbp構成要素の存在は、細胞凝集の結果、分離されてい
ない細胞浮遊液の蛍光変化によって示される。
容体から成る特異的結合対の構成要素（「sbp構成要
素」）を検出する方法を提供するものである。水性媒質
中で試料を、もし当該試料が細胞を含まない場合は少な
くとも１種の細胞とともに（１）少なくともsbp構成要
素または相補的sbp構成要素が試料中のもしくは加えら
れた細胞の表面と結合している、相補的sbp構成要素お
よび（２）細胞内にとり込み可能な蛍光剤を合わせる。
sbp構成要素の存在は、細胞凝集の結果、分離されてい
ない細胞浮遊液の蛍光変化によって示される。
この発明は、特に、例えば、Ａ、Ｂ、AB、ＯおよびＤ
（Rho）血液型決定抗原、およびそれに対応する抗体だ
けでなく、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、ルイス、ラセラン、ケル、
ダフィー、キッド等の各種抗原に対する抗体の存在を測
定する、血液型判定に適用される。
（Rho）血液型決定抗原、およびそれに対応する抗体だ
けでなく、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、ルイス、ラセラン、ケル、
ダフィー、キッド等の各種抗原に対する抗体の存在を測
定する、血液型判定に適用される。
［実施態様の説明］ この発明は、分離段階を行わずに、試料中の分析物、通
常sbp構成要素の存在を測定する新規方法を提供する。
この方法はsbp構成要素または相補的sbp構成要素の少な
くともいずれか一方が、細胞表面と結合している場合の
相補的sbp構成要素を使用する。また、この方法では細
胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する。試料中のsbp構
成要素が細胞表面に結合していない場合、蛍光剤は、好
ましくはまず相補的sbp構成要素と結合した細胞内にと
り込ませ、ついでその結合体を試料と合わせることによ
って、試料と結合する。試料上のsbp構成要素が細胞表
面と結合している場合は、蛍光剤は、一般に相補的sbp
要素を試料と合わせる前に、試料に加えられる。したが
って、「試料と結合する（合わせる）」の語は、上記の
２つまたはそれ以上の試薬と合わせてから残りの試薬と
合わせることを包含する。「試薬」の語は、試料、相補
的sbp構成要素および細胞内にとりこまれる蛍光剤を含
み、さらにこの方法を有効に操作するのに要するすべて
の添加物を包含する。
常sbp構成要素の存在を測定する新規方法を提供する。
この方法はsbp構成要素または相補的sbp構成要素の少な
くともいずれか一方が、細胞表面と結合している場合の
相補的sbp構成要素を使用する。また、この方法では細
胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する。試料中のsbp構
成要素が細胞表面に結合していない場合、蛍光剤は、好
ましくはまず相補的sbp構成要素と結合した細胞内にと
り込ませ、ついでその結合体を試料と合わせることによ
って、試料と結合する。試料上のsbp構成要素が細胞表
面と結合している場合は、蛍光剤は、一般に相補的sbp
要素を試料と合わせる前に、試料に加えられる。したが
って、「試料と結合する（合わせる）」の語は、上記の
２つまたはそれ以上の試薬と合わせてから残りの試薬と
合わせることを包含する。「試薬」の語は、試料、相補
的sbp構成要素および細胞内にとりこまれる蛍光剤を含
み、さらにこの方法を有効に操作するのに要するすべて
の添加物を包含する。
この発明の１態様を実施するには、試料、もし当該試料
が細胞を含まない場合は少なくとも１種の細胞、相補的
sbp構成要素および細胞内にとり込まれる蛍光剤を水性
検定媒質中で合わせ、ついで細胞凝集の結果として起き
る混合物の蛍光変化を測定する。試料中にsbp構成要素
が存在している場合は、この蛍光変化によって示され
る。
が細胞を含まない場合は少なくとも１種の細胞、相補的
sbp構成要素および細胞内にとり込まれる蛍光剤を水性
検定媒質中で合わせ、ついで細胞凝集の結果として起き
る混合物の蛍光変化を測定する。試料中にsbp構成要素
が存在している場合は、この蛍光変化によって示され
る。
この発明方法は、多様なsbp構成要素分析物の多様な検
定方法に適合できる。sbp構成要素および相補的sbp構成
要素の少なくとも一方が、細胞表面の正規成分である場
合は特に興味深い。細胞表面sbp構成要素には、抗原、
細胞壁抗原、特に細菌細胞壁、活性化因子、成長因子お
よび阻害因子等の諸因子受容体を含む細胞表面受容体
類、抗体、HLA抗原、Fc受容体、ホルモン受容体、イオ
ンチャンネル、糖脂質、リポタンパク室、補体成分、ウ
イルス性抗原、膜結合酵素、ペプチドグリカン、真菌性
抗原、イデオタイプ抗原等の自然産生型膜成分を包含す
る。興味深い細胞型は、白血球、細菌、真菌細胞、赤血
球、網状赤血球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細
胞、好酸球等を含むリンパ球等である。特に、この方法
が適合するのは血液型判定の分野である。血液型決定抗
原およびその抗体は、上記の方法を用いて確かめること
ができる。
定方法に適合できる。sbp構成要素および相補的sbp構成
要素の少なくとも一方が、細胞表面の正規成分である場
合は特に興味深い。細胞表面sbp構成要素には、抗原、
細胞壁抗原、特に細菌細胞壁、活性化因子、成長因子お
よび阻害因子等の諸因子受容体を含む細胞表面受容体
類、抗体、HLA抗原、Fc受容体、ホルモン受容体、イオ
ンチャンネル、糖脂質、リポタンパク室、補体成分、ウ
イルス性抗原、膜結合酵素、ペプチドグリカン、真菌性
抗原、イデオタイプ抗原等の自然産生型膜成分を包含す
る。興味深い細胞型は、白血球、細菌、真菌細胞、赤血
球、網状赤血球、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細
胞、好酸球等を含むリンパ球等である。特に、この方法
が適合するのは血液型判定の分野である。血液型決定抗
原およびその抗体は、上記の方法を用いて確かめること
ができる。
この発明は新規方法を提供し、特に赤血球細胞を負荷蛍
光体のキャリアーとして使用し、検定方法の間に細胞を
凝集させることによって、赤血球細胞の型判定、または
赤血球細胞抗原およびその抗体の同定を行うのに有用で
ある。凝集の結果生じる蛍光変化を測定し、特定の赤血
球細胞抗原またはその抗体の存在の指標とする。赤血球
細胞抗原に結合する物質、通常、抗体またはレクチンは
細胞凝集を生じるのに必要である。血液型抗原を測定す
るこの発明の１態様では、水性媒質、例えば好適な緩衝
液中で、全血を細胞中にとり込まれる蛍光剤および目標
とする抗原の受容体と合わせる。目標とする抗原が血中
赤血球細胞表面に存在するなら、凝集が起こり、目標抗
原存在の指標として蛍光変化が観察される。
光体のキャリアーとして使用し、検定方法の間に細胞を
凝集させることによって、赤血球細胞の型判定、または
赤血球細胞抗原およびその抗体の同定を行うのに有用で
ある。凝集の結果生じる蛍光変化を測定し、特定の赤血
球細胞抗原またはその抗体の存在の指標とする。赤血球
細胞抗原に結合する物質、通常、抗体またはレクチンは
細胞凝集を生じるのに必要である。血液型抗原を測定す
るこの発明の１態様では、水性媒質、例えば好適な緩衝
液中で、全血を細胞中にとり込まれる蛍光剤および目標
とする抗原の受容体と合わせる。目標とする抗原が血中
赤血球細胞表面に存在するなら、凝集が起こり、目標抗
原存在の指標として蛍光変化が観察される。
使用する受容体は、目標とする血液型表面抗原と優先的
に結合する。したがって、与えられた赤血球試料に該抗
原が存在する場合の変化を、抗原が存在しない場合と比
較して、蛍光分光学的に測定できる変化が起こる。例え
ばＡ、Ｂ、Ｏ式において抗Ａ抗体を使用した場合、分析
物がＢまたＯの血液型の場合と異なってＡまたはABの血
液型のＡ抗原を含有しているならば、凝集が起こり蛍光
変化を示すはずである。
に結合する。したがって、与えられた赤血球試料に該抗
原が存在する場合の変化を、抗原が存在しない場合と比
較して、蛍光分光学的に測定できる変化が起こる。例え
ばＡ、Ｂ、Ｏ式において抗Ａ抗体を使用した場合、分析
物がＢまたＯの血液型の場合と異なってＡまたはABの血
液型のＡ抗原を含有しているならば、凝集が起こり蛍光
変化を示すはずである。
抗体だけではなく、ある種のレクチンも種々の程度で赤
血球細胞表面抗原に結合することが知られており、これ
らもこの検定に都合のよい受容体として使用される。
血球細胞表面抗原に結合することが知られており、これ
らもこの検定に都合のよい受容体として使用される。
またこの方法は、赤血球抗原に対する抗体の存在の測定
にも使用できる。この目的のためには、問題の抗体と同
種の表面抗原を有する赤血球細胞を使用する。まず抗原
保有細胞と蛍光剤を合わせるのが好ましく、ついで、こ
れを水性媒質中にある試料と合わせる。もし問題の抗体
が試料中に存在するならば、凝集の結果として蛍光変化
が起こるはずである。この場合には、蛍光変化は問題の
抗体の存在を表す。
にも使用できる。この目的のためには、問題の抗体と同
種の表面抗原を有する赤血球細胞を使用する。まず抗原
保有細胞と蛍光剤を合わせるのが好ましく、ついで、こ
れを水性媒質中にある試料と合わせる。もし問題の抗体
が試料中に存在するならば、凝集の結果として蛍光変化
が起こるはずである。この場合には、蛍光変化は問題の
抗体の存在を表す。
またこの方法は、交差適合試験にも重要である。この測
定では、供血者の血液と予定受血者の血液を混合し、こ
の混合血液をこの発明の方法にしたがって処理する。好
ましくは、供血者から得られた細胞は、まず蛍光剤と合
わせ、それから患者の試料と合わせる。一般に、陽性の
徴候が見られれば試験の結果は不適合である。
定では、供血者の血液と予定受血者の血液を混合し、こ
の混合血液をこの発明の方法にしたがって処理する。好
ましくは、供血者から得られた細胞は、まず蛍光剤と合
わせ、それから患者の試料と合わせる。一般に、陽性の
徴候が見られれば試験の結果は不適合である。
この方法は単純であり、ほどよい短時間内に遂行でき
る。ほとんどの場合、試薬は同時に添加できる。遊離の
蛍光剤および試料中に共存する内因性物質から生じる盲
蛍光干渉はごく僅かである。一定の対照にかさねて、蛍
光変化を読みとることができる。この方法の特にすぐれ
ている点は、分離または洗浄段階をなんら必要としない
ことである。検定媒質または混合液から、蛍光変化を直
接細胞凝固の結果として観察することができる。
る。ほとんどの場合、試薬は同時に添加できる。遊離の
蛍光剤および試料中に共存する内因性物質から生じる盲
蛍光干渉はごく僅かである。一定の対照にかさねて、蛍
光変化を読みとることができる。この方法の特にすぐれ
ている点は、分離または洗浄段階をなんら必要としない
ことである。検定媒質または混合液から、蛍光変化を直
接細胞凝固の結果として観察することができる。
さらに説明を進める前に、いくつかの用語を定義づけ
る。
る。
「分析物（analyte）」−測定すべき化合物または組成
物であって、sbp構成要素であり、１価または多価リガ
ンドであって１個または複数個のハプテン性および抗原
性決定部位を有し、単数化合物、または少なくとも１個
の共通した抗原決定基または決定部位を共有し合う複数
の化合物群であるか、または受容体である。
物であって、sbp構成要素であり、１価または多価リガ
ンドであって１個または複数個のハプテン性および抗原
性決定部位を有し、単数化合物、または少なくとも１個
の共通した抗原決定基または決定部位を共有し合う複数
の化合物群であるか、または受容体である。
「sbp構成要素」−２個の異なる分子から成り、それら
分子のうちの一方は、他方の分子の特定の空間的極性構
造と特異的に結合し得る表面部分または凹陥部分を有し
ている特異的結合対の構成要素。特異的結合対の２つの
構成要素はリガンドと受容体（抗リガンド）として示さ
れ、また同時に、同種として示される。
分子のうちの一方は、他方の分子の特定の空間的極性構
造と特異的に結合し得る表面部分または凹陥部分を有し
ている特異的結合対の構成要素。特異的結合対の２つの
構成要素はリガンドと受容体（抗リガンド）として示さ
れ、また同時に、同種として示される。
「リガンド」−その受容体が自然に存在するか、または
調製し得る任意の１つの有機化合物。
調製し得る任意の１つの有機化合物。
「受容体」（抗リガンド）−ある分子の特殊な空間的お
よび極性的構造、即ちエピトープ性部位または決定基部
位を認識可能な（強い結合親和性を有する）任意の１つ
の巨大分子化合物、または組成物。受容体を例示すれ
ば、自然に存在する受容体、即ち、チロキシン結合性グ
ロブリン、抗体、酵素、Fab画分、レクチン等が挙げら
れる。この場合、抗体なる用語は受容体を例示的に、そ
してさらにに一般的に表示するために使用する。
よび極性的構造、即ちエピトープ性部位または決定基部
位を認識可能な（強い結合親和性を有する）任意の１つ
の巨大分子化合物、または組成物。受容体を例示すれ
ば、自然に存在する受容体、即ち、チロキシン結合性グ
ロブリン、抗体、酵素、Fab画分、レクチン等が挙げら
れる。この場合、抗体なる用語は受容体を例示的に、そ
してさらにに一般的に表示するために使用する。
「相補的sbp構成要素」−sbp構成要素が分析物である場
合の特異的結合対の同種構成要素。
合の特異的結合対の同種構成要素。
「細胞」−核をもち、および核をもたない小室とオルガ
ネラを有し、膜に囲まれている原形質構造から成り、組
織構造を構築している微小原形質重合体の１単位。
ネラを有し、膜に囲まれている原形質構造から成り、組
織構造を構築している微小原形質重合体の１単位。
「細胞内にとり込まれる蛍光剤」−細胞内にとり込ま
れ、それによって細胞に蛍光を与えることが可能な分子
量2000より小さい化合物、例えば細胞膜易溶性染料、DN
A染色染料、生体染色染料等。
れ、それによって細胞に蛍光を与えることが可能な分子
量2000より小さい化合物、例えば細胞膜易溶性染料、DN
A染色染料、生体染色染料等。
細胞内にとり込まれる蛍光剤は、細胞内にとり込まれて
からさらに蛍光を増すことが望ましい。そのような蛍光
剤は細胞膜に溶解し、または細胞膜を通過し、細胞外へ
の搬出を阻止する化学反応を起こすことによって細胞内
摂取が可能となる。タンパク室または炭化水素と高親和
性を示す蛍光剤は、この発明において有用である。デオ
キシリボ核酸（DNA）を有する細胞では、DNA親和性を有
する蛍光剤も使用できる。細胞内にとり込まれる蛍光剤
は疎水性染料である場合が多いので、水と相溶性を示す
キレート剤でキレート化することにより水溶性とする。
からさらに蛍光を増すことが望ましい。そのような蛍光
剤は細胞膜に溶解し、または細胞膜を通過し、細胞外へ
の搬出を阻止する化学反応を起こすことによって細胞内
摂取が可能となる。タンパク室または炭化水素と高親和
性を示す蛍光剤は、この発明において有用である。デオ
キシリボ核酸（DNA）を有する細胞では、DNA親和性を有
する蛍光剤も使用できる。細胞内にとり込まれる蛍光剤
は疎水性染料である場合が多いので、水と相溶性を示す
キレート剤でキレート化することにより水溶性とする。
生物学的干渉を最大限に消去するため、細胞内にとり込
まれる蛍光剤は好ましくは450nmより大きい吸収極大、
さらに好ましくは540nmより大きい吸収極大をもつべき
である。多くの場合、吸収波長の極大は320〜1000nm、
好ましくは600〜800nmであるべきである。
まれる蛍光剤は好ましくは450nmより大きい吸収極大、
さらに好ましくは540nmより大きい吸収極大をもつべき
である。多くの場合、吸収波長の極大は320〜1000nm、
好ましくは600〜800nmであるべきである。
細胞内にとり込まれる蛍光剤の励起波長におけるモル吸
光係数は、できるだけ高くあるべきであり、1,000/モル
/cmより高く、好ましくは10,000/モル/cmより高くある
べきである。細胞内にとり込まれる蛍光剤には高い量子
収量を有するものを選択し、細胞内に摂取された場合、
その値が、通常0.05より高く、好ましくは0.3より高い
ものとする。励起波長を選択するに当たっては、試料か
らの盲蛍光を最小限に、染色細胞の蛍光を最大に、また
光源およびフィルターの強度および相対強度を最大にす
ることを基準とする。特に都合よい波長は、その波長
が、アルゴン、アルゴンおよびヘリウム／ネオン（He/N
e）レーザーからそれぞれ容易に入手し得るとの理由に
より、488nm、515nm、および633nmである。一般に長波
長側になるほど、盲蛍光は少なくなる。特にHe/Neレー
ザーは好ましく、したがって633nmで高い量子収量と、
高いモル吸光係数を示す染料が好ましい。
光係数は、できるだけ高くあるべきであり、1,000/モル
/cmより高く、好ましくは10,000/モル/cmより高くある
べきである。細胞内にとり込まれる蛍光剤には高い量子
収量を有するものを選択し、細胞内に摂取された場合、
その値が、通常0.05より高く、好ましくは0.3より高い
ものとする。励起波長を選択するに当たっては、試料か
らの盲蛍光を最小限に、染色細胞の蛍光を最大に、また
光源およびフィルターの強度および相対強度を最大にす
ることを基準とする。特に都合よい波長は、その波長
が、アルゴン、アルゴンおよびヘリウム／ネオン（He/N
e）レーザーからそれぞれ容易に入手し得るとの理由に
より、488nm、515nm、および633nmである。一般に長波
長側になるほど、盲蛍光は少なくなる。特にHe/Neレー
ザーは好ましく、したがって633nmで高い量子収量と、
高いモル吸光係数を示す染料が好ましい。
また細胞内にとり込まれる蛍光剤は、幅広いストークシ
フト、好ましくは15nmより広い、さらに好ましくは30nm
より広いストークシフトを示すことが好ましい。即ち、
そのような蛍光剤では、吸収極大と発光極大との波長間
の記載のような幅、即ち差があることが好ましい。
フト、好ましくは15nmより広い、さらに好ましくは30nm
より広いストークシフトを示すことが好ましい。即ち、
そのような蛍光剤では、吸収極大と発光極大との波長間
の記載のような幅、即ち差があることが好ましい。
検定を行っている間、特にそのような蛍光剤を含んでい
る細胞が、そうでない細胞を含んでいる試料とまざって
いる場合では、細胞内に蛍光剤がとりこまれ残留してい
るべきである。また蛍光剤は、細胞内にとりこまれてい
るときの方が水性環境のなかにあるよりもはるかに強い
蛍光を示すことが好ましい。はるかに蛍光が強いという
ことは、蛍光剤が細胞内にとり込まれているときの方が
そうでないときよりも、はるかに一定励起波長における
吸光係数と量子収量を多く生じるということを意味して
いる。蛍光の増大を必要とはしないが、細胞にとり込ま
れている蛍光剤の方が、そうでない蛍光剤よりも少なく
とも３倍、特に少なくとも10倍、蛍光を示すことが好ま
しい。
る細胞が、そうでない細胞を含んでいる試料とまざって
いる場合では、細胞内に蛍光剤がとりこまれ残留してい
るべきである。また蛍光剤は、細胞内にとりこまれてい
るときの方が水性環境のなかにあるよりもはるかに強い
蛍光を示すことが好ましい。はるかに蛍光が強いという
ことは、蛍光剤が細胞内にとり込まれているときの方が
そうでないときよりも、はるかに一定励起波長における
吸光係数と量子収量を多く生じるということを意味して
いる。蛍光の増大を必要とはしないが、細胞にとり込ま
れている蛍光剤の方が、そうでない蛍光剤よりも少なく
とも３倍、特に少なくとも10倍、蛍光を示すことが好ま
しい。
細胞内にとり込まれる蛍光剤のもう１つの特徴は、sbp
構成要素、例えば抗原および抗体等の結合によって干渉
されないことである。また細胞内にとりこまれる蛍光剤
は細胞に対して高い親和性を示す。
構成要素、例えば抗原および抗体等の結合によって干渉
されないことである。また細胞内にとりこまれる蛍光剤
は細胞に対して高い親和性を示す。
細胞内にとり込まれる蛍光剤の細胞１個当たりの分子数
は、有意の検定を実施し得るに足るものであるべきで、
一般に、約102〜107分子数／細胞、好ましくは103〜106
分子数／細胞であるべきである。
は、有意の検定を実施し得るに足るものであるべきで、
一般に、約102〜107分子数／細胞、好ましくは103〜106
分子数／細胞であるべきである。
上述のように、細胞内にとり込まれる蛍光剤の好ましい
部類は細胞膜に可溶性である蛍光染料であり、このこと
はこれらの染料が疎水性であり、通常、両親媒性となっ
て、好適な時間内に薬剤を細胞内にとり込み得るに足る
水溶性を提供することを意味している。膜可溶性染料の
好ましい部類は600nmより大きい吸収極大を有し、好適
なモル吸光係数およびストークシフトを示すある種のス
クァレート染料である。
部類は細胞膜に可溶性である蛍光染料であり、このこと
はこれらの染料が疎水性であり、通常、両親媒性となっ
て、好適な時間内に薬剤を細胞内にとり込み得るに足る
水溶性を提供することを意味している。膜可溶性染料の
好ましい部類は600nmより大きい吸収極大を有し、好適
なモル吸光係数およびストークシフトを示すある種のス
クァレート染料である。
限定されるものではないが、代表例として、これらの染
料を例示すると、式： （式中、R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して炭素
原子数２〜16個のアルキル、好ましくは２〜６個の低級
アルキル、および炭素原子数２〜16個、好ましくは２〜
６個のアラルキルから成る群から選ばれ、この場合これ
らの基は、同じであっても、または異なってもよく、ま
たOH、CONHR1、SR1、OR1で置換されていることもでき、
ここにおいてR1は炭素原子数１〜６個の低級アルキル、
Ｆ、Cl、Br、Ｉ、NO2、オキソカルボニル、CNであり、R
5およびR6は、独立して、水素、メトキシ、またはヒド
ロキシから成る群から選ばれる） で示される。これらの染料の幾つかは、スプレンガーら
〔アンゲバンテ・ヘミー、インターナショナル・エジシ
ョン・イン・イングリッシュ（Angew.Chem.internat.Ed
it.）、５巻、894頁（1966年）〕に開示されている。
料を例示すると、式： （式中、R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して炭素
原子数２〜16個のアルキル、好ましくは２〜６個の低級
アルキル、および炭素原子数２〜16個、好ましくは２〜
６個のアラルキルから成る群から選ばれ、この場合これ
らの基は、同じであっても、または異なってもよく、ま
たOH、CONHR1、SR1、OR1で置換されていることもでき、
ここにおいてR1は炭素原子数１〜６個の低級アルキル、
Ｆ、Cl、Br、Ｉ、NO2、オキソカルボニル、CNであり、R
5およびR6は、独立して、水素、メトキシ、またはヒド
ロキシから成る群から選ばれる） で示される。これらの染料の幾つかは、スプレンガーら
〔アンゲバンテ・ヘミー、インターナショナル・エジシ
ョン・イン・イングリッシュ（Angew.Chem.internat.Ed
it.）、５巻、894頁（1966年）〕に開示されている。
また、下式： （式中、R1、R2およびR3は前記と同意義である）で示さ
れるスクァレート染料も、この発明における細胞内にと
り込まれる特別の蛍光剤の代表例である。これらの染料
の幾つかは、スプレンガーら〔アンゲバンテ・ヘミー、
インターナショナル・エジション・イン・イングリッシ
ュ（Angew.Chem.internat.Edit.）、６巻、553〜554頁
（1967年）〕に開示されている。
れるスクァレート染料も、この発明における細胞内にと
り込まれる特別の蛍光剤の代表例である。これらの染料
の幾つかは、スプレンガーら〔アンゲバンテ・ヘミー、
インターナショナル・エジション・イン・イングリッシ
ュ（Angew.Chem.internat.Edit.）、６巻、553〜554頁
（1967年）〕に開示されている。
細胞内にとり込まれる蛍光剤に関して、先に示した好適
な特徴を有する他のスクァレート染料が、当該技術の当
業者により示唆されている。
な特徴を有する他のスクァレート染料が、当該技術の当
業者により示唆されている。
例えば、キンスランドら〔ジャーナル・オブ・バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・メソッズ（J.Biop
hys.Methods）、（1984年）、９巻、81〜83頁〕の教示
するように、例えばシクロデキストリン等の水溶性を増
大する化合物を染料と混和することによって、染料の水
溶性を向上することができる。
ミカル・アンド・バイオフィジカル・メソッズ（J.Biop
hys.Methods）、（1984年）、９巻、81〜83頁〕の教示
するように、例えばシクロデキストリン等の水溶性を増
大する化合物を染料と混和することによって、染料の水
溶性を向上することができる。
この発明において使用できる細胞内にとり込まれる染料
のもう１つの部類は、「生体染色染料」である。これら
の染料は蛍光染料の誘導体であって、膜に可溶性で常に
弱い蛍光を発するが、細胞膜を通過して輸送されたあと
は、膜に対して不溶性となり、高い蛍光性を得ることが
できる。これらの誘導体がいったん細胞内へ入ると、細
胞内にある、例えば、細胞内で酵素が蛍光染料誘導体に
作用して、入るときは容易に通過した細胞から、これが
搬出されるのを防止する。このような染料誘導体の例
は、3,6−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロ
ールから誘導されたフルオレスセイン類および3,6−ジ
アミノ−９−フエニルキサンテンから誘導されたローザ
ミン類およびローダミン類を包含するキサンテン染料の
ような蛍光化合物の、アセテート類等のエステル類であ
る。ローダミン類およびフルオレセイン類は９−Ｏ−カ
ルボキシフェニル基を有し、９−Ｏ−カルボキシフェニ
ルキサンテンの誘導体である。これらの化合物のフェニ
ル基に置換基を有し、または有しない化合物は商業的に
入手できる。
のもう１つの部類は、「生体染色染料」である。これら
の染料は蛍光染料の誘導体であって、膜に可溶性で常に
弱い蛍光を発するが、細胞膜を通過して輸送されたあと
は、膜に対して不溶性となり、高い蛍光性を得ることが
できる。これらの誘導体がいったん細胞内へ入ると、細
胞内にある、例えば、細胞内で酵素が蛍光染料誘導体に
作用して、入るときは容易に通過した細胞から、これが
搬出されるのを防止する。このような染料誘導体の例
は、3,6−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロ
ールから誘導されたフルオレスセイン類および3,6−ジ
アミノ−９−フエニルキサンテンから誘導されたローザ
ミン類およびローダミン類を包含するキサンテン染料の
ような蛍光化合物の、アセテート類等のエステル類であ
る。ローダミン類およびフルオレセイン類は９−Ｏ−カ
ルボキシフェニル基を有し、９−Ｏ−カルボキシフェニ
ルキサンテンの誘導体である。これらの化合物のフェニ
ル基に置換基を有し、または有しない化合物は商業的に
入手できる。
他の蛍光化合物の例は、アミノ基をα位またはβ位に有
し、通例α位に有するナフチルアミン類である。包含さ
れるナフチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフ
チル−５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフタレ
ンスルホン酸塩および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフ
タレンスルホン酸塩である。他の興味深い蛍光化合物は
クマリン類、例えばウンベリフェロンである。
し、通例α位に有するナフチルアミン類である。包含さ
れるナフチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフ
チル−５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフタレ
ンスルホン酸塩および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフ
タレンスルホン酸塩である。他の興味深い蛍光化合物は
クマリン類、例えばウンベリフェロンである。
この発明に使用できる細胞内にとり込まれる染料のもう
１つの部類は、DNAまたはRNAに親和性を有する染料であ
る。前記のとおり、これらの染料はDNAを有する細胞が
含まれる検定に使用できる。このような染料の例はDNA
挿入剤であって、これらは一般によく知られた化合物で
あり、またその大部分は商業的に入手できる。このよう
な薬剤の代表例は、アクリフラビン、アクリフラビン塩
酸塩、および類似のアクリフラビン誘導体、およびエチ
ジウム・ブロミド等のエチジウム・ハライド類である。
１つの部類は、DNAまたはRNAに親和性を有する染料であ
る。前記のとおり、これらの染料はDNAを有する細胞が
含まれる検定に使用できる。このような染料の例はDNA
挿入剤であって、これらは一般によく知られた化合物で
あり、またその大部分は商業的に入手できる。このよう
な薬剤の代表例は、アクリフラビン、アクリフラビン塩
酸塩、および類似のアクリフラビン誘導体、およびエチ
ジウム・ブロミド等のエチジウム・ハライド類である。
細胞内にとり込まれる蛍光剤のもう１つの部類は、タン
パク質または炭化水素類に高い親和性を有する染料、即
ちステイン類である。そのような薬剤を例示すれば、ピ
レンおよびナフタレンのスルホン酸塩、スチルベンのジ
マレインイミド、サリチル酸マレインイミド、ピレンお
よびクマリンのイソチオシアネート、ダンジルアジド等
のダンジル化合物、アントラセンカルボキシアルデヒド
のカルボヒドラゾン、一般細菌染料等であるが、これに
限定されるものではない。上記薬剤の例は、モレキュラ
ー・ブローブズ社（Molecular Probes,Inc.〔ジヤンク
ション市（Junction City）、オレゴン（Oregon）〕の
1981年３月のカタログおよびコダック・バイオロジカル
・スティンズ・アンド・リレーテイッド・プロダクツ
（Kodak Biological Stains and Related Product
s）（発行番号、JJ−281−51）に見いだされる。
パク質または炭化水素類に高い親和性を有する染料、即
ちステイン類である。そのような薬剤を例示すれば、ピ
レンおよびナフタレンのスルホン酸塩、スチルベンのジ
マレインイミド、サリチル酸マレインイミド、ピレンお
よびクマリンのイソチオシアネート、ダンジルアジド等
のダンジル化合物、アントラセンカルボキシアルデヒド
のカルボヒドラゾン、一般細菌染料等であるが、これに
限定されるものではない。上記薬剤の例は、モレキュラ
ー・ブローブズ社（Molecular Probes,Inc.〔ジヤンク
ション市（Junction City）、オレゴン（Oregon）〕の
1981年３月のカタログおよびコダック・バイオロジカル
・スティンズ・アンド・リレーテイッド・プロダクツ
（Kodak Biological Stains and Related Product
s）（発行番号、JJ−281−51）に見いだされる。
次にこの発明を、血液試料を検定試料の例とし、その血
液型抗原または抗体を、この方法によって測定できるsb
p構成要素の例として用いて、詳細に記述する。この説
明は単に例示的説明の手段であって、この発明の範囲を
何ら限定する意図はない。
液型抗原または抗体を、この方法によって測定できるsb
p構成要素の例として用いて、詳細に記述する。この説
明は単に例示的説明の手段であって、この発明の範囲を
何ら限定する意図はない。
この発明にしたがい、血液型抗原の検定を実施するた
め、所望により血液試料を５％より大きく、好ましくは
20％より大きく、さらに好ましくは50％より大きい血液
容量から成る緩衝液水性媒質を使用する。緩衝液水性媒
質のpHは通常約５〜９、好ましくは約６〜８とする。試
料を好適量の蛍光剤および相補的sbp構成要素と混合す
る。相補的sbp構成要素の量は、一般に有意な検定結果
を得るに足る十分量を使用すべきである。細胞内にとり
込まれる蛍光剤の量は、細胞の性質と薬剤の性質によっ
て変化する。通常、蛍光剤は、血液1ml当たり約0.1〜10
0μｇ、好ましくは約１〜10μｇを使用する。相補的sbp
構成要素の使用量は実験に基づいて決定し、通常、sbp
構成要素量の0.01〜1000倍、好ましくはsbp構成要素量
の0.1〜100倍の範囲とする。
め、所望により血液試料を５％より大きく、好ましくは
20％より大きく、さらに好ましくは50％より大きい血液
容量から成る緩衝液水性媒質を使用する。緩衝液水性媒
質のpHは通常約５〜９、好ましくは約６〜８とする。試
料を好適量の蛍光剤および相補的sbp構成要素と混合す
る。相補的sbp構成要素の量は、一般に有意な検定結果
を得るに足る十分量を使用すべきである。細胞内にとり
込まれる蛍光剤の量は、細胞の性質と薬剤の性質によっ
て変化する。通常、蛍光剤は、血液1ml当たり約0.1〜10
0μｇ、好ましくは約１〜10μｇを使用する。相補的sbp
構成要素の使用量は実験に基づいて決定し、通常、sbp
構成要素量の0.01〜1000倍、好ましくはsbp構成要素量
の0.1〜100倍の範囲とする。
細胞内にとり込まれる蛍光剤の水溶性が低い場合、蛍光
剤が細胞内にとり込まれ易くするため、好適な有機極性
溶媒に溶解した蛍光剤と血液試料を、まず最初に混合す
ることができる。有機溶媒は、一般に１〜６個の炭素原
子と、酸素、窒素および硫黄から成る群から選ばれる１
〜３個のヘテロ原子を有するものとする。このような溶
媒の例は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ヘキサメチルホスホルアミド等である。次に、この
混合物を相補的sbp構成要素と合わせる。
剤が細胞内にとり込まれ易くするため、好適な有機極性
溶媒に溶解した蛍光剤と血液試料を、まず最初に混合す
ることができる。有機溶媒は、一般に１〜６個の炭素原
子と、酸素、窒素および硫黄から成る群から選ばれる１
〜３個のヘテロ原子を有するものとする。このような溶
媒の例は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ヘキサメチルホスホルアミド等である。次に、この
混合物を相補的sbp構成要素と合わせる。
試料および細胞内にとり込まれる蛍光剤、相補的sbp構
成要素を結合させ、目標とするsbp構成要素が存在すれ
ば細胞凝集が起こる条件下でインキュベートする。加温
時間はsbp構成要素の表面密度、細胞および相補的sbp構
成要素の濃度、およびポリブレン、デキストランまたは
デキストリン誘導体、低イオン強度媒質、血清アルブミ
ンおよびポリエチレングリコール等の凝集促進剤を添加
すること等を含む反応条件によって、大きく変化する。
望ましい加温時間は、通例約10〜37℃の緩和な温度で約
10〜600秒、好ましくは約10〜200秒である。
成要素を結合させ、目標とするsbp構成要素が存在すれ
ば細胞凝集が起こる条件下でインキュベートする。加温
時間はsbp構成要素の表面密度、細胞および相補的sbp構
成要素の濃度、およびポリブレン、デキストランまたは
デキストリン誘導体、低イオン強度媒質、血清アルブミ
ンおよびポリエチレングリコール等の凝集促進剤を添加
すること等を含む反応条件によって、大きく変化する。
望ましい加温時間は、通例約10〜37℃の緩和な温度で約
10〜600秒、好ましくは約10〜200秒である。
特殊な血液型抗原に対する全血試料中の抗体を測定する
逆の血液型判定では、水性緩衝液媒質中で、試料を目標
とするＡまたはＢの個々の型の赤血球細胞と合わせる。
赤血球試料に蛍光剤をとり込ませる前記記載と同様の方
法および量を用いて、好ましくは蛍光剤をあらかじめ細
胞にとりこませてから、これを試料と結合させる。つい
で前記の同様の時間および温度に、媒質を保つ。
逆の血液型判定では、水性緩衝液媒質中で、試料を目標
とするＡまたはＢの個々の型の赤血球細胞と合わせる。
赤血球試料に蛍光剤をとり込ませる前記記載と同様の方
法および量を用いて、好ましくは蛍光剤をあらかじめ細
胞にとりこませてから、これを試料と結合させる。つい
で前記の同様の時間および温度に、媒質を保つ。
上記のインキュベート処理後、媒質の測定を行い、細胞
凝集の結果を蛍光変化から読みとる。
凝集の結果を蛍光変化から読みとる。
この目的のため、非フロー式血球計算法を用いることが
できる。これは、細隙灯、または好ましくはレーザーに
より得られる径の小さい光束を使用し、相対的粒子サイ
ズに基づいて粒子を分別する方法である。この手法は、
蛍光パルス強度分析または蛍光変動の相関を利用して行
う〔ブリッグスら、「ホモジニアス・フルオレッセント
・イムノアツセイ（Homogeneous Fluorescent Immuno
-assay）」、サイエンス（Science）、212巻、1266〜12
67頁（1981年）、およびニコリら、「フルオルッセンス
・イムノアッセイ・ベースト・オン・ロング、タイム・
コレレイションス・オブ・ナンバー・フラクチュエーシ
ュンズ（Fluorescence Immunoassay Based on Long
Time Correlations of Number Fluctuations）」、（プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ、USA（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、77巻（８）、4904〜4908頁（1980年）〕。
できる。これは、細隙灯、または好ましくはレーザーに
より得られる径の小さい光束を使用し、相対的粒子サイ
ズに基づいて粒子を分別する方法である。この手法は、
蛍光パルス強度分析または蛍光変動の相関を利用して行
う〔ブリッグスら、「ホモジニアス・フルオレッセント
・イムノアツセイ（Homogeneous Fluorescent Immuno
-assay）」、サイエンス（Science）、212巻、1266〜12
67頁（1981年）、およびニコリら、「フルオルッセンス
・イムノアッセイ・ベースト・オン・ロング、タイム・
コレレイションス・オブ・ナンバー・フラクチュエーシ
ュンズ（Fluorescence Immunoassay Based on Long
Time Correlations of Number Fluctuations）」、（プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ、USA（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、77巻（８）、4904〜4908頁（1980年）〕。
この発明における好ましい蛍光変化の測定方法は、米国
特許出願番号第397,285号（1982年７月12日出願）に記
載のファイバー、オプティック血球計算器を使用するこ
とを包含しているので、ここに引用して記載の一部とす
る。この特許は、目標物質の存在または量を検出するこ
とに関して、分散液中に存在する粒子を測定する方法と
装置を提供する。蛍光をうけ取り、それを計数すること
ができる光学的ファイバーを使用し、これによってかな
り小さい容積を明らかにする。該容積とは、予定されて
いる変動（fluctuation）を生じる単一の粒子だけが存
在していると思われる容積のことである。試料中に存在
する分析物量に比例して蛍光変動を変化させる種々の手
法を駆使することにより、存在する分析物の量が複数容
積を試料から採ることにより観察する。得られた結果
を、既知量の分析物を含んでいる溶液から得られた成績
と比較することにより、分析物の量を定量的に測定す
る。
特許出願番号第397,285号（1982年７月12日出願）に記
載のファイバー、オプティック血球計算器を使用するこ
とを包含しているので、ここに引用して記載の一部とす
る。この特許は、目標物質の存在または量を検出するこ
とに関して、分散液中に存在する粒子を測定する方法と
装置を提供する。蛍光をうけ取り、それを計数すること
ができる光学的ファイバーを使用し、これによってかな
り小さい容積を明らかにする。該容積とは、予定されて
いる変動（fluctuation）を生じる単一の粒子だけが存
在していると思われる容積のことである。試料中に存在
する分析物量に比例して蛍光変動を変化させる種々の手
法を駆使することにより、存在する分析物の量が複数容
積を試料から採ることにより観察する。得られた結果
を、既知量の分析物を含んでいる溶液から得られた成績
と比較することにより、分析物の量を定量的に測定す
る。
対照として、問題の血液型抗原または抗体の既知量を好
適な媒質に加え、未知分析物を含有している試料に対し
て行った前記の処理を行う。当該血液型抗原または抗体
の存在を指標として、対照品の蛍光変化を未知試料の蛍
光変化と比較する。
適な媒質に加え、未知分析物を含有している試料に対し
て行った前記の処理を行う。当該血液型抗原または抗体
の存在を指標として、対照品の蛍光変化を未知試料の蛍
光変化と比較する。
［実施例］ 以下に示す実施例によって、この発明をより詳細に説明
する。
する。
実施例１ ２−（ｐ−ジエチルアミノ−ｍ−ヒドロキシフェニル）
−４−（４−ジエチルインモニオ−２−ヒドロキシ−2,
5−シクロヘキサジエニリデン）−３−オキソ−１−シ
クロブテノレート（DEAS）の製造 DEASを下記のとおり製造した。スクアリン酸（741mg、6
5ミリモル）をｎ−ブタノール：トルエン（2:1）90ml中
に入れた３−N,N−ジエチルアミノフェノール（2.16g、
13ミリモル）と撹拌下に混合した。共沸により水を除去
しながら、混合物を１液還流した。反応の進行は、メタ
ノール：トルエン（1:9）を使用する薄層クロマトグラ
フィーにより追跡した。つぎに反応混合物を蒸留してト
ルエン約40mlを除去した後、この反応混合物を室温に冷
却した。結晶性の生成物を濾過して分離し、室温で乾燥
して生成物2.5gを得た。UV（DMF）λmax650nm、ε＝24
0,000、蛍光（DMF）650/666nm。
−４−（４−ジエチルインモニオ−２−ヒドロキシ−2,
5−シクロヘキサジエニリデン）−３−オキソ−１−シ
クロブテノレート（DEAS）の製造 DEASを下記のとおり製造した。スクアリン酸（741mg、6
5ミリモル）をｎ−ブタノール：トルエン（2:1）90ml中
に入れた３−N,N−ジエチルアミノフェノール（2.16g、
13ミリモル）と撹拌下に混合した。共沸により水を除去
しながら、混合物を１液還流した。反応の進行は、メタ
ノール：トルエン（1:9）を使用する薄層クロマトグラ
フィーにより追跡した。つぎに反応混合物を蒸留してト
ルエン約40mlを除去した後、この反応混合物を室温に冷
却した。結晶性の生成物を濾過して分離し、室温で乾燥
して生成物2.5gを得た。UV（DMF）λmax650nm、ε＝24
0,000、蛍光（DMF）650/666nm。
実施例２ Ｄ（Rho）血液型抗原判定の検定 DEASのジメチルホルムアミド（DMF）飽和溶液を調製
し、さらにこれをDMFで1:10（容量比）に希釈した。Ｏ
（Rho）陽性全血試料1mlにDEAS希釈液50μを、絶えず
激しく撹拌しながら滴下して混合した。この混合物10μ
を、Ｄ（Rho）血液型抗原の特異的抗体（商業的に入
手可能な型判定用試薬）10μと混合した。この混合物
を、１分間環境温度に保ち、ついでこれを、血清アルブ
ミンおよびスクロース含有リン酸緩衝液1.5mlで希釈し
た。
し、さらにこれをDMFで1:10（容量比）に希釈した。Ｏ
（Rho）陽性全血試料1mlにDEAS希釈液50μを、絶えず
激しく撹拌しながら滴下して混合した。この混合物10μ
を、Ｄ（Rho）血液型抗原の特異的抗体（商業的に入
手可能な型判定用試薬）10μと混合した。この混合物
を、１分間環境温度に保ち、ついでこれを、血清アルブ
ミンおよびスクロース含有リン酸緩衝液1.5mlで希釈し
た。
米国特許出願番号第397,285号（1982年７月12日出願）
に記載の粒子計測用限界容積法および装置を用いて、細
胞凝集によって生じる蛍光変化を分析した。
に記載の粒子計測用限界容積法および装置を用いて、細
胞凝集によって生じる蛍光変化を分析した。
カプトロン社（Kaptron,Inc.）〔パロ・アルト、カリホ
ルニア（Palo Alto,California）〕から入手したＹ字
型ファイバーオプティクス・カプラー〔スプリッター、
モニター（Splitter−Monitor）、FOMS−850−Ｐ型〕の
ファイバーの１本の端を媒質中に浸漬した。ファイバー
の直径は50ミクロンで、半角12゜の励起光円錐および１
×10-7mlの有効サンプル容積を生じた。He−Neレーザー
（632.9nm）から得られる励起光を、分岐した２本のフ
ァイバーの一方へ加えた。細胞から放射され、浸漬した
ファイバー末端へ入って来る蛍光部分を、ファイバー接
合部で２等分し、２本の分岐ファイバーへ送り返した。
２番目の分岐ファイバーを通って来る部分を、フィルタ
ーにかけて干渉を除き、高感度エミ（EMI）光電増倍管
を用い、１ミリセコンドのゲート時間内で、0.1秒毎に
１回の割合で50〜500秒間、読み取った。ついで、１ゲ
ート時間当たりの蛍光パルスの平均値をコンピュータで
算定した。
ルニア（Palo Alto,California）〕から入手したＹ字
型ファイバーオプティクス・カプラー〔スプリッター、
モニター（Splitter−Monitor）、FOMS−850−Ｐ型〕の
ファイバーの１本の端を媒質中に浸漬した。ファイバー
の直径は50ミクロンで、半角12゜の励起光円錐および１
×10-7mlの有効サンプル容積を生じた。He−Neレーザー
（632.9nm）から得られる励起光を、分岐した２本のフ
ァイバーの一方へ加えた。細胞から放射され、浸漬した
ファイバー末端へ入って来る蛍光部分を、ファイバー接
合部で２等分し、２本の分岐ファイバーへ送り返した。
２番目の分岐ファイバーを通って来る部分を、フィルタ
ーにかけて干渉を除き、高感度エミ（EMI）光電増倍管
を用い、１ミリセコンドのゲート時間内で、0.1秒毎に
１回の割合で50〜500秒間、読み取った。ついで、１ゲ
ート時間当たりの蛍光パルスの平均値をコンピュータで
算定した。
標準放射水準を確立するため２つの対照実験を行った。
（ａ）通常の型判定によってＤ（Rho）陰性と判定され
た試料を同じ方法で検定した。
た試料を同じ方法で検定した。
（ｂ）Ｄ（Rho）型判定試薬のうち抗体以外のすべての
要素を含む商業的に入手可能な「Rh対照」試薬を、上記
の検定の抗体試薬の代わりに使用した。
要素を含む商業的に入手可能な「Rh対照」試薬を、上記
の検定の抗体試薬の代わりに使用した。
陽性５名、および陰性５名の対象から、それぞれ採取し
た試料で得られた成績を、第１表にまとめる。
た試料で得られた成績を、第１表にまとめる。
実施例３ Ａ血液型抗原特異性抗体判定の検定 Ａ型全血液を2800rpmで遠心し、上清および白血球の軟
層を吸引除去した。固まっている細胞を血漿がなくなる
まで等張生理食塩液で洗浄し、50％へマトクリットとな
るように10％ウシ血清アルブミン含有緩衝液に浮遊させ
た。
層を吸引除去した。固まっている細胞を血漿がなくなる
まで等張生理食塩液で洗浄し、50％へマトクリットとな
るように10％ウシ血清アルブミン含有緩衝液に浮遊させ
た。
DEASのDMF飽和溶液を調製し、これをDMFで1:10（容量
比）に希釈した。上記のＡ型細胞浮遊液1mlにDEAS希釈
液50μを、絶えず激しく撹拌しながら滴下して混合し
た。
比）に希釈した。上記のＡ型細胞浮遊液1mlにDEAS希釈
液50μを、絶えず激しく撹拌しながら滴下して混合し
た。
上記の浮遊液50μを、全血試料20μと混合した。こ
の混合物を１分間環境温度に保ち、血清アルブミンおよ
びデキストランを含有する緩衝液3mlで希釈し、実施例
２に記載の粒子計測用限界容積法および装置を用いて分
析した。得られた成績を第２表にまとめる。
の混合物を１分間環境温度に保ち、血清アルブミンおよ
びデキストランを含有する緩衝液3mlで希釈し、実施例
２に記載の粒子計測用限界容積法および装置を用いて分
析した。得られた成績を第２表にまとめる。
実施例４ Ａ（αＡ）およびＢ（αＢ）血液型抗原特異性抗体、お
よびＯ型対象（αＡ、Ｂ）から得られた抗体を使用し、
血液型Ａ、ＢおよびＯに対し、それぞれ実施例２の検定
を行った。キンスランド（前出）の教示にしたがい、DE
ASをβ−シクロデキストリンと混合した。得られた成績
を第３表にまとめる。
よびＯ型対象（αＡ、Ｂ）から得られた抗体を使用し、
血液型Ａ、ＢおよびＯに対し、それぞれ実施例２の検定
を行った。キンスランド（前出）の教示にしたがい、DE
ASをβ−シクロデキストリンと混合した。得られた成績
を第３表にまとめる。
以上の事実から、この発明の方法が各種の分析物の検定
に幅広い有用性を有し、特に血液型の判定に有用である
ことが判明する。この方法は簡単で、迅速である。一般
に、この方法を１段階で遂行できる。試料の他の要素に
よって、検定感度に生じる干渉効果は最小限に抑えられ
る。分離段階または洗浄段階を行うことなく、検定結果
を得ることができる。
に幅広い有用性を有し、特に血液型の判定に有用である
ことが判明する。この方法は簡単で、迅速である。一般
に、この方法を１段階で遂行できる。試料の他の要素に
よって、検定感度に生じる干渉効果は最小限に抑えられ
る。分離段階または洗浄段階を行うことなく、検定結果
を得ることができる。
この発明の内容を明示し、理解を得るために、以上、幾
つかの例を挙げて詳細に記載したが、この発明の範囲内
で、なお若干の変更または修飾を実施できることは言う
までもない。
つかの例を挙げて詳細に記載したが、この発明の範囲内
で、なお若干の変更または修飾を実施できることは言う
までもない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドウイン・エフ・ウルマン アメリカ合衆国カリフオルニア 94025、 アサートン、セルビー・レーン 135番
Claims (15)
- 【請求項１】試料中に存在する、リガンドおよびその同
種受容体から成る特異的結合対の構成要素（「sbp構成
要素」）を測定する方法において、 （ａ）水性媒質中で、（１）上記試料、（２）当該試料
が細胞を含まない場合は少なくとも１種の細胞、（３）
相補的sbp構成要素、但し、上記sbp構成要素または当該
相補的sbp構成要素の少なくとも一方が、（１）の試料
中のもしくは（２）の細胞表面と結合しているもの、お
よび（４）当該細胞内にとり込み可能な蛍光剤を合わ
せ、 （ｂ）上記細胞を水性媒質から分離することなく、上記
細胞の凝集の結果生じる蛍光変化を測定し、この蛍光変
化を指標として上記sbp構成要素の存在を知ることから
なる方法。 - 【請求項２】sbp構成要素が細胞表面構成要素である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】相補的sbp構成要素が表面抗原の受容体で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】細胞が赤血球である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項５】蛍光変化を非フロー式血球計算法、好まし
くはファイバー・オプティック血球計算器によって測定
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】蛍光剤が膜易溶性染料、好ましくはスクア
レート染料である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】上記試料が全血試料である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - 【請求項８】蛍光変化を非フロー式血球計算法、好まし
くはファイバー、オプティック血球計算器によって測定
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項９】蛍光剤が膜易溶性染料、好ましくはスクア
レート染料である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】細胞が赤血球であり、sbp構成要素が表
面抗原である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１１】表面抗原がＡ、Ｂ、Ｄおよび免疫グロブ
リンからなる抗原群から選ばれる特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項１２】蛍光変化が、細胞凝集の結果生じる特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１３】蛍光剤が、式： （式中、R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して炭素
原子数２〜16個のアルキルおよび炭素原子数２〜16個の
アラルキルおよび原子数２〜16個のアラルキルから成る
群から選ばれ、ここで上記の基は、同じ基であってもま
たは異なった基であってもよく、また、OH、CONHR1、SR
1、OR1から成る群から選ばれる置換基で置換されている
こともでき、ここにおいてR1は、炭素原子数１〜６個の
低級アルキル、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、NO2、オキソカルボニ
ル、CNであり、R5およびR6は、それぞれ独立して水素、
メトキシおよびヒドロキシから成る群から選ばれる） または、式： （式中、R1、R2およびR3は、それぞれ独立して炭素原子
数２〜16個のアルキルおよび炭素原子数２〜16個のアラ
ルキルから成る群から選ばれ、ここで上記の基は、同じ
基であってもまたは異なった基であってもよく、また、
OH、CONHR1、SR1、OR1から成る群から選ばれる置換基で
置換されていることもでき、ここにおいてR1は、炭素原
子数１〜６個の低級アルキル、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、NO2、
オキソカルボニルおよびCNである） から成る群から選ばれる式で示されるスクアレート染料
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１４】特異的結合対が赤血球細胞抗原およびそ
の抗体もしくはレクチンより成り、赤血球細胞を細胞内
にとり込み可能な蛍光剤と合わせ、赤血球細胞凝集反応
の結果生ずる蛍光変化を指標として、赤血球細胞の型判
定を行う、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１５】蛍光剤が、600ナノメーターより大きい
吸収波長を有するスクアレート染料であり、好ましくは
式： （式中、R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立して炭素
原子数２〜16個のアルキルおよび炭素原子数２〜16個の
アラルキルおよび原子数２〜16個のアラルキルから成る
群から選ばれ、ここで上記の基は、同じ基であってもま
たは異なった基であってもよく、また、OH、CONHR1、SR
1、OR1から成る群から選ばれる置換基で置換されている
こともでき、ここにおいてR1は、低級アルキル、Ｆ、C
l、Br、Ｉ、NO2、オキソカルボニル、CNであり、R5およ
びR6は、それぞれ独立して水素、メトキシおよびヒドロ
キシから成る群から選ばれる） または、式： （式中、R1、R2およびR3は、それぞれ独立して炭素原子
数２〜16個のアルキルおよび炭素原子数２〜16個のアラ
ルキルから成る群から選ばれ、ここで上記の基は、同じ
基であってもまたは異なった基であってもよく、また、
OH、CONHR1、SR1、OR1から成る群から選ばれる置換基で
置換されていることもでき、ここにおいてR1は、炭素原
子数１〜６個の低級アルキル、Ｆ、Cl、Br、Ｉ、NO2、
オキソカルボニルおよびCNである） から成る群から選ばれる式で示されるスクアレート染料
である特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/645,458 US4748129A (en) | 1984-08-28 | 1984-08-28 | Assay method employing fluorescent cell incorporative dye |
| US645458 | 1984-08-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6162862A JPS6162862A (ja) | 1986-03-31 |
| JPH0692971B2 true JPH0692971B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=24589110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189350A Expired - Lifetime JPH0692971B2 (ja) | 1984-08-28 | 1985-08-27 | 細胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する検定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4748129A (ja) |
| EP (1) | EP0176252B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0692971B2 (ja) |
| AT (1) | ATE63002T1 (ja) |
| AU (1) | AU591636B2 (ja) |
| CA (1) | CA1261742A (ja) |
| DE (1) | DE3582643D1 (ja) |
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| US4806488A (en) * | 1985-09-06 | 1989-02-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Ligand-receptor assays employing squarate dye compositions |
| US5627027A (en) * | 1986-04-18 | 1997-05-06 | Carnegie Mellon University | Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods |
| US6956032B1 (en) | 1986-04-18 | 2005-10-18 | Carnegie Mellon University | Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods |
| US5569587A (en) * | 1986-04-18 | 1996-10-29 | Carnegie Mellon University | Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes |
| CA1340806C (en) * | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
| EP0261719A3 (en) * | 1986-09-23 | 1990-10-10 | Akzo N.V. | Thermochemiluminescent cyclodextrin complexes |
| US4891324A (en) * | 1987-01-07 | 1990-01-02 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Particle with luminescer for assays |
| AU607533B2 (en) * | 1987-08-07 | 1991-03-07 | Xoma Corporation | Methods and compositions for mimicking antigenic determinants |
| US5256532A (en) * | 1988-05-02 | 1993-10-26 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
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| US5375606A (en) * | 1990-02-28 | 1994-12-27 | Zynaxis, Inc. | Bio-analytical separation method |
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| DE10008373C2 (de) * | 2000-02-23 | 2002-11-28 | Helmut Adelsberger | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität |
| CN109917141B (zh) * | 2019-03-19 | 2022-05-10 | 迪佰(厦门)生物科技有限公司 | 一种检测人abo血型试纸条、制备方法、检测方法及应用 |
| CN110736832B (zh) * | 2019-12-18 | 2020-04-10 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 一种抗体鉴定谱细胞的组合物 |
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| US4424201A (en) * | 1978-11-28 | 1984-01-03 | Rockefeller University | Employment of a mereyanine dye for the detection of malignant leukocytic cells |
| DE3000483A1 (de) * | 1979-01-09 | 1980-07-17 | Fuji Photo Film Co Ltd | Mikrokapseln fuer immunologische bestimmungen |
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| EP0039195B1 (en) * | 1980-04-28 | 1986-06-18 | Montefiore Hospital and Medical Center | Antibody detection process |
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| US4707441A (en) * | 1984-08-06 | 1987-11-17 | Technicon Instruments Corp. | Binding assays in automated apparatus with liposome compatible surfactants |
-
1984
- 1984-08-28 US US06/645,458 patent/US4748129A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-08-27 EP EP85306054A patent/EP0176252B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-27 JP JP60189350A patent/JPH0692971B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-27 AU AU46820/85A patent/AU591636B2/en not_active Ceased
- 1985-08-27 DE DE8585306054T patent/DE3582643D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-27 CA CA000489455A patent/CA1261742A/en not_active Expired
- 1985-08-27 AT AT85306054T patent/ATE63002T1/de not_active IP Right Cessation
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| DE3582643D1 (de) | 1991-05-29 |
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