JPH0775593A - 蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 動物細胞を用いた蛋白質の製造方法を提供す
る。 【構成】 動物細胞を培養して蛋白質を製造する際に、
培地にトリコスタチンを添加することを特徴とする蛋白
質の製造方法。 【効果】 動物細胞を培養する際に、培地にトリコスタ
チンを添加することにより、蛋白質の生産を増強させる
ことができる。本発明により、培地コストの削減、培養
期間の短縮が可能になった。また培養液中の生産物濃度
が増加したこと及び細胞傷害が認められなかったこと
は、生産物の精製においても有利である。従って、本発
明は工業的規模における動物細胞培養による物質生産の
効率化を可能にするものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞を用いた蛋白
質の製造方法に関する。さらに詳細には、動物細胞の培
養時にトリコスタチンを培地に添加することにより、蛋
白質の生産を増強させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの生理活性を有する蛋白質等の有用
物質が、遺伝子組換え技術を用い、微生物及び動物細胞
を宿主として工業的規模で生産されている。

【０００３】大腸菌等の微生物を用いた有用物質の生産
は、生産性においては有利であるが、目的の蛋白質が高
分子であり複雑な高次構造を有していてリフォールディ
ングができない場合や、糖鎖等の修飾基が結合して初め
て生理活性を示す物質である場合、この方法は適用でき
ない。このような蛋白質を生産する場合には、一般的に
動物細胞が使用されている。既知の動物細胞としては、
ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ−Ｋ１由来ジヒドロ葉酸還
元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｄｃ
ｔａｓｅ；ＤＨＦＲ）遺伝子欠損株、Ｃ１２７Ｉ（マウ
ス乳癌細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１９）、ＢＨＫ（新
生仔ハムスター腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）及びＶ
ｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−８１）等がある。しかし、動物細胞を微生物と比較し
た場合の欠点として、増殖速度が遅いこと、培地が高価
であること、生産性が低いこと等が挙げられる。細胞の
増殖速度については、細胞特有の性質であるため現段階
では解決し難い。また培地についても細胞維持に必須な
成分で合成されているため、価格の根本的な改善は困難
である。従って工業的な動物細胞を用いた物質生産で
は、如何にその生産性を向上させるか、即ち細胞の物質
生産能を増強し、目的物質の生産量を増大させるかが問
題となる。

【０００４】従来、動物細胞による蛋白質の生産を増強
させるために、酪酸を始めとする直鎖アルカン酸、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用されてきた（特
公昭５６−４６７９７，特公昭６０−１８３９８及び特
開平１−２５７４９２参照）。酪酸については、ヒスト
ンの脱アセチル化を阻害し高アセチル化を引き起こす作
用、またある種の細胞においては分化誘導作用を示すこ
とが報告されている。遺伝子発現に関与する現象の一つ
としてヒストンのアセチル化が知られているため、酪酸
における生産の増強は、酪酸が示す様々な作用の中で、
ヒストンの高アセチル化に起因しているのではないかと
考えられているが、酪酸の作用の多様性のため、その確
証はない。ＤＭＳＯについては、細胞膜に対する作用、
分化誘導作用等が知られている。また各物質の生産増強
における有効な添加濃度は、細胞種によって若干異なる
と考えられるが、酪酸で０．１〜数ｍＭ、ハイドロコー
チゾンでμＭオーダー、ＤＭＳＯで０．０５〜２％程度
（数ｍＭ〜数百ｍＭ）である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの物質
は、生産性を向上させるために前述のようにかなりの高
濃度を必要とし、そのため細胞傷害性を示すことがあ
る。細胞に傷害が与えられると、生細胞数の減少によっ
て目的物質が充分に生産されないばかりでなく、傷害を
起こした細胞から内容物（即ち夾雑物質）が培地中に放
出されることにより、目的物質の精製の妨げになること
が考えられる。また、培地中に放出された細胞内容物に
含まれるプロテアーゼによって目的物質が分解されるこ
とも考えられる。従って、従来使用されてきた誘導物質
が、細胞培養における有用物質の生産増強に適切である
とは言えない。動物細胞を用いた有用物質の生産増強の
ためには、低濃度の添加で有効であり、かつ細胞傷害性
のない効果的な誘導物質が望まれる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
動物細胞を用いた蛋白質の生産系において、工業的規模
で蛋白質の生産を増強させる効率的な方法を提供するこ
とを最終目的とし、本発明を完成した。本発明における
動物細胞は、生理活性を有する蛋白質を産生する天然の
動物細胞と生理活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
により形質転換された動物細胞のいずれを用いてもよ
い。本発明における蛋白質とは、蛋白質又はペプチドを
意味する。また、本発明における培地は、血清を含むも
のあるいは含まないもののいずれを用いてもよい。

【０００７】本発明者らは、前述したヒストンの高アセ
チル化が物質の生産増強に起因するのであれば、特異的
にヒストンの高アセチル化を誘導するが、細胞傷害を全
く又はほとんど示さない物質が物質の生産増強において
最も適していると考えた。そこで、本発明において用い
ることができる物質としては、ヒストンの高アセチル化
誘導作用を有し、かつ細胞傷害性を示さないか又は非常
に弱い物質であればよい。例えば該性質を有するトリコ
スタチンまたはその誘導体を用いることができ、望まし
くはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を培地に添加すること
により目的とする蛋白質の生産を増強させることができ
る。

【０００８】ＴＳＡは一部の真菌に対する抗生物質とし
て発見された物質で、現在ヒストン脱アセチル化酵素の
阻害による細胞周期のＧ１、Ｇ２期特異的増殖阻害剤と
して使用されており、他に抗癌剤としての使用の報告も
ある（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．
２８，ｐ１７１７４−ｐ１７１７９，１９９０．、代
謝，Ｖｏｌ．２８，増刊号／癌‘９１，ｐ１３１−ｐ１
３９，１９９１．、蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．３
７，Ｎｏ．６，ｐ９５９−ｐ９６９，１９９２．及び特
公平４−４７６４８参照）。

【０００９】ＴＳＡはヒストン脱アセチル化酵素の阻害
によってヒストンの高アセチル化を引き起こし、物質の
生産増強を促す可能性が考えられるが、物質生産にＴＳ
Ａを応用した例は現在のところ報告されていない。本発
明者らは動物細胞の培養の際に、培地に微量のＴＳＡを
添加することにより蛋白質の生産量が著しく向上するこ
とを見い出し、トリコスタチンを用いた蛋白質の製造方
法を完成した。

【００１０】以下に本発明に係る蛋白質の製造方法につ
いて示す。まず、従来、有用物質の生産増強に使用され
てきた物質とＴＳＡの効果を比較するために、ＣＨＯ細
胞を宿主とするアミド化酵素（ＡＥ）産生浮遊細胞であ
る３μ−１Ｓ細胞（参考例１参照）に及ぼすＴＳＡ、Ｄ
ＭＳＯ、酪酸の影響を調べた。

【００１１】３μ−１Ｓ細胞をＦ−１２培地（味の素社
製）にインスリン及びトランスフェリンを添加した無血
清培地に懸濁し、２４穴培養プレート（コーニング社
製）に接種した。続いてＴＳＡ、ＤＭＳＯあるいは酪酸
を目的濃度となるように添加し、培養した。ここでＴＳ
Ａは、粉末試薬（和光純薬工業社製）をメタノールある
いはエタノールに溶解し、１ｍＭ溶液を調製後−２０℃
で保存し、必要時に基本培地（Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＤＭ
ＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等）、生理食塩水、あるいは蒸
留水に希釈して使用した。ＤＭＳＯは直接添加あるいは
基本培地、生理食塩水、あるいは蒸留水に希釈して使用
した。酪酸は基本培地、生理食塩水、あるいは蒸留水で
１ｍＭ溶液を調製後４℃で保存し、必要時に同溶媒で希
釈して使用した。培養後、細胞数およびＡＥ活性を測定
した。

【００１２】ＡＥ活性の測定は、合成基質［^１２５Ｉ］
−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを用いて行った（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｙｕ
ｎ．，Ｖｏｌ．１３７，ｐ９８４−ｐ９９１，１９８
６．及び特開平１−１０４１６８参照）。１単位の活性
は、標準反応条件下、３７℃で１時間に１ｐｍｏｌｅの
基質を５０％アミド化する活性で定義される。

【００１３】さらに、他の細胞系での物質生産における
ＴＳＡの有効性を確かめるために、Ｃ１２７Ｉ細胞を宿
主とするヒトインターフェロン−γ（ｈＩＦＮ−γ）産
生細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，Ｖｏｌ．８１，ｐ５０８６−ｐ５０９０，１９８１
参照）に及ぼすＴＳＡの影響を調べた。

【００１４】ｈＩＦＮ−γ産生細胞を１０％ＣＳ添加Ｄ
ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し２４穴培養プレ
ートに接種した。インキュベートして細胞をプレート底
面に着床させた後、ＴＳＡを添加し、培養した。培養
後、細胞数を計測し、採取した培養上清に含まれるｈＩ
ＦＮ−γを以下に記載のＥＬＩＳＡ法によって定量し
た。

【００１５】操作１；ｈＩＦＮ−γの定量に先立ち、９
６穴イムノプレート（Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．Ｐｌ
ａｔｅ，Ｃｏｓｔａｒ社製）に、ｈＩＦＮ−γ標準液
（１．０μｇ／ｍｌとなるようにコーティングバッファ
ー（０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６）で希釈す
る。）を００μｌ／ｗｕｌｌずつ分注し、４℃で一晩放
置する。翌日ウェル内のｈＩＦＮ−γ標準液を捨て、
０．１％となるようにＴｗｅｅｎ２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ
社製）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ＰＢＳ（−）
（日水製薬社製）（以下「Ｔ−ＰＢＳ」と記す。）を２
００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注しウェル内を洗浄する。ウ
ェル内に残ったＴ−ＰＢＳを除去し、１．０％となるよ
うにゼラチン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を添加したＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ′ｓ ＰＢＳ（−）（ブロッキング液）を１
５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で２時間インキ
ュベートする。インキュベート後、ウェル内のブロッキ
ング液を捨て、Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄し、ウェル内に残
ったＴ−ＰＢＳを除去する。

【００１６】上記操作１と並行して、次の操作を行って
おく。 操作２；９６穴Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）にサ
ンプルバッファー（ゼラチンを０．１％、Ｔｗｅｅｎ２
０を０．１％、ＮａＮ_３を０．１％、ＥＧＴＡ（ＳＩＧ
ＭＡ社製）を０．０５％、ＭｇＣｌ_２を０．４ｍＭとな
るようにＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ＰＢＳ（−）で溶解し
たもの）で希釈したｈＩＦＮ−γ標準液（０〜６２．５
ｎｇ／ｍｌ、２^ｎ段階希釈）及び測定サンプル（培養上
清、２^ｎ段階希釈）を９μｌ／ｗｅｌｌずつ分注する。
さらにサンプルバッファーで２０ｎｇ／ｍｌとなるよう
に希釈したマウス抗ｈＩＦＮ−γモノクローナル抗体を
９０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で２時間インキ
ュベートする。インキュベート後、Ｖ底プレートを４℃
で１５００ｒｐｍ、１０分間遠心する。

【００１７】操作１の済んだプレートに、操作２によっ
て得られた上清を１００μｌ／ｗｃｌｌずつ分注し、３
７℃で２時間インキュベートする。Ｔ−ＰＢＳで５回洗
浄後、サンプルバッファーで１０００倍に希釈したビオ
チン化抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１
００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で１時間インキ
ュベートする。Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄後、サンプルバッ
ファーで１０００倍に希釈したアルカリフォスファター
ゼ・アビジン（ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ社製）を１００μｌ
／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で３０分間インキュベー
トする。Ｔ−ＰＢＳで５回洗浄後、ｐＮＰＰＡ・２Ｎａ
溶液（基質溶液；アルカリフォスファターゼ基質溶液キ
ット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により調製）を１００μｌ
／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で１０〜２０分間インキ
ュベートする。適度に発色した時点で、２ＮＮａＯＨを
１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し反応を停止させ、４０
５ｎｍにおける吸光度を測定する。

【００１８】ＡＥの生産増強におけるＴＳＡと、ＤＭＳ
Ｏ及び酪酸の比較実験を行ったところ、至適添加濃度は
それぞれ２００ｎＭ、１％（約１４０ｍＭ）、１ｍＭと
なり、これらの添加濃度において培地当たりのＡＥ生産
量は無添加の場合と比較して、それぞれ４．７倍、１．
９倍、３．９倍に増加した。この結果より、ＴＳＡはＤ
ＭＳＯや酪酸よりも、ＡＥの生産増強において効果的で
あることが示された。ＤＭＳＯはＴＳＡ、酪酸と比較す
ると増加量は少なく、ＡＥの生産増強に効果的な物質で
あるとはいえない。また酪酸では、１ｍＭ以上の添加濃
度において細胞傷害が認められたのに対し、ＴＳＡは、
最も強いＡＥ生産の増強効果を示した２００ｎＭの添加
において、細胞傷害性を全く示さなかった。しかも、Ｔ
ＳＡは酪酸の５０００分の１の添加量で最も強いＡＥ生
産の増強効果を示した。

【００１９】このように、ＴＳＡが低濃度の添加量で、
細胞に傷害を与えずに目的とする蛋白質の培地当たりの
生産量を効果的に増大させたことは、有用物質の生産、
特に工業的規模における物質生産に大きく寄与するもの
である。

【００２０】また、Ｃ１２７Ｉ細胞を宿主とするｈＩＦ
Ｎ−γ産生細胞においても、ＴＳＡが物質の生産増強に
有効であることが示された。このことは、動物細胞培養
による有用物質の生産において、ＴＳＡが目的とする蛋
白質及び使用する細胞種の相違にかかわらず有効である
ことを示すものである。

【００２１】従って、実施例に記載のものだけでなく、
インターロイキン（特開昭６３−１８５３８７参照）、
アミド化酵素及びその誘導体（例えば７９９ＤｒａＩ，
７９９ＲＶ）７９９ＳａｌＩ、Δ７９９、７９９−４５
７Δ、７９９ＢｓｔＥＩＩ^Ｌ（特開平１−１０４１６８
参照；配列番号１）、ＸＡ（特開平１−１０４１６８参
照；配列番号２））あるいは巨核球増殖分化因子（特願
平５−１９７７５２参照）等のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子を有するベクターで形質転換された動物細胞を
用いて、本発明に係る製造方法により目的とする蛋白質
を得ることができる。

【００２２】

【実施例】次に本発明を参考例及び実施例によりさらに
詳細に説明する。 参考例１ ３μ−１Ｓ細胞の取得 配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列−３９か
ら６９２番目までのアミノ酸配列を含有するプラスミド
から得られた特開平２−１９０１９３に記載のＭＴＸ３
μＭ耐性株９Ｃ株より、特開平２−１９０１９３に記載
の方法でクローニングを行った。即ち、９６穴プレート
（コーニング社製）にＭＴＸ３μＭ耐性株９Ｃ細胞を播
種し、核酸を含まないＭｉｈｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ Ｍｃｄｉｕｍ（ＭＥＭ）Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ
（α−ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ社製）に１０％透析ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地１００μｌ／ｗｅｌ
ｌで１週間培養した。さらに、１００μｌ／ｗｅｌｌの
α⁻ＭＥＭ培地を加え、１週間培養した。この結果得ら
れたアミド化酵素高産生細胞を３μ−１細胞とした。次
に３μ−１細胞をシリコナイズした３００ｍｌ容三角フ
ラスコを用いて、１０％ＦＢＳ、１．０ｍＭＭＴＸを添
加したＦ−１２培地で振盪培養（培養容量；６０ｍｌ／
フラスコ）することによって浮遊化した。さらに、培地
中の血清濃度を徐々に低下させていき、最終的にインス
リン及びトランスフェリンをそれぞれ５μｇ／ｍｌ、Ｍ
ＴＸを１．０μＭ添加した培地に馴化させ、３μ−１Ｓ
細胞を得た。

【００２３】実施例１ ＴＳＡのＡＥ産生細胞に及ぼす
影響 参考例１より得られたＣＨＯ細胞由来ＡＥ産生浮遊細胞
である３μ−１Ｓ細胞を、Ｆ−１２培地を基本培地と
し、インスリン及びトランスフェリンをそれぞれ５μｇ
／ｍｌずつ添加した無血清培地に４×１０^５ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ細胞密度で懸濁し、２４穴培養プレートニ１ｍｌ
／ｗｅｌｌずつ接種した。接種後、１００倍濃度で調製
したＴＳＡ（３００ｎＭ〜３０μＭ）を１０μｌ／ｗｅ
ｌｌずつ添加し（終濃度；３〜３００ｎＭ）、３７℃、
５％ＣＯ_２下で３日間培養した。培養後、細胞数を計測
し、培養上清を遠心分離（１０００回転、５分間）によ
り回収した。細胞数については、マイクロセルカウンタ
ー（東亜医用電子社製）あるいは血球計算盤を用いて総
細胞数を計測した。回収した培養上清に含まれるＡＥ活
性を前述の方法で測定した。結果を第１表に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】ＡＥ生産量はＴＳＡ添加濃度に従って増大
し、２００ｎＭの添加で最大値を示し、無添加の場合の
４，７倍程度となった。またＴＳＡの添加濃度に伴って
細胞増殖阻害の傾向が認められ、無添加の場合８．１１
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで増殖したのに対し、２０
０ｎＭ添加の場合５．７７×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで
あった。この細胞密度は、接種時の細胞密度（４×１０
^５ｃｅｌｌ／ｍｌ）と比較して増加しており、細胞は２
００ｎＭのＴＳＡ添加によって増殖を阻害されたもの
の、傷害を受けなかったことを示している。また顕微鏡
観察においても、細胞傷害は認められなかった。ＴＳＡ
を３００ｎＭ添加した場合には３．６４×１０^５ｃｅｌ
ｌｓ／ｍ１となり、わずかに細胞傷害が認められた。

【００２６】以上の結果より、ＡＥの生産増強にｎＭオ
ーダーのＴＳＡ添加が有効であることが示された。つま
り、ＡＥの生産に際しては、３００ｎＭ以下、さらに好
ましくは２００ｎＭ以下のＴＳＡ添加が好適であるこ
と、即ち細胞傷害を起こさずに、最大の生産増強効果を
もたらすことが示された。

【００２７】実施例２ ＤＭＳＯのＡＥ産生細胞に及ぼ
す影響 実施例１と同様の方法で、終濃度が０．０１〜８％とな
るようにＤＭＳＯを添加し、ＤＭＳＯのＡＥ産生細胞に
及ぼす影響を調べた。結果を第２表に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】１％ＤＭＳＯの添加により、ＡＥ生産量は
最大値を示したが、無添加の場合の１．９倍に留まっ
た。また、このとき細胞傷害は全く認められなかった
（ＤＭＳＯ無添加；９．６５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ）１％；７．５４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。２％
を超えてＤＭＳＯを添加した場合には、著しい細胞形態
変化及び細胞傷害が認められ、培地当たりの生産量は急
激に低下した。

【００３０】実施例３ 酪酸のＡＥ産生細胞に及ぼす影
響 実施例２と同様の方法で、終濃度が１ｎＭ〜４ｍＭとな
るように酪酸を添加し、酪酸のＡＥ産生細胞に及ぼす影
響を調べた。結果を第３表に示す。

【００３１】

【表３】

【００３２】０．１ｍＭの酪酸添加でＡＥ生産の増強が
認められ始め、１ｍＭの添加でＡＥ生産量は最大値を示
し、無添加の場合の約３．９倍に増強された。また酪酸
の場合、ＴＳＡにおいて生産増強が認められた添加濃度
では、ＡＥ生産の増強は全く認められなかった。一方、
酪酸無添加の場合、細胞は９．５６×１０^５ｃｅｌｌｓ
／ｍｌまで増殖したのに対し、最も強いＡＥ生産の増強
効果を示した１ｍＭ添加の場合には、３．５４×１０^５
ｃｅｌｌｓ／ｍｌと接種時細胞密度よりも減少してお
り、細胞傷害が認められた。１ｍＭを超える添加量で
は、細胞傷害がさらに顕著になり、ＡＥ生産量は急激に
低下した。

【００３３】実施例４ Ｃ１２７Ｉ細胞を宿主とするヒ
トインターフェロン−γ（ｈＩＦＮ−γ）産生細胞に及
ぼすＴＳＡの影響 トリプシン処理及び遠心分離によって採取したｈＩＦＮ
−γ産生細胞を１０％ＣＳ添加ＤＭＥＭ培地に懸濁し、
２４穴培養プレートに２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ
^２及び１ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように接種した。３時間
３７℃でインキュベートして細胞をプレート底面に着床
させた後、ＴＳＡを終濃度０．８２〜２００ｎＭとなる
ように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３日間培養し
た。培養後、培養上清を遠心分離して採取し、またトリ
プシン処理により細胞を回収し、細胞数の計測を行っ
た。また、採取した培養上清に含まれるｈＩＦＮ−γは
前述のＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。結果を第４表に
示す。

【００３４】

【表４】

【００３５】ｈＩＦＮ−γの生産増強は０．８２ｎＭ
（８２０ｐＭ）のＴＳＡ添加で認められ（無添加の場合
の２．５倍）、２．４７ｎＭのＴＳＡ添加で最大とな
り、無添加の場合の２．６倍を示した。また、このとき
細胞増殖阻害及び細胞傷害は全く認められなかった（Ｔ
ＳＡ無添加；３．９４×１０^５ｃｃｌｌｓ／ｃｍ^２、
２．４７ｎＭ；４．１５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃ
ｍ^２）。増殖阻害は７．４１ｎＭを超えるＴＳＡ添加濃
度において認められた。以上より、Ｃ１２７Ｉ細胞を宿
主としたｈＩＦＮ−γ産生細胞においてもＴＳＡが有効
であることが示された。また、使用する細胞種によって
は、ｐＭオーダーのＴＳＡ添加による生産増強が可能で
あることが示された。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、トリコスタチンを用いること
により細胞培養による蛋白質の効率的な生産増強を可能
にした。さらに、培地当たりの生産量を向上させ得たこ
とにより、培地コストの削減、生産培養期間の短縮を可
能にした。また培養液中の生産物濃度が増加したこと及
び細胞傷害が認められなかったことは、生産物の精製に
おいても有利である。従って、本発明は工業的規模にお
ける動物細胞培養による物質生産の効率化を可能にする
ものである。

【００３７】

【配列表】

【００３８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大末 和廣 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬セン ター内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】動物細胞を培養して蛋白質を製造する際
   に、培地にトリコスタチンを添加することを特徴とする
   蛋白質の製造方法。