JPH0734736B2 - 培養装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は培養装置に関する。さらに詳しくは高密度お
よび連続培養に好適な培養装置に関する。

（ロ）従来の技術 従来動物細胞等を大量培養しようとする場合に、小さな
装置で効率良く培養するためには培養液中から老廃物を
多く含んだ培地を連続かつ高速でかつ確実に回収するこ
とが必要であり、このため培養液交換手段を備えた培養
装置が用いられている。とくに浮遊性の動物細胞の場合
には、攪拌型の培養槽に培養液交換手段を取り付けた培
養装置が用いられることが多い（杉野幸夫編、『細胞培
養技術』講談社,1985年,p146〜150）。上記培養液交換
手段とは、培養槽内に設けた細胞沈殿管、培養槽内もし
くは培養槽に付設される培養液循環路に設けられたロ過
手段等のごとく細胞と培地とを分離しかつこの分離され
た培地を培養槽外に排出する手段と、新鮮培地を培養槽
に供給する手段とを合わせたものをいう。

（ハ）発明が解決しようとする課題 連続的に培養を行うとやがて死んだ細胞が固まって細胞
塊をつくるが、この細胞塊は生きている細胞に比べて沈
降しやすい。従って細胞沈殿管を有する培養装置で培養
を行う場合、上記細胞塊は生きている細胞よりも培養槽
外に排出されにくいため、培養槽内には細胞塊がどんど
ん溜まってきて細胞にとって好ましくない環境となる。
また、培養槽内にもしくは培養槽に付設される培養液循
環路にロ過手段とを有する培養装置で連続的に培養を行
うと、上記細胞塊によってロ過手段の目詰まりがはやく
なり、培地の交換が十分に行えなくなる。

この発明はかかる状況に鑑みなされたものであり、培養
液中から細胞塊を除去しうる手段を有して安定した連続
培養が行えるよう構成された培養装置を提供しようとす
るものである。

（ニ）課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、細胞等を含んだ培養液を循
環または貯留して細胞等の増を行う培養系と、該培養系
中の液状培地を連続的に新鮮培地と交換しうる液−補給
・分離手段を備え、 上記培養系に、培養液を一時この系外に迂回できる迂回
流路を設けると共に、該迂回流路に、培養液中の細胞等
を透過するが細胞塊等を透過しえないフィルタを内蔵し
た筒状体からなり、このフィルタにより分割される筒状
体内下流側に洗浄液供給手段を管路接続し、かつ上記筒
状体内上流側にドレインへの排出管路を接続して構成さ
れる細胞塊除去部を挿設してなる培養装置が提供され
る。

この発明は、培養操作を停止することなく必要に応じて
培養液中に生じた細胞塊を効率良く除去できうるよう構
成された培養装置であることを特徴とする。

この発明の培養装置は、連続的かつ高密度培養に好適な
装置であり、さらにバイオリアクタにも適用できるもの
である。

この発明の培養装置において、細胞等を含んだ培養液を
循環または貯留して細胞等の増殖を行う培養系とは、上
記培養液を循環または貯留でき、かつ攪拌手段、液面セ
ンサ、pHメータ等培養に必要な部材が必要に応じて具備
された当該分野で公知の培養槽またはこれと均等な機能
を備えた培養槽を意味する。また、この発明の培養装置
に具備される液−補給・分離手段としては、公知のもの
例えば、培養槽内に設けた細胞沈殿管、培養槽内もしく
は培養槽に付設される培養液循環路に設けられたロ過部
等のごとく細胞と液状培地とを分離しかつこの分離され
た培地を培養槽外に排出する手段と、新鮮培地供給手段
とからなるもの等をそのまま用いることができる。

この発明の培養装置において培養系に設けられる培養液
迂回流路は、培養系外に一時培養液を迂回できるように
構成されたものであり、送液手段を介して培養系内と該
系外との間を培養液を循環できるように構成される。こ
の迂回流路は培養槽に直接設けられてもよく、また上記
液−補給・分離手段の分離手段に設けられてもよい。後
者の場合において分離手段側がロ過部を有して培養槽に
付設された培養液循環路で構成されているとき、上記迂
回流路は、培養液循環路のロ過部の前段に設けられ、か
つ迂回流路と培養液循環路との流路切換手段が設定され
る。なおこのとき迂回流路に設定される送液手段は培養
液循環路に設定されている送液手段と共通であってもよ
い。この構成の一例については後述する実施例の記載が
参照される。

上記培養液迂回流路には細胞塊除去手段が設けられる。
この細胞塊除去手段は上記迂回流路への流路接続が可能
な液導入口および液排出口を対向する端面に有する筒状
体と、該筒状体内部の断面にわたって設けられるフィル
タと、このフィルタにより分割される筒状体内下流側に
管路接続される洗浄液供給手段と、上記筒状体内上流側
に接続されるドレインへの排出管路とから主として構成
される。上記フィルタは培養液中の細胞等を透過するが
細胞塊等を透過しえない程度の網目状のものが選択され
る。この網目の孔径としては約0.5〜2mmが適している。
上記筒状体の材質としては該筒状体外部からその内部を
透視できうるものが好ましく、これにはガラスまたは透
明樹脂が適し、一方フィルタの材質としてはステンレ
ス、合成樹脂が選択され、合成樹脂としてはナイロンが
好ましい。上記筒状体内下流側に管路接続される洗浄液
供給手段は、送液ポンプを介して洗浄液貯留槽に接続さ
れる管路から構成されるものが好ましい。一方上記筒状
体内上流側に接続される排出管路には流路開閉弁が設け
られる。

この発明の装置において、迂回流路への培養液の移送の
タイミングは、目視に基づく培養槽内での細胞塊の生成
状態に基づいて手動で行うものであってもよく、また所
定時間毎に機械的に作動しうるよう予め設定されたプロ
グラムにより切換操作が制御されていてもよい。また、
迂回流路に挿設される細胞塊除去手段への洗浄液供給の
タイミングは、目視に基づく筒状体内の細胞塊の蓄積状
態に応じて手動で行うものであってもよく、所定時間毎
に機械的に作動しうるよう予め設定されたプログラムに
より切換操作が制御されていてもよい。またさらにこの
タイミングに関する別の構成としては、上記除去部に内
蔵されるフィルタの上流側流路および下流側流路にそれ
ぞれ圧力計を取り付け、該フィルタの目詰まり状態を両
者の圧力変動により自動的に感知して行う構成であって
もよい。

（ホ）作用 この発明によれば、培養系から増殖細胞、細胞塊、液状
培地等を含有してこの培養系外に迂回される培養液は、
迂回流路の途中に設けられた細胞塊除去部のフィルタに
おいて細胞隗のみがロ別された後、上記培養系内に戻さ
れる。上記フィルタにおいてロ別された細胞隗がある程
度蓄積すると培養系からの培養液の迂回流路への移送は
停止されると共に、この除去部内の下流側に洗浄液が供
給されさらにこの洗浄液がフィルタを介して上流側に逆
流され、この上流部に蓄積されている細胞塊と共に排出
管路を通じてドレインへ排出される。

以下実施例によりこの発明を詳細に説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（ヘ）実施例 第１図はこの発明の培養装置の一実施例の構成説明図で
ある。図において培養装置（１）は、培養槽（２）、攪
拌手段（３）、新鮮培地供給手段（４）、培養液ロ過手
段（５）、細胞塊除去手段（６）、制御部（７）から主
として構成されている。

培養槽（２）は、培養液貯留槽とこれを着脱可能に密閉
しうる蓋体とから構成されている。該蓋体には液面セン
サ（21）、攪拌羽根（31）、図示しないpH電極、図示し
ないDOセンサおよび後述する各管路がそれぞれ所定の位
置に設定されている。またこの培養槽には図示しない温
度コントローラが付設されており培養液の温度が所定の
温度で一定に保持できるように構成されている。

攪拌手段（３）は、上記攪拌羽根（31）とこれを回転す
る図示しない回転駆動部とから構成されている。

新鮮培地供給手段（４）は、新鮮培地を貯留する培地タ
ンク（41）と該タンク内の底部近傍に開口し、ペリスタ
ポンプ（42）を介して培養槽（２）の蓋体に接続され、
培養槽内の上部空間に開口する培地供給管路（ａ）とか
ら構成されている。

培養液ロ過手段（５）は、培養槽内の底部近傍に開口し
て蓋体に取り付けられ、ペリスタポンプ（51）および電
磁弁（52）をこの順に介してロ過部（53）上端に管路接
続される汲み出し管路（b₁）と、該ロ過部（53）下端か
ら再び上記蓋体に接続されて培養槽内の上部空間に開口
して設定される戻し管路（b₂）と、上記ロ過部（53）側
面下部からペリスタポンプ（54）を介して回収タンク
（55）に管路接続される回収管路（b₃）とから構成され
ている。上記汲み出し管路（b₁）と戻し管路（b₂）とで
培養液循環路（ｂ）が構成されている。上記ロ過部（5
3）には、筒状にフィルタ面を有して流路と同軸に設定
されるフィルタ管路と、このフィルタ管路の外側にフィ
ルタ管路内からの透過液を一時貯留する外筒状容器とか
ら構成されるクロスフロー型ロ過装置が用いられてい
る。上記フィルタ面のフィルタ孔径は、細胞等を透過し
ないが培養液中の溶解成分を透過しうる孔径のもの（例
えば0.2〜10μｍ程度）が用いられている。

細胞塊除去手段（６）は、上記培養液ロ過手段（５）の
汲み出し管路（b₁）の電磁弁（52）の上流側に管路接続
され、電磁弁（61）および電磁弁（62）をこの順に介し
て再び汲み出し管路（b₁）の電磁弁（52）の下流側に管
路接続される迂回管路（ｃ）と、この迂回管路（ｃ）に
挿設された細胞塊除去ユニット（63）と、洗浄液タンク
（64）からペリスタポンプ（65）を介して上記細胞塊除
去ユニット（63）の下流側に接続される洗浄液供給管路
（d₁）および細胞塊除去ユニット（63）の上流側から電
磁弁（66）を介して洗浄液回収タンク（67）に接続され
る回収管路（d₂）とからなる細胞塊除去部（68）とから
構成されている。

上記細胞塊除去ユニット（63）の構成の一例を第２図に
示す。この細胞塊除去ユニット（63）は図に示すごと
く、迂回管路（ｃ）に接続可能な管路（ｅ）を一端面に
有しかつ他端が外側に広げられた縁部を有して開口され
た円筒型容器体（８）の一対からなり、これらの開口端
面周縁を対向配置してこの間に所定のメッシュを有する
網状フィルタ（９）をその両側からＯリング（10）（1
1）を介して密着挟持させると共に、上記対向配置され
た一対の開口周縁部の外周に沿って跨設された止めバン
ド（12）により上記密着挟持状態が保持されている。上
記のごとく構成される細胞塊除去ユニット（63）におい
て、迂回管路（ｃ）の上流側に接続される円筒型容器体
（以下液導入側部（イ））および迂回管路（ｃ）の下流
側に接続される円筒型容器体（以下液排出側部（ロ））
それぞれには連通孔（81）（82）が設定されている。こ
のうち液排出側部（ロ）の連通孔（82）に上記洗浄液逆
流手段（68）の管路（d₁）が接続され、一方の液導入側
部（イ）の連通孔（81）には洗浄液逆流手段（68）の管
路（d₂）が接続されている。上記網状フィルタ（９）は
メッシュが2mmのステンレス製のものであり、円筒型容
器体（８）すなわち液導入側部（イ）および液排出側部
（ロ）はガラス製のものである。

制御部（７）は、液面センサ（21）、攪拌手段（３）、
pH電極、DOセンサ、電磁弁（52），（61），（62），
（66）、ペリスタポンプ（42），（51），（54），（6
5）にそれぞれ電気接続されており、これらを予め設定
された設定値に維持しまたは予め設定されたタイミング
で駆動しうるプログラムを有し、このプログラムに従っ
て上記各部に作動を指令するよう構成されている。

以上のごとく構成された培養装置（１）の作動を説明す
る。

まず通常の連続培養を行う場合、電磁弁（52）を開き電
磁弁（61）（62）および（66）を閉じておく。この状態
でペリスタポンプ（51）および（54）をそれぞれ予め設
定された速度で駆動すると、培養槽（２）内の培養液は
所定量の送液量で、培養槽（２）→管路（b₁）→ロ過部
（53）→管路（b₂）→培養槽（２）を循環される。この
操作により該循環路上に設定されたロ過部（53）におい
て、培養液内の細胞等はロ過されず培養槽（２）内に戻
され、一方培養液中の溶解成分は透過され回収管路
（b₃）を通じて回収タンク（55）に回収される。この循
環作動により培養液中で細胞等が増殖されると共にこの
増殖に伴って生成され培養液中に溶解した老廃物等はロ
過部（53）から除去され、培養槽内の液面が下降してい
くことになるが、この液面が液面センサ（21）により検
出されると制御部（７）はこのセンサ（21）からの出力
に基づいてペリスタポンプ（42）を所定時間、所定の速
度で駆動し、これによって新鮮培地が所定量補給され
る。このようにして培養・増殖が連続して行われる。

上記作動状態である程度進行すると培養液中に細胞塊が
生じ始めるが、これが目立ってくると目視に基づく切換
えか、または制御部内に設定したタイマ（培養開始から
所定時間経過後までの設定）の出力に基づく切換えによ
り、電磁弁（61）および（62）を開き一方電磁弁（52）
を閉じる。この状態においてペリスタポンプ（51）によ
り汲み上げられる培養液は、管路（b₁）の電磁弁（52）
の上流部から迂回管路（ｃ）に流出されて電磁弁（61）
→細胞塊除去ユニット（63）→電磁弁（62）の順に迂回
して再び管路（b₁）の電磁弁（52）の下流部に流入さ
れ、以下上記のごとく循環される。この迂回循環によ
り、培養液中の細胞塊は細胞塊除去ユニット（63）内の
液導入部側（イ）にロ別され、一方増殖対象の細胞等は
該ユニット（63）内の網状フィルタ（９）を通過して培
養槽（２）内に戻される。上記迂回循環の進行につれて
細胞塊除去ユニット（63）の液導入部側（イ）にロ別さ
れた細胞塊が蓄積しだすと、目視に基づいて、または液
導入部側（イ）内および液排出側（ロ）内の圧力を測定
すべき設定された各圧力センサの比較圧力値に基づい
て、制御部からの指令により電磁弁（52）を開き電磁弁
（61）および（63）を閉じると同時に電磁弁（66）を開
き、ペリスタポンプ（65）を駆動する。この操作により
培養液は再びはじめのように培養液循環路を循環すると
同時に、細胞塊除去ユニット（63）に洗浄液タンク（6
4）から洗浄液（この場合培地タンク（41）と同等の新
鮮培地または等張の緩衝液）が、連通孔（82）→液排出
側部（ロ）→網状フィルタ（９）→液導入側部（イ）→
連通孔（81）の順に逆流され、電磁弁（66）を経て洗浄
液回収タンク（67）に回収される。この洗浄液逆流操作
により網状フィルタ（９）および液導入側部（イ）に蓄
積されていた細胞塊は、この洗浄液流によってこれらか
ら取り除かれて回収タンク（67）に排出され、細胞塊は
培養系外に除去されることとなる。その後目視による判
断または一定時間経過後の自動操作により、ペリスタポ
ンプ（65）を停止しかつ電磁弁（66）を閉じて洗浄液逆
流操作を終了して、再び通常の連続培養状態とする。

従って上記操作が繰返されることにより、ロ過部（53）
での目詰まりが少なく長期間にわたって安定して連続培
養することができる。

（ト）発明の効果 この発明によれば、培養液に生ずる細胞塊を効率良く除
去でき、培養槽に付設される培養液循環路のロ過部での
目詰まり等の不都合な状態が少なく培養液が培養に好ま
しい状態に保持できるので、安定した細胞培養を長時間
にわたって連続して行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の培養装置の一実施例の構成説明図、
第２図は第１図の培養装置に用いられる細胞塊除去ユニ
ットの一例の構成説明図である。 （２）……培養槽、（３）……攪拌手段、 （４）……新鮮培地供給手段、 （５）……培養液ロ過手段、（６）……細胞塊除去手
段、 （７）……制御部、（８）……円筒型容器体、 （９）……網状フィルタ、（10）（11）……Ｏリング、 （12）……止めバンド、 （21）……液面センサ、（31）……攪拌羽根、 （41）……培地タンク、 （42）（51）（54）（65）……ペリスタポンプ、 （52）（61）（62）（66）……電磁弁、 （53）……ロ過部、（55）……回収タンク、 （63）……細胞塊除去ユニット、 （64）……洗浄液タンク、 （67）……洗浄液回収タンク、 （68）……洗浄液逆流手段、 （ａ）……培地供給管路、（b₁）……汲み出し管路、 （b₂）……戻し管路、（ｃ）……迂回管路。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞等を含んだ培養液を循環または貯留し
   て細胞等の増殖を行う培養系と、該培養系中の液状培地
   を連続的に新鮮培地と交換しうる液−補給・分離手段を
   備え、 上記培養系に、培養液を一時この系外に迂回できる迂回
   流路を設けると共に、該迂回流路に、培養液中の細胞等
   を透過するが細胞塊等を透過しえないフィルタを内蔵し
   た筒状体からなり、このフィルタにより分割される筒状
   体内下流側に洗浄液供給手段を管路接続し、かつ上記筒
   状体内上流側にドレインへの排出管路を接続して構成さ
   れる細胞塊除去部を挿設してなる培養装置。