JPH04299990A - モチリンアナログの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトモチリンアナログ
の配列を含むタンパク質の発現を指示するように組換え
ＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された微生物中に
、不溶性の封入体として生産されるタンパク質を化学的
に切断して活性型ヒトモチリンアナログに転換し、精製
する方法に係わる。

【０００２】本発明で精製されるヒトモチリンアナログ
は、天然のモチリンと同等以上の活性を示すので、医薬
品成分として、殊に消化管の治療の用途が期待されてお
り、本発明は該ヒトモチリンアナログを廉価に大量に供
給ができる。

【０００３】

【従来技術】モチリンは、ブラウン等によりブタの上部
小腸粘膜から初めて単離され、構造の決定された物質で
ありペプチドホルモンの一種である。［Ｇａｓｔｒｏｅ
ｎｔｅｒｏｌｇｙ　第６２巻第４０１−４０４　頁（１
９７４年）及びＣａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５２巻
第７−１０頁（１９７２年）］　　このブタモチリンは
２２個のアミノ酸から構成されており、分子量は約２７
００である。

【０００４】一方、ヒト由来のモチリンについては、本
発明者等によってそのｃＤＮＡクローンが単離されると
共にその構造決定がなされ、ブタ由来のものと同一のア
ミノ酸配列であることが明らかにされた。［特開昭６３
−２７６４８９　］モチリンの生理作用としては消化管
運動亢進作用及び消化管平滑筋収縮作用が良く知られて
いる。これらの作用の中で、消化管運動亢進作用に関し
ては、例えば胃に於ける内容物の排出時間を短縮する作
用が報告されている［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ第８０巻　　第４５６−４６０　頁（１９８１年）］
。又、消化管平滑筋収縮作用に関してはウサギやヒトの
胃前庭部及び十二指腸に対して神経回路に依存せずに強
い収縮をもたらすことが知られている。尚、モチリンは
胃腸運動を亢進させ、しかも格別の副作用が報告されて
いないので、術後における胃腸障害の治療や診断等に有
効なものものと考えられてきた（因に、術後に於ける腸
管麻痺等の治療にはプロスタグランジン等が用いられて
いるが、副作用が強い点が問題である。）尚、モチリン
の１３位はメチオニンであるが、これをロイシン又はノ
ルロイシンに変換したアミノ酸構造を有するポリペプチ
ドもモチリンと同様な生理活性を示すことが報告されて
おり［Ｓｃａｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．　
第１１巻第１１９−２０３　頁（１９７６年）等］１３
位のメチオニンは活性に及ぼす影響はほとんどないもの
と考えられている。

【０００５】更に、本発明者らによってＣ末端のホモセ
リン残基を含むモチリン様ポリペプチドの種々の変換体
がモチリンと同等またはそれ以上の活性を示すこと明ら
かにされた（特願昭６４−０００２８６　）。　　加え
て、本発明者らによってこのＣ末端にホモセリン残基を
含むポリペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて廉価に製
造するための方法が示された。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題及び発明の目的】慣用技
術によれば、モチリンは一般にブタ由来のものであって
、抽出により得られており、大量生産が極めて困難であ
った。一方、化学合成法を利用する場合にも、モチリン
は２２個のポリペプチドであるために、大量かつ廉価に
得ることが困難であった。即ちモチリンは胃腸障害の治
療等に於ける有効性が期待されているにも拘らず、その
生産性がネックとなって臨床応用に汎く利用されるには
至らなかったのである。

【０００７】それ故に、所謂「バイオテクノロジー」を
応用してモチリン様活性を有するポリペプチドを廉価に
製造するための研究がなされてきた（特開昭６３−７７
１９５公報及び本発明者等が開発の特願昭６３−２０８
００６　号明細書に記載の方法等）。しかし、バイオテ
クノロジーを利用するこれらの方法においてはブロムシ
アンを用いて切断する工程を有しており、この際生じた
Ｃ末端の　Ｈｓｅを含むペプチドを酵素処理によって取
り除く工程を行なっていたが、この酵素処理の工程が実
際の大量生産においては、収率の低下やコストの増大を
招くなどの問題点を残していた。そこで本発明者らはブ
ロモシアンによる切断工程のみで調製することの可能な
、Ｃ末端に　Ｈｓｅを持つモチリン様ポリペプチド自体
がモチリンと同等以上の生理活性を有していることを見
いだした（特願昭　６４−０００２８６）。その後本発
明者らは組換え　ＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミド
を作製し、モチリン様ポリペプチドを更に容易に製造す
る方法を開発した（特願平１−２１６０３４）。

【０００８】本発明はこれらの方法をふまえてなされた
ものであり、本発明の主目的は微生物中で発現されたモ
チリン様ペプチドの配列を含むタンパク質を生理活性を
有するモチリン様ペプチドに転換し、容易に精製する方
法を提供することにある。本発明の附随的な、但し、重
要な目的は高純度のモチリン様ポリペプチドを効率的に
しかも廉価に製造する方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決し、目的を達成する手段】本発明者らは既
に、モチリン様ペプチドの配列を含むタンパク質を形質
転換微生物中に不溶性の封入体として生産する系を確立
した。形質転換微生物中に不溶性封入体として生産した
タンパク質は一般的には不溶性封入体のままで、または
変性剤により可溶化した後にこのタンパク質を精製し、
この段階を経た後に封入体タンパク質を例えば７０％ギ
酸の様な酸溶液に溶解してブロムシアン処理を行い、断
片化ペプチドを得る。この反応液はそのままでは各種ク
ロマトグラフィー等のタンパク質分離方法とは相容れな
いことがほとんどである。従って、例えば凍結乾燥等の
方法を用いてギ酸を除く方法が一般的である。又、反応
液を例えば水酸化ナトリウム等のアルカリで中和した後
に、生じた不溶性沈澱を除去して得られる中和液をゲル
ろ過することにより脱塩する方法も考えられる。しかし
ながら、この方法は毒性の高いブロムシアンを含む溶液
をゲルろ過するので、大量の毒性の高い廃液が生ずるこ
と、及び工業的生産では大量の中和液を分離する設備が
必要となる。このような複雑な工程を経た後に初めて、
タンパク質分離方法に移ることが可能となる。また、ブ
ロムシアン反応等の処理を経る場合は目的タンパク質の
類縁体ができることが多く、この類縁体を効率的に目的
ペプチドと分離するにはイオン交換クロマトグラフィー
等の通常の低圧カラムクロマトグラフィーでは分離が困
難であり、逆相クロマトグラフィー等の高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることが一般的である
が、有機溶媒の濃度勾配（グラジエント）を利用する溶
出法では分離できるペプチドの量が限られること及び一
定濃度の溶媒を用いた分離（アイソクラティック）条件
では比較的大量に分離できるが溶出溶媒量が多量になる
ことと溶出時間が長いことから、時間当りの分離できる
量が限られる。

【００１０】本発明者の目的は、形質転換微生物中にお
いて不溶性の生物学的不活性の封入体として生産される
タンパク質を臭化シアン反応して得られる断片化ペプチ
ドを回収し、医薬品として利用可能な高純度まで精製す
るための効率的、経済的方法を提供することにある。発
明の方法はタンパク質の目的ペプチドへの変換および、
微生物菌体からの目的ペプチドの精製のためのものであ
る。

【００１１】本発明者らは鋭意研究した結果、特別に不
溶性封入体を精製すること無しに、不溶性封入体を含む
微生物菌体をそのままブロムシアン処理し、得られる溶
液を例えば水酸化ナトリウムで中和することで微生物由
来の物質の多くを不溶化して除去し、得られる上清をそ
のまま疎水クロマトグラフィーにより、脱塩と粗精製を
同時にできることを見いだした。このことにより目的ペ
プチドを複雑な工程を経ることなく短時間で、しかも工
業的生産規模でも特別の設備を必要とせずに粗精製まで
可能となった。さらに本発明者らはこの粗精製液をイオ
ン交換膜で電気透析することにより簡便にイオン交換ク
ロマトグラフィー樹脂に吸着せしめることを見いだし、
イオン交換クロマトグラフィーを行い更に逆相クロマト
グラフィーを２種類の溶媒を用いる２段階のアイソクラ
ティック溶出法で行うことにより、モチリンアナログを
効率的に目的の純度まで精製できることを見いだし、本
発明を完成するに至った。以下に本発明を詳細に説明す
る。

【００１２】本発明は下記式１に示されるモチリン様ポ
リペプチドの工業レベルでの製造法を提供する。 Ｐｈｅ−Ｖａｌ−　Ａ　−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｙｒ−　Ｂ　−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−　Ｃ　−Ａｒｇ−　Ｘ
　−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−　Ｄ　
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−　Ｅ　−　Ｙ　　　　　　（式１） ［式中　Ａは　Ｐｒｏ，　Ｇｌｙ，　Ａｓｎまたは　Ｓ
ｅｒを意味し、　Ｂは　Ｇｌｙ，　Ｐｒｏ，　Ａｓｎま
たはＳｅｒを意味し、　Ｃは　Ｇｌｎ，　Ｇｌｕ　また
は　Ａｓｐを意味し、　Ｄは　Ａｓｎ，　Ｇｌｕ　また
は　Ａｓｐを意味し、　Ｅは　Ｇｌｎ，　Ｌｙｓ　また
は　Ａｒｇを意味し、　Ｘは　Ｍｅｔ以外のアミノ酸残
基を意味し、　Ｙはホモセリン（ホモセリンラクトンも
含み、　Ｈｓｅと略す）またはＣ末端にホモセリンを含
むアミノ酸１０個以内の任意のポリペプチドを意味する
。］ここで、上記の式（１）にて示されるアミノ酸配列
でＣ末端が　Ｍｅｔ（臭化シアン切断後は　Ｈｓｅに変
換）であるポリペプチドをタンデムに複数個連結した融
合タンパク質をトランスホーマント微生物内で大量に不
溶性の封入体として生産する系をすでに本発明者らは報
告しており、この重合体タンパク質をブロムシアン処理
する工程にのみよって上記（１）式にて示されるモチリ
ン様ポリペプチドの単量体を得られる。

【００１３】本発明の製造法はこの形質転換微生物を培
養して得られる菌体を遠心分離等の方法を用いて集菌し
、そのまま未精製の菌体を、または不溶性の封入体をア
セトンによる脱脂、菌体の超音波または高圧力を用いた
破砕による可溶性物質質の可溶化、白糖などの密度によ
る宿主微生物由来の物質を除去する、またはそれ以外の
封入体を精製する方法の内、適当と考えられる方法を組
み合わせて得られる粗精製の封入体タンパク質を５０−
８０％のギ酸を含む溶液に溶解せしめ、この溶解液にブ
ロムシアンを加えてタンパク質の　Ｍｅｔ部位で切断を
行い、次いでアルカリ性溶液で中和し、大部分のモチリ
ン様ポリペプチドは沈澱させずに大部分の微生物由来物
質を沈澱せしめ、例えば遠心分離等の方法を用いて得ら
れる高塩濃度のモチリン様ポリペプチドを含む溶液画分
を疎水クロマトグラフィー用担体に通して、モチリン様
ポリペプチドを疎水クロマトグラフィー用担体に吸着せ
しめ、次いで酸性または中性の低塩濃度の溶液または水
を用いてモチリン用ポリペプチドを溶離し、モチリン様
ポリペプチドを含む溶出液を例えば電気透析法等の脱塩
法を用いて脱塩し、得られる溶液に酸溶液を加えて弱酸
性溶液にしてイオン交換クロマトグラフィー用担体に吸
着せしめ、次いで塩を含む溶液でモチリン様ペプチドを
溶離し、モチリン様ポリペプチドを含む溶出液にアルカ
リ溶液を加えてｐＨを９　ー１０の範囲にして加温処理
し、モチリン様ポリペプチドのＣ末端の　Ｈｓｅをホモ
セリンに変換して、変換後直ちに中性にし、中和液を逆
相クロマトグラフィー用担体に吸着せしめ、酸性のアセ
トニトリルを１８ー２１％　含む溶液と２１−２５％含
む２種類の溶液で段階的にモチリン用ポリペプチドを溶
離し、溶出液を直ちに中和して、濃縮、脱塩して高純度
のモチリン用ポリペプチドを製造する方法である。

【００１４】封入体の精製は大部分の大腸菌由来物質を
この後の工程で除去可能であるので特に必要とはしない
が、医薬品などの高純度の目的産物を効率的に得たい場
合は例えば一般的に行なわれる不溶性の封入体をアセト
ンによる脱脂、菌体の超音波または高圧力を用いた破砕
による可溶性物質質の可溶化、白糖などの密度による宿
主微生物由来の物質を除去する工程等を１または複数の
工程を組み合わせて経ることが好ましい。

【００１５】封入体を溶解するギ酸の濃度は５０−８０
％が最も好ましく、濃度が低くなるにしたがって、封入
体の精製度が低いほど微生物由来の物質が溶解しない物
質が残るが、その後の中和の段階でそれらの大部分は除
去されるので、ギ酸などの酸で濃度を調節することによ
り可溶化した封入体タンパク質と不溶な物質とを分離す
ることはほとんど意味がない。封入体を溶解した５０−
８０％のギ酸の溶液にブロムシアンを加えて切断反応を
行なうのが反応速度、副反応物の量などの点から好まし
い。

【００１６】上記のブロムシアン反応でメチオニンの部
位で切断されて得られる目的のポリペプチドは封入体と
は異なり水に可溶性の物質となり、アルカリ性の溶液で
中和することで目的のポリペプチドは溶液側に残り、こ
の際大部分の微生物由来物質は不溶化するので例えば遠
心分離等の方法により目的ペプチドを効率的に分離でき
る。

【００１７】この場合、中和液のｐＨは　３より大きく
　３．５より小さいことが最も好ましい。この処理によ
って大部分の微生物由来の不純物を不溶性沈澱として除
去できる。ｐＨが　３．５より大きい場合は目的のペプ
チドが中和液の塩濃度が高いために不溶化する量が多く
なり回収率の低下を引き起し、ｐＨが　３より小さい場
合はその後の精製工程でステンレスに接触する場合など
は金属の腐食の可能性があること、及び微生物由来の不
要な物質を充分に沈澱できない可能性があるので好まし
くない。従って、このｐＨの範囲で目的のペプチドの大
部分が沈澱せずに、最も高い塩濃度を選択することが最
も好ましい。但し、中和液の塩濃度を低くする事により
ｐＨが　３．５より大きい場合でもｐＨが１０以下であ
れば、微生物由来の不要な物質を充分に沈澱でき、目的
のペプチドを溶液画分に残すことができる。この場合、
有毒なブロムシアンを含む溶液の量が多くなる、および
、その後の工程である疎水クロマトグラフィーでそのま
までは担体に吸着しなくなる可能性があるので、別に例
えば硫安等の塩を添加しなければ回収率が低下する。

【００１８】中和液から例えば遠心分離などの方法によ
り沈澱物を除去した溶液を疎水クロマトグラフィー用担
体に注ぐ、この担体は一般的にはカラムに詰めた形であ
る。

【００１９】本発明に用いる適当な疎水クロマトグラフ
ィー用担体としては例えば、ブチルトヨパール、オクチ
ルセファロース　ＣＬ−４Ｂ、フェニルセファロース、
ブチルセファロース４Ｂ、アガロース−ヘキサン、アガ
ロース−オクチルアミン、セパビーズ　ＦＰ−ＰＨ系、
セパビーズ　ＦＰ−ＯＴ系、セパビーズ　ＦＰ−Ｂｕ系
がある。疎水クロマトグラフィー用担体は、ポリビニー
ル系などの合成ポリマーの支持体にくっついた、または
、デキストラン、アガロース、またはセルローズのよう
な多糖支持体にくっついた、アルキル基（ブチル、オク
チル、フェニル）のような置換基を、かなりの程度に含
む。そのような好ましい樹脂の例はブチルトヨパールで
ある。

【００２０】疎水クロマトグラフィーで目的のペプチド
を溶離するには、塩濃度を下げるのみで充分であり、精
製水で溶離できるが、精製する目的のペプチドの等電点
から離れたｐＨの溶液を溶離液とすることがより好まし
い。もし所望ならば、その後の分離工程に影響がなけれ
ば例えばメタノール、またはアセトニトリルのような両
親媒性の有機溶媒を加えることも可能である。溶出液は
塩濃度が高いので、例えばゲル濾過、電気透析等の方法
で脱塩することができる。

【００２１】電気透析を用いる場合は、分子分画量が１
００　より大きく５００　より小さい半透膜を用いるこ
とが好ましく、透析外液に若干の塩を加えておくことが
回収率の低下を低く押さえることができる。また、通常
の透析や限外濾過等の方法も考えられるが、分画分子量
が１０００より大きい膜ではモチリン様ポリペプチドが
膜を通過し、回収率の低下を招くので好ましくない。

【００２２】ここまでの段階でトランスホーマント微生
物中に生産させたタンパク質を可溶性の目的のポリペプ
チドに分解して、微生物中から粗精製の目的物質を得る
ことができる。この方法はモチリン様ポリペプチドの生
産に限らず、ブロムシアン分解、またはギ酸分解等の封
入体体タンパク質を高濃度の酸溶液中で化学的切断によ
って水に可溶性の目的ペプチドをトランスホーマント微
生物中から簡便に精製する方法として極めて有効な方法
である。

【００２３】次の課題は得られたモチリン様ポリペプチ
ドの粗分画から医薬品などに利用できる高純度のモチリ
ン様ポリペプチドを工業レベルで効率的に製造すること
である。

【００２４】モチリン様ポリペプチドを含む脱塩した疎
水クロマトグラフィーの溶出液はそのままでもＨＰＬＣ
などの理論段数の高い分離法を用いて高純度のモチリン
様ポリペプチドを得ることができるが、このままでは効
率的な生産には好ましくない。ＨＰＬＣ法で分離を行な
う前に少なくとも１工程の例えばイオン交換クロマトグ
ラフィーのようなタンパク質精製法を行なうことが好ま
しい。そのような好ましい方法の例は陽イオン交換樹脂
を用いる方法である。この場合、疎水性クロマトグラフ
ィーで得られたモチリン様ポリペプチドを含む溶出液は
さきに示した方法で脱塩する事が必要であり、脱塩した
溶出液は例えば酢酸の様な酸または酸性の緩衝液でｐＨ
を　２より大きく　５より小さい値にする事が好ましい
。ｐＨを調節した溶出液を陽イオン交換樹脂に注ぐ、こ
の樹脂も一般にはカラムに詰めた形である。

【００２５】適当な陽イオン交換樹脂としては一般にタ
ンパク質精製用に市販されている各種の樹脂が用いられ
、デキストラン、アガロース、またはセルロースのよう
な多糖支持体に、またはポリアクリレート、または親水
性のポリビニールの様な合成高分子の支持体に結合させ
たカルボキシメチル基、またはスルホン系の交換基をか
なりの程度に含むものであり、この場合はスルホン系の
交換基を持つ陽イオン交換樹脂が好ましく、そのような
好ましい樹脂の例はＳ−セファロースＦＦである。スル
ホン系の樹脂に溶出液を注いだ場合、ｐＨを　６以上に
するとモチリン様ポリペプチドが溶離してくるので、ｐ
Ｈが　６より小さいところで例えば食塩の様な塩を０．
０１−　０．５Ｍ含む溶液で濃度濃度勾配で、または段
階的に濃度を高めることでモチリン様ペプチドを溶離す
る、またはｐＨを段階的に上げて行くことによりモチリ
ン様ポリペプチドを溶離する。

【００２６】この溶離液はオクタデシル（Ｃ−１８）系
（ＯＤＳ　）の逆相ＨＰＬＣを用いたｐＨがおよそ　２
の条件でアセトニトリルの濃度勾配で分析するとモチリ
ン様ポリペプチドの主画分が溶出する前側には比較的溶
離する物質は少なく、陽イオン交換クロマトグラフィー
を行なう前よりもかなり改善される。溶出液はこのまま
でもＨＰＬＣを行なうことが可能であるが、弱アルカリ
性溶液にしてモチリン様ポリペプチドのＣ末端の　Ｈｓ
ｅのホモセリンラクトンを開環してホモセリンにする操
作をする事がより好ましい。この場合のｐＨは９−１１
の範囲が適当であり、目的物質の分解を避ける意味でこ
の範囲内でもｐＨは１０より小さい値の方がより好まし
い。　　溶出液はカラムに詰めたＨＰＬＣ用　ＯＤＳ担
体を用いて２種類のアセトニトリルの濃度が異なる分離
溶媒を用いることで高純度のモチリン様ポリペプチドを
精製でき、一定溶媒系よりも短時間でしかも溶離液の量
を少なくすることができ、しかも一定溶媒系の場合と同
程度の量が精製可能となった。

【００２７】モチリン様ポリペプチドを吸着させたカラ
ムを一次溶媒で分離し、モチリン様ポリペプチドより先
に移動する物質を除去し、一次溶媒よりもアセトニトリ
ルの濃度が高い２次溶媒でモチリン様ポリペプチドを溶
離する。

【００２８】適当な逆相ＨＰＬＣ担体としては、多くの
市販されている　ＯＤＳ担体が使用可能である。溶媒の
ｐＨは２．０−９．０　の範囲が好ましく、シリカ系の
樹脂を用いた場合は安定性から　ｐＨ２から　６　　付
近がより好ましい。分離する一次溶媒のアセトニトリル
の濃度は１８−２０％　の間が最も好ましく、二次溶媒
のアセトニトリルの濃度は一次溶媒よりも高く　３０％
より小さいことが好ましく、２０−２４％　の間である
方がより好ましい。有機溶媒の濃度が高くなると溶出液
の量は減少するが、混入する目的ペプチド以外の物質量
が増加する傾向がある。得られた溶液は酸性であるので
溶離後直ちに中性にすることが目的物質の分解を防ぐ意
味で好ましい。溶離液を、一般に既知の方法で濃縮、脱
塩することにより高純度のモチリン様ポリペプチドを得
られる。　　なお、本発明により得られた高純度モチリ
ン様ポリペプチドは消化管運動改善剤、涙分泌異常改善
剤等として注射剤、経口剤、坐剤、目剤等として任意慣
用の方法で投与用に調整される。凍結乾燥、製剤化等に
あたっては他の一般の酵素類、ポリペプタイド類の製剤
化と同様、安定化剤たとえばアルブミン等が、経口剤の
場合は一般の賦形剤たとえば乳糖、デンプン等が使用さ
れ投与用に調製される。

【００２９】

【実施例】次に、本発明の実施例に関してさらに詳しく
説明する。尚、以下のおいてはモチリンの１３位がＬｅ
ｕ　に変換され且つ２３位にＨｓｅ　の付加したモチリ
ン様ポリペプチド（Ｌ−ロイシン−１３−モチリン−ホ
モセリン）の製造に関して説明するが、ブロムシアン断
片化ペプチドであれば、同様にして製造し得ることに留
意され、実施例が本発明の範囲を決して限定するもので
はない。

【００３０】実施例 モチリン様ペプチド含有融合タンパク質を産生した菌体
を冷やしたアセトンで懸濁後フィルターで濾過して得ら
れる残渣を風乾した固形物（アセトンパウダー）、３５
０ｇを生理食塩水約　８０　ｌに懸濁して、高圧ホモジ
ナイザーにて４００ｋｇ／ｃｍ２　以上の高圧で菌体を
破砕した。破砕した菌体はドラバル式遠心機で連続遠心
し不溶性物質の画分を　１０　ｌ以下に濃縮した。この
溶液に白糖を溶液と精製水を加えて０．５Ｍ白糖溶液と
して、連続遠心器にて不溶性沈澱物をペレット化し回収
した。このペレットはモチリン様ペプチド含有融合タン
パク質からなる封入体を含有している。

【００３１】得られた沈澱物を精製水で懸濁して８．６
　ｌとした。次いで、ギ酸　２０　ｌを加えて沈澱物を
溶解し、更にブロムシアン　７５ｇを加えて約３０℃で
一晩反応させた。反応液に精製水３　ｌを加えた後、冷
却水で冷やしながらと５Ｎ水酸化ナトリウム溶液４０ｌ
を徐々に添加した。 中和液を１時間程度放置し、遠心分離と０．３　μｍの
ポアサイズのフィルターを併用して沈澱物を除去した。

【００３２】疎水クロマトグラフィー用担体ブチルトヨ
パール６５０Ｍカラム（φ　９ｃｍ×８０ｃｍ）を　５
０％飽和硫安で緩衝化しておき、このカラムに中和液を
通してＬ−ロイシン−１３−モチリン−ホモセリンを吸
着せしめた後、　５０％飽和硫安液でカラムを洗浄し、
次いで０．５％酢酸で溶出すると、２８０　ｎｍの吸光
度で検出されるメインピークにＬ−ロイシン−１３−モ
チリン−ホモセリンを含む画分を得る。

【００３３】溶出液を分画分子量　３００、有効膜面積
４００　ｃｍ２　のスチレン系の膜を用い、透析外液に
１％程度の硫安を含む溶液で電気透析装置（旭化成株式
会社製、マイクロアシライザーＧ３）により電圧７．５
Ｖで電流値０．１Ａになるまで脱塩した。脱塩した溶液
は予め０．５％酢酸で緩衝化しておいた陽イオン交換ク
ロマトグラフィー用担体Ｓ−セファロースＦＦ（φ１４
ｃｍ×２０ｃｍ）に通して、０．５％酢酸と５０ｍＭ酢
酸を含む０．２５％　酢酸をＮａＯＨで約ｐＨ５にした
溶液で洗浄し、次いで３５０ｍＭ　食塩を含む０．２５
　％酢酸をＮａＯＨで約ｐＨ５　にした溶液で溶出する
と、２８０　ｎｍの吸光度で検出されるメインピークに
メインピークにＬ−ロイシン−１３−モチリン−ホモセ
リンを含む画分を得る。

【００３４】溶出液に５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を徐々
に加えてｐＨを約１０に調節し、約３７℃の温浴で１時
間処理し、直ちにｐＨ６　の燐酸緩衝液を２０ｍＭの濃
度になる様に加えて中和する。処理液を約　１００ｍｌ
取り、０．０１２Ｎの塩酸を含む　１９％アセトニトリ
ル水溶液で緩衝化したＯＤＳ　シリカ担体カラム（５　
×２５ｃｍ、ポアサイズ１２０Ａ°、粒径　１０　μｍ
　）に注ぎ、次いで流速約６０ｍｌ／分で同溶液で溶出
する。

【００３５】光路長３ｍｍ　のＵＶ検出計を用いて２２
０ｎｍ　で連続的に測定し、目的のＬ−ロイシン−１３
−モチリン−ホモセリンが溶出しはじめ、検出計の吸光
度が　０．１で分離溶液を０．０１２Ｎの塩酸を含む　
２２％アセトニトリル水溶液にし、吸光度　０．５以上
を分画し、Ｌ−ロイシン−１３−モチリン−ホモセリン
を含む画分を得、直ちにｐＨ＝７．５のリン酸緩衝液を
２０ｍＭになるように加えて中和する。同様の操作を繰
り返して全ての処理液をＨＰＬＣで分離する。

【００３６】その際、カラムは　５０％アセトニトリル
を注入して洗浄した後に再び緩衝化する。ＨＰＬＣでの
　５回分の中和した分離液を精製水を加えて約２倍に希
釈し、０．００３Ｎ塩酸で緩衝化したＷａｔｅｒｓ社の
プレパックカートリッジデルタパック（４．７　×３０
ｃｍ、粒子径１５μｍ　官能基Ｃ１８　ポアサイズ　１
００　Ａ°）に注ぎ、同様液で洗浄し、０．００２Ｎ塩
酸を含む　３０％アセトニトリル水溶液で溶出し、メイ
ンピークにＬ−ロイシン−１３−モチリン−ホモセリン
を得、同様液は直ちにｐＨ　７．５のリン酸緩衝液を１
０ｍＭになるように加えて中和しする。同様の操作を繰
り返して全てのＨＰＬＣ分画液をカラム濃縮する。

【００３７】その際、カラムは　５０％アセトニトリル
を注入して洗浄した後に再び緩衝化する。この画分をエ
バポーレーターによる濃縮と凍結乾燥により大部分の有
機溶媒を除去し、得られたペプチドを精製水にペプチド
の濃度が２％となるように溶解し、分画分子量　３００
、有効膜面積４００ｃｍ　２　の膜を用い、透析外液に
１％程度の硫安を含む溶液で電気透析により電圧７．５
Ｖで電流値　０．０１Ａ以下になるまで脱塩する事によ
り高純度のＬ−ロイシン−１３−モチリン−ホモセリン
を含む溶液を得た。かくして得たＬ−ロイシン−１３−
モチリン−ホモセリンはペプチドとして　２０ｇ　　以
上であり純度は９９％　以上であった。またリムルステ
ストによるエンドトキシンの定量では検出限界以下であ
った。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　形質転換微生物中に、不溶性でヒトモ
   チリンアナログの多分子連結体とした融合タンパク質と
   して生産される封入体を活性型ヒトモチリンアナログに
   転換する方法及びその精製方法。
2. 【請求項２】　　封入体を生産した大腸菌をアセトンで
   殺菌及びアセトン可溶性物質を除去し、その不溶性画分
   を破砕し、不溶性画分をギ酸を含む溶液で封入体を可溶
   化し、臭化シアンで処理する事により活性なヒトモチリ
   ンアナログ転換することを特徴とする請求項１に記載の
   活性型ヒトモチリンアナログへの転換法。
3. 【請求項３】　　活性型モチリンアナログを含むペプチ
   ド溶液をアルカリで中和し、不純物を塩析し、この上清
   から疎水クロマトグラフィー用樹脂にヒトモチリンアナ
   ログを吸着せしめ、次いで水または弱酸を含む溶液で溶
   出し、疎水クロマトグラフィー用担体から分離し、この
   溶液を脱塩装置で脱塩し、酢酸溶液でｐＨを４以下に調
   製してからヒトモチリンアナログをイオン交換樹脂に吸
   着せしめ、食塩を含むｐＨ５の緩衝液でイオン交換樹脂
   から分離し、さらにこの溶液を逆相クロマトグラフィー
   用担体に吸着せしめ、アセトニトリルの濃度を変えた２
   種類の溶媒で逆相クロマトグラフィー用担体により分離
   精製することを特徴とする請求項１に記載のヒトモチリ
   ンアナログの精製方法。
4. 【請求項４】　　疎水性クロマトグラフィーにポリビニ
   ール系などの合成ポリマーの支持体、またはデキストラ
   ン、アガロース、またはセルローズのような多糖支持体
   に結合したアルキル基（ブチル、オクチル、フェニル）
   のような置換基を、かなりの程度に含む樹脂をもちいる
   ことを特徴とした請求項３に記載のヒトモチリンアナロ
   グの精製方法。
5. 【請求項５】　　脱塩装置として炭化水素系、フッ素系
   もしくはスチレン系のイオン交換膜を用いた電気透析装
   置を用いることを特徴とした請求項３に記載のヒトモチ
   リンアナログの精製方法。
6. 【請求項６】　　イオン交換クロマトグラフィ−にスル
   ホン系もしくはカルボキシメチル（ＣＭ）系の陽イオン
   交換クロマトグラフィー樹脂を用いることを特徴とする
   請求項３に記載のヒトモチリンアナログの精製方法。
7. 【請求項７】　　逆相クロマトグラフィーにアルキル基
   を結合させたシリカ系もしくはポリマー系樹脂を用いる
   ことを特徴とした請求項３に記載のヒトモチリンアナロ
   グの精製方法。