DE69228700T2

DE69228700T2 - Verwendung von Decorin oder Biglycan zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Diabetes-bedingter Zustände

Info

Publication number: DE69228700T2
Application number: DE69228700T
Authority: DE
Inventors: Wayne Border; Erkki Ruoslahti
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1999-09-09
Anticipated expiration: 2012-12-05
Also published as: AU3242993A; CA2124591A1; JP3854307B2; JPH07504650A; WO1993010808A1; AU7051896A; FI942622A; EP0616536A1; FI942622A0; AU670770B2; NO942072L; JP2004043507A; EP0616536B1; DK0616536T3; NO942072D0; DE69228700D1; ATE177644T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Verschiedene Erkrankungen sind durch eine schädliche Akkumulation extrazellulärer Matrixmaterialien gekennzeichnet. Beispielsweise akkumuliert bei progressiver glomerulärer Erkrankung extrazelluläre Matrix in dem Mesangium oder entlang der Glomerulum-Basalmembran, wodurch gegebenenfalls eine terminale oder Endstadium-Erkrankung und Urämie verursacht werden. In ähnlicher Weise umfaßt das "adult respiratory distress syndrome" oder "acute respiratory distress syndrome" (ARDS) die Akkumulation von Matrixmaterialien in der Lunge, wohingegen Leberzirrhose durch eine schädliche Matrixakkumulation gekennzeichnet ist, die durch Narbenbildung in der Leber nachgewiesen wird.
Diabetes ist jetzt die häufigste Ursache von fortschreitendem Nierenversagen und führt auch zu Beschwerden oder Leiden, die durch die schädliche Akkumulation von extrazellulären Matrixkomponenten gekennzeichnet sind. Die Einführung von Insulin revolutionierte die Behandlung von Diabetes und verlängerte die Überlebensdauer der Patienten dramatisch. Jedoch ist Insulin nicht wirksam gewesen, derartige schwerwiegende Komplikationen, wie diabetische Nephropathie, zu verhindern. Obwohl eine strenge Kontrolle der Blut-Glukose, eine Behandlung von Bluthochdruck und eine Einschränkung von Protein aus der Nahrung die Geschwindigkeit verringern können, mit der Nierenfunktion verlorengeht, erfolgt eine stetige Weiterentwicklung zu einer terminalen oder Endstadium-Erkrankung.
Das zentrale pathologische Merkmal diabetischer Nephropathie ist eine Akkumulation extrazellulärer Matrix innerhalb der Glomeruli. Die Faktoren in dem diabetischen Milieu, die für eine Akkumulation extrazellulärer Matrix verantwortlich sind, werden nur in geringem Umfang verstanden.
Extrazelluläre Matrix ist eine Mischung von Proteoglykanen, Glykoproteinen und Kollagenen, die innerhalb einer komplexen Überstruktur angeordnet sind. Obwohl eine Vielzahl immunologischer, hämodynamischer und toxischer Faktoren experimentell eingesetzt worden sind, um eine glomeruläre Erkrankung zu induzieren, wurde nicht nachgewiesen, daß einer dieser Faktoren die Synthese oder den Abbau extrazellulärer Matrixkomponenten direkt beeinflussen würde. Folglich scheint es wahrscheinlich, daß es einen anderen vermittelnden Prozeß zwischen akuter Zellschädigung und dem Aufbau glomerulärer extrazellulärer Matrix gibt.
Folglich besteht ein Bedürfnis, die Faktoren zu ermitteln, die eine schädliche Akkumulation von Matrixkomponenten bei pathologischen Zuständen, wie einer Nierenerkrankung, regulieren. Ferner besteht ein Bedürfnis, solche Faktoren zu kontrollieren, um pathogene Zustände, die eine unpassende Matrixakkumulation umfassen, zu verhindern, zu beschränken oder zu behandeln. Die Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt gleichzeitig damit in Beziehung stehende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Decorin oder Biglycan zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung einer Erkrankung, die durch eine Akkumulation von extrazellulärer Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet ist, wobei die Erkrankung eine Diabetes-assoziierte Erkrankung ist. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Erkrankung diabetische Nephropathie.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Insulin und Decorin oder Biglycan zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von diabetischer Nephropathie. Die Erfindung ist ferner auf eine Zusammensetzung, die Insulin und Decorin oder Biglycan umfaßt, gerichtet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines Northern-Blotting von aus Ratten-Glomeruli isolierter mRNA, hybridisiert mit einer cDNA- Sonde für (A) TGF-β1, (B) Biglycan und (C) Glyceraldehyd-3-dehydrogenase (GAPDH), einem Enzym, das konstitutiv in den Ratten- Glomeruli exprimiert wird. mRNA wurde hergestellt aus Glomeruli, die aus Kontrollratten (C), Kontrollratten, die mit Insulin behandelt wurden (CI), diabetischen Ratten (D) und diabetischen Ratten, die mit Insulin behandelt wurden (DI), 15 Wochen nach der Induktion von Diabetes isoliert worden waren. Links sind Molekulargewichtsmarker gezeigt.
Fig. 2 zeigt die Quantifizierung einer alternativ gespleißten Form von Fibronektin, Fibronektin EDA+ (Fig. 2A), und Tenascin (Fig. 2B) in Glomeruli von Kontroll- und diabetischen Ratten. Das Sternchen bezeichnet p < 0,01 für diabetische Ratten (D) und diabetische Ratten, die mit Insulin behandelt wurden (DI), im Vergleich zu normalen Kontrollen (C) zum gleichen Zeitpunkt. Normale Kontrollratten, die mit Insulin behandelt wurden (CI), sind zu Vergleichszwecken aufgenommen. Nicht mit Insulin behandelte diabetische Tiere lebten nicht länger als 37 Wochen und fehlen folglich bei den Daten aus Woche 40. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.
Fig. 3 zeigt Immunfluoreszenzmikrographien von Glomeruli, die mit anti-TGF-β1-Antikörper angefärbt worden sind. (A) Anfärbung eines Glomerulus einer normalen Kontrollratte. (B) Eine Anfärbung eines Glomerulus aus einer diabetischen Ratte, die nicht mit Insulin behandelt wurde, 15 Wochen nach Induktion von Diabetes zeigt eine auffallende Zunahme der Anzahl TGF-β1-positiver Zellen. Die positiven Zellen wurden als glomeruläre Mesangial- und Epithelzellen identifiziert. Bei den diabetischen Glomeruli gab es signifikant mehr positive Zellen pro Glomerulus, *32 ± 1 gegenüber 25 ± 1 (Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung, *p < 0,01) verglichen mit Glomeruli aus den Kontrollratten. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit gleichen Belichtungszeiten von 60 Sekunden aufgenommen. Vergrößerung · 500.
Fig. 4 zeigt Immunfluoreszenzmikrographien von Glomeruli, die mit anti-Fibronektin EDA&spplus;-Antikörper angefärbt worden sind. (A) Ein Glomerulus einer normalen Kontrollratte, die mit Insulin 40 Wochen lang behandelt worden ist, zeigt eine schwache Anfärbung. (B) Eine Anfärbung eines Glomerulus aus einer Ratte mit Diabetes, die 40 Wochen lang mit Insulin behandelt worden ist, zeigt eine bedeutende Zunahme an Anfärbung. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit gleichen Belichtungszeiten von 60 Sekunden aufgenommen. Vergrößerung · 500.
Fig. 5 zeigt die Immunfluoreszenz von menschlichen Glomeruli, die mit anti-TGF-β1-Antikörper angefärbt worden sind. (A) Schwache Anfärbung eines Glomerulus aus einer normalen Niere und (B) aus der Niere eines Patienten mit "Minimal-Change"-Erkrankung ("minimal change"-Glomerulonephritis). (C und D) Glomeruli aus zwei Patienten mit schwerwiegender Matrixakkumulation, die für fortgeschrittene diabetische Glomerulosklerose charakteristisch ist, zeigen eine starke Anfärbung von immunreaktivem TGF-β1- Protein. In einem anderen Fall von früher diabetischer Nephropathie mit weniger Matrixakkumulation lag das Anfärbungsmuster in der Mitte zwischen jenem, das bei diesen Fällen von fortgeschrittener humaner Erkrankung festgestellt wird, und jenem, das bei den diabetischen Ratten zum Zeitpunkt 15 Wochen, die in Fig. 3B gezeigt sind, festgestellt wird, was nahelegt, daß das Muster der TGF-β1-Anfärbung kontinuierlich der Erkankungsschwere folgt, wobei anfänglich eine klare zelluläre Anfärbung festgestellt wird und diese später in einem solchen Ausmaß zunimmt, daß die zelluläre Anfärbung verdeckt wird. (D) Diese Mikrographie zeigt auch eine Anfärbung in der epithelialen (Bowman) Kapsel, die den Glomerulus umgibt. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit gleichen Belichtungszeiten von 60 Sekunden aufgenommen. Vergrößerung · 500.
Fig. 6 zeigt eine Immunfluoreszenz von menschlichen Glomeruli, die mit anti-Fibronektin EDA&spplus;-Antikörper angefärbt worden waren. (A) Ein Glomerulus aus einer normalen Niere und (B) aus einem Patienten mit "Minimal-Change"-Erkrankung ("Minimal-Change"- Glomerulonephritis) werden kaum angefärbt. (C und D) Im Gegensatz dazu zeigen zwei Patienten mit diabetischer Glomerulosklerose eine starke Anfärbung innerhalb der abnormalen Glomeruli und den umgebenden (Bowman) Kapseln. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit gleichen Belichtungszeiten von 60 Sekunden aufgenommen.
Fig. 7 zeigt die Neutralisierung der Aktivität von TGF-β1, 2 und 3 durch rekombinantes humanes Decorin. Ein Nerzlungenzellassay, der die Wachstumsinhibition mißt, wurde verwendet, um die Fähigkeit von rekombinantem Decorin zur Neutralisierung der Aktivität der TGF-β-Isoformen zu untersuchen. Der [³H]-Thymidin- Einbau wurde in Gegenwart von TGF-β und zunehmenden Konzentrationen von Decorin (0) oder Rinderserumalbumin (BSA oder RSA) ( ) bestimmt, wie von Yamaguchi et al., Nature 346: 281 (1990), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Die Daten stehen für die prozentuale Neutralisierung der TGF-β1-induzierten Wachstumsinhibition. Der [³H]-Thymidin- Einbau in Gegenwart von weder TGF-β noch Decorin ist als 100% definiert (125 000 cpm für TGF-β1 und TGF-β3; 107 000 cpm für TGF-β2). Der Einbau in Gegenwart von TGF-β, aber nicht Decorin ist als 0% definiert (57 000 cpm für TGF-β1; 78 000 cpm für TGF-β2; 59 000 cpm für TGF-β3). Jeder Punkt steht für den Mittelwert der Ergebnisse von Doppelproben.
Fig. 8 zeigt die Ablagerung von Fibronektin in Glomeruli von Decorin-behandelten Ratten mit Glomerulonephritis. (A) Quantifizierung der Fibronektin-Anfärbung in Glomeruli aus normalen Kontrollen, Kontrollratten mit Glomerulonephritis, die sechs Injektionen von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), Ovalbumin (OVA), Aggrecan (AGC) oder Rinderserumalbumin (BSA oder RSA) oder verschiedene Mengen an Decorin erhielten. Mit vier oder sechs Injektionen von Decorin behandelte Ratten wiesen signifikant weniger an in Glomeruli abgelagertem Fibronektin auf als die Kontrollen mit der Erkrankung oder Ratten, die keine oder zwei Injektionen von Decorin erhielten (p < 0,01). (B) Immunfluoreszenzmikrographien von Glomeruli aus Ratten mit Glomerulonephritis, angefärbt mit anti-Fibronektin-Antikörper. Die Ratten wurden ohne Injektionen von Decorin (ND) (d. h. PBS allein) oder mit Injektionen von Decorin für zwei Tage (2D), 4 Tage (4D) oder 6 Tage (6D) behandelt. Der maximale Standardfehler des Mittelwerts für glomeruläre Scores bei jedem Tier betrug 0,16, was geringe interglomeruläre Variabilität anzeigt. Matrix- Scores der gezeigten Glomeruli sind: ND, 3,5; 2D, 3,5; 4D, 2,0; 5D, 2,0. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit Belichtungszeiten von 40 Sekunden aufgenommen. Vergrößerung · 500.
Fig. 9 zeigt die Ablagerung von EDA&spplus;-Fibronektin und Tenascin in Glomeruli von Decorin-behandelten Ratten mit Glomerulonephritis. (A) Quantifizierung der EDA&spplus;-Fibronektin-Anfärbung in Glomeruli. Die Symbole sind, wie bei Fig. 8A beschrieben. Ratten, die vier oder sechs Injektionen von Decorin erhielten, waren signifikant vor der Ablagerung von EDA&spplus;-Fibronektin im Vergleich zu allen anderen glomerulonephritischen Gruppen geschützt (p < 0,01). (B) Immunfluoreszenzmikrographien von Glomeruli aus Ratten mit Glomerulonephritis, die mit anti-EDA-Fibronektin- Antikörper angefärbt worden sind. Symbole sind, wie bei Fig. 8B beschrieben. Der maximale Standardfehler des Mittelwerts für glomeruläre Scores bei jedem Tier betrug 0,11, was eine geringe interglomeruläre Variabilität anzeigt. Matrix-Scores der gezeigten Glomeruli sind: ND, 4,0; 2D, 3,5; 4D, 1,0; 6D, 1,5. Die Photographien wurden unter identischen Bedingungen mit Belichtungszeiten von 60 Sekunden aufgenommen. Vergrößerung · 500. Immunfluoreszenzmikrographien von Glomeruli aus Ratten mit Glomerulonephritis, angefärbt mit anti-Tenascin-Antikörper, wurden ebenfalls erhalten. Ratten wurden mit vier oder sechs Injektionen von Decorin behandelt und hatten weniger Tenascin in den Glomeruli als Ratten, die ohne oder mit zwei Injektionen von Decorin behandelt worden waren. Sowohl EDA&spplus;-Fibronektin als auch Tenascin waren in nephritischen Glomeruli in Ratten, die ohne oder mit zwei Injektionen von Decorin behandelt worden waren, stark erhöht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Inhibition der Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten in einem Gewebe bereit, bei welchem das Gewebe mit einem Mittel, das die Aktivität des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) supprimiert, in Kontakt gebracht wird. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Behandeln von Erkrankungen, die durch eine Akkumulation extrazellulärer Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet sind, bereit, bei welchem das Gewebe mit einer wirksamen Menge eines Mittels, das die extrazelluläre Matrix-produzierende Aktivität von TGF-β supprimiert, in Kontakt gebracht wird. Gemäß der Erfindung ist die Erkrankung eine Diabetes-assoziierte Erkrankung, insbesondere diabetische Nephropathie, und das Mittel ist Decorin oder Biglycan.
Das Mittel kann Decorin, ein Analog davon oder dessen funktionales Äquivalent sein. Wie hier verwendet; bezieht sich "Decorin" auf ein Proteoglykan, das im wesentlichen die strukturellen Charakteristika aufweist, die diesem in Krusius und Ruoslahti, PNAS (USA 83: 7638 (1986) zugeschrieben werden. Decorin aus menschlichen Fibroblasten hat im wesentlichen die Aminosäuresequenz, die in Krusius und Ruoslahti, a. a. O., angegeben ist. "Decorin" bezieht sich sowohl auf die native Zusammensetzung als auch auf Modifikationen davon, die im wesentlichen die funktionalen Eigenschaften bewahren, wie auf Decorin-Fragmente. Decorin-Core-Protein bezieht sich auf Decorin, das nicht länger substantiell mit Glykosaminoglykan substituiert ist, und ist in der Definition von Decorin enthalten. Decorin kann Glykosamino glykan-frei durch enzymatische Behandlung, Mutation oder andere Mittel, wie durch Herstellen von rekombinantem Decorin in Zellen, die nicht in der Lage sind, Glykosaminoglykanketten an ein Core-Protein anzuknüpfen, gemacht werden.
Funktionale Äquivalente von Decorin umfassen Modifikationen von Decorin, die dessen funktionale Eigenschaften bewahren, und Moleküle, die zu Decorin homolog sind, wie beispielsweise Biglycan und Fibromodulin, die die gleiche funktionale Aktivität wie Decorin aufweisen. Modifikationen können beispielsweise die Hinzufügung von einer oder mehreren Seitenketten, die mit der funktionalen Aktivität des Decorin-Core-Proteins nicht interferieren, umfassen.
Diese Erfindung soll zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten Mitteln die Verwendung von Homologen und Analogen solcher Mittel umfassen. In diesem Zusammenhang sind Homologe Moleküle, die substantielle strukturelle Ähnlichkeiten zu den vorstehend beschriebenen Mitteln aufweisen, und sind Analoge Moleküle mit substantiellen biologischen Ähnlichkeiten unabhängig von strukturellen Ähnlichkeiten.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht bestimmen, ob ein funktionales Äquivalent, Homolog oder Analog für den Zweck dieser Erfindung tauglich ist, indem er dieses als Ersatzmittel in den hier angegebenen Beispielen verwendet.
Das In-Kontakt-Bringen kann in vitro oder in vivo ausgeführt werden. Wenn das In-Kontakt-Bringen in vitro erfolgt, können die Zellen mit einer wirksamen Menge des Mittels inkubiert werden. Wenn das In-Kontakt-Bringen in vivo erfolgt, kann das Mittel allein oder mit einem Träger verabreicht werden. Verabreichungsmethoden sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und umfassen eine intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Das Mittel kann kontinuierlich oder mit Unterbrechungen verabreicht werden.
Eine wirksame Menge wird abhängig von der Erkrankung und dem zu behandelnden Patienten variieren. Die Verfahren dieser Erfindung sind zum Behandeln oder Schützen von Säugetieren, am meisten bevorzugt Menschen, nützlich.
Decorin und Biglycan können zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung von Diabetes-assoziierten Erkrankungen, wie einer diabetischen Nierenerkrankung, verwendet werden.
Jedoch sind diese Erkrankungen lediglich repräsentativ und ein Fachmann auf diesem Gebiet erkennt leicht, daß das Verfahren bei jeder Diabetes-assoziierten Erkrankung nützlich ist, die durch eine Akkumulation extrazellulärer Matrix gekennzeichnet ist.
Vor der Erfindung war es unbekannt, daß eine Diabetes-assoziierte Erkrankung durch eine TGF-β-induzierte Akkumulation extrazellulärer Matrix in dem Gewebe verursacht wird.
WO 91/04748 offenbart eine Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Akkumulation extrazellulärer Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet sind. Die Erkrankungen können jedoch ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Glomerulonephritis, "adult respiratory distress syndrome", Leberzirrhose, fibrotischem Krebs, Lungenfibrose, Arteriosklerose, Postmyokardinfarkt, kardialer Fibrose, Postangioplastierestenose, renaler interstitieller Fibrose und Narbenbildung.
Border et al., Nature 346 (1990), 371-374, offenbaren eine Suppression experimenteller Glomerulonephritis durch Antiserum gegen TGF-β1.
Jedoch war im Stand der Technik weder offenbart noch durch diesen nahegelegt, daß eine Diabetes-assoziierte Erkrankung behandelt werden könnte, indem das Gewebe mit einem Arzneimittel, das Decorin oder Biglycan enthält, oder mit einer Zusammensetzung, die Insulin und Decorin oder Biglycan umfaßt, in Kontakt gebracht wird.
Bezüglich einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren ist eine Rolle bei der Produktion extrazellulärer Matrix vermutet worden. Jedoch ist deren Einfluß auf die pathologische Akkumulation von Matrixkomponenten unklar gewesen. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Gewebe, die zu einer pathologischen Akkumulation von Matrix neigen, bestimmte Proteoglykane synthetisieren. Mittel, die die TGF-β-Aktivität inhibieren, wie gegenüber TGF-β1- reaktive Antikörper, blockieren den stimulatorischen Effekt von TGF-β auf die Proteoglykanproduktion. In dieser Hinsicht ist TGF-β einzigartig unter den untersuchten Wachstumsfaktoren, und folglich ist die Manipulation dieses speziellen Effekts von TGF- β nützlich bei der Kontrolle oder Behandlung der unpassenden und nicht wünschenswerten Akkumulation von Matrixkomponenten bei verschiedenen Erkrankungen.
TGF-β ist ein multifunktionales Zytokin, das eine wichtige Rolle bei der Regulation von Reparatur und Regeneration nach Gewebeschädigungen spielt. Drei Isoformen von TGF-β, TGF-β1, 2 und 3, werden in Säugetieren exprimiert und zeigen gegenwärtig in vitro ähnliche Eigenschaften. Plättchen enthalten hohe Konzentrationen an TGF-β und setzen bei einer Degranulation an einer Schädigungsstelle TGF-β in das umgebende Gewebe frei. TGF-β initiiert dann eine Sequenz von Ereignissen, die die Heilung fördert, einschließlich (1) Chemoattraktion von Monozyten, Neutrophilen und Fibroblasten, (2) Autoinduktion der TGF-β-Produktion und Stimulierung von Monozyten zur Sekretion von Interleukin-1 (IL- 1), Tumornekrosefaktor und anderen Zytokinen, (3) Induktion von Angiogenese und Zellproliferation, (4) Kontrolle von Entzündung und Zelltoxizität, indem es als wirkungsvolles Immunsuppressionsmittel und als Inhibitor der Peroxidfreisetzung wirkt, und (5) verstärkte Ablagerung von extrazellulärer Matrix.
Die Wirkung von TGF-β auf extrazelluläre Matrix ist ein Schlüsselmerkmal seiner funktionalen Aktivitäten. TGF-β stimuliert die Synthese von individuellen Matrixkomponenten, wie Fibronektin, Kollagenen und Proteoglykanen, und blockiert gleichzeitig den Matrixabbau durch Verringerung der Synthese von Proteasen und Erhöhung der Konzentrationen an Proteaseinhibitoren, wie in Edwards et al., EMBO 6: 1899 (1987) und Laiho et al., J. Biol. Chem. 262: 17467 (1987) beschrieben wurde. TGF-β erhöht auch die Expression von Integrinen und verändert deren relative Anteile auf der Oberfläche von Zellen auf eine Weise, die die Adhäsion an Matrix vereinfachen könnte, wie in Ignotz & Massague, Cell 51: 189 (1987) beschrieben wurde.
Die reife Form von TGF-β umfaßt zwei identische Ketten von jeweils 112 Aminosäuren. TGF-β ist für die verstärkte Synthese extrazellulärer Matrix, die bei verschiedenen Erkrankungen beobachtet wird, verantwortlich. Die Aminosäuresequenz von TGF-β ist, wie folgt:
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser.
Spezielle Nierenerkrankungen sind durch eine verstärkte Akkumulation extrazellulärer Matrixkomponenten gekennzeichnet. Beispielsweise sind Mesangialzellen einer der Zelltypen, die den Nierenglomerulus aufbauen. In dem normalen Glomerulus sind die Mesangialzellen von extrazellulärer Matrix umgeben. Eine Zunahme der Menge an mesangialer Matrix mit oder ohne mesangiale Hyperzellularität ist der früheste histologische Befund bei vielen Formen von Glomerulonephritis und bei diabetischer Nephropathie. Es ist bekannt, daß Mesangialzellen in Kultur mehrere Matrixkom ponenten einschließlich Proteoglykanen, Fibronektin, Laminin, Entactin, Thrombospondin und Kollagen Typ I, III, IV und V sezernieren. Jedoch sind die genaue Zusammensetzung und die supermolekulare Organisation der mesangialen Matrix wie auch die Faktoren, die deren Synthese, Aufbau und Abbau kontrollieren, unbekannt gewesen.
Um Faktoren zu untersuchen, die die Zusammensetzung der mesangialen Matrix steuern, wurden Mesangialzellen in Kultur mit IL- 1, PDGF, Tumornekrosefaktor (TNF) und TGF-β behandelt. Eine Analyse der Kulturmedien zeigte an, daß TGF-β die Menge von zwei Komponenten, die als die Proteoglykane Biglycan und Decorin identifiziert wurden, erhöhte. PDGF, IL-1 und TNF hatten im Vergleich zu der Kontrolle keine signifikante Wirkung.
Glomerulonephritis kann durch eine spezielle immunologische Schädigung der Mesangialzellen induziert werden. Aus Tieren mit einer Schädigung der Mesangialzellen isolierte Glomeruli zeigen eine Verstärkte Biglycan- und Decorin-Produktion. Darüber hinaus stimulieren konditionierte Medien von in Kultur gehaltenen nephritischen Glomeruli die Biglycan- und Decorin-Synthese durch normale Mesangialzellen.
Ein äquivalenter stimulatorischer Effekt kann durch die Zugabe von exogenem TGF-β erzeugt werden. Darüber hinaus blockieren Mittel, die die Wirkung von TGF-β blockieren, wie ein anti-TGF- β-Antiserum, den stimulatorischen Effekt von exogenem TGF-β. Solche Mittel, einschließlich monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, PDGF, Arg-Gly-Asp-enthaltenden Peptiden, Decorin oder dessen funktionalen Äquivalenten, können verwendet werden, um eine schädliche Synthese von Matrix-Proteoglykan spezifisch zu kontrollieren oder zu behandeln. Folglich können solche Mittel verwendet werden, um jedes beliebige Leiden, das mit einer Akkumulation extrazellulärer Matrix assoziiert ist, beispielsweise Narbenbildung, zu verhindern oder um Erkrankungen, die durch eine Akkumulation extrazellulärer Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet sind, zu behandeln, indem das Gewebe mit einem Mittel, das die TGF-β-Aktivität supprimiert, in Kontakt gebracht wird.
Die Wirkungen von Decorin auf TGF-β wurden unter Einsatz des Glomerulonephritis-Modells untersucht. Da Decorin ein natürlicher Regulator von TGF-β zu sein scheint, sollte es in vivo in diesem Modell aktiv sein und, wenn dem so ist, wäre es ein ideales Molekül für einen therapeutischen Einsatz, um die Wirkung von TGF-β zu antagonisieren. Eine intravenöse Verabreichung von rekombinantem humanem Decorin und von Decorin, das aus Rindergeweben gereinigt worden ist, wurde eingesetzt, um die Fähigkeit des Proteoglykans zur Supprimierung einer Matrixakkumulation in glomerulonephritischen Rattennieren zu untersuchen. Die Menge an in Glomeruli vorliegendem Fibronektin wurde verwendet, um die Fähigkeit von Decorin zur Blockierung einer Matrixablagerung bei Glomerulonephritis quantitativ zu bestimmen. Fibronektin ist ein im Überfluß vorkommendes Protein in der normalen mesangialen Matrix der Ratte und des Menschen und ist in Menschen mit mesangialer proliferativer Glomerulonephritis stark erhöht. Courtoy et al., J. Cell. Biol. 87: 691 (1980), Courtoy et al., J. Histochem. Cytochem. 30: 874 (1982), Oomura et al., Virchows Archiv. A Pathol. Anat. 415: 151 (1989), Border, Kidney Int. 34: 419 (1988). Unter Einsatz einer Fibronektin-Anfärbung als einen Marker für Matrix wurde festgestellt, daß Decorin den akuten Aufbau von Matrix, der um Tag 7 herum in dem Ratten-Glomerulonephritis-Modell auftritt, in signifikanter Weise verhinderte. EDA&spplus; Fibronektin und Tenascin stellten spezifischere Marker für die TGF-β-Aktivität und Matrixakkumulation dar, da diese Proteine in der Niere normaler erwachsener Ratten nahezu undetektierbar sind und da sie durch TGF-β stark induziert werden. Beide Marker waren in den nephritischen Glomeruli erhöht und beide wurden durch Decorin-Injektionen supprimiert. Daß der Effekt auf den Matrixaufbau tatsächlich therapeutisch war, wurde schließlich durch eine parallel erfolgende Verringerung der Proteinurie angezeigt, einem weithin verwendeten Indikator glomerulärer Schädigung in Menschen, wie von Ginsberg et al., N. Engl. J. Med. 309: 1543 (1983), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben.
Akute mesangiale proliferative Glomerulonephritis ist in Tiermodellen ebenfalls induziert worden, indem Ratten anti-Thymozytenserum injiziert wurde, wie in der US-Anmeldung Serial No. 07/416,656, die in ihrer Gesamtheit in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Es wurde festgestellt, daß geschädigte Glomeruli mehr TGF-β-mRNA exprimieren, mehr TGF- β-Protein synthetisieren und signifikant mehr Fibronektin und Proteoglykane sezernieren, als dies normale Glomeruli tun. Eine Injektion eines Antiserums, das in der Lage ist, die Aktivität von TGF-β zu neutralisieren, in die nephritischen Ratten supprimierte die Produktion von Matrixkomponenten durch die Glomeruli und verhinderte den Aufbau mesangialer Matrix.
Die Entwicklung von diabetischer Nephropathie (d. h. diabetischer Nierenerkrankung) ist eine der häufigsten und schwerwiegendsten Komplikationen bei Diabetes und tritt schließlich bei nahezu der Hälfte der Patienten trotz Behandlung mit Insulin auf. Das dominante histologische Merkmal diabetischer Nephropathie ist die Ausdehnung der extrazellulären Matrix in den mesangialen Bereichen der Glomeruli mit daraus resultierendem Kapillarenverschluß und Sklerose. Eine Ausdehnung der mesangialen Matrix korreliert eng mit dem klinischen Ausbruch von Proteinurie, Bluthochdruck und Nierenversagen.
Die Ähnlichkeiten der Matrix-Abnormalitäten von Glomerulonephritis und diabetischer Nephropathie, bei denen eine Akkumulation extrazellulärer Matrix pathologisch wird, legten die potentielle Beteiligung von TGF-β bei der diabetischen Nierenerkrankung nahe. Durch die Erfindung wird gezeigt, daß Glomeruli von Ratten, die durch die Injektion von Streptozotocin diabetisch gemacht wurden, eine bedeutende Erhöhung der Expression von TGF- β1-mRNA und TGF-β1-Protein aufweisen. Die Glomeruli zeigten auch eine verstärkte Ablagerung einer alternativ gespleißten Form der extrazellulären Matrixproteine, Fibronektin und Tenascin. Diese beiden Komponenten werden bekanntermaßen durch TGF-β induziert. Diese Ergebnisse zeigen an, daß TGF-β auch zu der Entwicklung von diabetischer Nephropathie beiträgt.
In Studien, die die Erfindung betreffen, wurden die Nieren von Ratten, die durch die Verabreichung von Streptozotocin, einer Chemikalie, die eine Insulindefizienz erzeugt, diabetisch gemacht wurden, untersucht. Das Streptozotocin-Modell ist in großem Umfang verwendet worden, da die Tiere eine Nierenerkrankung entwickeln, die humaner diabetischer Nephropathie ähnelt, wie in Velasquez et al., FASEB 4: 2850 (1990) und Mauer et al., Diabetes 25: 850 (1976), die beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben wurde. Ratten wurden in Gruppen eingeteilt, die keine Behandlung erhielten oder die mit täglichen Injektionen von Insulin zur Verringerung der Blutglukose behandelt wurden, wie in Beispiel II beschrieben. Normale männliche Ratten gleichen Alters dienten als Kontrollen und wurden ebenfalls in Gruppen eingeteilt, die keine Behandlung erhielten oder die mit dem gleichen Insulin-Behandlungsplan wie die diabetischen Ratten behandelt wurden. Um die Expression von TGF-β bei Diabetes zu ermitteln, wurde die Konzentration an TGF-β1-mRNA und TGF-β1-Protein in Glomeruli der diabetischen Ratten und der Kontrollratten untersucht. Die mRNA-Analyse zeigte erhöhte Konzentrationen an TGF-β1-mRNA in Glomeruli von diabetischen Ratten im Vergleich zu den Kontrollen (Fig. 1A). Die Konzentrationen an TGF-β1-mRNA stiegen mit der Zeit nach dem Ausbruch von Diabetes an und waren bei unbehandelten diabetischen Ratten im Vergleich zu Ratten, die Insulin erhielten, höher, wie in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Konzentrationen von TGF-ß1-mRNA und Biglycan-mRNA in Glomeruli
Eine Anfärbung von Glomeruli mit einem Antikörper, von dem angenommen wird, daß er neu synthetisiertes TGF-β1 erkennt, ergab signifikant mehr positive Zellen in diabetischen Ratten als in Kontrollen (siehe Fig. 3A und 3B). Die TGF-β1-positiven Zellen wurden mit Markern für Monozyten/Makrophagen oder Lymphozyten nicht angefärbt, zeigten jedoch Anfärbungsmuster, die für glomeruläre Mesangial- und/oder Epithelzellen charakteristisch sind.
Um zu ermitteln, ob in Glomeruli diabetischer Ratten exprimiertes TGF-β wirksam war, die Produktion extrazellulärer Matrix zu stimulieren, wurden solche Glomeruli mit Antikörpern angefärbt, die eine alternativ gespleißte Form von Fibronektin (Fibronektin EDA+) und Tenascin detektieren. Diese Matrixkomponenten werden durch TGF-β induziert, wie in Border et al., Kidney Int. 37: 689 (1990) und Nakamura et al., Kidney Int. 41: 1213 (1992) beschrieben. Die Matrixkomponenten treten ebenfalls an Stellen einer Gewebereparatur auf, Wang et al., J. Biol. Chem. 266: 15598 (1991) und Pearson et al., EMBO J. 7: 2977 (1988). Es wurde ebenfalls festgestellt, daß sowohl Fibronektin EDA+ als auch Tenascin in Glomeruli diabetischer Ratten bereits 6 Wochen nach der Entwicklung von Hyperglykämie, zu einem Zeitpunkt, wo die Nierenhistologie anhand von Lichtmikroskopie normal ist, signifikant erhöht sind und mit der Zeit weiter akkumulieren ( Fig. 1A und 2B).
Interstitielles Kollagen Typ III wird in sklerotischen Glomeruli von Menschen mit diabetischer Nephropathie, aber nicht in normalen menschlichen oder Ratten-Glomeruli gefunden, wie in Nerlich & Schleicher, Am J. Pathol. 139 : 889 (1991) beschrieben. Typ III- Kollagen wurde als Ablagerung in den Glomeruli diabetischer Ratten zu den Zeitpunkten 6, 15 und 40 Wochen gefunden. TGF-β induziert bekanntermaßen, wenn es Kulturen normaler Ratten-Mesangialzellen oder -Epithelzellen zugesetzt wird, die Produktion von Decorin und Biglycan, Proteoglykanen, die in der Lage sind, TGF-β zu binden und dessen Aktivität zu neutralisieren. Biglycan-mRNA-Konzentrationen wurden untersucht, da Ratten-BiglycanmRNA anders als Ratten-Decorin-mRNA mit den entsprechenden humanen cDNA-Sonden kreuzhybridisiert. Erhöhte Konzentrationen an Biglycan-mRNA wurden in den Glomeruli diabetischer Ratten nachgewiesen, wie in Fig. 1B gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß TGF-β aktiv und spezifisch eine Produktion von Matrixkomponenten in Glomeruli diabetischer Ratten induziert.
Tabelle 1 zeigt die Expression von TGF-β1-mRNA und Biglycan-mRNA in Glomeruli. Eine Northern-Blotting-Analyse wurde mit RNA, hergestellt aus Glomeruli, die aus Tieren in jeder Gruppe, wie in Fig. 1 beschrieben, isoliert worden waren, ausgeführt. Zu drei Zeitpunkten wurde jede experimentelle Gruppe in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt, die verwendet wurden, um zwei voneinander unabhängige Experimente auszuführen. Filme wurden unter Verwendung eines Laser-Densitometers abgetastet. Für einen quantitativen Vergleich wurden die Verhältnisse der Dichte der TGF- β1- und Biglycan-mRNA-Banden zu jener der Kontroll-Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-mRNA-Bande in der gleichen Bahn berechnet. Die Ergebnisse wurden dann als die relativen Änderungen der Verhältnisse ausgedrückt, wobei die Verhältnisse der normalen Kontrolltiere (C) als 1,0 angenommen wurden. Werte sind Mittelwerte zweier Experimente.
Diese Ergebnisse legen ferner eine Parallele zwischen der Matrixausdehnung in dem diabetischen Glomerulus und dem Reparaturprozeß nach einer Gewebeschädigung, wie einer Verwundung, nahe. In beiden Prozessen gibt es eine frühzeitige Expression von TGF- β-mRNA und TGF-β-Protein in Verbindung mit einer erhöhten lokalen Produktion von extrazellulärer Matrix. Durch TGF-β induzierte Matrixkomponenten, Fibronektin EDA&spplus; und Tenascin, werden präferentiell in heilenden Wunden und in dem diabetischen Glomerulus exprimiert. Typ III-Kollagen wird in normalen Glomeruli nicht gefunden, tritt jedoch in diabetischen Glomeruli und in heilenden Wunden auf. Ein Schlüsselmerkmal der Wundreparatur ist die Notwendigkeit, den Prozeß zur Vermeidung einer übermäßigen Narbenbildung zu beenden.
In Patienten mit Diabetes tritt eine Beteiligung der Nieren nach 10 bis 20 Jahren Diabetes auf und schreitet fort, bis die Glomeruli durch extrazelluläre Matrix funktionell obliteriert sind, wie in Knowles, Kidney Int. Suppl. 1: 52 (1974); Dorman et al., Diabetes 33: 271 (1984); und Mauer et al., J. Clin. Invest. 74: 1143 (1984) beschrieben. In dem Streptozotocin-Modell für Diabetes sind 6 oder mehr Monate erforderlich, bevor glomeruläre Abnormalitäten unter dem Lichtmikroskop sichtbar sind, eine Zeitspanne die vergleichbar ist mit 20 oder mehr Menschenjahren. Folglich legt die Entwicklung von Glomerulosklerose bei Patienten und Versuchstieren mit Diabetes ein chronisches Versagen, den Prozeß der Gewebereparatur zu regulieren oder zu beenden, woran möglicherweise die fortgesetzte Aktivität von TGF-β beteiligt ist, nahe. Der Stimulus einer Gewebereparatur bei Diabetes ist wahrscheinlich chronische, episodische Hyperglykämie, die trotz Insulintherapie auftritt. Hyperglykämie verursacht bekanntermaßen zahlreiche organspezifische und systemische Veränderungen, wie hämodynamische Veränderungen in der Niere und erhöhte Blutkonzentrationen von glykosylierten Proteinen.
Eine in den Verfahren der Erfindung nützliche Zusammensetzung enthält die Mittel, die die Aktivität von TGF-β supprimieren, wie sie vorstehend identifiziert wurden, zusammen mit Insulin und einem Träger. Pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen beispielsweise Hyaluronsäure und wäßrige Lösungen, wie Bicarbonatpuffer, Phosphatpuffer, Ringer-Lösung und physiologische Kochsalzlösung, ergänzt durch 5% Dextrose oder menschliches Serumalbumin, sofern gewünscht. Andere pharmazeutische Träger, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Um die Relevanz der bei der diabetischen Ratte erhaltenen Ergebnisse für humane diabetische Nephropathie zu zeigen, wurden sechs Fälle diabetischer Glomerulosklerose (dem Endstadium diabetischer Nephropathie), drei normale Kontrollen und sechs Erkrankungskontrollen, bestehend aus drei Fällen von "minimal change"-Erkrankung und drei Fällen dünner Basalmembran-Erkrankung, untersucht. Die Kontroll-Erkrankungen wurden ausgewählt, da sie glomeruläre Erkrankungen darstellen, die Proteinurie und/oder Hämaturie erzeugen, von denen jedoch bekannt ist, daß sie selten, wenn überhaupt, zu Glomerulosklerose führen. Alle Glomeruli in den sechs Fällen diabetischer Glomerulosklerose waren hinsichtlich TGF-β1 und Fibronektin EDA&spplus; stark positiv wie in den zwei in den Fig. 5 und 6 gezeigten Fällen. Aufgrund der beschränkten Gewebemenge wurde die Studie auf diese zwei Marker beschränkt. Im Gegensatz dazu waren sowohl die normalen Kontrollen als auch die Erkrankungs-Kontrollen negativ oder zeigten lediglich Spuren einer Anfärbung (Fig. 5 und 6).
Diese Ergebnisse ergeben eine Parallele zwischen der Ausdehnung glomerulärer Matrix bei diabetischer Nephropathie und experimen teller Glomerulonephritis und eine Verbindung zwischen beiden Erkrankungen und dem Reparaturprozeß nach einer Gewebeschädigung, wie einer Verwundung. Bei beiden gibt es eine frühzeitige Expression von TGF-β-mRNA und TGF-β-Protein in Verbindung mit einer erhöhten lokalen Produktion extrazellulärer Matrix. Durch TGF-β induzierte Matrixkomponenten, Fibronektin EDA&spplus; und Tenascin, werden präferentiell in heilenden Wunden und, wie in dieser Studie gezeigt, in dem diabetischen Ratten-Glomerulus exprimiert. Ein Schlüsselmerkmal der Wundreparatur ist die Notwendigkeit, den Prozeß zur Vermeidung übermäßiger Narbenbildung zu beenden. Die Entwicklung von Glomerulosklerose in Patienten mit Diabetes legt ein chronisches Versagen, den Prozeß der Gewebereparatur zu regulieren oder zu beenden, was zu fortgesetzter Aktivität von TGF-β führt, nahe und steht im Gegensatz zu unseren Ergebnissen in dem Glomerulonephritis-Modell, wo eine TGF-β- Expression transient und die Erkrankung reversibel ist. In Patienten mit Diabetes tritt eine Beteiligung der Nieren nach 10 oder mehr Jahren Diabetes auf und schreitet fort, bis die Glomeruli durch extrazelluläre Matrix funktionell obliteriert sind. In dem Streptozotocin-Modell von Diabetes sind mehrere Monate erforderlich, bevor es sichtbare glomeruläre Abnormalitäten gibt, eine Zeitspanne, die mit 10 oder mehr Menschenjahren vergleichbar ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen.

BEISPIEL I

UNTERSCHIEDLICHE EFFEKTE DES TRANSFORMIERENDEN WACHSTUMSFAKTORS β AUF DIE PRODUKTION EXTRAZELLULÄRER MATRIX DURCH MESANGIALZELLEN UND GLOMERULÄRE EPITHELZELLEN

A. Wachstumsfaktoren und Antikörper

TGF-β1 vom Schwein wurde von R & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) erhalten. Menschlicher Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) und rekombinantes menschliches Interleukin-1 (IL-1), alpha und beta stammten von Collaborative Research, Inc. (Bedford, MA). Rekoinbinanter menschlicher Tumornekrosefaktor (TNF) wurde von Amgen (Thousand Oaks, CA) erhalten. Ziegeanti-human-Typ I- und III- Kollagen-Antikörper wurden von Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL) erworben. Kaninchen-anti-Maus-Fibronektin-Antikörper und Kaninchen-anti-Maus-Kollagen Typ I-, III-, IV- und VI-Antikörper und die Produktion von anti-Ratte-Laminin- Antikörper sind beschrieben worden. Kurz zusammengefaßt wurden polyklonale Käninchen-Antikörper hergestellt, indem New Zealand- Kaninchen jedes gereinigte Protein, emulgiert in komplettem Freund-Adjuvans, subkutan injiziert wurde. Der anfänglichen Immunisierung folgten drei Wochen später aufeinanderfolgende wöchentliche intramuskuläre Injektionen von gereinigtem Protein, emulgiert in unvollständigem Freund-Adjuvans. Die sekundären Injektionen wurden begleitet von einer Blutabnahme von 50 ml aus einer Ohrarterie. Das Blut wurde geronnen und die Seren durch Zentrifugation gesammelt. Monoklonaler Antikörper gegen Ratten- Thy-1 wurde von Accurate Chemicals (Westbury, N. Y.) und Ziegeanti-human-Faktor VIII-Antikörper von Miles Laboratory Inc. (Kankokee, IL) erhalten.
Kaninchen-anti-Ratte-Fx1A-Antikörper wurde durch Immunisierung mit FX1A, hergestellt aus der Niere von Sprague-Dawley-Ratten, gemäß dem Verfahren von Edgington hergestellt. Kurz zusammenge faßt wurden Kaninchen, wie vorstehend beschrieben, immunisiert mit einer Präparation, die an Cuticulasaum der proximalen Nierenkanälchen, der durch Ultrazentrifugation isoliert worden war, angereichert war. FITC- und alkalische Phosphatase-markierte oder anti-Kaninchen-IgG und anti-Ziege-IgG wurden von Cappel (Melvern, PA) erhalten.

B. Zellkultur

Glomeruläre Epithelzellen und Mesangialzellen wurden aus Auswuchs von intakten Glomeruli, die von 6 bis 8 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten erhalten worden waren, gewonnen. Eine Isolierung und Kultur von Mesangialzellen wurde, wie folgt, ausgeführt.
Männliche Sprague/Dawley-Ratten (100-140 g, 2 Ratten pro Isolierung) wurden unter Verwendung von Ketamin (10 mg/100 g Ratte) und Rompum (0,5 mg/Ratte) anästhesiert und unter Verwendung von Betadin sterilisiert. Die Nieren wurden chirurgisch freigelegt und unter Verwendung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfundiert. Dann wurden die Nieren entfernt und in sterilisiertes, auf Eis gehaltenes PBS gelegt.
Die Nieren wurden in zwei Teile geschnitten und der Cortex chirurgisch entfernt. Das verbleibende Gewebe wurde zu 1 mm³-Stücken unter Verwendung eines Skalpells klein geschnitten. Das klein geschnittene Nierengewebe wurde dann durch eine Reihe von Sieben (149 Mesh und 105 Mesh) unter Einsatz kontinuierlichen Waschens mit PBS gesiebt. Das durch das 105 Mesh-Sieb hindurchgehende Material wurde dann auf einem 74 Mesh-Sieb gesammelt. Dies repräsentiert die glomeruläre Fraktion.
Diese Fraktion wurde 10 Minuten in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert und das Pellet in RPMI 1640-Medium (Cell-Gro, Washington, D.C.), das 20% fötales Rinderserum, 0,66 Einheiten/ml Insulin und Antibiotika enthält, resuspendiert. Die Glo meruli wurden zu 2 Nieren-Äquivalenten in 12 ml Medium in einem T75 (75 cm²)-Kolben ausplattiert. Die Mesangialzellen wachsen aus den angehefteten Glomeruli nach ungefähr 3 Wochen Kultur aus. Frisches Medium wurde alle 3-4 Tage während dieser Kulturdauer zugesetzt.
Um Epithelzellen zu isolieren, wurden intakte Glomeruli in Kolben, die mit VitrogenTM (Collagen Corporation Palo Alto, CA) beschichtet worden waren, eingebracht. Das Wachstumsmedium war RPMI 1640 (Cell-Gro, Washington, D.C.), supplementiert mit 20% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, UT), 50 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 0,66 U/ml Insulin und 300 mg/ml L-Glutamin. Nach 7 Tagen wurden auswachsende Zellen mit 0,025 % Trypsin-0,5 M EDTA (Flow Labs, Molean, VA) abgelöst. Glomerulärer Rückstand wurde entfernt, indem das Material durch ein 30-Mesh-Sieb filtriert wurde. Eine hochangereicherte Epithelzellpopulation wurde unter Einsatz einer indirekten Panning-Technik erzeugt. Speziell wurden Glomeruli, wie vorstehend beschrieben, isoliert und auf Gewebekulturplatten, die mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I bei 0,15 mg/ml vorbeschichtet worden waren, ausplattiert. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur beschichtet, dann 2mal mit PBS gewaschen. Nach 1 Woche Kultur wurde der Auswuchs von Zellen (hauptsächlich Epithelzellen) und Glomeruli unter Verwendung von 0,05 % Trypsin-0,53 mM EDTA trypsinisiert. Die Zellsuspension wurde durch ein 30 Mesh-Sieb filtriert, um glomeruläre Stücke zu entfernen. Die verbleibende Zellsuspension wurde auf einer Platte, die vorab mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Thy 1-Antigen beschichtet worden war, ausplattiert. Nur Mesangialzellen werden an den Thy 1-Antikörper binden, da sie das Antigen exprimieren, wohingegen die Epithelzellen dies nicht tun und folglich in Suspension bleiben. Diese Vorgehensweise entfernte vorzugsweise Mesangialzellen. Platten wurden mit Antikörper (ungefähr 100 ug/ml) bei 4ºC 24 Stunden beschichtet. Die Inkubation von Zellen auf der anti-Thy 1-beschichteten Platte erfolgte für 1 Stunde bei 37ºC. Die nicht gebundenen Zellen wurden gesammelt und erneut ausplattiert. Glomeruläre Zellen wurden zu 60 · 15 mm-Polystyrolplatten, die mit Maus-anti-Thy-1-Antikörper durch 12stündige Inkubation bei 4ºC vorbeschichtet worden waren, zugesetzt. Nicht-anhaftende Zellen wurden entfernt und in Platten mit 6 Vertiefungen, die mit Laminin (Collaborative Research, Bedford, MA) vorbeschichtet worden waren, eingebracht.
Glomeruläre Epithelzellen wurden identifiziert durch: 1) charakteristische polygonale Morphologie; 2) gleichförmige Anfärbung mit Antikörper gegen FX1A (Heymann-Antigen); 3) Empfindlichkeit gegen Aminonukleosid von Puromycin; und 4) keine Anfärbung mit anti-Thy-1- oder anti-Faktor VIII-Antikörper. Eine Kontamination von glomerulären Epithelzellen durch proximale Tubuluszeljlen wurde durch alkalische Phosphatase-Anfärbung überprüft und weniger als 2 % der Zellen waren alkalische Phosphatase-positiv. Im Gegensatz dazu wurden Mesangialzellen identifiziert durch 1) typisches sternenförmiges Erscheinungsbild; 2) gleichförmige Anfärbung mit anti-Thy-1-Antikörper; 3) keine Anfärbung mit anti-FX1A- oder anti-Faktor VIII-Antikörper; und 4) keine Empfindlichkeit gegen Aminonukleosid von Puromycin.

C. Biosynthetische radioaktive Markierung

Glomeruläre Epithel- und Mesangialzellen wurden regulären oder Laminin-beschichteten Multiwell-Platten mit 6 Vertiefungen zu einer Konzentration von 5 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung zugesetzt und in Serum-freiem RPMI 1640-Medium 24 Stunden gezüchtet, um die Zellproliferation anzuhalten. Nicht-anhaftende Zellen wurden durch Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Serum- und Antibiotika-freies RPMI 1640 wurde als Niedersulfat-Medium für eine ³&sup5;S-Sulfat-Markierung und RPMI 1640 ohne Methionin (Flow Labs, Molean, VA) für eine ³&sup5;S-Methionin- Markierung zugesetzt. Wachstumsfaktoren wurden dem Medium 48 Stunden zu den folgenden Konzentrationen zugesetzt: TGF-β (25 ng/ml), PDGF (2 U/ml), IL-10α (5 U/ml), IL-1β (5 U/ml) und TNF (500 U/ml). 18 Stunden vor Beendigung des Experiments wurden den Kulturen ³&sup5;S-Methionin (100 uCi/ml) zur Markierung von Proteinen oder ³&sup5;S-Sulfat (200 uCi/ml) zur Markierung von Proteoglykanen zugesetzt.
Isotope wurden von New England Nuclear (Boston, MA) erworben. Konditionierte Medien und Zellschichten wurden geerntet und, wie vorstehend beschrieben, weiterverarbeitet. Die Proliferation von Zellen wurde durch die Aufnahme von ³H-Thymidin untersucht. Zellen wurden Laminin-beschichteten Platten mit 12 Vertiefungen zu einer Konzentration von 2 · 10&sup5;/Vertiefung zugesetzt. Nach 24 Stunden in Serum-freiem Medium wurden 25 ul einer 10 uCi/ml- Lösung von ³H-Thymidin jeder Vertiefung zugesetzt. Die Inkubation wurde für 24 Stunden ausgeführt. Das Kulturmedium wurde verworfen, Zellschichten 2mal mit 5% TCA-Lösung (Trichloressigsäurelösung) gewaschen und 15 Minuten mit 700 ul 6 N HCl-Lösung inkubiert. Ein Einbau von ³H-Thymidin wurde gemessen, indem jede Zellschicht in einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Beckman, Irvine, CA) gemessen wurde, und bezüglich der Proteingehalte jeder Zellschicht, die durch einen BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce, Rockford, IL) gemessen wurde, korrigiert.

D. Identifizierung von Matrixmolekülen

Matrix-Glykoproteine wurden durch Immunpräzipitation und Proteoglykan durch Enzymverdau identifiziert. Immunpräzipitationen wurden ausgeführt, indem 100 ul Antiserum 500 ul konditioniertem Medium oder 300 ul Zellextrakt, die aus jeweils zwei Vertiefungen gesammelt worden waren, in Gegenwart oder in Abwesenheit von zugesetzten Wachstumsfaktoren zugesetzt wurden. In jeweils zwei Vertiefungen wurden Zellen abgelöst und gezählt, um gleiche Zellzahlen sicherzustellen. Vorimmun-Serum wurde in parallelen Kontrollexperimenten verwendet. Die Proben wurden über Nacht bei 4ºC unter Mischen in konischen 4 ml-Röhrchen, die mit Rinderserumalbumin (BSA) vorbeschichtet worden waren, inkubiert. Protein-A-Sepharose-Körnchen (Sigma, St. Louis, MO) wurden mit frischem RPMI 60 Minuten bei 22ºC vorinkubiert. Um die Antigen- Antikörper-Komplexe zu präzipitieren, wurden 50 ul suspendierte Protein-A-Sepharose den Proben zugesetzt und bei 4ºC 120 Minuten gemischt. Die Proben wurden 10 Minuten bei 2000 · G zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Pellets wurden 10mal mit 1 ml eiskaltem PBS, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 7,4, gewaschen. Schließlich wurden die Pellets mit eiskaltem PBS gewaschen, in neue Röhrchen überführt, erneut zentrifugiert und 3mal mit PBS gewaschen. Die Pellets wurden in 40 ul SDS- PAGE-Probenpuffer, enthaltend 3 % SDS und 10 % β-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO), gelöst und 5 Minuten gekocht.
Ein Verdau mit Glykosaminoglykan abbauenden Enzymen wurde verwendet, um den Typ von Proteoglykanen, die durch TGF-β reguliert wurden, zu bestimmen. Der Verdau wurde an konditionierten Medien nach biosynthetischer Markierung ausgeführt. Aliquots von Medium (25 ul) wurden mit 100 Millieinheiten Chondroitinase ABC oder Chondroitinase AC, jeweils in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Calciumacetat, 2 mg/ml BSA, oder 100 Millieinheiten Heparinase II in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat gemischt. Alle Proben erhielten auch 1 mM PMSF, 5 mM Benzamidin, 100 ug/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 10 ug/ml Leupeptin und 10 ug/ml Antipain. Alle Materialien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben. Chondroitinase enthaltende Mischungen wurden bei 37ºC 1,5 Stunden inkubiert. Abschließend wurden Proben für eine SDS-PAGE vorbereitet.
Große Proteoglykane wurden durch Gelfiltration charakterisiert. ³&sup5;S-Sulfat-markierte Fraktionen von einer Sepharose CL-6B-Säule wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Proben wurden in 2 ml 0,1 M Natriumacetat, 0,1 M Tris, pH 7,3, enthaltend vorstehend beschriebene Proteaseinhibitoren, gelöst. Dann wurde 0,2 ml Chondroitinase ABC-Lösung (1,25 Einheiten/ml) 1,8 ml Probe zugesetzt; ein Verdau wurde für 24 Stunden bei 37 ºC ausgeführt. Proben wurden dann auf einer CL-6B-Säule fraktioniert, gegen destilliertes Wasser dialysiert, lyophilisiert und mit salpetriger Säure unter Nieder-pH (1,0)-Bedingungen behandelt. Nach Behandlung mit salpetriger Säure wurden Proben erneut auf einer CL-6B-Säule chromatographiert.
Um die durch TGF-β induzierte verstärkte Produktion von Proteoglykanen zu quantifizieren, wurden 3 ml konditioniertes Medium auf eine Sepharose CL-6B-Säule (1,3 · 100 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit 4 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 % (Vol./Vol.) Triton X-100 mit einer Fließrate von 20 ml/h eluiert und Fraktionen von 3 ml/Röhrchen gesammelt. Die Radioaktivität in jeder ausströmenden Fraktion wurde durch einen Beckman LS 2800-Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt.

E. Elektrophoresetechnik

Proben wurden durch SDS-PAGE mit Fluorographie und Densitometrie, wie in Beispiel II nachfolgend beschrieben, analysiert.

F. Ergebnisse

Die Ergebnisse der vorangehenden Studien zeigen, daß TGF-β die Produktion von Biglycan, Fibronektin und Typ IV-Kollagen durch die Epithelzellen reguliert, wohingegen TGF-β nur die Proteoglykanproduktion durch in Kultur gehaltene Mesangialzellen beeinflußt. Das biosynthetische Profil der Matrixproduktion durch Epithelzellen, reguliert durch TGF-β, unterscheidet sich folglich von jenem von Mesangialzellen. Genauer zeigen diese Ergebnisse, daß eine Freisetzung von TGF-β in dem Glomerulus zu einer Akkumulation von Mesangialmatrix und einer Verstärkung der Produktion von Matrixmolekülen, die die glomeruläre Basalmembran bilden, führt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2 TGF-β-Induktion extrazellulärer Matrix durch cilomeruläre Zellen in Kultur
↑ = Induktion, 0 = kein Effekt, NP = Komponente nicht produziert

BEISPIEL II

A. INDUKTION VON DIABETES IN RATTEN

Diabetes wurde in männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 150 g durch eine einzelne i. v.-Injektion von Streptozotocin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu 6,5 mg/100 g Körpergewicht in Citratpuffer induziert, wie in Velasquez et al., FASEB 4: 2850 (1990) und Mauer et al., Diabetes 25: 850 (1976), die beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben. 48 diabetische Ratten mit Blutglukosespiegeln > 300 mg/dl wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste diabetische Gruppe (D) erhielt keine Behandlung, die zweite Gruppe (DI) wurde mit einer täglichen subkutanen Injektion von 3,5 U NPH-Insulin (Eli Lilly, Indianapolis, IN) behandelt. 48 im Alter übereinstimmende männliche Ratten dienten als Kon trollen und wurden in Gruppen eingeteilt, die kein Insulin erhielten (C) oder mit demselben Insulin-Behandlungsplan behandelt wurden wie die diabetischen Ratten (CI).
Blutglukosespiegel wurden in jeder Gruppe nach 10 Wochen um 8.00 Uhr morgens nach Fasten über Nacht gemessen und die Werte sind in mg/dl in Tabelle 3 angegeben. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung.

TABELLE 3

Blutglukosespiegel

D 456 ± 31
DI 329 ± 31
C 122 ± 10.
CI 137 ± 15
Nach 1, 6, 15 und 40 Wochen wurden 6 Ratten in jeder Gruppe mit 1 M Ketamin-HCl, 10 mg/100 g Körpergewicht, und Xylazin, 0,5 mg/100 g Körpergewicht, für eine Entfernung der Nieren anästhesiert. Diabetische Ratten ohne Insulin (D) lebten nicht länger als 37 Wochen und fehlen folglich in der Analyse in Woche 40. Für alle Techniken wurden Nieren in situ mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, perfundiert und dann entnommen. Cortex-Stücke wurden für eine immunhistologische Untersuchung entfernt und Glomeruli aus dem verbleibenden Gewebe für eine mRNA-Detektion isoliert, wie in Okuda et al., J. Clin. Invest. 86: 453 (1990), das unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, beschrieben. Unterschiede zwischen den Gruppen bei der Immunfluoreszenz-Bewertung von Matrixkomponenten und TGF-β1-positiven Zellen wurden durch t-Tests analysiert.

B. PRÄPARATION UND DETEKTION VON GESAMT-RNA

Gesamt-RNA wurde durch Lyse isolierter Glomeruli (8-9 · 10&sup4; Zellen) in 3-4 ml Guanidinisothiocyanat (GITC)-Lösung (4 M GITC: 0,5% (Gew./Vol.) N-Isorylsarcosin, 0,1 % Anti-Foam A, 0,1 M β- Mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCl, pH 7,0), enthaltend 4 % 2-Mercaptoethanol und 0,5% Laurylsarcosyl, hergestellt. Das Lysat wurde einer Ultrazentrifugation bei 150 000 · g auf einem Cäsiumchlorid-Dichtegradientenkissen unterworfen. Die RNA wurde aus der Bodenschicht des Röhrchens nach der Zentrifugation gewonnen. 40 ug RNA wurden in jeder Gruppe zu jedem Zeitpunkt vereinigt und einer Elektrophorese in 1% Agarosegelen, enthaltend 2,2 M Formaldehyd und 0,2 M MOPS (Sigma Chemical Co., St. Louis, NO), pH 7,0, unterworfen und auf eine 0,2 um-Nylonmembran (ICN Radiochemicals, Inc., Irvine, CA) über Nacht durch Kapillarblotting überführt.
Gleiche Mengen an RNA (40 ug) wurden basierend auf der Extinktion bei 260 nm aufgetragen. Die Membranen wurden 5 Stunden bei 37ºC in 5· SSC (20· SSC; 175,3 g NaCl, 88,2 Natriumcitrat, pH 7,0 mit 10 N NaOH auf ein Endvolumen von 1 Liter), 5· Denhardt-Lösung (50·-Lösung: 5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA, H&sub2; (0 bis 500 ml), 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 0,1% SDS, 250 ug/ml ultraschallbehandelte denaturierte Lachssperma- DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 50% Formamid vorhybridisiert.
Um eine. Maus-cDNA-Sonde zu erhalten, wurde ein 280 bp-PvuII- Fragment in mit HincII verdauten pBluescript SKII+ (Stratagene, La Jolla, CA) aus einer Maus-TGF-β1-cDNA, erhalten von Dr. R. Derynck und beschrieben in Derynck et al., J. Biol. Chem. 261: 4377 (1986), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, subkloniert. Die Orientierung des Inserts, das die Aminosäuren 298-390 von reifem TGF-β1 kodierte, wurde bestimmt und das Plasmid durch Cäsiumchloriddichtezentrifugation, wie in Kondaiah et al., J. Biol. Chem. 263: 18313 (1988), das unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, beschrieben, gereinigt.
Die Maus-cDNA-Sonde, eine Ratten-GAPDH-cDNA-Sonde, zur Verfügung gestellt von Dr. M.B. Sporn, National Institute of Health (NIH), und eine humane Biglycan-cDNA-Sonde (Plasmid p16), die von Dr. L.W. Fisher, NIH, zur Verfügung gestellt worden war, wurden mit ³²P-CTP (Cytosintriphosphat) durch die Random-Primer-Methode (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) markiert und bei 42ºC über Nacht hybridisiert. Die Membranen wurden 3mal in 2· SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur 5 Minuten und 3mal in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50ºC 15 Minuten gewaschen. Eine Autoradiographie wurde durch Standardmethoden ausgeführt. Filme wurden unter Einsatz eines Laser-Densitometers (LKB, Bromma, Schweden) abgetastet. Für einen quantitativen Vergleich wurden die Verhältnisse der Dichte der TGF-β1- und Biglycan-mRNA-Banden zu jener der GAPDH-mRNA-Bande in derselben Gelbahn berechnet. Ergebnisse wurden dann als die relativen Veränderungen der Verhältnisse, wenn die Verhältnisse der normalen Kontrolltiere (C) zu 1,0 gesetzt wurden, ausgedrückt.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Fig. 1 gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Bei Standardisierung durch Vergleich mit der Menge an GAPDH-mRNA ergibt sich eine 3,4-fache Zunahme an TGF-β1-mRNA und eine 2,3-fache Zunahme an Biglycan-mRNA in den diabetischen Ratten, die nicht mit Insulin behandelt wurden. Mit Insulin behandelte diabetische Ratten zeigten eine geringere Erhöhung an TGF-β1- und Biglycan-mRNA.

C. NACHWEIS VON TGF-β IN DIABETISCHEN GLOMERULI

Gewebe von Glomeruli wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren, in Aceton fixiert und 4 um-Schnitte mit einem Antikörper (50 ug/ml), der gegen ein synthetisches Peptid entsprechend den ersten 30 Aminosäuren von reifem TGF-β1 hergestellt worden war, angefärbt. Dieser Antikörper (anti-LC) (Geschenk von Dr. K.C. Flanders und Dr. M.B. Sporn, National Institutes of Health) färbt intrazelluläres TGF-β1 an. Der anti-LC-Antikörper ist in Flanders et al., Biochem. 27: 739 (1988), dessen Lehre unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, veröffentlicht. Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertes Antiserum (·500) gegen Kaninchen-IgG oder Lissamin-Rhodamin-Esel-F(ab')2-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immunology Lab, West Grove, PA) wurde als sekundärer Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 300 verwendet.
Die TGF-β1-positiven Zellen wurden durch eine Doppelanfärbungs- Immunfluoreszenztechnik unter Einsatz von Fluorescein- und Rhodamin-konjugierten sekundären Antikörpern mit einer primären Anfärbung unter Einsatz monoklonaler Antikörper gegen ED1 (Monozyt/Makrophagen), OX19 (Lymphozyten) und Vimentin, Desmin und α- Actin aus der glatten Muskulatur (Jackson Immunoresearch Lab) identifiziert. Die Anzahl von TGF-β1-positiven Zellen wurde in 20 Glomeruli, die zufallsbedingt in kodierten Schnitten, präpariert aus jedem von sechs Tieren in der Kontroll- und der diabetischen Gruppe, ausgewählt worden waren, gezählt.
Eine Anfärbung eines Glomerulus aus einer diabetischen Ratte, die nicht mit Insulin behandelt worden war, 15 Wochen nach der Induktion von Diabetes zeigt eine bemerkenswerte Zunahme in der Anzahl von TGF-β1-positiven Zellen. In den diabetischen Glomeruli gab es signifikant mehr positive Zellen pro Glomerulus, *32 ± 2 gegenüber 25 ± 1 (Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung, *p < 0,001) verglichen mit Glomeruli aus den Kontrollratten.

D. OUANTIFIZIERUNG DER FIBRONEKTIN EDA&spplus;- UND TENASCIN-ABLAGERUNG IN GLOMERULI VON DIABETISCHEN RATTEN

Gewebe für die Immunfluoreszenz wurden, wie beschrieben, hergestellt. Ein monoklonaler Maus-Antikörper, hergestellt gegen humanes Fibronektin EDA+, wurde freundlicherweise von Dr. L. Zardi, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italien, zur Verfügung gestellt und ist in Balza et al., FEBS Letters 228: 42 (1988) und Sekiguichi et al., J. Biol. Chem. 260: 5104- 5114 (1985), die beide unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen werden, beschrieben. Kaninchen-anti-human-Tenascin wurde von Telios Pharmaceuticals Inc. (La Jolla, CA) erhalten. Tenascin wurde aus humanen Glioblastom-U251-Zellen isoliert, wie in Bourdon et al., Cancer Res. 43: 2796-2805 (1983), das unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, beschrieben. Fluoresceinisothiocyanat-anti-Kaninchen-IgG und Ratte-F(ab')2- anti-Maus-IgG (beide erhalten von Jackson Immunology Lab, West Grove, PA) wurden als sekundäre Antikörper verwendet.
Bei der Immunfluoreszenz (IF)-Anfärbung für Tenascin wurden 4 um-Gewebeschnitte in Aceton 4-5 Minuten eingetaucht. Ohne Trocknen wurden die fixierten Schnitte in PBS, pH 7,4, ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht. Die Schnitte wurden dann unter milden Bedingungen unter Verwendung eines Ventilators ungefähr 5 Minuten getrocknet, bis nur ein paar Tröpfchen Wasser auf dem Objektträger verblieben. Polyklonaler Kaninchen-anti- human-Tenascin-Antikörper (Telios Pharmaceuticals, La Jolla, CA) wurde 1 : 15 bis 1 : 20 mit PBS, enthaltend 0,01% Natriumazid, verdünnt. Ungefähr 10 bis 15 ul der PBS-Lösung wurden auf das Gewebe aufgetragen und danach ungefähr 45 Minuten bei 37ºC in einer feuchten Kammer inkubiert. Der Objektträger wurde dann gekippt, um zu ermöglichen, daß eine PBS-Waschlösung sanft darüber läuft, ohne daß die Waschlösung direkt auf den Bereich aufgebracht wird. Die Schnitte wurden dann 3mal jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS unter Schütteln eingetaucht. Die Schnitte wurden dann mit einem Ventilator getrocknet. Das FITC- konjugierte affinitätsgereinigte Esel-f(ab')&sub2;-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immuno. Lab, 711-096-132, #14620), 1 : 400 mit PBS, enthaltend 0,01% Natriumazid, verdünnt, wurde den Objektträgern zugesetzt. Die Objektträger wurden 3mal, wie vorstehend beschrieben, mit PBS gewaschen. Das Deckgläschen wurde über das Gewebe unter Verwendung von "Bartels buffered glycerol mounting medium FA" (Bartels gepuffertes Glycerol-Eindeckmedium FA; Baxter Laboratories) gelegt.
Der vorstehend erläuterten Prozedur folgte die IF-Anfärbung für Fibronektin EDA+. Reiner monoklonaler Maus-anti-human-Fibronektin EDA-Antikörper wurde als primärer Antikörper und FITC-konjugiertes affinitätsgereinigtes F(ab')&sub2;-Ratte-anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch Lab. #16381), 1 : 30 mit PBS, enthaltend 0,01% Natriumazid, verdünnt, wurde als sekundärer Antikörper verwendet.
Die Ergebnisse der Quantifizierungsassays sind in Fig. 2 gezeigt. Die Immunfluoreszenzanfärbung wurde unter Verwendung einer Skala von 0 bis 4 (0 = keine Anfärbung, 4 = maximale starke Anfärbung) in 20 zufallsbedingt in kodierten Schnitten, hergestellt aus sechs Tieren in jeder experimentellen Gruppe, ausgewählten Glomeruli eingestuft. Zu jedem Zeitpunkt gibt es eine bemerkenswerte Zunahme an Ablagerung der zwei Matrixkomponenten in den diabetischen Tieren.
Bei dem Nachweis der Fibronektin EDA&spplus;-Ablagerung in Kontroll- und diabetischen Glomeruli mit Immunfluoreszenzmikrographien von mit anti-Fibronektin EDA&spplus;-Antikörper angefärbten Glomeruli zeigt der Glomerulus einer normalen Kontrollratte, die 40 Wochen lang mit Insulin behandelt worden war, eine schwache Anfärbung, wohingegen der Glomerulus aus einer Ratte mit Diabetes, die 40 Wochen lang mit Insulin behandelt worden war, eine bemerkenswerte Zunahme der Anfärbung zeigt.

BEISPIEL III

INHIBITIONDER PROTEOGLYKANSYNTHESE MIT EINEM ARG-GLY-ASP-ENTHALTENDEN PEPTID

Mesangialzellen wurden aus intakten Glomeruli von 4 bis 6 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten gemäß dem Verfahren von Harper et et., Kidney International 26: 875 (1984), das unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, erhalten. Das verwendete Wachstumsmedium war RPMI 1640 (Cell-Gro, Washington, D.C.), supplementiert mit 20% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone, Logan, UT), 50 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 0,66 U/ml Insulin und 300 mg/ml L-Glutamin. Zwischen Tag 15 und 20 wurden Primärkulturen mit einer Lösung von 0,025% Trypsin - 0,5 mM EDTA (Flow Labs, Molean, VA) abgelöst und 2 · 10&sup6; Zellen wurden zu Kolben zugesetzt. Die Zellen wurden alle 7 Tage passagiert und alle Experimente wurden an Zellen zwischen Passage 3 und 7 ausgeführt.
Ratten-Mesangialzellen wurden bis zur Subkonfluenz in Mutti- Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang serumfrei gemacht und TGF-β1 zu 25 ng/ml zusammen mit Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) zu 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 oder 0,003 mg/ml oder Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro (GRGESP) zu 0,3 mg/ml zugesetzt. Die Peptide wurden, wie in Pierschbacher und Ruoslahti, J. Biol. Chem., 292: 1794-1798 (1987), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben, an einem Applied Biosystems Peptide Synthesizer gemäß dem Protokoll des Herstellers synthetisiert. 30 Stunden später wurden die Kulturen metabolisch mit ³&sup5;S-Sulfat markiert und 18 Stunden danach wurden die konditionierten Medien durch SDS-PAGE mit Fluorographie analysiert. Die Fluorogramme wurden mit einem Laser-Densitometer abgetastet und die folgenden Werte geben die relativen Densitometereinheiten für die Proteoglykanbanden wieder. Kontrolle 1,9; TGF-β&sub1; 4,5; TGF-β&sub1;+GRGDS 0,3 mg/ml, 1,3; 0,1 mg/ml, 2,4; 0,03 mg/ml, 2,6; 0,01 mg/ml 3,9; 0,003 mg/ml, 4,0; und TGF-β&sub1;+GRGESP 0,3 mg/ml, 4,3.
Diese Daten zeigen einen Dosis-Wirkungs-Effekt höher Dosen von GRGDSP, der eine Inhibition der TGF-β1-induzierten Proteoglykanproduktion verursacht, ohne irgendeinen Effekt des Kontrollpeptids GRGESP.

BEISPIEL IV

Es wurden Nierengewebe aus einer Nierenbiopsie oder Nephrektomie-Proben, erhalten von Patienten, die sich einer diagnostischen oder chirurgischen Auswertung an dem University of Utah Medical Center unterzogen, studiert. Die Analyse umfaßte sechs Fälle von diabetischer Nephropathie, drei Fälle von "minimal change"-Glomerulonephritis, drei Fälle von dünner Basalmembran- Erkrankung und drei normale Nieren. Vier oder mehr Glomeruli lagen in jeder Probe vor und die Diagnose wurde in jedem Fall unter Verwendung herkömmlicher klinischer und pathologischer Kriterien durch Ärzte, die an der gegenwärtigen Studie nicht beteiligt waren, erstellt. Gefrorenes Gewebe wurde auf die Anwesenheit von TGF-β1-Protein und Fibronektin EDA&spplus; durch Immunfluoreszenzmikroskopie, wie in Beispiel II für das experimentelle Modell beschrieben, untersucht. Die Mensch- und Tier-Studien wurden von dem Institutional Review Board der University of Utah School of Medicine genehmigt.
Alle Glomeruli in den sechs Fällen von diabetischer Glomerulosklerose waren stark positiv hinsichtlich TGF-β1 und Fibronektin EDA&spplus; wie in den zwei in den Fig. 5 und 6 gezeigten Fällen. Aufgrund der beschränkten Menge an Gewebe wurde die Studie auf diese zwei Marker beschränkt. Im Gegensatz dazu waren sowohl die Normal- als auch die Erkrankungskontrollen negativ oder zeigten lediglich Spuren einer Anfärbung (Fig. 5 und 6).

BEISPIEL V

NEUTRALISIERUNG DER AKTIVITÄT VON TGF-β1, 2 UND 3 DURCH REKOMBINANTES MENSCHLICHES DECORIN

A. Reagenzien

Gereinigtes menschliches TGF-β1 und 2 wurden von R & D Systems (Minneagolis, MN) erhalten und TGF-β3 war ein Geschenk von Dr. A. Roberts und Dr. M. Sporn, National Institutes of Health.
Rekombinantes menschliches Decorin wurde aus dem Kulturmedium des Klons 62 einer Ovarzellinie vom chinesischen Hamster, wie von Yamaguchi et al., a. a. O., das hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben, hergestellt. Decorin wurde durch ein modifiziertes Verfahren, das Ionenaustausch an Q-Sepharose und hydrophobe Chromatographie an Octyl-Sepharose kombinierte, wie beschrieben von Choi et al., J. Biol. Chem. 264: 2876 (1989), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, gereinigt. Nach Elution des Decorins von der Octyl-Sepharose-Säule durch 4 M Guanidin-HCl wurde die Präparation gegen PBS, pH 7,4, dialysiert und die Decorin-Konzentrationen auf 0,9 mg/ml eingestellt.
Ovalbumin und Rinderserumalbumin wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten und wurden unter den gleichen Bedingungen präpariert, die bei der Reinigung von Decorin verwendet worden waren.

B. Zellkultur

Ein Nerzlungen-Zellassay, der Wachstumsinhibition mißt, wurde verwendet, um die Fähigkeit von rekombinantem Decorin zur Neutralisierung der Aktivität der TGF-β-Isoformen zu messen. Der [³H]-Thymidin-Einbau wurde in Gegenwart von TGF-β und steigenden Konzentrationen an Decorin (0) oder Rinderserumalbumin (BSA) ( ), bestimmt, wie von Yamaguchi et al., a. a. O., beschrieben.
Die TGF-β-Isoformen wurden in den Konzentrationen zugesetzt, die den Einbau von [³H]-Thymidin zu 50% inhibierten; diese Konzentrationen waren 0,2 ng/ml, 0,1 ng/ml bzw. 0,05 ng/ml für TGF-β1, TGF-β2 bzw. TGF-β3. Die in Fig. 7 gezeigten Daten repräsentieren die prozentuale Neutralisierung der TGF-β1-induzierten Wachstumsinhibition. Der [³H]-Thymidin-Einbau in Gegenwart von weder TGF-β noch Decorin wird als 100% definiert (125 000 cpm für TGF-β1 und TGF-β3; 107 000 cpm für TGF-β2). Der Einbau in Gegenwart von TGF-β, aber nicht von Decorin ist als 0% definiert (57 000 cpm für TGF-β1; 78 000 cpm für TGF-β2; 59 000 cpm für TGF-β3). Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert der Ergebnisse von Doppelproben.
Wie in Fig. 7 gezeigt, neutralisierte Decorin die wachstumsinhibierende Aktivität von jedem der drei TGF-β-Isoformen.
Das anti-TGF-β1-Serum, das früher zur Linderung von Glomerulonephritis verwendet wurde, wie von Border et al., Nature 346: 371 (1990) beschrieben, wurde ebenfalls untersucht. Dieses Antiserum neutralisiert TGF-β1, aber weder TGF-β2 noch 3 (Daten nicht gezeigt). Folglich hat Decorin eine breitere Bindungsreaktivität gegen die TGF-β-Isoformen als das anti-TGF-β1-Antiserum.

BEISPIEL VI

INTRAVENÖSE VERABREICHUNG VON REKOMBINANTEM HUMANEM DECORIN

Eine intravenöse Verabreichung von rekombinantem humanem Decorin und von Decorin, das aus Rindergeweben gereinigt worden ist, wurde verwendet, um die Fähigkeit des Proteoglykans zur Supprimierung der Matrixakkumulation in glomerulonephritischen Rattennieren zu untersuchen. Die Menge an Fibronektin, die in den Glomeruli vorlag, wurde verwendet, um die Fähigkeit von Decorin zur Blockierung einer Matrixablagerung bei Glomerulonephritis quantitativ zu bestimmen.

A. Protokoll

Glomerulonephritis wurde in Sprague-Dawley-Ratten (4-6 Wochen alt) durch intravenöse Injektion von Antithymozytenserum induziert, wie von Okuda et al., a. a. O., beschrieben. Ratten gleichen Alters dienten als normale Kontrollen. Rekombinantes humanes Decorin, hergestellt, wie in Beispiel V. A. beschrieben, und Rinder-Decorin wurden in separaten, aber identischen Experimenten gemäß dem folgenden Protokoll untersucht.
8 Ratten wurden in vier Gruppen von jeweils zwei eingeteilt und diesen Antithymozytenserum injiziert. Eine Stunde später begann die Behandlung mit einer einzelnen intravenösen Injektion von 0,45 mg rekombinantem humanem Decorin oder Rinder-Decorin in 0,5 ml PBS oder, als Kontrolle, von 0,5 ml PBS allein (für die Injektionen wurden die Ratten festgehalten, aber nicht anästhesiert). Rinder-Decorin wurde aus Gelenkflächenknorpel durch Extraktion für 24 Stunden mit 4 M Guanidin-HCl und Proteaseinhibitoren isoliert und dann gereinigt, wie in Beispiel V.A. beschrieben. Die Behandlung wurde mit einer einzelnen täglichen Injektion von Decorin oder PBS, wie folgt, fortgesetzt: Decorin wurde Gruppe 1 zwei Tage lang, Gruppe 2 vier Tage lang und Gruppe 3 sechs Tage lang verabreicht. Gruppe 4 erhielt PBS allein für sechs Tage. Als Decorin in den Gruppen 1 und 2 abgesetzt wurde, wurde es durch PBS ersetzt, so daß alle Tiere sechs tägliche Injektionen erhielten. Sämtliche Behandlungen wurden am Tag 7 beendet, Urin über 24 Stunden gesammelt, wonach die Tiere getötet und die Nieren entfernt wurden.
Gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll wurde ein Experiment ausgeführt, um die Kontrollpräparationen, wie folgt, zu testen: Acht Ratten wurde Antithymozytenserum injiziert, diese in Gruppen von jeweils zwei Ratten eingeteilt und diesen täglich 6 Tage lang 0,5 ml PBS allein oder PBS, enthaltend Aggrecan, Ovalbumin, Rinderserumalbumin, injiziert. Der Kohlenhydratgehalt von Aggrecan und Decorin wurde bestimmt und Aggrecan in PBS zu der gleichen Kohlenhydratkonzentration wie Decorin injiziert. Zusätzliche 4 Ratten erhielten eine einzelne Injektion von PBS anstelle des Antithymozytenserums und dienten als normale Kontrollen. Alle Tiere wurden nach einer 24stündigen Urinsammlung, wie vorstehend beschrieben, getötet und Harn-Protein und Kreatinin gemessen, wie von Okuda et al., a. a. O., beschrieben.
Für alle Techniken wurden Nieren in situ mit kaltem PBS perfundiert und dann entnommen. Nierengewebe wurde für Licht- und Immunfluoreszenzmikroskopie präpariert, wie von Okuda et al., a. a. O., welches unter Bezugnahme in diese Unterlagen auf genommen wird, beschrieben.

B. Fibronektin-Anfärbung

Fluoresceinisothiocyanat-konjugierter Schaf-anti-human-Fibronektin-Antikörper stammte von Binding Site, Inc. (San Diego, CA). Eine Immunfluoreszenz-Anfärbung auf Fibronektin wurde ohne Kenntnis der Quelle des Gewebes unter Verwendung einer Skala von 0 bis 4 (0 = keine Anfärbung, 4 = maximale starke Anfärbung) in 20 zufallsbedingt in kodierten Schnitten, die aus jedem Tier hergestellt wurden, ausgewählten Glomeruli eingestuft. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch t-Tests analysiert, wie Von Okuda et al., a. a. O., beschrieben.

C. EDA&spplus;- und Tenascin-Anfärbung

Glomeruli wurden mit Antikörpern, die EDA&spplus;-Fibronektin und Tenascin detektieren, angefärbt; diese Matrixkomponenten werden relativ spezifisch durch TGF-β induziert. Monoklonaler Maus- Antikörper, hergestellt gegen humanes Fibronektin, das die Extra-Domäne A (EDA+) enthielt, wurde freundlicherweise von Dr. L. Zardi, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italien, zur Verfügung gestellt. Kaninchen-anti-human-Tenascin- Antikörper wurde von Telios Pharmaceuticals, Inc. (La Jolla, CA) erhalten. Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertes Ratten-F(ab')2- anti-Maus-IgG und Esel-F(ab')2-anti-Kaninchen-IgG wurden als sekundäre Antikörper verwendet (Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, PA). Die Technik zur Bestimmung des Matrix-Scores und die Methode der statistischen Analyse für die EDA&spplus;-Fibronektin- und Tenascin-Anfärbungen sind die gleichen wie für Fibronektin, die vorstehend beschrieben wurden.

D. Ergebnisse

Fig. 8 zeigt, daß vier oder sechs tägliche Injektionen von rekombinantem Decorin oder Rinder-Decorin eine Fibronektin-Ablagerung auf ein Niveau, das sich nicht signifikant von jenem, das bei den normalen Ratten gefunden wird, unterscheidet, supprimieren. Kontrollinjektionen bestanden aus Puffer allein, einem unterschiedlichen Proteoglykan und zwei Proteinen. Ein Knorpel- Proteoglykan, Aggregan, wurde als ein negativ geladenes Molekül verwendet, um eine Kontrolle bezüglich der Glykosaminoglykankette von Decorin durchzuführen; Aggregan inhibiert TGF-β nicht, wie von Yamaguchi et al., a. a. O., beschrieben wurde. Ovalbumin wurde als eine Kontrolle für das Core-Protein von Decorin verwendet, da beide Proteine ungefähr die gleiche Molekülgröße aufweisen. Serumalbumin wurde als eine damit nicht verwandte Proteinkontrolle verwendet. Fig. 8 zeigt, daß die Proteoglykan- und Protein-Kontrollen von glomerulonephritischen Ratten, denen Puffer allein injiziert worden war, nicht unterschieden werden konnten. Zwei Injektionen von Decorin, die frühzeitig in dem Erkrankungsprozeß gegeben wurden, hatten ebenfalls keinen Effekt auf die Fibronektin-Akkumulation.
Wie quantitativ in Fig. 9 gezeigt, ist EDA&spplus;-Fibronektin in Glomeruli von normalen Ratten nur in Spurenmengen anwesend und ein ähnlicher Befund wurde für Tenascin erhalten. Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl EDA&spplus;-Fibronektin als auch Tenascin in nephritischen Glomeruli in Ratten, die ohne oder mit zwei Injektionen von Decorin behandelt worden waren, stark erhöht waren. Jedoch verringerten, wie es auch der Fall mit ganzem Fibronektin war, 4 oder 6 Injektionen von Decorin die Ablagerung dieser 2 Marker der TGF-β-Aktivität stark (Fig. 9). Eine histologische Analyse von Periodsäure-Schiff-angefärbten Schnitten der gleichen Nieren zeigte einen vergleichbaren Effekt von Decorin bei der Verhinderung der Zunahme der glomerulären extrazellulären Matrix und der damit verbundenen glomerulären Vergrößerung, die bei der Erkrankung auftritt.
Für 4 oder 6 Tage verabreichtes Decorin supprimiert auch die Entwicklung von Proteinurie. Das Verhältnis der Harn-Proteinkonzentration zu der Harnkonzentration an Kreatinin wurde verwendet, um Proteinurie zu bestimmen, da dieses Verfahren den Einfluß von Unterschieden im Harnvolumen auf die Proteinäusscheidungswerte minimiert, wie von Ginsberg et al., a. a. O., beschrieben wurde. Mittelwerte für normale Tiere, Erkrankungs- Kontrollen, mit einer geringen Dosis von Decorin (2 Injektionen) und einer hohen Dosis von Decorin behandelte Ratten (4 und 6 Injektionen) betrugen 0,7, 15,2, 14,8 bzw. 2,4 (p < 0,01 für Ratten mit einer hohen Dosis an Decorin im Vergleich zu Erkrankungs-Kontröllen).
Diese Ergebnisse zeigen einen dramatischen Effekt von Decorin bei der Verhinderung der Ablagerung von extrazellulärer Matrix in geschädigten Glomeruli von nephritischen Ratten. Bereits früher war gezeigt worden, daß die Akkumulation extrazellulärer Matrix bei Glomerulonephritis durch eine Überproduktion von TGF- β verursacht wird (Okuda et al., a. a. O.; Border et al., (1990) a. a. O.). Daß eine Matrixakkumulation in diesem Modell durch Decorin-Injektion verhindert wurde, zeigt eine in vivo-Aktivität von Decorin bei der Supprimierung von TGF-β.

Claims

1. Verwendung von Decorin oder Biglycan zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer Erkrankung, die durch eine Akkumulation extrazellulärer Matrix in einem Gewebe gekennzeichnet ist, wobei die Erkrankung eine diabetes-assoziierte Erkrankung ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung Diabetische Nephropathie ist.

3. Verwendung von Insulin und Decorin oder Biglycan zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung Diabetischer Nephropathie.

4. Zusammensetzung, die (a) Insulin und (b) Decorin oder Biglycan umfaßt.