JPH0797395A - ポルフイロモナス・ジンジバリス線毛蛋白質の配列を含有するペプチド類及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ポルフィロモナス・ジンジバリス線毛を構成
する４１ＫＤサブユニット蛋白質のアミノ酸配列由来の
フラグメントに対応するペプチド（アミノ酸残基５〜１
０個）もしくはその誘導体またはそれらの塩が提供され
る。またこれらを含んでなる歯周病診断用組成物、これ
らの一部を含んでなる歯周予防ワクチン、ならびにかか
るペプチドで動物を免疫して得られる抗体を含んでなる
歯周病予防用または治療用口腔組成物が提供される。 【効果】 前記蛋白質およびそのアミノ酸残基２０個か
らなるペプチドに比し、非特異的反応性が低減し、前記
組成物についてより安全に使用できるペプチドが提供さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）線毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質
のアミノ酸配列由来のフラグメントに対応するペプチド
類およびその用途に関する。より具体的には、本発明は
上記４１ＫＤサブユニット蛋白質に対する抗体と抗原抗
体反応を行う抗原として作用するペプチド類、ならびに
そのペプチド類の歯周病患者の血清、唾液および歯肉溝
液中の特異抗体等の検出および歯周病の予防剤および治
療剤への使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】歯周病は、歯肉炎と歯周炎に分けられ、
更に、歯周炎には、成人性歯周炎、限局性若年性歯周炎
などがあるが、実際には、歯周炎の９０％以上が成人性
歯周炎で占められている。これらの歯周病は、歯肉の炎
症、出血、排膿、歯周ポケットの形成、歯根膜の破壊、
歯槽骨の吸収、歯の動揺や喪失にまで至る疾患である。
そして、これらの歯周病の病巣局所には、種々の細菌が
存在するが、これらの中でもポルフィロモナス・ジンジ
バリスが、主たる歯周病原性細菌、特に成人性歯周炎の
原因菌と目され、歯周病の病巣局所では、同細菌の顕著
な増加が認められる。

【０００３】現在、歯周病の治療法は、完全には確立さ
れておらず、できるだけ早期に歯周病を発見し、その病
態を正確に把握し、適切な処置を施すことが最も重要で
あるとされ、更には歯周病ワクチンの開発によるその予
防が望まれている。

【０００４】まず、歯周病の診断に関しては、できるだ
け早期に歯周病を発見し、その病態を正確に把握する診
断方法が期待されているが、実際には、信頼できる歯周
病診断薬は今だに開発されていない。しかし、あえて列
挙するならば、歯周病原性細菌に注目し、歯周病の診断
の手段として、その歯周病原性細菌の存否、ならびに多
寡を知るための種々の方法がある。また、歯周病原性細
菌に対する特異抗体を測定して、歯周病の診断に利用す
る方法が提案されている。更には、歯周病患者の歯肉溝
液中の炎症性産物の測定による方法が提案されている。

【０００５】歯周病原性細菌の存否、ならびに多寡を知
るための種々の方法がある。例えば、歯周病患者の歯垢
（プラーク）、歯肉溝液、および唾液などに棲息する歯
周病原性細菌を血液寒天培地を用いて嫌気的条件下で培
養し、得られた種々のコロニーの詳細な生化学的性状を
調べることにより、歯周病原性細菌を検出することが行
われた（Ｌｏｅｓｃｈｅ，Ｗ．Ｊ.，Ｓｙｅｄ，Ｓ．
Ａ.，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，
Ｅ．Ｃ．：Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．５６，４４７−４
５６，１９８５．など）。

【０００６】顕微鏡下で、歯周病患者の歯垢（プラー
ク）、歯肉溝液および唾液などに棲息する歯周病原性細
菌のグラム染色を行い観察したり、暗視野顕微鏡によっ
て調べたり（Ｌｉｓｔｇａｒｔｅｎ，Ｍ．Ａ．およびＬ
ｅｖｉｎ，Ｓ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏ
ｌ．８，１２２−１３８，１９８１．など）、歯周病原
性細菌に対する抗体と蛍光色素を組み合わせて、歯周病
原性細菌を検出することも行われてきた（Ｚａｍｂｏ
ｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｏｃｈａｃｋｉ，Ｖ．およびＧｅｎｃ
ｏ，Ｒ．Ｊ．：Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１，３９‐４４，１９８６．）。

【０００７】また、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）等の免
疫学的手法を用いて、歯周病患者の歯垢（プラーク）、
歯肉溝液および唾液などに棲息する歯周病原性細菌を、
それぞれの歯周病原性細菌に対する抗体で検出すること
が行われた（Ｚａｍｂｏｎ，Ｊ．Ｊ.，Ｂｏｃｈａｃｋ
ｉ，Ｖ．およびＧｅｎｃｏ，Ｒ．Ｊ．：Ｏｒａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，３９-４４，１
９８６．、特開昭６３−１５９７６２号、特開平２−１
０７９７０号、同４−２１２０６１号、同４−３５５３
３９号、同５−１０９５４号公報、欧州特許出願公開第
２３９,７７６号明細書参照）。

【０００８】更に歯周病原性細菌の産生する酵素に着目
し、その酵素活性を指標にして、歯周病患者の歯垢（プ
ラーク）、歯肉溝液および唾液などに棲息する歯周病原
性細菌を検出することも行われてきた（Ｌｏｅｓｃｈ
ｅ，Ｗ．Ｊ.，Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１，６５-７０，１９８６．、特開平１−１
４４９９７号、同１−１４４９９８号、同２−４９９
号、同４−２２９１９８号公報参照）。

【０００９】最近では、歯周病原性細菌の遺伝子に注目
し、ＤＮＡプローブ法を用いて、歯周病患者の歯垢（プ
ラーク）、歯肉溝液および唾液などに棲息する歯周病原
性細菌を検出することも行われている（ＤＭＤｘ（商
標）、ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
社、特開平２−１３５０９６号、同３−５０２６４０号
公報参照）。更にＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、極微量の菌体をも
検出することが可能となってきている。

【００１０】しかし、以上に述べた様な歯周病原性細菌
の存否、ならびに多寡を知る歯周病の診断方法は、病因
の診断だけに過ぎず、患者の病態を把握するには不十分
である。これと対をなすものとして、宿主である患者側
の歯周病原性細菌に対する応答を知り、患者の病態を把
握するための歯周病の診断方法として、歯周病原性細菌
に対する特異抗体、更にはそのクラスやサブクラスを知
る歯周病の診断方法が考えられる。勿論、歯周病原性細
菌の存否、ならびに多寡を知る歯周病の診断方法も重要
であり、両方法を組み合わせることにより、適切な歯周
病の診断を行うことが重要であると言われている。

【００１１】このような診断方法のひとつとして、成人
性歯周炎患者の歯周病原性細菌に対する特異抗体価をＥ
ＬＩＳＡ法で測定し、細菌検査とあわせて個々の患者の
歯周病の診断をする方法が提案されている（Ｍｏｕｔｏ
ｎ，Ｃ.，ｅｔ ａｌ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３１，１８２−１９２，１９８
１．、特開昭６１−１６２７５３号、特開平２−１０７
９６９号公報参照）。

【００１２】また、最近では、歯周病患者の歯周病原性
細菌に対する特異抗体の上昇だけでなく、歯周病の病態
の変化と共に、その特異抗体のサブクラスが、ＩｇＧ₁
からＩｇＧ₄に変動することを基にした歯周病の診断方
法が効果的である可能性が、成人性歯周炎患者の歯肉組
織中の歯周病原性細菌に対する抗体産生細胞を検出する
ＥＬＩＳＰＯＴ法により証明されている（Ｔ．Ｏｇａｗ
ａ ｅｔ ａｌ：Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
７６，１０３−１１０，１９８９．）。

【００１３】歯周病患者の歯周病原性細菌に対する特異
抗体の上昇、更にはそのクラスやサブクラスの変動を調
べる場合、検出に用いる抗原が必要になる。前述の従来
法では、抗原として、歯周病原性細菌全体、またはその
菌体表層成分、例えば、リポ多糖体や線毛などが用いら
れてきた。しかし、これらは、分離・精製して純粋なも
のを大量に取得することが困難であり、夾雑反応も多
く、正確な歯周病患者の歯周病原性細菌に対する特異対
抗の上昇、更には、そのクラスやサブクラスの変動を調
べるには好ましくない。

【００１４】ＢＢＲＣ．１８０，Ｎｏ．３，１３３５‐
１３４１（１９９１）は、ポルフィロモナス・ジンジバ
リス線毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質分子に
おいて、２０個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドの
免疫原性について報告している。

【００１５】また、歯周病患者の歯周病原性細菌に対す
る特異抗体を検出するために、歯周病原性細菌由来の成
分を用いることが、特開平２−１３５０９６号公報で示
されているが、この中で示されているポルフィロモナス
・ジンジバリス由来の抗原蛋白質は、本発明にいうポル
フィロモナス・ジンジバリス線毛とは物質が全く異な
り、また、全蛋白質を用いることによる抗原調製の煩雑
さがあり好ましくない。その他に歯周病の診断方法の１
つとして、炎症性産物を測定する方法がある。例えば、
コラゲナーゼ（Ｐｅｒｉｏｃｈｅｃｋ（商標）：Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）、カテプシン様活性
（Ｐｒｏｇｎｏ Ｓｔｉｃｋ：Ｄｅｎｔｓｐｌｙ Ｃｏ
ｒｐ.，Ｙｏｒｋ ＰＡ．）、グルクロニダーゼ（Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃ
ｈｉｃａｇｏ．ＩＬ．）を測定する方法が提唱されてい
る。しかし、これらの方法は、特異性の点で問題があ
る。

【００１６】特公平３−１３２０５号、特開昭６１−１
４０５２７号、特開平５−１３２４２８号公報では、ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス線毛を歯周炎（または歯
周病）予防ワクチンとして用いることを提案している。
しかしながら、これらの中で述べられている様な方法で
分離・精製した線毛を用いることには多くの問題点、即
ち、線毛を分離・精製して用いる場合、線毛以外の物
質、例えば、発熱性物質であるリポ多糖体等の線毛以外
の菌体成分の混入が考えられ、ワクチンとしては好まし
くない。また、ＢＢＲＣ．１８０，Ｎｏ．３，１３３５
‐１３４１（１９９１）の中で、この線毛自体、様々な
生物活性を発現することが示されている様に、この線毛
全体を用いることは、ワクチンとしての作用以外の作
用、例えば、起炎作用、発熱作用を引き起こす可能性が
あり、好ましいことではない。

【００１７】ところで、特開平２−１３５０９６号明細
書においてワクチンとして用いることが示されているポ
ルフィロモナス・ジンジバリス由来の抗原蛋白質は、本
発明によるポルフィロモナス・ジンジバリス線毛のペプ
チドとは、アミノ酸配列が異なり、また、この抗原蛋白
質全体を用いることによるワクチン調製の煩雑さ、ワク
チンとしての作用以外の作用、例えば、起炎作用、発熱
作用を引き起こす可能性があり好ましいものではない。
また、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３２７，２
５５‐２６２，１９９２で示されているポルフィロモナ
ス・ジンジバリス線毛の合成ペプチドは、本発明のポル
フィロモナス・ジンジバリス線毛のペプチドとは領域が
異なり、同様に、全蛋白質を用いることによるワクチン
調製の煩雑さ、ワクチンとしての作用以外の作用、例え
ば、起炎作用、発熱作用を引き起こす可能性があり好ま
しくない。

【００１８】特開昭６０−１４２９１５号、同６１−２
７７６３２号、同６１−２８９０２４号、同６２−４１
７号、特開平１−３１３４３８号、同２−５３４５８
号、同２−５３７１６号、同２−２１８６２０号、同４
−５９７３６号、同４−５９７３７号、特公平４−６３
８６５号公報では、ポルフィロモナス・ジンジバリス全
菌体や線毛蛋白を免疫して得られる抗体を含む口腔組成
物を提唱している。しかし、これらの方法で調製された
全菌体や線毛蛋白に対する抗体は、目的とする抗原以外
のものと交叉反応を起こす可能性があり、本目的には好
適なものではない。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、歯周
病患者の歯周病原性細菌に対する特異抗体の上昇、更に
はそのクラスやサブクラスの変動を効果的に検出できる
ペプチド類およびそのペプチド類を含む歯周病診断用組
成物の提供にある。また、本発明の目的は、かかるペプ
チド類のうち、ワクチンとして所望の作用以外の副作用
を実質的に伴わないペプチド類を含んでなる歯周病予防
ワクチンおよびこのように選ばれたペプチド類で動物を
免疫して得られる抗体を含んでなる歯周病予防用または
治療用口腔組成物を提供することにある。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、ポルフィロモナス・ジンジバリス線毛を
構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質のアミノ酸配列由
来のフラグメントに対応する各種合成ペプチドについ
て、前記蛋白質に対する抗体との抗原抗体反応性、およ
びそれらの生物活性について研究してきたところ、意外
にもアミノ酸残基が５〜１０個からなるペプチドが非常
に優れた特性を有することを見い出した。すなわち、上
述するように、ＢＢＲＣ．１３０，Ｎｏ．３，１３３５
‐１３４１，１９９１には前記蛋白質のアミノ酸配列由
来のフラグメントに対応する２０個のアミノ酸残基から
なる合成ペプチドが公表されているが、本発明のペプチ
ド類は、これらの合成ペプチドに比べ非特異的反応性が
低減し、そのため、各種用途分野で遥かに安全に使用で
きることを確認し本発明を完成した。

【００２１】従って、本発明によれば、ポルフィロモナ
ス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）線毛を構成する４１ＫＤサブユニッ
ト蛋白質のアミノ酸配列由来のフラグメントに対応する
ペプチドであって、前記フラグメントが５〜１０個のア
ミノ酸残基からなるフラグメント群から選ばれたことを
特徴とするペプチドもしくはその誘導体またはそれらの
塩が提供される。

【００２２】本発明の好ましい態様によれば、前記フラ
グメントが下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１〜
９を参照のこと）の連続する少なくとも５個のアミノ酸
残基からなるフラグメント群から選ばれた前記ペプチド
もしくはその誘導体またはそれらの塩が提供される。

【００２３】 Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Asp Ile Lys
（配列番号１）； Glu Val Lys Ala Leu Thr Thr Glu Leu Thr
（配列番号２）； Ala Glu Asn Gln Glu Ala Ala Gly Leu Ile
（配列番号３）； Ala Ala Gly Leu Ile Met Thr Ala Glu Pro
（配列番号４）； Thr Gly Ser Leu Thr Thr Phe Asn Gly Ala
（配列番号５）； Thr Phe Asn Gly Ala Tyr Thr Pro Ala Asn
（配列番号６）； Gly Phe Tyr Val Leu Glu Asn Asp Tyr Ser
（配列番号７）； Ala Asn Gly Gly Thr Ile His Pro Thr Ile
（配列番号８）；および Glu Gly Lys Thr Tyr Tyr Pro Val Leu Val
（配列番号９）。

【００２４】本発明の別の態様によれば、前記ペプチド
もしくはその誘導体またはそれらの塩の１種または２種
以上の組み合わさったものを含有することを特徴とする
歯周病診断用組成物が提供される。

【００２５】また本発明のもう一つの態様によれば、前
記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩から選
ばれるものであって、前記ペプチドが配列表の配列番号
１または７に示されるアミノ酸配列の連続する少なくと
も５個のアミノ酸残基からなるフラグメント群から選ば
れたことを特徴とするものを主成分として１種または２
種以上組み合わさって含んでなる歯周病予防ワクチンが
提供される。

【００２６】さらにまた本発明のもう一つの態様によれ
ば、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩
から選ばれるものであって、前記ペプチドが配列表の配
列番号１または７に示されるアミノ酸配列の連続する少
なくとも５個のアミノ酸残基からなるフラグメント群か
ら選ばれたことを特徴とするもので動物を免疫して得ら
れる抗体を含んでなる歯周病予防用または歯周病治療用
口腔組成物が提供される。

【００２７】

【発明の具体的な態様】本発明にいうポルフィロモナス
・ジンジバリス線毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋
白質のアミノ酸配列は、Ｄ．Ｐ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，Ｎ
ｏ．４，１６５８‐１６６５，１９８８に公表されてい
る配列を意味する。

【００２８】従って、本発明のペプチドは、そのアミノ
酸配列由来のフラグメントに対応するもののうち、５〜
１０個のアミノ酸残基からなるペプチドであって、本発
明の目的に適するものであればすべて包含される。これ
らのペプチドのうち、歯周病患者の血清と反応させた場
合に抗原性の高い領域を有するものが本発明の目的上、
殊に好ましく、それらの具体的なものとしては、前記配
列番号１〜９のアミノ酸配列の連続する少なくとも５個
のアミノ酸残基からなる各種鎖長のペプチドを挙げるこ
とができる。

【００２９】これらの各種鎖長のペプチドは、最低５個
のアミノ酸残基を有することにより、本発明の抗原とし
て用いることができ、また、最大１０個のアミノ酸残基
を有するものまでに限定することにより、上述の非特異
的反応性を低減することができる。従って、本発明のペ
プチドの具体的なものとしては、前記配列番号１〜９の
アミノ酸配列の内で、連続する５個、６個、７個、８
個、９個または１０個のアミノ酸残基からなるペプチド
が挙げられる。例えば、前記５個のアミノ酸残基を有す
るもののうち、好ましい具体的なペプチドの一例として
は、下記の配列表の配列番号１０で示されるものが挙げ
られる： Glu Asn Ala Thr Lys（配列番号１０）。

【００３０】本発明にいう誘導体とは、前記ペプチド
に、保護基、官能基、スペーサーおよび担体等を結合さ
せたものをいう。より具体的には、本発明のペプチドの
Ｎ末端がアセチル基またはウレタン基等で保護されたも
のや、Ｃ末端がアミド基またはエステル基等で保護され
たものが、保護基を有する誘導体の例である。また、ペ
プチドを直接または間接的に固相や担体へ化学結合する
場合、そのペプチド自体のアミノ基やカルボキシル基等
を利用できるが、フェノール基やスルフヒドリル基を利
用するために、本発明のペプチドヘチロシンやシステイ
ンを導入したものも本発明の誘導体に包含される。さら
に、抗体が本発明のペプチドに結合する場合に、立体障
害をうけにくくする目的でスペーサーを導入することが
できるが、このようなスペーサーが導入されたものも前
記誘導体に包含される。かかるスペーサーの具体的なも
のとしては、α,ω‐ジアミノアルカン（ｎ＝２〜１
２）；α‐アミノ‐ω‐カルボキシアルカン（ｎ＝２〜
１０）；３,３′‐ジアミノジプロピルアミン；サクシ
ニル‐３,３′‐ジアミノジプロピルアミン；ビスジア
ゾベンチジンを結合したｍ‐アミノフェノール；Gly‐G
ly‐Gly；Gly‐Gly‐Tyr；サクシニル‐１,３‐ジアミ
ノプロパン‐２‐オール；ポリリジン等が挙げられる。

【００３１】担体が結合した本発明の誘導体としては、
上記スペーサーと共通に使用されるリジン、各種ポリマ
ーまたはウシ血清アルブミン等が結合したものや、また
ペプチドを免疫原とする場合に使用されるウシ血清アル
ブミン、テタヌストキソイド、オボアルブミン、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、サイログロブリン、γ‐
グロブリン、多糖等が結合したものが包含される。

【００３２】前記ペプチドまたは前記誘導体の塩として
は、ペプチド自体またはその誘導体が一級、二級もしく
は三級のアミノ基をもつ場合には、それらと造塩作用の
ある塩酸、硫酸、燐酸、ピロ燐酸等の無機酸との塩、酢
酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、プロピオン
酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、シ
ュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ‐
トルエンスルホン酸等の有機酸との塩などの酸付加塩が
挙げられる。一方、ペプチド自体またはその誘導体がカ
ルボキシル基、スルホニル基をもつ場合には、それらの
ナトリウム塩、カルウム塩等のアルカリ金属塩、カルシ
ウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アン
モニウム塩、トリエチルアミン塩等の塩が挙げられる。

【００３３】本発明のペプチドは、ポルフィロモナス・
ジンジバリス線毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白
質の限定分解によって得ることもできるが、それ自体公
知のペプチド合成法によるのが有利である。このような
ペプチド合成法としては、例えば化学合成法〔固相合成
法、液相合成法（日本化学会編、実験化学講座２２、有
機合成ＩＶ、第２５８‐３０９頁等参考、平成４年１１
月３０日、丸善株式会社発行）〕および遺伝子工学的手
法によって達成することができる。

【００３４】この場合に、ＭＵＬＴＩ‐ＰＩＮ ＰＥＰ
ＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＫＩＴ（ＣＨＩＲＯＮ
ＭＩＭＯＴＯＰＥＳ ＰＴＹ ＬＴＤ：Ａｕｓｔｒａ
ｌｉａ）やＭｏｄｅｌ ９０５０ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）を用いて合成することができる。

【００３５】こうして得られたペプチドからの誘導体
は、ペプチド化学の技術分野で通常用いられる化学的修
飾手段によって得ることができる。例えば、ペプチドへ
前記担体を化学結合させる場合には、グルタルアルデヒ
ド、水溶性カルボジイミド、スクシンイミド等を用いる
方法が利用できる。

【００３６】歯周病患者の特異抗体を検出するために
は、前記ペプチドもしくはその誘導体またはそれらの塩
の１種または２種以上を組み合わせて使用することがで
きる。この検出に用いることのできる免疫学的手段は既
知の方法が使用でき、これらの例としては、ポリスチレ
ンプレート、ガラスフィルター、磁性粒子、ラテックス
等を固相とし、標識二次抗体で歯周病患者の特異抗体を
検出するＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、化学発
光抗体法等や、羊赤血球・ラテックス等を固相とした免
疫凝集法、ラテックス等を固相とした免疫比濁法、なら
びにニトロセルロース膜等を固相としたウェスタンブロ
ット法等が挙げられる。固相への前記ペプチド、それら
の誘導体およびその塩を固定化する方法も種々の公知の
方法が利用でき、物理的に吸着させる方法、グルタルア
ルデヒド等を用いて化学的に固定化する方法等が挙げら
れる。

【００３７】また、歯周病患者の抗体を固相に固定化す
るために、ヒト抗体に対する抗体を用いたり、物理的に
吸着させた後、標識ペプチドによる種々の免疫学的手法
が利用できる。

【００３８】本発明のペプチドを歯周病予防ワクチンと
して用いる場合には、これを担体蛋白質、例えば、ウシ
血清アルブミン、テタヌストキソイド等に吸着させるこ
ともできる。その他、水酸化アルミニウムやミョウバ
ン、及び合成アジュバントであるムラミルジペプチド等
のアジュバンドと共に経口的投与、または非経口的に局
所投与できる。非経口的局所投与としては、例えば、皮
下、皮内、筋肉内、静脈内等も良いが、歯周病は歯肉局
所という限られた部位での免疫応答が知られていること
から、歯肉内に投与することもできる。アジュバントと
して、水酸化アルミニウムゲルをアルミニウムの最終濃
度が、０.０５−０.２ｍｇ／ｍｌとなるように加えるの
が望ましい。１回に投与するワクチン中のペプチドの含
量は、０.００４−２.５ｍｇが好適で、好ましくは０.
０２−０.６ｍｇである。防腐剤としてチメロサール０.
０１％（ｗ／ｖ）を加えるのが好ましい。

【００３９】また、前記ペプチドをワクチンとして直接
用いるのではなく、ウシやニワトリ等に免疫し、得られ
る血清、牛乳、卵に含まれる特異抗体を含有する口腔組
成物を歯周病予防や治療に用いる事もできる。

【００４０】本発明のペプチドで哺乳動物を免疫する方
法としては、通常行われているように、例えば、ペプチ
ドを牛血清アルブミンやテタヌストキソイド等の担体に
結合させた複合体を、フロイント完全アジュバントや水
酸化アルミニウム等のアジュバントと一緒に生体に投与
してもよい。

【００４１】免疫される哺乳動物としては、ヤギ、ヒツ
ジ、ウマ、ウシ等が用いられる。前記ペプチドと担体と
の複合体で哺乳動物を免疫することによって得られる特
異抗体を含む抗血清や乳を使用する場合、特異抗体を含
む抗血清や乳を数種類混合してもよい。

【００４２】鶏卵による前記ペプチドに対する抗体の調
製は、例えば、ペプチドをウシ血清アルブミンやテタヌ
ストキソイド等の担体に結合させた複合体を、フロイン
ト完全アジュバントや水酸化アルミニウム等のアジュバ
ントと一緒に、鶏に１〜２回免疫し、１〜２ヶ月後よ
り、集卵して卵黄を分離し、リン酸生理食塩水とクロロ
ホルムを加えて撹拌した後、上層の水可溶性部分を分離
して、特異抗体を調製してもよい。

【００４３】また、本発明により調製されたペプチドに
対する抗体は、乳化液、分散液、ペースト、ゲル、また
はエアゾールとして配合することができる。具体的に
は、歯磨き、チューインガム、マウスウオッシュ、うが
い薬等の物質中に配合することができる。

【００４４】また、本発明のペプチドは、特異抗体の製
造に使用でき、このような特異抗体は、歯周病の診断あ
るいは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの感染に対す
る予防手段として受動免疫に利用できる。

【００４５】更にまた、本発明のペプチドは、ポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体の産生に使用でき
る。ポリクローナル抗体の取得には、普通に使用される
大、小の動物のいずれを用いてもよい。宿主動物にペプ
チドを免疫した後、抗体を公知の方法により、回収する
ことができる。一方、モノクローナル抗体の取得には、
ペプチドをマウスに免疫し、そのＢリンパ球と骨髄腫細
胞とを融合して得ることができる。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

【００４７】実施例１ ＭＵＬＴＩ ＰＩＮ ＰＥＰＴ
ＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＫＩＴを用いた部分ペプ
チドの合成 ＣＨＩＲＯＮ ＭＩＭＯＴＯＰＥＳ ＰＴＹ ＬＴＤ
（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）社製のＭＵＬＴＩ−ＰＩＮ Ｐ
ＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＫＩＴ（Ｎｏｎ−
Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｔｙｐｅ：Ｃｏｄｅ Ｎｏ．５９
３−２８２０１）を用いて、Ｄ．Ｐ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，Ｎｏ．４，１
６５８‐１６６５、１９８８）の求めたポルフィロモナ
ス・ジンジバリス３８１株線毛の推定アミノ酸配列を基
に、１０個のアミノ酸残基から成るペプチドをＮ末端側
から５個置きに合成した。

【００４８】まず、ピンの先端をＤｉｍｅｔｙｌｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）中に２分間浸した後、Ｍｅｔｈ
ａｎｏｌ（ＭｅＯＨ）中で１０分間、３回振盪し、洗浄
した。３０分間風乾した後、２０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ
ｅ／ＤＭＦに３０分間浸し、脱保護する。次に、ＤＭＦ
中に１０分間浸した後、Ｍｅｔｈａｎｏｌ（ＭｅＯＨ）
中で２分間、４回振盪し、洗浄した。３０分間風乾した
後、ＤＭＦ中に５分間浸した後、各Ｆｍｏｃ−アミノ酸
溶液（６０ｍＭ）／ＤＭＦ＋１２０ｍＭ １−Ｈｙｄｒ
ｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、Ｍｏｎｏｈｙｄｒ
ａｔｅ（ＨｏＢｔ）に浸し、室温で１６時間反応し、目
的のアミノ酸をカップリングさせた。翌日から、同様に
して、次のアミノ酸をカップリングする操作を繰り返し
た。

【００４９】そこで、目的のアミノ酸残基１０個までの
カップリングが終了したら、ＤＭＦ中に２分間浸し、膨
潤させた後、ＭｅＯＨ中で１０分間、３回振盪し、洗浄
した。３０分間風乾した後、２０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ
ｅ／ＤＭＦに３０分間浸し、脱保護する。次に、ＤＭＦ
中に１０分間浸した後、ＭｅＯＨ中で２分間、４回振盪
し、洗浄した。３０分間風乾した後、ＤＭＦ：無水酢
酸：トリエチルアミン＝５０：５：１の混合液に９０分
間浸し、アセチル化した後、ＭｅＯＨ中で２分間、振盪
し、洗浄した。１５分間風乾した後、トリフルオロ酢
酸：エタンジチオール：チオアニソール＝９５：２.
５：２.５の混合液に６０分間浸し、脱保護した。１０
分間風乾した後、１５分間超音波洗浄し、更に１０分間
風乾した。

【００５０】試験例１ 歯周病患者の血清を用いたエピトープの解明 実施例１で合成したペプチドと歯周病患者の血清を用い
て、ＥＬＩＳＡ法により、エピトープの解明を行った。

【００５１】まず、ペプチドの結合しているピンの先端
を２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸緩衝生理
食塩水＋Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）に浸し、室温で１
時間ブロッキングした後、ＰＢＳＴで５分間、３回振盪
して洗浄した。次に、一次抗体として、あらかじめポル
フィロモナス・ジンジバリス線毛を加え吸収操作を施し
たものと未吸収の健常者または患者血清を用意し、これ
を０.１％Ｃasein／ＰＢＳＴで１０⁵倍に希釈し、４℃
で１６時間反応させた。ＰＢＳＴで５分間、３回振盪し
て洗浄した後に、二次抗体としてアルカリホスファター
ゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（１０³倍希釈）／０.１％Ｃａ
ｓｅｉｎ／ＰＢＳＴを３７℃、３時間反応させた。ＰＢ
ＳＴで５分間、３回振盪して洗浄した後に、ｐ‐ニトロ
フェニルホスフェイト／ジエタノールアミンバッファー
中で、３７℃、３時間反応させ、吸光度（４０５ｎｍ）
を測定し、吸収操作前後の吸光度の差が、０.２以上の
ものを選んだ。また、これらのペプチドは、０.１Ｍリ
ン酸バッファー（ｐＨ７.２）＋１％ＳＤＳ＋０.１％
２‐メルカプトエタノール（５５〜６５℃）中で１０分
間超音波洗浄、蒸留水（６０℃）で３０秒間２回振盪し
て洗浄し、更に、３０分間振盪して洗浄した。次に、メ
タノールで１５秒間煮沸した後、１５分間風乾し、次の
ＥＬＩＳＡ法に供した。

【００５２】以上の結果より、歯周病患者血清と反応す
る特有のエピトープが見いだされた。その結果を表１に
示す。

【００５３】

【表１】 表１ 歯周病患者血清と反応する特有のエピトープ アミノ酸配列 略称 Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Asp Ile Lys：ペプチド１ Glu Val Lys Ala Leu Thr Thr Glu Leu Thr：ペプチド２ Ala Glu Asn Gln Glu Ala Ala Gly Leu Ile：ペプチド３ Ala Ala Gly Leu Ile Met Thr Ala Glu Pro：ペプチド４ Thr Gly Ser Leu Thr Thr Phe Asn Gly Ala：ペプチド５ Thr Phe Asn Gly Ala Tyr Thr Pro Ala Asn：ペプチド６ Gly Phe Tyr Val Leu Glu Asn Asp Tyr Ser：ペプチド７ Ala Asn Gly Gly Thr Ile His Pro Thr Ile：ペプチド８ Glu Gly Lys Thr Tyr Tyr Pro Val Leu Val：ペプチド９ 実施例２ ペプチド合成装置を用いたペプチドの合成 試験例１で見いだされた歯周病患者血清と反応する特有
のエピトープをＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９‐２１５４，１
９６３）の固相法に準じて、Ｍｏｄｅｌ ９０５０ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて合成した。精
製は、逆相ＨＰＬＣにてＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１
８ ＳＧ１２０（１.５×１５ｃｍ：資生堂）カラムを
用いて、アセトニトリルの濃度勾配（６〜６０％）によ
り主要なピークのペプチド画分を回収した。精製したペ
プチドは、定量的アミノ酸分析により組成を、また、Ｍ
ｏｄｅｌ ６４００／６６００ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ（日本ミリポア）を用いた自動エドマン
分解により、アミノ酸配列をそれぞれ確認した。

【００５４】試験例２ ペプチドを用いた歯周病患者血
清の特異抗体の測定 実施例２で合成した各ペプチド１ｍｇを０.１Ｍリン酸
緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６.０）１ｍｌに溶解し、硫酸化
ＳＭＣＣ（ピアース社製）５ｍｇを加え、３０℃、３０
分間インキュベートしマレイミド化した後、セファデッ
クスＧ‐１０カラムクロマトにかけ、第一溶出画分を集
めた。また、牛血清アルブミン（ＢＳＡ：和光純薬社
製）を７ｍｇを０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍｌに溶解し、先のマレイミド化
ペプチドと混合し３０℃で１時間反応させた。生じたペ
プチド修飾ＢＳＡをセファデックスＧ‐５０カラムクロ
マトにかけ、第一溶出画分を集め、プレート調製用抗原
溶液とした。

【００５５】一方、対照として、６種のペプチドを実施
例２に習い合成し、同様にしてプレート調製用抗原溶液
を調製した。

【００５６】これらの抗原溶液を０.１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９.６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈し１００
ｍｌとした。ポリスチレン製マイクロタイタープレート
（イムノプレートＩＩ；マキシソープ型：ヌンク社製）
に１００μl／ウエル添加し、４℃で一晩放置後、マイ
クロタイター自動洗浄機（以下洗浄機と略；バイオラッ
ド社製）で各ウェルあたり２００μlのＰＢＳで３回洗
浄した。０.１％ゼラチン（新田ゼラチン社製）を含む
ＰＢＳを２５０μl／ウェル添加し、４℃で一晩静置し
プレートをブロッキングした。ブロッキング液を吸収除
去し、真空乾燥機にかけプレートを乾燥させ、アルミ袋
にいれ密封後、４℃で保管し以下の測定に用いた。

【００５７】歯周病患者（ｎ＝３）及び健常者（ｎ＝
３）の血清を試料とし、各血清を１０％牛血清を含むＰ
ＢＳに１００倍希釈した。各種抗原コートプレートにこ
の希釈液を１００μl添加し、３７℃で１時間インキュ
ベートした。洗浄機を用い２００μｌのＰＢＳＴで３回
洗浄した後、二次抗体として市販のパーオキシダーゼ標
識ヒトＩｇＧ抗体（１０³希釈）／０.１％Ｃａｓｅｉｎ
／ＰＢＳＴを１００μl加え、再び３７℃で１時間イン
キュベートした。洗浄機で同様に洗浄した後、ｏ‐フェ
ニレンジアミン溶液１００μlを加え、３７℃で３０分
間インキュベートし、０.１Ｎ硫酸１００μlを加え反応
を停止後、検体無添加の反応ウエルを対照として、マイ
クロプレートリーダー（バイオラッド社製）で吸光度
（４０５ｎｍ）を測定した。表２に各種抗原プレートを
用いた測定結果を示す。尚、測定値は歯周病患者群、及
び健常者群各３検体の平均吸光度で示す。

【００５８】用いたペプチドのうち、アミノ酸配列が表
１のものにおいて、歯周病患者群に特異的な反応性が認
められた。従って、これらのペプチドを抗原として用い
ることにより、歯周病患者血清中に含まれる抗ポルフィ
ロモナス・ジンジバリス線毛抗体を検出することがで
き、歯周病患者のスクリーニングに有用であることが判
明した。

【００５９】

【表２】 〔表２〕各種ペプチドコートプレートを用いた 歯周病患者群血清及び健常者血清の抗体価測定 コートペプチド種類 歯周病患者群 健常者群 本発明のペプチド ペプチド１ 1.016 0.145 ペプチド２ 0.566 0.205 ペプチド３ 0.623 0.214 ペプチド４ 0.941 0.197 ペプチド５ 0.760 0.165 ペプチド６ 0.675 0.141 ペプチド７ 1.224 0.226 ペプチド８ 0.935 0.182 ペプチド９ 0.546 0.186 比較のペプチド Val Met Val Tyr Asn Gly Glu Gln Gln Glu 0.165 0.172 Arg Thr Leu Val Val Met Ala Asn Thr Gly 0.199 0.161 Asn His Ile Glu Asn Asp Pro Leu Lys Ile 0.205 0.201 Asp Ala Asn Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Thr 0.196 0.145 Trp Leu Ser Arg Asn Tyr Val Ala Pro Ala 0.210 0.204 Leu Cys Val Tyr Gly Lys Leu Gln Lys Asn 0.182 0.213 試験例３ ペプチドを用いたポルフィロモナス・ジンジ
バリスの感染阻止試験 実施例２で合成した各ペプチドをＦＩＡ（フロイント不
完全アジュバント）或はＦＣＡ（フロイント完全アジュ
バント）と共に油中水型乳化剤として５００μｇ／匹／
回でモルモット右側後肢足蹠に投与した。その後、２８
日目に１０¹¹ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌浮遊液２００μlを
同モルモットの右側横腹部を剃毛後、皮内に接種した。
２４時間後に、発赤の長径と短径を測定し、その積を求
めた。その積から阻止率を算出した。これらの結果を
〔表３〕に示すが、特にペプチド１とペプチド７が、ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して強い阻止効
果を示した。

【００６０】

【表３】 〔表３〕ペプチドを用いたポルフィロモナス・ジンジバリス 感染に対する阻止効果 試 験 群 発赤の程度 長径×短径 阻止率＊) (mm²) (％) ＦＩＡ^a) 1947 0 ＦＣＡ^b) 1784 8.3 ポルフィロモナス・ジンジバリス線毛＋ＦＩＡ 1571 19.3 ポルフィロモナス・ジンジバリス線毛＋ＦＣＡ 1486 23.7 ペプチド１＋ＦＣＡ 660 66.1 ペプチド２＋ＦＣＡ 1179 39.5 ペプチド３＋ＦＣＡ 1155 40.7 ペプチド４＋ＦＣＡ 851 56.3 ペプチド５＋ＦＣＡ 1063 45.4 ペプチド６＋ＦＣＡ 1112 42.9 ペプチド７＋ＦＣＡ 240 87.7 ペプチド８＋ＦＣＡ 1022 47.5 ペプチド９＋ＦＣＡ 1265 35.0 ａ） ＦＩＡ：フロイント不完全アジュバント ｂ） ＦＣＡ：フロイント完全アジュバント Ａ：ＦＩＡ接種群の長径×短径 Ｂ：本発明のペプチド接種群の長径×短径試験例４ マウスによるペプチドの免疫試験 実施例２で合成した各ペプチドをＰＢＳで２００μｇ／
ｍｌに溶解し、その等量のＦＣＡと混合、乳化後、マウ
ス（１群３匹）の背部皮下に注射した。４週間後に血清
や唾液中のペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡ法によ
り測定した。

【００６１】ＥＬＩＳＡ用９６ウェルマイクロタイター
プレートの各ウェルに、ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス線毛蛋白を吸着させ、これにＰＢＳで希釈した血清
（１／１０⁵）及び唾液（１／５００）、或はこれら希
釈した血清や唾液に各々のペプチドやポルフィロモナス
・ジンジバリス線毛蛋白を添加して吸収したものと、３
７℃、１時間反応させた後、通常のＥＬＩＳＡ法で測定
した。

【００６２】これらの結果を〔表４〕に示すが、血清、
及び唾液を各々のペプチドで吸収操作をすると、吸光度
の減少が認められた。以上の結果から、各々のペプチド
で免疫した血清及び唾液中には、各々のペプチドや線毛
蛋白に対する抗体の産生されていることが認められた。

【００６３】

【表４】 〔表４〕ペプチドの免疫試験 試験群 体重 吸収操作前後の抗体価^c) (平均ｇ) 血清 唾液 (1／10⁵) (1／500) 吸収前 吸収後 吸収前 吸収後 線毛蛋白＋ＦＣＡ^d) 25 1.10 0.14 1.22 0.19 対照 27 0.08 0.07 0.18 0.16 ペプチド１＋ＦＣＡ 25 0.62 0.19 0.61 0.11 ペプチド２＋ＦＣＡ 26 0.34 0.15 0.36 0.17 ペプチド３＋ＦＣＡ 26 0.38 0.16 0.37 0.09 ペプチド４＋ＦＣＡ 27 0.52 0.13 0.49 0.12 ペプチド５＋ＦＣＡ 28 0.45 0.11 0.42 0.15 ペプチド６＋ＦＣＡ 26 0.41 0.12 0.39 0.11 ペプチド７＋ＦＣＡ 23 0.67 0.14 0.69 0.15 ペプチド８＋ＦＣＡ 25 0.49 0.11 0.45 0.14 ペプチド９＋ＦＣＡ 26 0.32 0.13 0.34 0.13 ｃ） 抗体価：各希釈倍率のＥＬＩＳＡ法によるＡ₄₀₅
値 ｄ） ＦＣＡ：フロイント完全アジュバント試験例５ ペプチドを用いた種々の免疫生物学的活性の
検討 試験例１、試験例２、試験例３および試験例４に示され
た９種類のペプチドについて、生物活性として、Ｍｉｔ
ｏｇｅｎ活性、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｂ‐ｃｅｌｌ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（多クローン性Ｂ細胞活性化活
性）、ＴＮＦ−αやＩＬ‐６等の炎症性サイトカインの
産生誘導能ならびに赤血球凝集活性を測定した。各種生
物活性の測定方法を以下に示す。

【００６４】Ｍｉｔｏｇｅｎ活性：ＢＡＬＢ／ｃマウス
の脾細胞を、実施例２で得られた９種類のペプチドとと
もに４８時間培養し、最終培養の６時間前に³Ｈ‐チミ
ジンを添加した。培養終了後、細胞の³Ｈ‐チミジンの
取り込みをシンチレーションカウンターを用いて測定す
ることにより、Ｍｉｔｏｇｅｎ活性を調べた。

【００６５】Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｂ‐ｃｅｌｌ ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、
実施例２で得られた９種類のペプチドとともに７２時間
培養し、その脾細胞中の抗体産生細胞数をＥＬＩＳＰＯ
Ｔ法により測定し、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｂ−ｃｅｌ
ｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎを調べた。 ＴＮＦ‐α産生誘導能：ヒト末梢血中のマクロファージ
を実施例２で得られた９種類のペプチドとともに２４時
間培養した。培養終了後、得られた培養上清をＬ９２９
細胞とともに、更に２４時間培養し、Ｌ９２９細胞中の
死細胞数を測定することにより、ＴＮＦ‐α産生誘導能
を調べた。

【００６６】ＩＬ‐６産生誘導能：ヒト末梢血中のマク
ロファージを実施例２で得られた９種類のペプチドとと
もに２４時間培養し、その培養上清中のＩＬ‐６の量を
ＥＬＩＳＡ法で測定することにより、ＩＬ‐６産生誘導
能を調べた。

【００６７】赤血球凝集活性：丸底９６ウェルマイクロ
タイタープレートの各ウェルに２倍連続希釈したペプチ
ドのＰＢＳ溶液を０.１ｍｌずつ入れ、これに２％ウサ
ギ赤血球浮遊液０.１ｍｌを添加した。３７℃、２時間
培養後、各ウェルの赤血球凝集像を判定した。

【００６８】以上の結果を表５に示すが、ペプチド１と
ペプチド７には、いずれの活性も認められなかった。

【００６９】これらの結果より、種々の免疫生物学的活
性のないペプチド１とペプチド７を歯周病予防ワクチン
として用いることにした。

【００７０】

【表５】 〔表５〕ペプチドを用いた種々の免疫生物学的活性 Mitogen Polyclonal B-cell TNF-α IL-6 赤血球凝集 活性 activation 産生誘導能 産生誘導能 活性 ペプチド１ − − − − − ペプチド２ ＋ ＋ ＋ ＋ ± ペプチド３ − − ＋ ＋ ± ペプチド４ − − ＋ ＋ − ペプチド５ N.D.^e) N.D. N.D. N.D. ＋ ペプチド６ N.D. N.D. N.D. N.D. ＋ ペプチド７ − − − − − ペプチド８ N.D. N.D. N.D. N.D. ±ペプチド９ N.D. N.D. N.D. N.D. ± e） N.D．：未実施実施例３ ワクチンの製造 実施例２で調製したペプチドのうち、ペプチド１とペプ
チド７を１.０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、０.７５
Ｍリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、アジュバントとし
て、水酸化アルミニウムゲルを０.２ｍｇ／ｍｌになる
ように加え、これに防腐剤として、チメロサール０.０
１％（ｗ／ｖ）を加え調製した。

【００７１】試験例６ 歯周病抑制試験 試験例１、試験例２、試験例３、試験例４と試験例５の
結果より、ペプチド１とペプチド７についてのワクチン
の効果を、実施例３に記載したワクチンを用いて、歯槽
骨吸収度、抗体価を指標として、次の方法で調べた。

【００７２】３週齢のゴールデンハムスター（１群６匹
合計５群ポルフィロモナス・ジンジバリス３８１株線
毛免疫誘発群、ペプチド１免疫誘発群、ペプチド７
免疫誘発群、非免疫誘発群、非免疫非誘発群）を使
用した。

【００７３】本発明によるワクチンを生後３、４週目に
それぞれ０.２ｍｌ、５週目に０.４ｍｌずつ頬嚢の皮下
に投与した。歯周病の誘発は、ポルフィロモナス・ジン
ジバリス３８１株を、ＧＡＭブイヨンで３７℃、２０時
間培養した後、遠心分離により集菌し、菌体を１０⁹個
／ｍｌになるように生理食塩水に浮遊させ、これをゴー
ルデンハムスター頬嚢内に０.２ｍｌ生後６週目から７
日間投与し、それ以降は、毎週１回投与した。

【００７４】菌体投与開始後より、う蝕誘発飼料として
ダイエット２０００（船橋農場製）と水を自由に摂取さ
せた。

【００７５】ゴールデンハムスターを８０日間飼育した
後、０.５％塩酸ピロカルピン溶液を１ｍｌ／ｋｇ腹腔
内投与し、唾液を採取した。その後、腹部大動脈より採
血して血清を得た。また、骨標本の作製は、頭部を切断
後、オートクレイブを用いて熱処理後、筋肉部分を除去
し、水洗した後、乾燥させた標本とした。

【００７６】唾液と血清はＥＬＩＳＡ法によりペプチド
に対する抗体価を測定した。

【００７７】骨標本は、築山ら（口腔衛生会誌、第２８
巻、第３号１４９ページ、１９７８年）の方法^f)により
臼歯の歯槽骨吸収度を測定した。

【００７８】f）骨標本を２０％硝酸銀溶液で５分間染
色して、水洗、乾燥した後、実体顕微鏡（倍率１５倍）
でエナメル‐セメントジャンクションより歯槽骨縁まで
の距離を計測した。

【００７９】ワクチンによる歯周病抑制試験は、表６に
示したように、歯周骨吸収度においては、非免疫誘発群
で強い歯槽骨吸収が認められるが、ペプチド免疫誘発群
では、非免疫非誘発群とほぼ同程度に抑制された。

【００８０】各試験群の血清、唾液中のペプチドに対す
る抗体価は、ペプチド免疫群では、非免疫非誘発群より
有意に上昇してした。一方、非免疫誘発群では非免疫非
誘発群とほぼ同等の抗体価であった。

【００８１】これらの結果を表６に示すが、ペプチド１
とペプチド７に、歯槽骨吸収の抑制、および血清及び唾
液中の抗体価の上昇が認められた。

【００８２】

【表６】 〔表６〕ゴールデンハムスターによる歯周病抑制試験 試験群 体重(骨標本作製時) 歯槽骨吸収度 抗体価^g) (平均g) (平均) 血清 唾液 (1／10⁵) (1／500) 線毛免疫誘発群 128 52 1.08 1.29 ペプチド１免疫誘発群 124 48 0.65 0.62 ペプチド７免疫誘発群 123 41 0.71 0.79 非免疫誘発群 116 97 0.10 0.21 非免疫非誘発群 135 34 0.06 0.16 ｇ） 抗体価：各希釈倍率のＥＬＩＳＡ法によるＡ₄₀₅値試験例７ 歯周病予防ワクチンの安全性 実施例３により得られたワクチンを用いて、厚生省告示
生物的製剤基準、Ａ試験法に準じて、染色試験、無菌試
験及び急性毒性試験（マウス）を行ったが、いずれの試
験においても、特記すべき異常は認められなかった。

【００８３】実施例４ ペプチドに対するマウス抗血清の取得 試験例３で効果の認められたペプチドについて、ペプチ
ド３００μｇをＦＣＡと共に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに３
回に分けて免疫し、各ペプチドに対する抗血清を得た。
同様にして、ポルフィロモナス・ジンジバリス全菌体
（１００μg／回）、及び線毛（１００μｇ／回）に対
する抗血清を得た。

【００８４】次に、ペプチド、全菌体および線毛に対す
る各抗血清を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー
を経て精製して、蛋白含有１ｍｇ／ｍｌになるように抗
体溶液を調製した。

【００８５】試験例８ ペプチドに対する抗体を用いた菌体凝集試験 ポルフィロモナス・ジンジバリスをＧＡＭブイヨン、Ｂ
ｒａｉｎ‐ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎブロスなどにヘ
ミン、メナジオンを添加した培地に接種して、嫌気的条
件下で３７℃で２０時間培養し、遠心分離により、菌体
を集め、リン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、吸光度（５
５０ｎｍ）が０.５になるように調整した。この菌体浮
遊液１００μｌと実施例４の各抗体溶液を希釈したもの
を１００μlとよく混ぜ、丸底９６穴マイクロタイター
プレートに入れ、４℃で１６時間反応させ、菌体凝集試
験を行った。その結果を〔表７〕に示す。

【００８６】

【表７】 〔表７〕菌体凝集試験 抗体の希釈率 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 抗全菌体血清 +++ +++ +++ ++ + - 抗線毛血清 +++ +++ ++ + - - 抗ペプチド1血清 +++ +++ ++ - - - 抗ペプチド7血清 +++ +++ ++ - - - 以上の成分に実施例４で得たペプチド１に対する抗体溶
液を０.０１％を配合する。

【００８７】 以上の成分に実施例４で得たペプチド７に対する抗体溶
液を０.０１％を配合する。

【００８８】試験例９ ペプチドに対する抗体を用いた受動免疫試験 ゴールデンハムスターで、実施例４で得られたペプチド
に対する抗体溶液を用いて、洗口やブラッシングを敢行
することによる受動免疫の効果を調べた。

【００８９】本発明による受動免疫の効果は、歯槽骨吸
収度、抗体価を指標として、次の方法で調べた。

【００９０】３週齢のゴールデンハムスター（１群 ６
匹 ４群抗ペプチド１抗体投与誘発群、抗ペプチド
７抗体投与誘発群、非受動免疫誘発群、非受動免疫
非誘発群）を使用した。

【００９１】歯周病の誘発は、ポルフィロモナス・ジン
ジバリス３８１株を、ＧＡＭブイヨンで３７℃、２０時
間培養した後、遠心分離により集菌し、菌体を１０⁹個
／ｍｌになるように生理食塩水に浮遊させ、あらかじめ
下顎第一臼歯を木綿糸で結紮したゴールデンハムスター
口腔内に前述の菌体浮遊液を０.２ｍｌを投与した。

【００９２】菌体投与開始後より、う蝕誘発飼料として
ダイエット２０００（船橋農場製）と水を自由に摂取さ
せた。

【００９３】そして、菌体投与翌日より、実施例５で得
られたペプチドに対する抗体溶液を含む口腔組成物を用
いた洗口やブラッシングを毎日敢行した。

【００９４】ゴールデンハムスターを８０日間飼育した
後、頭部を切断後オートクレイブを用いて熱処理後筋肉
部分を除去し、水洗後、乾燥させて骨標本作製した。

【００９５】受動免疫による感染防御効果は、表８に示
したように、非受動免疫誘発群では強い歯槽骨の吸収が
認められるが、抗ペプチド１抗体投与誘発群ならびに抗
ペプチド７抗体投与誘発群では、非受動免疫非誘発群と
ほぼ同程度に抑制された。

【００９６】

【表８】 〔表８〕ゴールデンハムスターによる受動免疫試験 試験群 体重(骨標本作製時) 歯槽骨吸収度 (平均g) (平均) 洗口 ブラッシング 洗口 ブラッシング 抗ペプチド1抗体投与誘発群 120 122 60 51 抗ペプチド7抗体投与誘発群 120 123 56 46 非受動免疫誘発群 118 116 98 97 非受動免疫非誘発群 122 124 41 39

【００９７】

【発明の効果】本発明によれば、ポルフィロモナス・ジ
ンジバリス線毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質
のペプチドを合成し、それを抗原として歯周病患者の血
清、唾液、及び歯肉溝液注の特異抗体、更にはそのクラ
スやサブクラスを正確に測定することができる。

【００９８】また、ポルフィロモナス・ジンジバリス線
毛を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質のペプチドを
合成し、それを含み、適当な免疫賦活剤と共に、歯肉内
に投与すれば、効果的に特異抗体の上昇が見られ、ポル
フィロモナス・ジンジバリスの感染を阻止することがで
きる。また、前述のペプチドをウシやニワトリ等に免疫
し、得られる血清、牛乳、卵に含まれる抗体を含有する
口腔組成物を歯周病予防や治療に用いる事もできる。

【００９９】

【表１】

【０１００】

【表２】

【０１０１】

【表３】

【０１０２】

【表４】

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏ
   ｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）線毛
   を構成する４１ＫＤサブユニット蛋白質のアミノ酸配列
   由来のフラグメントに対応するペプチドであって、前記
   フラグメントが５〜１０個のアミノ酸残基からなるフラ
   グメント群から選ばれたことを特徴とするペプチドもし
   くはその誘導体またはそれらの塩。
2. 【請求項２】 前記フラグメントが配列表の配列番号１
   〜９に示されるアミノ酸配列の連続する少なくとも５個
   のアミノ酸残基からなるフラグメント群から選ばれた請
   求項１記載のペプチドもしくはその誘導体またはそれら
   の塩。
3. 【請求項３】 請求項２記載のペプチドもしくはその誘
   導体またはそれらの塩の１種または２種以上の組み合わ
   さったものを含有することを特徴とする歯周病診断用組
   成物。
4. 【請求項４】 請求項２記載のペプチドもしくはその誘
   導体またはそれらの塩から選ばれるものであって、前記
   ペプチドが配列表の配列番号１または７に示されるアミ
   ノ酸配列の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基から
   なるフラグメント群から選ばれたことを特徴とするもの
   を主成分として１種または２種以上組み合わさって含ん
   でなる歯周病予防ワクチン。
5. 【請求項５】 前記ワクチンが歯肉内投与用である請求
   項４記載の歯周病予防ワクチン。
6. 【請求項６】 請求項２記載のペプチドもしくはその誘
   導体またはそれらの塩から選ばれるものであって、前記
   ペプチドが配列表の配列番号１または７に示されるアミ
   ノ酸配列の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基から
   なるフラグメント群から選ばれたことを特徴とするもの
   で動物を免疫して得られる抗体を含んでなる歯周病予防
   用または歯周病治療用口腔組成物。