JPH09505057A - 白内障を予防または制御するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類の眼において白内障の形成に伴って生じる病理的変化を、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）量を減少することまたはＴＧＦβの作用を阻害することにより予防または制御するための方法に関する。また、本発明は「続発性白内障」を予防または最小化するためのＴＧＦβ阻害剤の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 白内障を予防または制御するための方法 技術分野 本発明は、哺乳類の眼において白内障の形成に伴って生じる病理的変化を、形 質転換成長因子β（ＴＧＦβ）量を減少することまたはＴＧＦβの作用を阻害す ることにより予防または制御するための方法に関する。また、本発明は「続発性 白内障」を予防または最小化するためのＴＧＦβ阻害剤の使用にも関する。 背景技術 白内障は、視力を損なう、水晶体の混濁である。これは最も一般的な眼科疾患 の１つであり、生涯のどの時期にも起こり得るものの、しばしば加齢に伴い生じ るものである。例えば米国においては、７４〜８９歳の範囲の年齢の４５％まで の人々が白内障に罹患している。現在、白内障に最も一般的に用いられる治療は 、水晶体細胞の外科的除去およびそれに続く、残った水晶体包（lens capsule） 内への合成置換水晶体の移植である。しかし、合成水晶体の移植は視力を一時的 に回復させるだけにすぎない可能性がある。それは、水晶体包に付着した残余水 晶体細胞がしばしば急速に生長して新たに混濁を形成するからである。このよう な新たな混濁の形成は「続発性白内障」または手術後の水晶体包性混濁化として 知られている。 ＴＧＦβ類は関連する蛋白質の群からなるが、最も広く研究されているＴＧＦ β類の仲間は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３であり、これらは全て 眼内に存在すると報告されている。 発明の開示 １つの態様において、本発明は、１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤の有効 量を被験者に投与することを包含する、哺乳類被験者の眼における白内障または 白内障様障害を予防または制御するための方法を提供する。 上記哺乳類被験者はヒトであることが好ましいが、本発明は、例えばウマ、ネ コおよびイヌ等の他の動物における白内障または白内障様障害の治療にも適して いる。 典型的には、ＴＧＦβ阻害剤は、蛋白質、糖蛋白質およびプロテオグリカンか ら選択される。 適切な蛋白質は、ＦＧＦのようなペプチド「成長因子」、抗体およびその他を 包含する。 適切な糖蛋白質は、α₂−マクログロブリン、ラミニン、コラーゲンまたはそ の他を包含する。 適切なプロテオグリカンは、デコリン(decorin)、ヘパラン硫酸プロテオグリ カン、ビグリカン（biglycan）またはその他を包含する。 別の態様において、本発明は、医薬学的に許容され得る担体中に１種またはそ れ以上のＴＧＦβ阻害剤を含む眼科製剤を提供する。 さらなる態様において、本発明は、水晶体移植手術後の哺乳類被験者の眼にお ける「続発性白内障」形成を予防または制御するための方法を提供するが、その 方法は、１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤で被覆された水晶体を被験者の眼 の中に移植することを包含する。 さらに別の態様において、本発明は、１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤で 被覆された水晶体移植片を提供する。 他の態様において、本発明は、白内障または白内障様障害を予防または制御す るための眼科製剤の製造におけるＴＧＦβ阻害剤の使用を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、ＴＧＦβ２と非免疫ＩｇＧ（Ａ、Ｂ）、またはＴＧＦβと抗ＴＧＦβ ＩｇＧ（Ｃ、Ｄ）と共に培養した、２１日齢ラット由来水晶体上皮外植片の位相 差顕微鏡像を示している。外植片は、培養３日目（Ａ、Ｃ）および５日目（Ｂ、 Ｄ）に撮影された。 発明を実施するための態様 ＴＧＦβの生物学的活性は種々の方法により阻害され得る。その生物学的活性 を阻害する１つの方法は、ＴＧＦβ分子の活性領域に対する抗体の使用によるも のである。ＴＧＦβの生物学的活性は、ＴＧＦβをマスクするか、阻害するか、 あるいは不活性化する、他の分子の使用によっても阻害され得る。例えば、デコ リン等のプロテオグリカン類は特異的ＴＧＦβ結合蛋白質として作用する。 本発明者らは、眼の水晶体を取り囲む房水（aqueous）と硝子体（vitreous） がＴＧＦβにより水晶体細胞において誘導される白内障変化を阻害する分子を含 有していることを示した。また、上記した阻害性分子の１種またはそれ以上は上 記の眼の媒質（occular media）中に存在することが報告されている。 本発明によれば、ＴＧＦβ阻害剤は、典型的な施用方法、即ち眼の１つまたは それ以上の房（例えば前眼房）内に導入する方法によって投与されるか、あるい は阻害剤が循環器系を介して眼に容易に移送され得る部位において血管内注射と して投与されるか、どちらか一方の手法により投与されることができる。ＴＧＦ β阻害剤がα₂−マクログロブリンであるときには、これは、経口で投与される か、または眼科調剤の方法を除く他の適切な経路により投与されることもできる 。例えば、α₂−マクログロブリンの合成または分解に影響するか、あるいは眼 の媒質内へのα₂−マクログロブリンの移送程度を強めることでα₂−マクログロ ブリンの血清レベルの増加をもたらす物質を投与することによって、水晶体細胞 に上昇したレベルのα₂−マクログロブリンを提供することも可能であろう。α₂ −マクログロブリンに関連する分子、即ち、α₂−マクログロブリンから誘導さ れた分子、またはα₂−マクログロブリンのＴＧＦβ阻害特性を擬態するが細胞 膜または腸をより良く通過し得るように特に設計された分子が、典型的な施用方 法 によって、あるいは経口またはその他の経路によって、投与されることができる 。 本発明による治療での使用に要するＴＧＦβ阻害剤の有効量は、使用する阻害 剤、投与経路、治療対象の病期状況および治療される眼の持ち主によって変化す るものであり、そして究極的には医師の裁量によるものである。典型的には、Ｔ ＧＦβ阻害剤は医薬学的製剤または眼科製剤として与えられる。本発明による治 療は、例えば合成水晶体物質の移植に続く「続発性白内障」の形成において生じ 得るような、手術的干渉の結果として生じ得る白内障に関連した変化を阻害する ために、眼の手術の補助として用いられることができる。また、本発明は、他の 理由から通常よりも高い白内障形成の危険を有する人々の治療、または水晶体近 傍の上昇したＴＧＦβレベルに晒されている人々の治療にも適している。 上記ＴＧＦβ阻害剤の多くは商業的に入手可能である。 デコリンとビグリカンは、コイら（Choi et al.）による精製により得ること ができる。ＰＧＩおよびＰＧIIはそれぞれビグリカンおよびデコリンに対する別 名である。 ヘパラン硫酸プロテオグリカン類は、ヤナギシタら（Yanagishitaetal.）の方 法に従い得ることができる。 本発明の眼科製剤は、従来の医薬学的製剤技法に従い調製される。担体は、投 薬に望ましい調剤形態に応じた如何なる形態であってもよく、そして製剤は他の 治療成分を付加的に含有していてもよい。典型的には、ＴＧＦβ阻害剤の１種ま たはそれ以上が、従来の灌注溶液または粘弾性溶液内に包含されることができる 。１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤で被覆された水晶体移植片は他の治療剤 を含有することができ、そして従来の技法に従い調製されることができる。実施例 １ ＴＧＦβ単独およびＦＧＦと組合わせたＴＧＦβの、水晶体上皮外植片に対す る影響。方法 水晶体外植片を、生後ラットと成熟ラットの双方から調製し、成長因子との５ 日間の培養中の変化を、光学および電子顕微鏡観察；ラミニン、ヘパラン硫酸プ ロテオグリカンおよび繊維特異的クリスタリンの免疫位置決定法（immuno-local isation）；およびクリスタリンエライザ法（ＥＬＩＳＡ）によりモニターした 。 それぞれの実験は外植片を５日間まで培養することを包含していたが、培養は 次の条件で行った：成長因子添加せず（対照）、ＴＧＦβ添加、ＴＧＦβおよび ＦＧＦの組合せを添加（ＴＧＦβ/ＦＧＦ）、またはＦＧＦを単独で添加。ＦＧ Ｆは、水晶体細胞の振る舞いに影響を与える別の成長因子である（Chamberlain and McAvoy，1989; McAvoyetal.，1991）。幾つかの実験において、外植片は、 接着包（adhering capsule）が細胞の基層として働く、本発明者らの研究室で用 いられる標準方法により調製した。あるいは、外植片をラミニン基層上で裏返し て培養した。後者の方法は、モニターされるべき細胞の接着、拡散および遊走、 ならびに個々の細胞の良好な視覚化を提供することを可能にする。 チャンバーラインとマクアボイの文献（Chamberlain and McAvoy，1989）に記 載のように、ウシ脳の塩基性ＦＧＦを調製し、そして−２０℃で貯蔵した。高純 度天然ヒトＴＧＦβ１をジーンザイム（Genzyme，Cambridge，MA）より入手し、 −８０℃で貯蔵した。ＴＧＦβおよびＦＧＦの作業用貯蔵溶液を、（それぞれ培 養培地中、またはリン酸緩衝生理食塩水内の１％ウシ血清アルブミン−０.５Ｍ 塩化ナトリウム中に）調製し、使用直前に、４℃、１０,０００ｇで１０分間の 遠心分離に供した。水晶体上皮外植片の調製および培養：標準方法 滅菌条件下に１０日齢および１４週齢のウイスター（Wistar）ラットから眼を 除去し、培地中に設置した。その培地は、ホールズらの文献（Hales et al.，19 92）に記載されたようにウシ血清アルブミンおよび抗菌剤を含有した、５％二酸 化炭素／空気中、３７℃で予備培養された培地１９９であった。水晶体を除去し 、２ｍｌの培地中で４５〜９０分間（生後）または１〜２時間（成熟）インキュ ベーションを行った。次いで、上皮を繊維から剥離し、マクアボイとフェーノン の文献（McAvoy and Fernon，1984）に記載のように、細胞表面を上向きにして 、 ２ｍｌの培地の入った培養皿内に留めた。特に断らない限り全ての上皮を使用し 、それぞれの培養皿には２〜３片の外植片を入れた。 外植片の調製からほぼ３時間後、培地（１ｍｌ／培養皿）を交換し、そしてＴ ＧＦβおよび／またはＦＧＦの貯蔵溶液の試料を１０μｌ添加し、必要に応じて 、それぞれ２０および４０ｎｇ/ｍｌの最終濃度とした。外植片を、位相差顕微 鏡により毎日モニターしながら５日間培養した。適当なときに、外植片を、下記 に記載するように光学および電子顕微鏡観察のために処理した。または、繊維特 異的クリスタリンの蓄積を評価するため、培養期の終わりに、外植片を１０ｍＭ ＥＤＴＡ−０.０２％トリトンＸ−１００（ｐＨ１０）内に入れ（２００μｌ 中に２つの外植片）、−２０℃にて貯蔵した後、０〜２０ｎｇ/ウエルの範囲の 対照を用いて、β−およびγ−クリスタリンエライザ法に使用した。水晶体上皮外植片の調製および培養：ラミニン基層上 この方法は、ホールズらの文献（Hales et al.，1992）に記載されたとおりで ある。 簡単に述べれば、まず実験前日に培養皿をラミニンで予め被覆した。そして全 ての外植片を上述の通り調製したが、ラミニンに向かい合わせるように細胞表面 を下向きにし、そして２１日齢ラット由来水晶体を使用した。この齢のラット由 来外植片はＦＧＦに対し強い遊走反応を示す（未発表観察）。それぞれの培養皿 には３つの外植片を入れた。成長因子処理および培養条件は、標準外植片につい て上述した通りであったが、より低いＦＧＦ濃度である２ｎｇ/ｍｌを使用して 単独のＦＧＦに対する主反応が繊維分化よりもむしろ細胞遊走であることを確認 した。反応を位相差顕微鏡観察によって毎日モニターした。顕微鏡観察 免疫蛍光位置決定法に用いる外植片を培養期の終わりに収集し、室温下に２０ 分間かけてカルノワ固定液中で固定し、７０％エタノールに移した後、エタノー ル中で脱水する前に溶融した２.５％寒天の滴で覆い、そしてパラフィン内に包 埋した。外植片表面周辺の切片を切り出し、ヘマトキシリン−フロキシンで染色 するか、あるいはラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）または β−およびγ−クリスタリンの免疫位置決定法に使用した。それぞれの抗体およ びそれぞれの外植片ごとに、中央領域から切り出した切片を試験し、そしてそれ ぞれの成長因子処理毎に少なくとも２つの外植片を処理した。通常行われる通り 、非特異的蛍光のための対照、即ち、特異的抗体の代わりに非免疫ウサギ血清で 処理した切片を含んだ実験を行った。全ての検鏡板のために、外植片を１００％ エタノールの入った培養皿内で固定し、ヘマトキシリン−フロキシンで染色した 。 超微構造研究のため、ロビクとマクアボイの文献（Lovicu and MuAvoy，1992 ）に記載のように、１０日齢ラット由来外植片を透過電子顕微鏡観察（ＴＥＭ） および走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）用に処理したが、外植片は培養３日目また は５日目に収集した。成熟ラット由来外植片を、５日目のものだけＳＥＭ用に処 理した。ＳＥＭおよびＴＥＭ双方のために、それぞれの処理毎に少なくとも２つ の外植片を観察し、そしてＴＥＭのために外植片当たり２０〜３０グリッドを観 察した。結果 （１０日齢および２１日齢の）生後ラット由来上皮外植片を最初の詳細な研究 のために使用した。ＴＧＦβに対する反応の異常な性質が観察されたために、成 熟ラット由来外植片を用いて簡単な比較研究を実施した。１０日齢ラット由来水晶体外植片：標準方法 位相差顕微鏡観察およびＳＥＭ 対照およびＴＧＦβ処理外植片において、細胞は培養期を通じて特徴的な上皮 細胞形態を保持した。即ち、これらの細胞は栗石様填塞を伴う単層の状態で存在 した。双方の場合において、単層表面上に幾らかの細胞砕片を検出した。ＴＧＦ β処理した外植片のみにおいては、単独細胞または細胞の小さな群も、単層表面 上で時々検出した。５日間培養した外植片のＳＥＭは、ＴＧＦβ処理した外植片 において、幾つかの細胞の上部表面が隣り合う細胞とオーバーラップしていたこ とを示した。 ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片およびＦＧＦ処理外植片は、培養第一日目の内か ら対照と明確に区別することができ、そしてこの段階では互いには区別不可能で あった。細胞は不規則に群がりそして細胞間隙は普通であったが、外植片の形態 学は一般的に活性な細胞遊走と関連しているものである（McAvoy and Chamberla in，1989; McAvoy，1988）。２日間の培養後、ＴＧＦβ処理細胞の幾つかにおい て外植片は大きく伸展したが、ＦＧＦ処理細胞においては伸展しなかった。伸展 した細胞の数は外植片の間で違っていた。これらは、通常細胞群落の小さな割合 を形成するにすぎないが、しばしば規則的な列を形成するので、ＦＧＦ処理外植 片の細胞と似て見える、外植片内の他の細胞とは明瞭に区別できる。処理間での この顕著な相違は、培養３日目にはさらにより明らかであるが、それはＴＧＦβ /ＦＧＦ処理外植片内でより多くの細胞が大きく伸展したからである。この段階 におけるＳＥＭは、伸展した細胞の多くがその長さに沿って複数の部位で隣り合 う細胞と接着していたことを示した。 ４日間および５日間の培養により、ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片内の細胞の多 くは複層の状態となり、これらの外植片全てが幾つかの領域を発達させていたが 、その領域においては、環状に配列して焦点から外へ放射する伸展細胞によるバ ラ文様（rosette）内に細胞が並んでいた。これらの文様の外では、それは外植 片表面の約５０％までを占めていたが、同様に広く伸展した細胞が平行な配列で 並んでいた。残りの細胞は、より少なく伸展し、そしてＦＧＦ処理外植片におけ ると同様に不規則に配列しているように見えた。 ＳＥＭは、バラ文様の外側であって広く伸展した細胞が平行に配列した領域に おいて、細胞が多くの絡み合った突起を有し、ＦＧＦ単独で処理した外植片にお いて見られる分化初期の繊維に似ているように見えたことを示した。この濃度の ＦＧＦに反応して繊維分化が進行中の１０日齢ラット由来外植片における形態学 的変化が、他の文献（Lovicu and McAvoy，1992）にて詳細に報告されており、 多層となることおよび多くの絡み合った突起の形成がこのプロセスの特徴である ことがよく判っている(Lovicu and McAvoy，1992; Lovicu and McAvoy，1989)。 ＦＧＦ/ＴＧＦβ処理外植片において、繊維性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）様 物質の特殊な斑（occasional patches）が外植片表面上に認められた。このマト リックスは密であり、かつ細胞をその下に覆い隠した。ＴＥＭ ５日間に亘ってＦＧＦおよびＴＧＦβ/ＦＧＦと共に培養した外植片内の細胞 は、多層となり、そして、伸展、少ない細胞質小器官および核小体ＲＮＡ粒子の 凝集を包含する初期繊維分化の特徴を呈した。また、繊維分化に典型的な球関節 も検出された。さらに、ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片においては、クロマチン辺 縁趨向および細胞質凝集を呈した細胞が一般的であり、そして膜結合細胞断片お よび二次リソゾームに似た高電子密度体が、正常と思われたもの以外の細胞の多 くに見られた。これらの特徴は、アポプトシスまたはプログラムされた細胞死の 特質である（Wyllie et al.，1980; Williams et al.，1992）。また、３日間Ｔ ＧＦβ/ＦＧＦで処理した外植片においても、アポプトシスに類似の変化が検出 された。 ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片においてＥＣＭ様顆粒物質のポケットが細胞間に 広く検出された(また、ときには細胞内に存在するように思われた)。しばしば、 この物質は細胞膜近傍に層状に存在し、そのような領域においては被覆された穴 および小胞が一般的であった。通常はマイクロフィラメントの豊富な配列を示す 、隆起した粗面小胞体およびゴルジ体を有する細胞がこれらの外植片に高頻度に 見られた。 単独のＴＧＦβと共に培養した外植片において、上皮細胞は、単層を維持して おり、対照に類似していたが、ＴＧＦβの存在下では細胞間にしばしば空間が存 在していた。このことは、細胞がオーバーラップすることと共に、ＴＧＦβが細 胞−細胞相互作用の障害を引き起こし得ることを示唆している。ラミニンおよびＨＳＰＧの免疫組織化学的位置決定法 ＥＣＭ分子であるラミニンおよびＨＳＰＧは共に正常水晶体包内で見つかって おり（Parmigiani and McAvoy，1991; Mohan and Spiro，1986）、そして期待通 り、処理にかかわらず全ての外植片の水晶体包においてラミニンおよびＨＳＰＧ 双方に対する反応性が検出された。 ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片において、ラミニンおよびＨＳＰＧ双方に対する 反応性も、外植片内の、ＴＥＭにより見られたＥＣＭ様物質のポケットとほぼ類 似した大きさおよび分布の部位であると位置決定された。ＦＧＦ処理外植片にお いて、そのような領域は僅かに検出されたものの、両方の成長因子で処理した外 植片に見られたよりも一般的に小さく、その数も少なかった。ラミニンに対する 反応性を示した部位がＨＳＰＧに対する反応性を示した部位よりも多く、そして 一般的にラミニン反応性のほうが強かった。 対照およびＴＧＦβ処理外植片においては、細胞層内にラミニンまたはＨＳＰ Ｇに対して反応性であるポケットは検出されなかった。即ちＴＧＦβ処理細胞に おいてＴＥＭにより明らかにされた細胞間隙はＥＣＭを含有していなかった。β−クリスタリン蓄積 繊維分化を評価するため、本発明者らは５日間の培養期の終わりにエライザ法 により、外植片の繊維特異的β−およびγ−クリスタリン含有量を測定した。Ｔ ＧＦβ/ＦＧＦ処理またはＦＧＦ処理外植片においてのみ、有意なβ−クリスタ リン蓄積が生じていた（Ｐ＝０.００１、対照と比較）。ＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外 植片におけるβ−クリスタリン蓄積はＦＧＦ処理外植片に比べて見掛け上増大し ていたが、この増大は統計的に有意なところまでは達していなかった。どの処理 も、５日間以内の培養期ではγ−クリスタリンの有意な蓄積を導かなかった。 免疫位置決定の補足研究は、これらの知見を確認し、そしてβ−クリスタリン がＴＧＦβ/ＦＧＦ処理およびＦＧＦ処理外植片の双方において多くの細胞に亘 って分布しているらしいことを明らかにした。２１日齢ラット由来水晶体外植片：ラミニン基層上 成長因子無しに、ラミニン基層に向かい合うように細胞表面を下向きにして培 養した外植片において、細胞は拡散し、そして水晶体包から基層上に遊走して外 植片の周りに環を形成した。このプロセスは５日間の培養期に亘って継続し、Ｆ ＧＦ処理により有意に強調された（Hales et al.，1992）。しかし、ＴＧＦβの 添加はＦＧＦの存在下または不存在下に拡散および遊走を阻害して、細胞の完全 な環を発達させなかった。即ち、外植片週界の周りに細胞の孤立した外植が僅か に存在しただけであり、拡散および遊走は２日間の培養後に絶えたように思われ た。これらの外植の最外辺縁部の細胞が、２日間培養したＦＧＦ処理外植片に見 られる素早い遊走細胞の特質である偽足を僅かに有していたことは、観察におい て一貫して変わらなかった。培養期を通じて、ＴＧＦβ処理外植片とＴＧＦβ/ ＦＧＦ処理外植片との間では明らかな相違はなかった。 培養初日の間、（ＦＧＦの有無に関わらず）ＴＧＦβ処理外植片内の全ての細 胞は、対照における形態と非常に類似した形態であったが、２日目までには、ラ ミニン基層上に拡散した細胞の多くが実質的に伸展し、幾つかの細胞は紡錘形ま たは針状にまでなっていた。幾つかの領域において、水晶体包下に留まった細胞 も伸展して列をなしていた。これらの領域は、上皮様細胞の島の間に広がる傾向 があった。培養３日目までに、ＴＧＦβで処理した外植片は大部分、伸展した細 胞からなるようになっており、そして、水晶体包下において、外植片の周縁領域 と中心領域との間の相違は検出可能となった。周縁部は、多層の、列をなした伸 展細胞がよく集まっていたが、一方で、中心領域の細胞は裸の水晶体包の網状配 列顕在（exposing）領域内に存在した。 これらの外植条件下にＴＧＦβと共に培養された全ての外植片において、水晶 体包にしわが寄ったことが記録された。これらのしわは、網状配列を有し、最初 は外植片の中央領域内に位置していた。これらのしわは、培養２日目に最も明瞭 となり、一般的には５日間の培養期の残りの間により目立たなくなった。 細胞損失も、ＴＧＦβに晒された外植片の主特徴であると思われた。水晶体包 の裸の斑は最初に培養３日目の外植片の中心領域で検出され、そしてラミニン上 に拡散していた細胞内に凝集核が容易に認められた。次いで、細胞数が激減し、 培養５日目までに細胞の過半数が外植片から失われた。残りの細胞は培養３日目 に最初に観察された網状配列を保持していた。成熟ラット由来水晶体外植片：標準方法 位相差顕微鏡観察およびＳＥＭ これらの実験において位相差顕微鏡観察により観察された形態学的変化は、ラ ミニン上で培養した２１日齢ラット由来外植片について報告した変化と本質的に 類似していたが、これらの培養条件下では水晶体包から遊走して離れた細胞はな かった。培養期を通じてＴＧＦβ処理外植片とＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植片との 間には明瞭な相違はなかった。培養初日の間、ＴＧＦβと共に培養された外植片 は、対照の特質である栗石のような外観を保持していたが、培養２日目までに多 数の細胞が伸展していた。水晶体包の裸の斑が培養３日目に検出され、これらは 培養期の間に急激に増加した。 後者の知見は培養５日目のＳＥＭにより確認されが、このＳＥＭも、ＴＧＦβ と共に５日間に亘って培養した外植片内に留まった細胞の形態が変化し得ること を明らかにした。しばしば細胞が網目状配列で存在していたが、この配列は、そ の多くが上皮様細胞である細胞のモザイクから主としてなるように見えた。他の 領域においては多くの細胞が伸展し、明確に紡錘形または針状であった。また、 これらの領域の幾つかにおいて、細胞表面が細かな泡状突起で覆われていた。よ り多くの細胞が生存する傾向のあった外植片周縁部では、細胞はしばしば、多層 の滑面紡錘形細胞であるか、あるいはアポプトシスによる細胞死が進行中の細胞 において典型的である明瞭な表面の泡状突起（Wylie et al.，1980; Williams e t al.，1992）を有するより丸い細胞であるか、そのどちらかとして存在した。 ＦＧＦ処理外植片において多くの細胞は上皮細胞の形態を保持していたが、周 縁部では幾つかの細胞が初期繊維分化の特質である僅かな伸展（Lovicu and McA voy，1992）を示した。対照は培養期を通じて単層の上皮細胞として留まった。免疫組織化学的位置決定研究 上述したラミニンまたはＨＳＰＧ反応性のポケットは、処理に関わらず培養期 の終わりに試験した成熟ラット由来外植片内には検出されなかった。β−クリス タリンに対する反応性は、対照外植片とＦＧＦ処理外植片に亘って散在した幾つ かの細胞内に検出された。ＴＧＦβ処理外植片およびＴＧＦβ/ＦＧＦ処理外植 片の双方で、５日間の培養を生き抜いた細胞の集塊もβ−クリスタリンに関して 蛍光した細胞を幾つか含んでいた。どの外植片からもγ−クリスタリンは全く検 出されなかった。従って、５日間の培養期の間に何らかのもの（creatments）が ＥＣＭ産生または繊維特異的クリスタリン蓄積を刺激したという証拠はない。まとめ ＴＧＦβは、外植片内の細胞に、ＦＧＦが誘導する繊維分化とは区別され得る 特徴を有する、広範かつ急速な伸展の進行を誘導した。また、ＴＧＦβは、細胞 外マトリックスの蓄積、水晶体包にしわを寄せること、アポプトシスによる細胞 死および細胞の明確な配列をも誘導した。ＴＧＦβにより誘導されるこれらの反 応は、種々のタイプの白内障の形成中に生じることが報告された変化の特質であ る(Novonty and Pau，1984; Eshagian，1982; Eshagian and Streeten，1980; G reen and McDonnell，1985)。１０日齢ラット由来の標準方法による外植片はＦ ＧＦの存在下のみでＴＧＦβに反応した。成熟ラットまたは２１日齢ラットに由 来しラミニン基層上で培養した比較用の外植片は、ＦＧＦが存在しても存在しな くてもＴＧＦβに対して容易に反応した。実施例 ２ ＴＧＦβにより誘導される白内障様変化を阻害するためにＴＧＦβに対する抗 体を用いた外植片研究の詳細な記載。方法 ２１日齢ラットから水晶体上皮外植片（培養皿当たり２つ）を調製し、別記の 通りトリミングして周縁部を除去した（実施例１、標準方法参照）。使用前に、 外植片を５％二酸化炭素／空気中、３７℃で約３時間、培養培地中で予備インキ ュベーションした。 ＴＧＦβに対する広範特異性（pan-specific）ポリクローナル抗体（ウサギＩ ｇＧ：British Bio-technology，Abingdon，UK; Cat．No．BDA 47）を使用した 。これは、ＴＧＦβ１、β１.２、β２、β３およびβ５に対して中立である。 このＩｇＧおよび非免疫ウサギＩｇＧを滅菌リン酸緩衝食塩水中で再構成して３ ｍｇ ＩｇＧ/ｍｌの濃度とした。 ＴＧＦβ２（Genzyme，Cambridge，MA）を滅菌培地で０.２５ｎｇ/１０μｌの 濃度まで希釈した。滅菌条件下に、３３μｌの免疫または非免疫のＩｇＧ溶液を ２０μｌのＴＧＦβ２貯蔵溶液および４７μｌの培地と混合し、５％二酸化炭素 ／空気中、３７℃で３０分間インキュベーションした後、培地を用いて２ｍｌに 希釈した。予備インキュベーション培地を２つの培養皿から取り除き、それぞれ に１ｍｌのＴＧＦβ−ＩｇＧ混合液を添加した。全ての外植片を、位相差顕微鏡 観察により毎日モニターしながら５日間培養した。非免疫ＩｇＧと共に培養した 外植片を、ＩｇＧ自体がＴＧＦβ活性に与える何らかの影響を見るための対照と して供した。 図１は、ＴＧＦβ２と非免疫ＩｇＧ（Ａ、Ｂ）、またはＴＧＦβと抗ＴＧＦβ ＩｇＧ（Ｃ、Ｄ）と共に培養した、２１日齢ラット由来水晶体上皮外植片の位相 差顕微鏡像を示している。外植片は培養３日目（Ａ、Ｃ）および５日目（Ｂ、Ｄ ）に撮影された。ＴＧＦβは細胞の広範な伸展を誘導し（Ａ、矢印）、続いて多 くの細胞が、しわの寄った水晶体包の顕在領域が失われる（Ｂ、矢印）。抗ＴＧ Ｆβはこれらの変化を完全にブロックし、そして上皮細胞は密接して詰められた 栗石配列内に残る（Ｃ、Ｄ）。ＴＧＦβとＩｇＧの最終濃度はそれぞれ０.２５ ｎｇ/ｍｌおよび５０μｇ/ｍｌであった。結果 非免疫ＩｇＧの存在下に、ＴＧＦβは培養２〜３日以内に生じた素早い伸展を 誘導し（図１Ａ）、そして培養５日目までに、細胞が下層の水晶体包にしわの寄 った外植片から失われていた。これらの変化は、ＩｇＧの不存在下にＴＧＦβと 共に培養した外植片について実施例１において詳細に記述した変化の典型的なも のである。 抗ＴＧＦβの存在下ではこれらの変化は完全にブロックされた。５日間の培養 期を通じて、外植片はその生来の上皮様形態を保持し（図１Ｃ、Ｄ）、そして培 地だけで培養された外植片と区別可能であった。実施例 ３ ＴＧＦβにより誘導される白内障様変化を阻害するために房水および硝子体と を用いた外植片研究の詳細な記述。方法 房水と硝子体とを、下記の通りにして、屠殺された直後の２〜３歳のウシの眼 から得た。眼を除去した直後に、２３ゲージの針を付けた滅菌シリンジを用いて （約１.５ｍｌの）房水を収集し、水晶体への通路を得るために角膜の周りを切 開した。慎重に、付着した虹彩を除去した後、水晶体を持ち上げて取り去り、水 晶体に近接した硝子体（主に硝子体液である）を、針を付けないシリンジを用い て網膜の混入を避けるように注意しながら（２〜３ｍｌ）収集した。全ての手順 は動物の死から約１時間以内に完了した。試料を氷詰めにして研究室に持ち帰り 、可能な限り素早く使用した。 既述の通りにして水晶体上皮外植片を２１日齢ラットから調製した(実施例１ 、標準方法参照)。房水または硝子体の試料を等量の（実施例１で定義した）滅 菌培養培地を用いて希釈したが、このとき混合液を２３ゲージ針に繰り返し通し て完全に混合させた。使用前にこれらの混合液を５％二酸化炭素／空気中、３７ ℃で３０分間かけて平衡させた。２５ｐｇ/１０μｌまたは１００ｐｇ/１０μｌ のＴＧＦβ（Genzyme，Cambridge，MA）を滅菌培地内に含有する貯蔵溶液を調製 した。次いで、外植片の入った培養皿内の培地を、１ｍｌの培地、希釈房水また は希釈硝子体のどれかにＴＧＦβを添加しなかった培地または２種類のＴＧＦβ のどちらかを添加した培地のいずれかと交換することにより、表１に示すとおり 、９つの処理グループを設定した。外植片を培養し、そして位相差顕微鏡観察に より白内障様変化についてモニターした。特に、それぞれの外植片を、ＴＧＦβ と共に培養した外植片において特徴的に観察された、紡錘様伸展および細胞死の 程度に従い区分した(実施例１および２参照)。外植片を培養４日目に撮影した。結果 培養初日には、どの処理においても有意な変化は観察されず、外植片は典型的 な上皮細胞形態を保っていた。培地だけで培養された外植片は培養期を通じて変 化しなかった。培養の進行に伴い、ＴＧＦβと共に培養された外植片は典型的な 白内障様変化を示し、１００ｐｇ/ｍｌにおいて２５ｐｇ/ｍｌよりも多い細胞死 を伴っていた（表１）。房水は、２５ｐｇ/ｍｌのＴＧＦβの効果を事実上完全 に阻害し、１００ｐｇ/ｍｌの効果を部分的に阻害した。（ＴＧＦβが共存して もしなくても、房水は水晶体包を幾らか縮ませた。）硝子体と共に培養した外植 片は、 ＴＧＦβが共存してもしなくても、初期繊維分化の典型的な変化（Schultz et a l.，1993参照）を示したが、白内障様変化の証拠はなく、従って、硝子体はＴＧ Ｆβにより誘導される白内障様変化を完全に阻害した。 上表に示した通り、外植片を、培地と共にあるいは房水または硝子体と共に、 ＴＧＦβを添加してまたは添加せずに、培養した。それぞれの処理当たり４つの 外植片を供した。表中のコードは次のことを表している。「−」は極僅かな変化 を表し、「＋〜＋＋＋＋」は紡錘様伸展の程度を示し、「｜〜｜｜｜｜」は細胞損失 の程度を示し、「○」は細胞損失のために伸展評価が無効になったことを表し、そ して「ｆｄ」は白内障様変化を伴わない初期繊維分化の典型的な変化を表す。意義 本研究は、眼の水晶体を取り囲む房水および硝子体が、ＴＧＦβにより水晶体 細胞内に誘導される白内障様変化を阻害する分子を含有することを示している。 この効果は、房水および硝子体内に存在すると報告されている数種類の異なる阻 害性分子の１種またはそれ以上の存在によるものであろうが、そのような阻害性 分子は、例えば、α₂−マクログロブリンのような血清蛋白質、デコリンまたは ヘパラン硫酸プロテオグリカン等のプロテオグリカン、またはＦＧＦのような他 のペプチド「成長因子」である。これらの分子は全てＴＧＦβと結合すること、 および／またはＴＧＦβ活性を阻害することが報告されている（LaMarre et al. ，1991; Yamaguchi et al.，1992; McCaffrey et al.，1992; Hales et al.，印 刷中）。α₂−マクログロブリンは角膜で合成され(Twining et al.，1994)、そ して房水内に存在する(Ando et al.，1993)。これは恐らく、房水および硝子体 内に見出された他の血清蛋白質と同様にして、これらの媒質内に入るのであろう （例えば、Beebe et al.，1986参照）。デコリンが、硝子体網膜症において、水 晶体近傍に存在することが示されている(Hagedorn et al.，1993)。ヘパラン硫 酸は硝子体内に存在し、恐らくは細胞外マトリックスのプロテオグリカン類と会 合している(Kamei et al.，1992)。ＦＧＦは、硝子体内に存在し、かつそれより もかなり少ない量が房水内に存在すること(Schulz et al.，1993)、ならびに水 晶体外植片においてＴＧＦβが誘導する紡錘細胞形態の形成を抑制すること（Ha les et al.，印刷中）が報告されている。ＴＧＦβと結合することおよび／また はＴＧＦβ活性を阻害することが知られているその他の分子は、ビグリカン（Ya maguchi et al.，1990）、ラミニンおよびコラーゲン（Paralkar et al.，1991 ）を包含するが、そのような分子は房水および／または硝子体の観察された阻害 効果に寄与している可能性がある。実施例 ４ ＴＧＦβにより誘導される白内障様変化を阻害するためにα₂−マクログロブ リンを用いた外植片研究の詳細な記述。方法 ウシ血漿から調製されたα₂−マクログロブリンをボーリンガーマンハイムオ ーストラリア（Boehringer Mannheim Australia，Castle Hill，Nsw; #602 442 ）から入手した。（培養皿当たり２つの）水晶体上皮外植片を、既述の通り、２ １日齢ラットから調製した（実施例１、標準方法参照）。α₂−マクログロブリ ンを（実施例１で定義した）培養培地に溶解し、最終濃度を４００μｇ/ｍｌと したこの溶液を０.２２μｍのフィルターに通して滅菌した後小分けして、それ ぞれを等量の滅菌培地で希釈した。これらの溶液を、使用前に５％二酸化炭素／ 空気中、３７℃で平衡させた。滅菌培地中に２５ｐｇ/１０μｌのＴＧＦβ（Gen zyme，Cambridge，MA）を含有する貯蔵溶液を調製した。次いで、外植片の入っ た培養皿内の培地を、１ｍｌの培地あるいは２００または４００μｇ/ｍｌのα₂ −マクログロブリンを含有する１ｍｌの培地に、ＴＧＦβを添加した培地または 添加しなかった培地のいずれかと交換することにより、表２に示すとおり、６つ の処理グループを設定した。外植片を培養し、そして位相差顕微鏡観察により白 内障様変化についてモニターした。特に、それぞれの外植片を、ＴＧＦβと共に 培養した外植片において特徴的に観察された紡錘様伸展および細胞死の程度に従 い区分した（実施例１および２参照）。外植片を培養３〜５日目に撮影した。 上表に示した通り、外植片を、α₂−マクログロブリン（α₂−ＭＧ）および／ またはＴＧＦβを添加したまたは添加しなかった培地と共に培養した。それぞれ の処理当たり４つの外植片を供した。表中のコードは次のことを表している。「 −」は極僅かな変化または上皮細胞形態に優勢に戻ったことを表し、「＋〜＋＋ ＋＋」は紡錘様伸展の程度を示し、「｜〜｜｜｜｜」は細胞損失の程度を示し、 「○」は細胞損失のために伸展評価が無効になったことを表す。結果 培地だけと共に、またはα₂−マクログロブリンを含有する培地と共に培養し た外植片において、有意な変化は観察されなかった。外植片は、培養期を通じて 典型的な上皮細胞形態を保持した。培養２〜５日目に、ＴＧＦβと共に培養した 外植片は典型的な白内障様変化を示した（表２参照）。このＴＧＦβにより誘導 された変化は培地中へのα₂−マクログロブリンの包含により実質的に阻害され た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． １種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤の有効量を投与することを包含する 、哺乳類被験者の眼における白内障または白内障様障害を予防または制御する方 法。 ２． 前記１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤が蛋白質、糖蛋白質およびプロ テオグリカンから選択される、請求項１に記載の方法。 ３． 前記蛋白質ＴＧＦβ阻害剤が抗体およびペプチド成長因子から選択される 、請求項２に記載の方法。 ４． 前記糖蛋白質ＴＧＦβ阻害剤がα₂−マクログロブリン、ラミニンおよび コラーゲンから選択される、請求項２に記載の方法。 ５． 前記プロテオグリカンＴＧＦβ阻害剤がデコリン、ヘパラン硫酸プロテオ グリカンおよびビグリカンから選択される、請求項２に記載の方法。 ６． 医薬学的に許容され得る担体中に１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤を 包む、眼科製剤。 ７． 前記ＴＧＦβ阻害剤が請求項２〜５のいずれかに記載のものである、請求 項６に記載の眼科製剤。 ８． 被験者の眼の中に１種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤で被覆された水晶 体を移植することを包含する、水晶体移植手術後の被験者の眼における「続発性 白内障」形成を予防または制御する方法。 ９． 前記ＴＧＦβ阻害剤が請求項２〜５のいずれかに記載のものである、請求 項８に記載の方法。 １０． １種またはそれ以上のＴＧＦβ阻害剤で被覆された水晶体移植片。 １１． 請求項２〜５のいずれかに記載のＴＧＦβ阻害剤で被覆された、請求項 １０に記載の水晶体移植片。 １２． 白内障または白内障様障害を予防または制御するための眼科製剤の製造 におけるＴＧＦβ阻害剤の使用。 １３． 前記ＴＧＦβ阻害剤が請求項２〜５のいずれかに記載のものである、請 求項１２に記載の使用。