JPH06505253A - Ｅｌａｍ−１に対するモノクロナール抗体及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＥＬＡＭ−１に対するモノクロナール抗体及びそれらの使用発明の背景 本発明は、細胞間の癒着ににより仲介される炎症及び他の病的状態の治療のため の組成物及び方法に関する。特に、本発明は、細胞間の癒着に関係する細胞表面 レセプタ（ＥＬＡＭ−１）上の機能的エピトープに選択的に結合する新規の免疫 グロブリンを使用することにより、細胞の癒着を抑制することに関する。

血管内皮は、特定の細胞の、管壁を通過しての及び周囲の組織への移動に先立っ て、血液の流れの中の特定の細胞の癒着において中心的な役割を演じる。例えば 、特定の炎症誘発物質、例えばバクテリアの内毒素、腫瘍壊死因子、及びインタ ーロイキンｌは、血管内皮に、直接的または非直接的に作用して、白血球とリン パ球の癒着を促進する。これらの細胞は、次に、血管壁を通過し、そして損傷ま たは感染領域に移動する。血管内壁への細胞の癒着が、腫瘍の転移に関係すると も考えられる。循環している癌細胞は、おそらく、生体の正常な炎症機構を利用 し、モして内皮が活性化されている血管壁の領域に結合する。

最新の研究により、内皮細胞、血小板、及び白血球上の特殊化された細胞表面の レセプタ（ＬＥＣ−ＣＡＭｓ、　ＬＥＣＡＭｓまたは５ｅｌｅｃｔｉｎｓと名ず けられている）が、さまざまな細胞間の相互作用に関係していることか明らかに なっている。これらのレセプタは、レクチン様のドメイン、上皮成長因子に対し 相同性をもつ部位、及び補体調節蛋白に対し相同性をもつ部位を備えた表面糖蛋 白である（参照、　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕ組み入れる）。例えば、ＬＥＣＡＭ−２ またはＥＬＡＭ−１と名ずけられたセレクチンが、多くの炎症反応の最初の段階 である、内皮白血球の、活性化された内皮細胞への癒着、を仲介することが明ら かになっている。

特に、ＥＬＡＭ−１が、ヒトの好中球、単球、及び前骨髄球の細胞系ＨＬ−６０ に結合することが明らかになっている。

この普通のクラスの細胞表面レセプタは、さまざまな細胞で発現されることがで きる。例えば、ＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ、　ＬＥＣＡＭ−３及びＣＤ６２ としても知られている）は、活性化された血小板の表面上に存在しそこで血小板 と白血球との相互作用を仲介する別のセレクチンレセブタである。同様に、ＬＡ Ｍ−１（ＬＥＣＡＭ−１としても知られている）は、循環しているリンパ球の、 構成的に発現された細胞表面レセプタであり、そしてリンパ節の”帰巣性”レセ プタとして働く。

これらのレセプタの働きを妨害し、そしてそれ故に細胞癒着を抑制するために、 様々な方法が、開発されている。例えば、ＥＬＡＭ−１に向けられたモノクロナ ール抗体は、内皮と白血球との癒着抑制剤として提案されている。しかしながら 、抗体による癒着の抑制とインビボにおける効果との関係は明らかでない。した がって、ＥＬＡＩＪ−１と反応性がある抗体の使用による、炎症疾患の効果的治 療の証拠に対する要求が存在する。

発明の要約 本発明は、ＥＬＡＭ−１上の機能的エピトープへの結合及びそれによる患者内で の細胞間癒着の抑制能力をもつ免疫グロブリンを提供する。

特に、この免疫グロブリンは、ＥＬＡＭ−１に仲介される様々な炎症疾患反応、 例えば敗血症のショック、成人の呼吸困難症候群または損傷関連の敗血症の治療 において効果的である。特に好まれる免疫グロブリンは、１９９０年ｌＯ月３０ 日にブタペスト条約に基き寄託された、Ａ。

Ｔ、　Ｃ，Ｃ，アクセス番号ＨＢ１０５９１と名ずけられた細胞系により分泌さ れる。本発明は、患者の炎症反応の治療または診断のための医薬組成物あるいは 方法を提供する。この組成物は、好ましくは静脈中に投与される。効果的治療の 投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重までの、好ましくは、 約５ｍｇ／ｋｇ体重から約１５ｍｇ／ｋｇ体重までの間にある。この組成物は、 免疫グロブリンが埋め込まれた標的リポソームを含んで成ることもできる。この リポソームは、抗炎症化学療法剤を含んで成ることができる。この免疫グロブリ ンは、診断剤として使用された時、典型的にラベルされる。

図面の簡単な説明 図１は、予防的に投与されたＥＬＡＭ−１に対するモノクロナール抗体が、ラッ トでのリボ多糖類により誘導される致死を防止することを示す。

図２は、治療的に投与されたＥＬＡＭ−１に対するモノクロナール抗体が、ラッ トでのリボ多糖類により誘導される致死を防止することを示す。

図３は、ラットでのりボテイコ酸誘導の胸膜炎を抑制する本発明のモノクロナー ル抗体の能力を例示する。

図４は、ヒト内皮細胞への好中球の癒着を誘導するのに要求されるリボ多糖体及 びリボティコ酸の最適濃度を示す。

図５は、リボ多糖類及びリボティコ酸誘導の好中球の癒着の時間経過、及びこの 癒着がＥＬＡＭ−１に対する抗体によって抑制されることを示す。

図６は、本発明のモノクロナール抗体、ＥＢ３−１の血液浄化曲線を表す。

図７は、ラットでのリボ多糖類により誘導される死におけるＥＢ３−１及び修飾 形態の効果を例示する。

好ましい態様の説明 本発明は、ＥＬＡＭ−１が関係する炎症及び他の疾患の抑制のための、組成物及 び方法に関する。特に、本発明は、インビボにおける細胞の、セレクチンにより 仲介される癒着を抑制する能力をもつ免疫グロブリンを利用する。本発明の免疫 グロブリンは、ＥＬＡＭ−１上の機能的エピトープに選択的に結合し、そして血 管内皮への白血球の癒着を妨害する。本発明は、この免疫グロブリンの調製、及 びＥＬＡＭ−１に仲介される細胞間癒着を特異的に抑制する免疫グロブリンを同 定するためのスクリーニング検定のための方法も提供する。加えて、これらの物 質の診断的及び治療的使用が提供される。

前に言及したように、セレクチンは、様々な細胞の表面上に発現した独特な糖蛋 白である。例えば、内皮の白血球癒着分子１（ＥＬＡＭ−■）は、血管の内皮細 胞上に誘導的に発現する（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ他、凱起ａｎｄ　Ｈｅ５ｓｉｏ ｎ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８７　：１６７３−１６ ７７（１９９０）、この両方を引用として本明細書に組み入れる）。このレセプ タが、炎症性サイトカイン例えばインターロイキンｌβ（ルー！β）及び腫瘍壊 死因子α（ＴＮＦα）、並びにバクテリアの内毒素（リボ多糖類）に組み入れる ）。これらの物質は、インビトロにおいて内皮細胞上に直接的に作用し、多形核 の白血球（顆粒球）、及び単球の癒着を実質的に増大させる（Ｂｅｖｉ　１ａｃ ｑｕａ他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＲＥ）。

最新の研究は、ＥＬＡＭ−１に認識されたオリゴ多糖のリガントの証拠を提供し た。このリガンドは、シアル酸Ｌｅｗｉｓ　Ｘ（ＳＬＸ）として知られているが 、顆粒球の表面の糖蛋白及び糖脂質に見られる末端構造である。以下参照、Ｐｈ １ｌｌｉｐｓ他、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０：１１３０−１１３２（１９９０ ）；及上記で言及したように、ＧＭＰ−１４０は、血小板及び内皮の分泌顆粒の 膜糖蛋白である（Ｇｅｎｇ他、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４３　ニア５７−７６０（ １９９０）これを引用として本明細書中に組み入れる）。表面上にＧＭＰ−１４ ０を発現する活性化された血小板が、単球及び好中球に（Ｊｕｎｇｉ他、Ｂｌｏ ｏｄ　６７：６２９−６３６（１９８６））　、そしてさらに単球様細胞系、例 えばＨＬ６０及びＵ９３７（Ｊｕｎｇｉ他、　呵爬：５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ他 、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　７９：８６７−８７４（１９８７））に 結合することは、知られており、これらを全て引用として本明細書中に組み入れ る。

ＧＭＰ−１４０は、分子量１４０．０００のアルファ顆粒膜蛋白であり、血小板 刺激及び顆粒分泌において、活性化された血小板の表面上に発現される（Ｈｓｕ Ｌｉｎ他、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９：９１２１−９１２６（１９８ ４）；Ｓｔｅｎｂｅｒｇ他、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　Ｈす：８８０−８ ８６（１９８５）　；Ｂｅｒｍａｎ他、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、［ｖｅｓｔ。

ａ（１９８７））、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体内（Ｂｏｎｆａｎｔｉ他、Ｂ ｌｏｏｄ、　７３：１１０９−１１１２（１９８９））にも見つけられている。

Ｆｕｒｉｅ他の米国特許第４．７８３．３３０号は、ＧＭＰ−１４０と反応性の あるモノクロナール抗体について記載している。以下の全てを、引用として本明 細書に組み入れる。

第３のセクレンレセプタは、リンパ球帰巣性レセプタ（ＬＨＲ，ｇｐ”ＭＥＬ（ マウス）またはＬＡＭ−１（ヒト）としても言及される）である。

以下参照、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１　：９１３−９１９（１９８９）、 及びＬａ５ｋｙ他、Ｃｅ１ｌ、５６・１０４５−１０５５（１９８９）これらを 全て引用として本明細書に組み入れる。リンパ球帰巣性に加えて、ＬＨＲが、炎 症反応において先に機能し、そして内皮への好中球の結合を仲介すると信じられ ている。　セクレチンレセプタの構造と機能は、上記のレセプタのそれぞれをコ ードするｃＤＮＡ全長のクローニング及び発現により明らかにされている（東男 、例えば、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ他、５ｃｉｅｎｃｅ　、　ＨＥ　（［ＥＬＡＭ −１）　、Ｇｅｎｇ他、ＬＥ（ＧＭＰ−１４０）　、及びＬａ５ｋｙ他、ｆＦＥ 、（ＭＥＬ−１４））　、セレクチンの細胞外の部分は、先に記載した蛋白への 相同性に基礎を置く３つのセグメントに分割され得る。Ｎ−末端部位（約２０ア ミノ酸）は、低い親和性ＩｇＥレセプタＣＤ２３を含む、哺乳類のＣ−タイプレ クチン蛋白家系に関係する。残基１２１−１５５は、上皮成長因子（ＥＧＦ）の モチーフを含む蛋白と関係する。ＥＧＦのドメインが６分の３になった後、それ ぞれ約６０アミノ酸の縦に並ぶ反復するモチーフは、補体調節蛋白の家系に見ら れるものと関係する。

本発明の免疫グロブリンは、ＥＬＡＭ−１上の機能的エピトープを認識し、並び に選択的に結合し、そして、これによりインビトロでの検定において細胞間の癒 着を抑制する。本明細書に記載した例証の免疫グロブリンは、本発明の範囲内の 追加の免疫グロブリンを同定するために、各種の標準スクリニング手順において 使用することができる。さらに、本明細書で用意されたインビボにおける証拠は 、請求項の抗体がＥＬＡＭ−１に仲介された炎症性の症状の治療にも効果がある ことを証明する。本明細書で使用する”機能的エピトープは、抗体により選択的 に結合されたＥＬＡＭ−ルセブタ上の抗原性の部位と解釈する。ここで、抗体は 、ＥＬＡＭ−１リガンドがそのＥＬＡＭ−ルセプタへ結合することを実質的に抑 制し、そしてそのことにより患者での炎症性疾患反応を抑制する。本明細書の目 的のため、”実質的な抑制”とは、少なくとも約６０％の抑制、好ましくは約７ ０％から約９０％、そしてより普通には約９９％もしくはそれより多く（以下に 記載するようなインビトロにおける検定での測定として）である。

数多くの抗体が、活性化された内皮細胞のスクリーニングにより同定されている 。以下参照、辺人４、Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１． 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、前記；　Ｐｏｂｅｒ他、Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ　、 　１３６：１６８０（１９８６）；Ｇｒａｂｅｒ他、８（１９９０）：及びＰＣ Ｔ公開番号Ｗ０９０１０５７８６．ＷＯ９０１０５５３９及びＷＯ９０／１３３ ００、、これらを全て引用として本明細書中に組み入れる。

請求項の免疫グロブリンは、様々な免疫グロブリンの生産及び操作のために当業 者が利用できる多くの技術を使用する、修飾に適している。可能な修飾のいくつ かが、以下により詳細に考察される。

基本的な免疫グロブリンの構造単位は、テトラマーを含んで成ることが知られて いる。それぞれのテトラマーは、２対のポリペプチド鎖から構成され、それぞれ の対は、１つの”軽い”（約２５ｋＤ）及び１つの″重い“Ｍ（約５０〜７０ｋ Ｄ）をもつ。それぞれの鎖のＮ−末端は、抗原を認識するために最初に反応する ことができる約１００からｌＩＯもしくはそれより多くのアミノ酸の多様な部位 を定義する。それぞれの鎖のＣ−末端は、エフェクター機構のために最初に反応 することができる一定の部位を定義する。

本明細書で使用されたとき、用語”免疫グロブリン”は、免疫グロブリン遺伝子 により実質的にコードされた１もしくはそれより多くのポリペプチドより構成さ れた蛋白と解釈する。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、ア ルファ、ガンマ、デルタ、ニブシロン、及びミューの一定部位の遺伝子を、並び にその無数の免疫グロブリンの様々な部位の遺伝子を含む。Ｌ鎖は、カッパまた はラムダとして分類される。Ｈ鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、また はニブシロンとして分類され、これが、順番に、免疫グロブリンのクラスである ところの、それぞれ、［ｇＧ　、　ＩｇＭ　、　［ｇＡ、［ｇＤ及びＩｇＢを定 義する。

免疫グロビリンは、全ての抗体のかたわらに、例えばＦｖ、　Ｆａｂ及びＦ（ａ ｂ’　）ｚを含む様々な形態で、並びに、単鎖で存在することができる（例えば 、Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８ ５：５８７９−５８８３（１９８８）及びＢｉｒｄ他、５ｃｉｅｎｃｅ　、２４ ２：４２３−４２６（１９８８）、及びＨｕｎｋａｐｉｌＨｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏ ｏｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３　：１５−１６（１９８６）、　これらを全て 引用として本明細書に組み入れる）。

プロテアーゼであるパパインの処理が、その分子を３つのフラグメントに分割し 、その内の２つは、Ｆａｂフラグメントと、及び他方は、Ｆｃフラグメントと名 ずけられる。Ｆａｂフラグメントは、それぞれ、抗原結合ドメイン及びＣ８１ド メインより構成される。さらにＦａｂフラグメントの蛋白消化が、可変領域から のみ構成されるＦｖフラグメントを解放する。プロテアーゼであるペプシンは、 アミノ酸残基２３４及び３３３付近のＨ＃Ｉを解裂して、Ｆ（ａｂ’　）２及び ｐＦｃ’Ｆｃフラグメントする。Ｃ，２及びＣ，３ドメインから構成されるＦ１ フラグメントは、様々なエフェクター機構を仲介する免疫グロブリン分子の一部 分である。この免疫グロブリンのＨ鎖に依存して、様々なエフェクター機構が存 在する。これらは、補体の固定、Ｂ細胞の刺激、循環寿命、並びに食菌作用に先 立つ顆粒球及び大食細胞上のＦｅレセプタの結合を含む。以下参照、概して、Ｆ ｕｎｄｅｍｅｎｔｓｌて本明細書に取り込む。

本発明の免疫グロブリンは、色々な方法で作ることができる。非ヒトのモノクロ ナール抗体、例えば、ネズミ、ウサギ、ウマ、その他が良く知られており、そし て、例えば、単離されたＥＬＡＭ−ルセブタ、活性化された内皮細胞、またはＥ ＬＡＭ−１をコードするＤＮＡにより形質転換された細胞をもつ上記の動物を免 疫化することにより完成されることができる。その免疫化された動物から得られ た抗体生産細胞は、不朽化及びスクリーニングされ、または、所望の抗体の生産 のために最初にスクリーニングされ、そして次に不朽化される。

モノクロナール抗体生産の一般手順の考察のためには、以下参照、Ｈａｒｌｏｗ 　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、これらは参考文献として本明細書中で引用される。

ＥＬＡＭ−１に対する抗体を作るのに適した方法のためには、以下参照、例えば 、Ｂｅｖ目ａｃｑｕａ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、前 記：Ｐｏｂｅｒ他、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、　１３６：１６８０（１９８６）　； Ｇｒａｂｅｒ他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１４５：　８１９−８３０（１ ９９０）　；Ｌｅｅｕｗｅｎｂｅｒｇ番号Ｗ０９０１０５７８６、ＷＯ９０１０ ５５３９及びＷＯ９０／１３３００　、これを全て引用として本明細書に取り込 む。

本発明のモノクロナール抗体は、例１に以下に記載するような検定において、好 ましくは、ＥＬＡＭ−１及び他のセレクチンレセプタにより仲介された癒着の抑 制能力のためにスクリーニングされる。理想的には、この検定は、免疫グロブリ ンのインビトロにおける大規模なスクリーニングを可能にする。リガンド−レセ プタの相互作用の抑制因子のインビトロにおけるスクリーニングのための多数の 直接的及び間接的方法が、利用でき、そして当業者に知られている。例えば、リ ガンド担持細胞、例えばＰＭＮｓと、特定セレクチン発現細胞との癒着を抑制す る能力が決定された。上述のように、セレクチンレセブタ遺伝子は、クローン化 されており、したがって、この遺伝子は、多種多様な細胞、例えばＣＯ３細胞、 Ｃ）（Ｓ細胞及び同様のもの内で、挿入及び発現され得る。典型的には、このテ ストの免疫グロブリンは、固体表面で不朽化されている、ラベルされたリガンド 担持細胞及び活性化されたセレクチン担持細胞と一緒にインキュベートされる。

次に細胞癒着の抑制が、適切な洗浄の後にその表面に結合したラベルを検出する ことにより測定された。以下に記載する例示の分析の中では、ＰＭＮｓ及び活性 化されたヒト内皮細胞または活性化された血小板が使用された。

上記の分析により同定された免疫グロブリンは、様々な医薬、診断及び他の応用 に好適である。以下により詳しく記載するセレクチン仲介疾患の治療及び診断に 加えて、この免疫グロブリンは、機能的エピトープを認識する他のモノクロナー ル抗体のためのスクリーニングに使用されることができる。このような抗体は、 請求項の免疫グロブリンがセレクチンレセブタを発現する細胞に結合することを 妨害する能力により同定され得る。

しかしながら、ヒトにおける、非ヒト免疫グロブリンの治療的効果は、それらが 血漿中での短い半減期をもち、ヒトの免疫反応を引き起こすために、しばしば限 定される。それ故、その抗体を修飾し、治療的利用を改善することが要求される であろう。モノクロナール抗体を使用した診断及び治療の改善のために、様々な 戦略が利用できる。以下参照、Ｗａｌｄｍａｎｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５２： １６５７−１６６２（１９９１）、これらを引用として本明細書に取り込む。

本発明の抗体の修飾に好適な１つの方法は、非ヒト抗体の抗原結合領域を、ヒト 抗体の領域に転移させることである。例えば、Ｆ（ａｂｏ）、フラグメントが、 キメラ抗体を作るためにヒトの定常領域に連結されることができる。あるいは、 本明細書中て“ヒト化“抗体と言われるものを作るために、超可変的領域がヒト のフレームワーク領域に連結されることができる。このような方法は、当業者に 普通に知られており、そして例えば、米国特許番号４．８１６．３９７　、米国 特許番号４．８１６．５６７及び欧州特許公開１７３．４９４及び２３９．４０ ０　、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／９０１０７８６１及びＲｅｉｃｈｍａｎｎ、　Ｌ、 他、Ｎａｔｕｒｅ、　３３２：３２３−３２７（１９８８）に記載されており、 これらを全て引用として本明細書中に取り込む。

キメラ及びヒト化抗体は、典型的には、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子 のセグメントから組み換えＤＮＡ技術により構築される。例えば、マウスのモノ クロナール抗体だめの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒトの不変（Ｃ）セグ メント、例えばγ１及びγ、に接続されることができる。好ましい治療的キメラ 抗体は、したがって、マウスの抗体からのＶまたは抗原結合ドメイン並びにヒト 抗体からのＣまたはエフェクタードメインから構成されるハイブリッド蛋白であ る。ただし、他の哺乳類の種も使用できる。

キメラ及びヒト化抗体は、ヒトの治療での使用においてマウスの抗体を超える多 くの潜在的利点をもつ。例えば、ヒトの免疫系は、外来のものとしてのキメラ抗 体のＣ領域部位を認識することができないし、そして、それ故に、注入されたキ メラ抗体に対し反応する抗体は、全体として外来性であるマウスの抗体に対して 向けられる抗体より少なくなるはずである。加えて、注入されたマウスの抗体が 、同じクラスのヒトの抗体の半減期よりもかなり短い、ヒトの循のものとほとん ど同じ半減期をもつであろうし、より少量の及びより少ない回数の、与えられる べき投与を可能にする。

本発明の抗体を生産する他の方法は、Ｈｕｓｅ他、５ｃｉｅｎｃｅ　、２４６： １２７５−１２８１（１９８９Ｘ引用として本明細書中に取り込む）により概説 された一般的な文書に従ったヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーのスクリーニ ングにより、そして次に、所望の特異性をもつ抗体（または結合フラグメント） をコードする配列をクローニング及び増幅することにより、ヒトのセレクチンレ セブタに特異的に結合するヒトのモノクロナール抗体またはそれらの部分をコー ドするＤＮＡ配列を単離することである。

１つの視点では、本発明は、請求項のモノクロナール抗体からのＨ及び／または Ｌ鎖の可変または超可変領域をコードする組み換えＤＮＡセグメントに向けられ ている。これらの領域をコードするＤＮＡセグメントは、典型的には、適切な不 変領域、例えばヒトのガンマＨ鎖領域またはヒトのカッパＬ鎖領域をコードする ＤＮＡセグメントに、接続されるであろう。当業者は、コドンの縮重及び非必須 のアミノ酸置換により、以下に記載するように、他のＤＮＡ配列がそれらのＤＮ Ａ配列に難なく置換され得ることを認識するであろう。

このＤＮＡセグメントは、典型的には、天然に結合したまたは異種性のプロモー タ一部位を含む、キメラの抗体をコードする配列に、作用可能な状態で結合され る、発現制御ＤＮＡ配列をさらに含む。好ましくは、この発現制御配列は、真核 宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター内での、 真核細胞のプロモーター系となるであろう。このベクターが、適切な宿主に取り 込まれれば、その宿主は、そのヌクレオチド配列の高いレベルの発現に適した条 件下で、培養され、そして、所望により、Ｌ鎖、Ｈ鎖、Ｌ／Ｈ鎖の２量体、また は完全なキメラ抗体の収集及び精製が続くであろう。

”成熟“免疫グロブリンの生来の形態が、その配列内の１もしくはそれより多く のアミノ酸の欠損、置換、挿入または付加により、長さの点でいくらか変化する ことは、良く知られている。それ故、可変領域及び定常領域の両方は、実質的な 天然の修飾に供されるが、しかし未だ、”実質的に同じ”であり、そして、それ らのそれぞれの活性を保持することができている。ヒトの定常領域のＤＮＡ配列 は、様々なヒトの細胞から、しかし好ましくは、不朽化されたＢ−細胞まｌ）、 これらを引用として本明細書に取り込む）から良く知られた手順に従い単離され 得る。そのＤＮＡ配列のためのソース細胞並びに発現及び分泌のための宿主細胞 は、多数のソース、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（”細胞系及 びハイブリドーマ”、第５版（１９８５）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａ ｎｄ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、これを引用として本明細書に取り込む）から得ら れることができる。

免疫グロブリンの鎖の、これらの天然に形態に加えて、”実質的に同じ“に修飾 されたＨ及びＬ鎖は、当業者に良く知られた様々な組み換えＤＮＡ技術を使用し て、簡単に操作及び生産されることができる。例えば、その鎖は、いくつかのア ミノ酸の置換、末端及び中間での追加並びに欠損等の方法により、−次構造レベ ルでのその天然配列から変化することができる。あるいは、−次構造の一部分（ 普通は、少なくとも約６０−８０％、典型的には、９０−９５％）のみを含んで 成るポリペプチドのフラグメントが、生産され得る。これらのフラグメントは、 低い免疫抗原性を示しながら、１もしくはそれより多くの免疫グロブリン活性（ （Ｗ、ｔｌ；！’、補体固定活性）をもつ。特に、多くの遺伝子と同様に、免疫 グロブリン関連の遺伝子が、それぞれｌもしくはそれより多くの別個の生物活性 をもつ分けられた機能的部位を含むことが注目される。これらは、新規の性質を もつ融合蛋白（例えば、免疫素）を生産するために、他の遺伝子（例えば、酵素 ）からの機能的領域に融合されることができる。一般的に、遺伝子の修飾は、様 々なよく知られた技術、例えば、部位特異的突然変書に取り込む）により、簡単 に行われることができる。

所望のキメラ抗体を最終的に発現する本発明の核酸配列は、様々な異なるポリヌ クレオチド（ゲノムもしくはｃＤＮＡ、　ＲＮＡ、他）及び成分（例えば、■、 Ｊ、Ｄ及びＣ部位）から、並びに、様々な技術により、構成されることができる 。適切なゲノムの配列の結合は、目下、最も普通の生産方法であるが、しかしさ らに、ｃＤＮＡ配列も使用されることができる（参照、欧州特許出願番号８５１ ０２６５５．８．８５３０５６０４．２．８４３０２３６８．０　及び８５１１ ５３１１．４．並びにＰＣＴ出願番号ＧＢ８５１００３９２及びＵＳ８６１０２ ２６９．　これらの全てを引用として本明細書に取り込む）。

前に述べたが、ＤＮＡ配列は、その配列が、作用可能な状態で発現を制御する配 列に連結した（すなわち、その機能することを保証するために置かれた）後に、 宿主で発現される。このような発現ベクターは、典型的には、エピソームまたは 宿主の染色体ＤＮＡ一体部分として、宿主の生体内で複製できる。一般に、発現 ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にす るための特定の選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを 含む（参照、例えば、米国特許４．７０４．３６２．これを引用として本明細書 に取り込む）。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、本発明のＤＮＡ配列のクローニングに特に有用な原 核細胞性宿主の一つである。他の、使用に好適な微生物宿主は、バチルス属、例 えば、バチルス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ旦１、及び他の 腸内細菌科、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒ ａｔｉａ）、そして、各種のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種であ る。これらの原核宿主において、その宿主細胞と適合できる特定の発現制御配列 （例えば、複製起点）を典型的に含む発現ベクターを作ることもできる。加えて 、様々な良く知られたプロモーターのいくつかが、例えばラクトースのプロモー ター機構、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター機構、ベーターラクトースプ ロモーター機構、またはラムダファージからのプロモーター機構が存在するであ る・）。このプロモーターは、場合によってはオペレーター配列を伴、って、典 型的に発現を制御し、そして、転写及び翻訳を開始及び完成するために１．リポ ソーム結合部位の配列等をもつ。

他の微生物、例えば酵母も発現のために使用される１：とができる。

サツカロミセス（Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ）は、好ましい宿主であり、好適 なベクターは、所望のものとして、発現制御配列、例えば、３−ホスホグリセレ ートキナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、並びに、複製起点、停止 配列等をも−）。

微生物に加えて、哺乳類の組繊細胞培養も、本発明のポリペプチドを生産するた めに使用することができる（東風、Ｗｉｎｎａｅｋｅｒ、“遺伝子からクローン へ”ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｎ、　Ｙ、　、　Ｎ、　Ｙ、　（１９８７） 、これを引用として本明細書に取り込む）。真核細胞は実際には好まれる、なぜ なら、完全な免疫グロブリンを分泌することができる多くの好適な細胞系が、本 技術分野で開発されているからであり、そして、ＣＨＯ細胞系、各種のＣＯ３細 胞系、Ｈｅ　Ｌａ細胞、骨髄腫細胞系等、好ましくは形質転換されたＢ−細胞ま たはハイブリドーマを含む。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配 列、例えば複製起点、プロモルタ−、エンハンサ−（Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，他、１ ｍｍｕｎｏ１．Ｒｅｖ、、８９　：４９−６８（１９８６）、これを引用どしＣ 本明細書に取り込む）、並びに必要な工程情報部位、例えばリポソーム結合部位 、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン部位、及び転写終了配列を 含むことができる。

好まれる発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０．アデノウィルス、 ウシの乳頭腫ウィルス等に由来するプロモーターである。

興味あるＤＮＡセグメント（例えば、Ｈ及びし鎖をコードする配列及び発現制御 配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存し異なるよく知られた方法に より、宿主細胞へ転移されることがてきる。例えば、塩化カルシウムによるトタ ンスフェクシ３しが、原核細胞のために、一般的に利用される。しかしながら、 リン酸カルシｌｄ　Ｓｐｒｉｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　（１９８９ ）を参照のこと１、−れを引用として本明細書に取り込む。

一旦発現されれば、本発明の、全キメラ抗体、それらの２量体、または個々のし 及びＨ鎖は、硫酸アンモニウム沈殿、分画カラムクロマトグラフィー、ゲル電気 泳動等を含む本技術分野の標準手順に従って、精製されることができる（参照、 一般的に、５ｃｏｐｅ、　Ｒ，、蛋白質の精製、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ ａｇ、　Ｎ、　Ｙ、　（１９８２））。−リ１、部分的にまたは所望により均質 に精製されると、ポリペプチドは、次に治療的に、あるいは、分析手順の開発及 び実施において、免疫蛍光検査の発色剤等として、使用される１：とかてきる（ 参照、一般的に、免疫学の方法、Ｖｏｌｓ、［ａｎｄ　ＩＩ、Ｅｄｓ、Ｌｅｆｋ ｏｖｉｔｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９７９ａｎｄ　１９８１））。

本発明の組成物は１、数多くの失調と関係する細胞−Ｆのセレクチンレセブタと 選択的に結合するモノクロナール抗体を含んで成る。例えば、多くの炎症性失調 が、欠陥内皮細胞に発現したセレクチンと関係している。用語″炎症“は、本明 細書中で、特異的と非特異的の両方の防御機構の反応に言及するために使用され る。特異的防御機構の反応は、抗原に対する特異的な免疫機構の反応である。特 異的な免疫機構の反応の例は、抗原、例えばウィルスに対する抗体反応、及び遅 延型過敏症を含む。非特異的な免疫機構の反応の例は、免疫学の記憶を一般的に もち得ない白血球に仲介された炎症反応である。このような細胞は、顆粒球及び 大食細胞を含む。非特異的反応の例は、バクテリアの感染部位でのＰＭＮ白血球 の集合を含む（例えば、バクテリア性肺炎における肺への進入及びはれ物での膿 の形成）。

本発明で処理できる炎症性の症状は、例えば敗血症のショック、損傷関連の敗血 症、リウマチ様の間接炎、虚血性後の白血球仲介組織破壊（再潅流性損傷）、急 性白血球仲介肺損傷（例えば、成人呼吸困難症候群）、免疫複合体仲介組織（例 えば、肺）損傷、並びにアトピー性皮膚炎及び乾癖を含む慢性の炎症性症状であ る。加えて、腫瘍の転移は、循環する癌細胞の疹着を抑制することにより防ぐこ とができる。例は、結腸の癌腫及び黒色腫を含む。

本発明の抗体及びそれらの医薬組成物は、非経口投与、すなわち、経皮的、筋肉 内への、または静脈内への、投与のために、特に有用である。完全な免疫グロブ リンまたはそれらの結合フラグメント、例えばＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ’）ｚ　、 他は、医薬組成物における使用に適している。加えて、数多くの新薬運搬のアプ ローチが、開発されつつあり、本発明の医薬組成物は、これらの新しい方法を使 用する投与にも、同様に適している。以下参照、Ｌａｎｇｅｒ、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、これを引用として本明細書に 取り込む。

１つの態様では、本発明の抗体は、組織損傷の特異的部位への従来の抗炎症薬ま たは他の剤をターゲットとして、使用されることができる。ＥＬＡＭ−１をター ゲットとした抗体の使用により、このような医薬は、損傷部位でより高い濃度を 達成できる。従来の抗炎症化学療法剤からの副作用は、その低い投与量、損傷部 位でのその剤の局在化、および／または運搬に先立つその剤のカプセル化により 、実質的に緩和され得る。

この抗体は、直接的または間接的に化学療法剤と組になることができる。この組 合せは、本技術分野で一般的に知られた方法で行うことかでき、その抗体のレセ プタへの結合能力を実質的に抑制すべきでなく、あるいは、その化学療法剤の活 性を実質的に減少させるべきではない。様々な化学療法が、ターゲット化のため に組合せられることができる。例えば、組合されることができる抗炎症剤は、免 疫転形剤、血小板活性化因子（ＰＡＦ）拮抗薬、シクロ酸化酵素抑制剤、脂肪酸 化酵素抑制剤、及びリューコトリエン拮抗薬を含む。いくつかの好ましい成分は 、サイコスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、ＦＸ−５０６、マイコフ ェノール酸、他である。同様に、抗酸化薬、例えば、スーパーオキシドジスムタ ーゼが、再潅流損傷の治療に使用できる。同様に、抗癌剤、例えばダウノマイシ ン、ドクソルブシン、ビンブラスチン、プレオマイシン、その他が、ターゲット とされる。

セレクチンレセブタをターゲットとすることは、両親媒性、または水溶液中で、 集合体として存在する両性質分子（極性：非極性）を介して、達成されることも できる。両親媒性物質は、非極性脂質、極性脂質、モノ及びジグリセリド、スル ファチド、リソレクチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸並びにそれらの塩を含む 。これらの分子は、エマルジョン及び泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質 による分散、並びにラメラ層として、存在できる。これらは、本明細書中でリポ ソームとして、総称的に言及される。これらの調製において、運搬されるべき医 薬は、本発明の抗体と共にリポソームの部分として取り込まれる。このリポソー ムが、冒された細胞に近傍に運ばれるとき、これらが、選択された治療のための 組成物を解放する。

本発明のリポソームは、中性の及び負に帯電したリン脂質並びにステロール、例 えばコレステロールを一般に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の 選択は、例えばリポソームのサイズ及び血液流でのそのリポソームの安定性を考 慮して、一般的に指導される。

様々なターゲット剤（例えば、リガンド、レセプタ及びモノクロナール抗体）を 使用するリポソームのターゲット化は、本技術分野で、よく知られている（参照 、例えば、米国特許番号４．９５７．７７３及び４．６０３．０４４．これらの 両方を引用として本明細書に取り込む）。ターゲット剤とリポソームとの組合せ のための標準的方法が使用され得る。抗体によりターゲットとされたリポソーム は、例えば、蛋白Ａを取り込まれたリポソームを使用して構築されることができ る（の両方を引用として本明細書に取り込む）。

リポソームの帯電は、血液からのリポソームの浄化において、重要な決定要素で あり、負に帯電されたリポソームは、細網内皮細胞をもつ。循環での延長された 半減期をもつリポソームは、治療的及び診断的使用にとって典型的に好ましい。

８．１２から、または２４時間まで血流内で維持されることができるリポソーム は、抗炎症剤の持続された放出を提供する。そのリポソームまたは抗体が、イン ビボにおける診断像形成の提供のためにラベルされたとき、血漿中の半減期も重 要であろう。

様々な方法が、例えば、５ｕｚｏｋａ他、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ｂｉｏｅｎｇ、　９　：４６７（１９８０）、　Ｕ米国特許番号４，２３５ ，８７１．４，５０１，７２８及び４．８３７．０２８、（これらを引用として 本明細書に取り込む）に記載されたように、リポソームの調製のために利用可能 である。１つの方法は、不均一な大きさの多ラメラの小胞を作る。この方法にお いて、その小胞を形成する脂質は、薄い脂質膜を作るために、好適な有機溶媒も しくは有機系に溶かされ、そして真空または不活性ガスの下、乾燥される。所望 により、その膜は、好適な溶媒、例えば第４級ブタノールに再溶解し、そして次 に、より簡単に水和された粉末状の形態である、より均一な脂質混合物を作るた めに凍結乾燥されることができる。この膜は、そのターゲットとされた薬物及び そのターゲテイング組成物（抗体）の水溶液で被覆され、そして、典型的には、 振とうにより１５−６０分間以上で、水和物とされる。結果物としての多ラメラ 小胞の大きさの分布は、より強い振どう条件下での脂質の水和により、または、 再溶解化界面活性剤、例えばデオキシコール酸の添加により、より小さいサイズ にシフトされることが可能である。

水和溶媒は、最終的なリポソームの懸濁液の中でリポソームの内部空間にあるこ とが必要とされる濃度で、ターゲットとされる薬物を含む。典型的には、薬物溶 液は、バッファーで調製された食塩水中に、１０−１００ｍｇ／ｍｌの間で含む 。抗体の濃度は、一般的には、約０゜１−２０ｍｇ／ｍｌの間である。

小孔のポリカーボネート膜または不斉のセラミック膜を通しての押し出しは、リ ポソームのサイズを比較的良く定義されたサイズ分布に減少させるための効果的 方法でもある。典型的には、懸濁液は、所望のリポソームのサイズ分布が達成さ れるまで、ｌもしくはそれより多くの回数、膜通過を繰り返される。そのリポソ ームは、引き続きより小さな孔の膜を通過し押し出されることができ、リポソー ムのサイズの段階的減少を達成する。

最も効果的なカプセル化の方法の下でさえ、その初期のサイズのリポソームの懸 濁液は、遊離の（非カプセル化）形態で、５０％まで、もしくはそれ以上の薬物 及びターゲツティング剤を含むことができる。それ故、リポソームのターゲット とされた薬物の利点を最大とするためには、遊離の薬物及びターゲツティング剤 を、最終の注入可能な懸濁液から除去することが、重要である。いくつかの方法 が、リポソーム懸濁液から封じ込められていない物質の除去のために利用できる 。１つの方法においては、懸濁液中のリポソームは、高速遠心分離法によりペレ ット化され、上清に遊離の物質及び非常に小さいリポソームを残す。他の方法は 、限外濾過によりその懸濁液を濃縮し、次に、薬物を含まない代替溶液にその濃 縮されたリポソームを再懸濁することを含む。あるいは、ゲル濾過が、溶質分子 から大きなリポソーム粒子を分けるために使用されることができる。

遊離の薬物及び／またはターゲティング剤の除去のための処置に従い、リポソー ム懸濁液は、静脈中への投与における要求使用濃度まで持っていかれる。これは 、リポソームが、例えば、遠心分離もしくは限外濾過により、または、薬物除去 の段階が懸濁液の全容量を増加させるその懸濁液の濃縮により、濃縮されている ところの注入溶媒の好適容量内に、そのリポソームを再懸濁することを含むこと ができる。この懸濁液は、次に、濾過により滅菌される。リポソーム−リガンド の調製物は、以下に記載するように、投与されることができる。

前に検討したように、医薬組成物（ターゲットとされたリポソームまたは遊離の 抗体を含んで成る）は、非経口的投与に特に適している。この組成物は、許容さ れる担体、好ましくは水性担体中に抗体またはそれらのカクテルを一般的に含ん で成る。様々な水性担体が、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グ リシン及び同様のものが、使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、そして 、普通は粒状物を含まない。これらの組成物は、従来のよく知られた技術で滅菌 されることができる。この組成物は、大体の生理学的条件に、例えば、ｐＨ調整 及び緩衝剤、緊張性（例えば、浸透圧の）調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、 塩化ナトリウム、塩化ケリラム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、その他に、 要求されるものとして、医薬として許容される補助物質を含むことができる。こ れらの形態中の抗体の濃度は、重量として広く、即ち、普通には約０．５％未満 もしくは少なくとも約１％から、１５もしくは２０％と同じくらいまで変化し、 そして、第一に、液体の体積、粘度、その他に基礎を置き、選択された特定の投 与モードに従い選ばれるであろう。　それ故に、筋肉内注射のための典型的な医 薬組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水、及び５０ｍｇの抗体を含むよう調製されるこ とができよう。静脈中への注入のための典型的組成物は、２５０ｍ１の無菌リン ゲル液、及び１５０ｍｇの抗体を含むよう調製されることができよう。非経口的 に投与できる組成物の実際の調製方法は、当業者に知られまたは明らかになるで あろうし、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、　第１７版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ（１９８５）、 　（これを引用として本明細書に取り込む）により詳細に記載されている。

本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥され、そして、使用に先立って、好適な 担体中で再構成されることができる。この技術は、従来の免疫グロブリン、並び に、使用され得る当業者に知られた凍結乾燥及び再構成技術を伴って、効果的で あることが示されている。

当業者にとっては、凍結乾燥及び再構成が、抗体活性の損失の程度の変化（例え ば、通常の免疫グロブリンを用いた場合は、［ｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりもｊ ；り大きな活性損失をも一つ傾向がある）を導くことができ、そして、その使用 レベルが、補うために調整されるへきであろうことは、認識されるであろう。

本抗体またはそれらのカクテルを含む組成物は、予防的及び／または治療的処置 のために投与されることができる。泊・療的使用において、組成物は、治療のた めの十分な量をもって患者に投すされ、そしてその感染及びその併発症の進行を 少なくども部分的に止める。

このことを達成するために適した量は、”治療的有効投与ｌ”として、定義され る。この使用のだの有効量は、疾患の重症度及び患者自身の免疫系の総合的状態 に依存するであろうが、一般的な範囲は、約１．ｍｇ／ｋｇ体重から約２ｏｍｇ ／ｋｇ体重まで、好ましくは約５１Ｔ１ｇ／ｋｇ体重から約１５ｍｇ／ｋｇまで にある。本発明の物質が、重い疾患状態、すなわち、命を脅かすまたは潜在的に 命を脅かｔ状態で、一般的（７使用されることができることは、留意されるへき である。このような場合には、りを来物質の最少化、及び、本発明のヒトキメラ 抗体形態により達成される゛外来物質”の拒絶の見込みの視点において１、処置 を夛−゛る内科医によるこれらの抗体の実質的過＠量の投り、は、可能であり、 そして、好ましいものとして考えられることができる。。

予防的使用においては、本抗体またはそれらのカクテルを含む組成物は、患者の 抵抗性を増強するために、未だ病的状態に至ってない患者に投与される。このよ うな量は、”予防的有効投与量“として定義される。この使用においては、正確 な量は、患者の健康状態及び免疫の総合レベルに再度依存するが、一般的には、 上記の範囲にある。

この組成物の１回または数回の投与は、その処置を行う内科医により選択されて いる投与レベル及びパターンで行われ得る。とんなことがあっても、医薬として の形態は、患者を効果的に治療するに十分な本発明の抗体量を提供４゛べきでる 。７本発明の抗体は１診断目的、例スーば炎症領域の同定のため軒も使用される ことができる。診断目的のためには、抗体は、５ラベルさねてもよいし、または ラベルされないなくてもよい。ラベルされない抗体は、その抗体、例えば特定の 免疫グロブリンの不変領域に特異的な抗体と反応性のある、他のラベルされた抗 体（第２の抗：体）と組み合わされて使用されることができる。あるいは、その 抗体は、直接的にラベルされ得る。多種多様なラベルが、例えば−１放射性核種 、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、リガンド（ 特に、ハプテン）、その他が、使用されることができる。免疫検定数の多くのタ イプが、利用でき１．そして当業者に良く知られている。

診断的使用においては、免疫グロブリンまたはそれらのカクテルを含む組成物は 、炎症疾患の症状をもっと推定される患者に投与される。あるいは、その特定の 治療の効力が、観察される。このことを達成するのに十分な量は、”診断的有効 投与量゛と定義される。。

この使用においては、その正確な量は、患者の健康状態及び同様のものに依存す るであろう。

対象の抗体を伴った使用のため（こキットも供給され得る１、そイ］故、本発明 の対象の抗体組成物は、普通には、コンテナ中で凍結乾燥された形態で、単独ま たは好まれる細胞のタイプに特異的な追加の抗体と一緒になって、用意されるで あろう。ラベルもしくは毒素に変化される、または変化されないことができる抗 体は、そのキット中に、バッフ了−１例えばトリス、リン酸塩、炭酸塩、他、安 定剤、殺菌剤、不活性蛋白、例えば血清アルブミン等、並びに、使用指示書一式 と共に含まれる。一般的に、これらの物質は、活性抗体の量に基礎を置き、約５ ％未満で存在するであろうし、そして、その抗体の濃度に再度基礎を置き全量で 少なくとも約０．００１％として普通は存在するであろう。繰り返すが、賦形剤 が全組成物の約１％から９９％まで存在することができるところの、活性成分を 希釈する不活性な増量剤または賦形剤を含むことが好まれるであろう。キメラの 抗体に結合することができる第２の抗体が検定で使用されるところでは、キット は、普通は、分割されたバイアルで存在するであろう。この第２の抗体は、典型 的にラベルに結合され、そして、上記の抗体の処方を用いた類似の方法で調製さ れる。

以下の例は、限定するためでなく、説明のために提供される。

例１ 本例は、本発明のモノクロナール抗体が、細胞間癒着検定において、好中球（Ｐ ＭＮｓ）が活性化された血管内皮細胞へ癒着することを妨害する能力のあること を示す。ヒトの調帯を分娩により得た。長さ２０−４０ｃｍの羨帯の断片及びク ランプマークの無いものを使用した。

無菌条件Ｆ、その調帯血管の一端に、カニユーレを挿入し、ぞして、３方弁及び シリンジに連結した。この調帯を、血液及び血塊を除去するために、Ｃａ÷１Ｍ ｇ＋を含まないリン酸緩衝化生理水ＣＰＢＳ）で洗浄した。その調帯の反対の端 を、次に、カニユーレ挿入し、そして、２方弁に連結し、次に、コラゲナーゼ（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　１ｍｇ／ｍｌで短時間濯ぎ、そし て、２方弁を閉めた。次に、その調帯にコラゲナーゼを充填し、空気を除き、そ して、３方弁を閉めた。この調帯を、滅菌容器に置き、３７°Ｃて１５−２０分 インキコベートした。インキュベーション後、この調帯を、３０ｍ１のＣａ十及 びＭｇ＋を含むＰＢＳで洗浄し、そして、溶出された内皮細胞を、さらなるコラ ゲナーゼ活性を阻害するために、５ｍｌのＢＧＭ−ＵＶ培地（Ｃ１ｏｎｅｔｉｃ ｓ）及び１０％のＦＣＳを含む無菌管内に集めた。この細胞を遠心分離し、そし て、ＢＧＭ−ＵＶ、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、ｌｏｇ／ｍｌのヒドロコル チゾン、ケンタミシン、アンホテリシンーＢ及び１０％のＦＣＳを含む完全培地 に再懸濁した。適切なサイズの組織培養フラスコ（！Ｉｔ帯片の長さに従う）０ ．１％のゼラチン（内毒素を含まず、ウシの表皮から単離された）で、１５分、 室温にて、被覆し、過剰なものを除去した。内皮細胞の懸濁液を、そのフラスコ の中に入れ、そして、５％ＣＯ，インクベーター内に置いた。その培地を、細胞 が癒着するようにみえた時、１６時間後に交換した。コンフルエント（集密）に 達する前（７５％）のとき、細胞を継代培養した。細胞を継代培養するため、そ の培地を、真空の吸入口により除去し、そして、そのフラスコを、ＦＣＳを除去 するためＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）緩衝生理水で２回濯ぎ、次に、０．０２５％ト リプシンＥＤＴＡＩ−２ｍｌを、そのフラスコに添加し、そして、表皮細胞が懸 濁液となるまで（３０秒−１分）、倒立顕微鏡下で観察した。次に、新しい完全 培地をそのフラスコに添加し、そして、それを、新しいゼラチン被覆のフラスコ に、１：２または１：３で分割した。

９６ｗｅ　ｌ　１の検定プレート上に内皮細胞の単層を確立するために、そのプ レートを、上記のようにゼラチンで被覆した。３回継代培養した培地からの内皮 細胞は、上記のように０．０２５％のトリプシンを使用して、フラスコから収穫 し、そして、５　ｘ　１０’　／ｗｅｌｌに置いた。その細胞は、コンフルエン ト（集密）するための増殖を許された。

ＥＬＡＭ−１の発現を誘導するため、その培地を、そのｗｅｌｌから一度に数ｗ ｅｌｌずつ取り除き、そして、０．０５ｍ１の新しい完全培地（対照ｗｅｌｌ内 に）、または、３０ｕｇ／ｍｌのｒｌＬ−１βを含む新しい完全培地（テス）ｗ ｅｌｌ内に）で置き換えた。このプレートを、インキュベータに４時間戻した。

これらは、刺激を与えられた内皮と称する。

好中球（ＰＭＮｓ）を、全血から調製した。５０ｍ１の全血を、ボランティアの 提供者からヘパリン化された真空チューブに吸引した。２５ｍ１の血液のそれぞ れを、”Ｍｏｎｏ−Ｐｏ１ｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ”（Ｆｌｏｗ 　Ｌａｂｓ）１５ｍｌの上に重層した。この試験管を、Ｒτ６０００遠心分離機 で、２０℃、２５分、２０００ｒｐ［Ｄで遠心分離し、そして、次に、そのスピ ードを、更に２５分間、２５００ｒｐｍまで増加した。ＰＭＮ層（２つの浮遊細 胞層の下側）を、除き、そして、きれいな５０ＣＣの遠心管内に置いた。次に、 ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び０．２％のグルコース（Ｆｉｓｈｅｒ ）を含むＨａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅ（Ｂ ＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）３０ｍｌを、それぞれの管に添加した。この管を、３分間 ３０００ｒｐｍで遠心分離し、そして、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ／ｇｌｕｃｏｓｅ 緩衝液で３回再懸濁し、血球計で計測した。

検定を実施するため、検定プレートを、インキュベーターから取り出し、そして 、癒着した細胞を、）ＩＢｓｓ／ＨＥＰεＳ／ｇｌｕｃｏｓｅ＋　５ｍｇ／ｍｌ のウシ血清アルブミンで２回洗った。テストされるべきそれぞれのモノクロナー ル抗体１００ｕμｌを、検定プレー）ｗｅｌｌに加えた。その抗体を、プレート 上で２０分間インキュベートした。５ｘｌＯ’　ＰＩＪＮを、その冑ｅｌｌへ５ ０μｌとして添加した。次に、そのプレートを、室温で６分間インキュベートし た。流しの上でそのプレートをひっくり返し、そして多チヤンネルピペットを使 用し４回培地２００μｌを添加することにより、非癒着細胞を、そのｗｅｌｌか ら除去した。そのｗｅ目から最後の洗浄液を取り除き、そして、可溶化緩衝液５ ０μｌを添加した。

クエン酸の緩衝液（２４，３ｍｌの０．１Ｍクエン酸、１０．５ｇ１５００ｍｌ 　＋２５．７ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム２塩基、１４．２ｇ１５００ｍｌ 及びＳＱ　Ｈｚ　Ｏｔｏ　１００ｍ１）のこの構成物は、０．１χのＮＰ−４０ 界面活性剤を含む。このプレートを、１０分分間中かに混合しながらインキュベ ートし、そして次に、５０μｍのＯＰＤＡ（８ｍｇ　Ｏ−フェニレン−ジアミン 、Ｓ　ｉ　ｇｍａ触媒＃Ｐ−１５２６，８μｍの３０％Ｈ２Ｏ２及び１０ｍ１の ＳＱ　Ｈ２０）を、それぞれのｗｅｌｌに添加した。このプレートを、室温で１ ５分間インキュベートし、そして次に、１５μｌの４Ｎ　Ｈ２ＳＯａをそれぞれ のプレートに添加し、反応を停止した。ブランクの試薬を、可溶化緩衝液５０μ ｌ、　０ＰＤＡ溶液５０μｌ及び４Ｎ　Ｈ！　Ｓｏ　、　１５μｍを混合して調 製した。表面の１００μｌを、それぞれのｗｅｌｌから取り除き、そして、フレ キシブルＥＬ［ＳＡ検定プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。このプレートを、 ３０分間４９２ｎｍで走査した。

さらに、癌腫細胞、：１　口２０５（ＣＯＩＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２２２） 　（ＳＬＸを発現することで知られる）を、使用した。これらの細胞はＦＣレセ プタを持っていないので、モノクロナール抗体による交差結合は生じるべきでな い。この検定手順は、ＰＭＮｓに関して先に記載したものと同様である。しかし ながら、この細胞は、”Ｃｒ（５０μＣｉ／細胞、３０分間）でラベルされた。

癒着を、標準手順に従いガンマ線カウンタを使用して検出した。

以下の表１に表された結果は、本発明のモノクロナール抗体が、ＰＭＮｓ及びｃ ｏｉｏ　２０５　細胞の活性化された内皮細胞への癒着を効果的に妨害すること を示す。従来の技術であるモノクロナール抗体Ｈ１８／７（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０１０５５３９、前記）を、対照としてインキュベートした。抗体の存在下の 結合量を、任意に１．０の値に指定した。本検定で結合を促進した抗体は、１よ り大きな値をもつが、結合を抑制した抗体は、１未満の値をもつ。

ＥＢＩ−５［ｇＧ　、　１．４２　０．０８ＥＮＢＩ−６［ｇＧ　＋　１．６４ 　０．７６ＥＢＩ−７［ｇＧ　、　１．４８　０．１０ＥＢ３−１　［ｇＧ　３ 　０．１８　０．１２ＥＢ３−２　ｒｇＧ　２　０．３　０．１２ＥＢＭ−２１ ｇＭ　Ｏ，２１０，１２ ＥＢＭ−４１ｇＭ　Ｏ，２８０，１０ Ｈ１８／７　１ｇＧ　＊　ａ　ｏｒ　ｂ　１．２０　０．１６例２ 本例は、本発明のモノクロナール抗体により認識されたエピトープと、ＥＬＡＭ −１（Ｈ１８／７）に結合するものとして前もって同定されたモノクロナール抗 体により認識されたエピトープとの比較のために使用された競合阻害検定からの データを表す。これを行うために、標準手順（参照、例えば、Ｈａｒｌｏｗ　ａ ｎｄ　Ｌａｎｅ、前記）に従い、Ｈ１８／７をビオチン化し、そして、ＨＲＰ− アビジン染色を、［Ｌ−１活性化内皮細胞上で固相ＥＬＩＳＡにより検出した。

与えられた値は、４９２ｎｍでの吸光度である。

表２が示す結果として、８１８／７結合の阻害範囲が、判明した。

表２　（モノクロナール抗体＝Ｍａｂ）妨害するＭａｂ　ビオチン化Ｍａｂ　Ｈ ＲＰ−アビジン対照　８１８／７　１．１７５ Ｈ１８／７　８１８／７　０．３０９ ＦＢＩ−Ｉ　ＨＩ８／７　１．０２１ ＥＢ３−Ｉ　Ｈ１８／７　０．８３０ ＥＮＢＩ−６８１８／７　０．３４６ 例３ 本例は、本発明のモノクロナール抗体が細胞間検定での好中球（ＰＭＮｓ）の活 性化された血小板（ＧＭＰ−１４０をもつ）への癒着を妨害する能力を示す。こ れらの検定の結果は、表３に表され、本発明のこれらのモノクロナール抗体の存 在下で、ＰＭＮｓまたはｃｏｉｏ　２０５細胞の活性化された血小板への相対的 癒着が示される。この検定の手順は以下の通りである： 血小板を、正常なヒトのドナーから得て、そして、ＰＧＥ　＋　（１００ｎＭＸ 参照Ｐｏ１ｌｅｙ　ａｎｄ　Ｎａｃｈｍａｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　、　 １５８　：６０３（１９８３）、これを引用として本明細書に取り込む）の存在 下で、血漿蛋白を含まないもので洗浄した。次に、２０分間室温で攪拌せずに、 トロンビン（０，２５０／ｍｌ　；ｍ１当たり２ｘｌＯ’血小板）で活性化した 。

活性化された血小板へのＧＭＰ−１４０に仲介される癒着の評価のために２つの 検定ニブレート検定及び液相検定を使用した。プレート検定は、先に記載された 内皮細胞と好中球との癒着検定（ＤＱｌ）ｒｉｎａ他、ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ６７　：５０２（１９８９）、　これを引用として本明細書に取り込む）を修正 したものである。血小板の懸濁液（３００μｍ：１０　”　／ｍｌ）を、前もっ て０．１％ゼラチンで被覆された４８ｗｅｌｌプレートのそれぞれのｗｅＩｔで 使用した。このプレートを、１５分間３７℃でインキュベートし、次に２分間９ ０ｘｇで遠心分離し、そして非癒着の血小板を除去するためリン酸緩衝食塩水（ ＰＢＳ）で２回洗浄した。血小板のＦＣレセプタを妨害するために、熱により集 合した［ｇＧ（２０μｇ／ｍ１）３００μｌをそれぞれのｗｅｌｌに添加し、そ してそのプレートを、室温で２０分間放置した。このプレートを、ＰＢＳで１回 洗浄し、そして次にテストされるべきモノクロナール抗体３００μｌをプレート のそれぞれのｗｅｌｌに加え、そしてそのブし・−トを、室温でさらに２０分間 放置した。一方、好中球を、上記の方法によりヒト全血から単離した。それらを 、６１Ｃｒ（４５０μＣｉが３ｘ１０’の細胞に３００１１１で添加し、そして ６０分間３７°Ｃでインキｌベートした）で放射性ラベルし、１０％の小ウシ胎 児血清を含むＲＰＭ　［で３回洗浄し、そして２ｘｌＯ’　ｍｌに再懸濁した。

この懸濁液５０μｌを、検定プレートのそれぞれのｗｅｌｌに添加した。このブ レートを、２分間９０ｘｇで遠心分離し、そして次に、５分間室温で放置した。

非結合の細胞を、ＰＢＳでの３回の洗浄で除去し。そして残存する結合細胞を、 ＳＤＳを含む緩衝液でプレートから取り出し、そして次に放射能計数のために処 理した。

液相検定は、（参照、［、ａｒｓｅｎ他、Ｃｅ１ｌ、６３　：４６７（１９９０ ）、これを引用どして本明細書中に取り込む）に記載された検定法の変法により 行った。活性化された血小板（２ｘｌＯ″／ｍ１）２０μｌを、εｐｐｅｎｄｏ ｒｆ管内に置いた。熱により集合された［ｇＧ　２０μｌを、添加し、そして混 合後、その管を、室温で２０分間放置した。モノクロナール抗体２０μｌを添加 し、そしてその管を室温でさらに２０分間放置した。一方、ＰＭＮｓを上記のよ うに（放射性ラベルなしで）調製し、２ｘｌＯ＠／ｍｌに希釈した。この懸濁液 ２０μｌを、それぞれの管に添加し、そして混合後、その管を、室温で２０分間 放置した。次に、癒着を顕微鏡により評価し、ぞして、２もしくはそれより多く の血小板が結合したテスト細胞のパーセントとして記録した。

さらに、結腸癌腫、Ｃｏ１ｏ　２０５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２２２）　にれは、 セレクチンレセブタにより認識されたリガンドを発現することが知られている） 由来の細胞を使用して、検定を行った。使用した検定の手順は、ＰＭＮｓで使用 されたものと同じであった。

Ｍａｈ　ＰＭＮｓ　癌腫（Ｃｏｉｎ　２０５）　沈殿物　精製ＧＭＰ−１４０例 ４ 本例は、リボ多糖体誘導死の動物モデルにおけるＭａｂ　ＰＢＳ−１の効果を証 明する。ラット系が選ばれたが、その理由は、ＰＢＳ・−１が、ＥｌＡＭ−１と 同じく、ラットで交差反応することが示されたからである。

使用に一日先立って、大腸菌（ε、ｅｏｌｉ）　０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ、 Ｌｏｔ　＃３６Ｐ４０１９）からのＬＰＳを、無菌の、発熱因子を含まない生理 食塩水に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かすことにより、単一ロットから新鮮な状態で 用意した。この溶液を、Ｔｅｋｍａｒｋ音波破壊器を使用して、氷上で３０秒間 音波処理した。使用の直前、この物質を、もう一度３０秒間音波処理した。

体重２００ｇ（＋−１０ｇ）の雌のＬｅｗｉｓラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉ ｖｅｒ　ＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｓから購入し、そして受取後生なくとも７日間 （順応のため）維持した。特にことわらない限り、１０匹の動物のグループを使 用した。全ての試薬を、非経口的に尻尾の血管から０．５−１．０ｍｌ／ｋｇで 注射した。負対照として、動物は、無菌のＬＰＳを含まない生理食塩水、または ネズミの１ｇＧ３に骨髄腫蛋白（Ｊ３０６．低ピロゲン＜２　ｎｇ／ｍｇｇＧ） を受け入れた。

ＰＢＳ−１の投与量／スケジュール手順書は、ラットへのＰＢＳ−１の予防的投 与から当方が得た薬物速度論的データから経験的に到達１．た。

ＬＰＳの”最小の“ＬＤ　＋ａｏは、これらのラットにおいては７．５ｍｇ／ｋ ｇと決定された。

一つの実験では、ラットを、ＬＰＳチャ１ノンジの前に１時間ｉｏｍｇ／ｋｇの Ｐ２Ｈ４で処理した。処理されｔ＝−動物の４７１Ｏが、ＬＰＳチトトソジで生 き残りｔ−ｏ対照的に−０（生理食塩水を注射された）対照の１０匹全てが死ん だ。２４時間の観察期間において、生き残ったものは、ＬＰＧで処理された動物 に特徴的な臨床徴候を示した。

我々は、（１）２倍に−上昇した、及び（２）最初の実験で使用された１０ｍｇ ／ｋｇ未溝の量の状態のＰＢＳ−１の投り、量を試した。その結果は、ＰＢＳ− １が有意な効果、その動物の８０％が１０ｍｇ／ｋｇ投与で生き残った（図１） 、を示した。ある動物が生理食塩水の対照グループの中で生き残ったことは、動 物のこのグループが、その先立つ実験における動物でど同様に激しく、１、ＰＳ チャレンジにより”攻撃“さねていないことを示唆する。

ＰＢＳ−１の治療的価値を証明するため他の研究が行われた。動物は、！、ＰＳ チャレンジの１時間前、または２．４または６時間後に、１０ｍｇ／ｋｇの静脈 内ポーラスのＰＢＳ−１の拶′与を受け人ねた。

もう一度、１０分の１の動物は、生理食塩水のグループの中で、並びに、Ｊ６０ ６骨髄腫蛋白１ｏｍｇ／ｋｇてＴ＝−６０分にて処理された（図２）グループの 中で生き残った。しかしながら、εＢ３−１は、ＬＰＳ後２または４時間に投与 された時にのみ有意な保護効果をもった。

結論 ＣｙｔｅｌのＭａｂ　ＰＢＳ−１で見られた保護（ｊ、本発明の抗体が、ＥＬＡ Ｍ−１（−仲介される炎症疾患反応の治療において、予防的及び治療的の両方で 有用であることを示す。

例５ 本例は、精製されたＰＢＳ−１抗体が、ラットの胸膜腔において、リボティコ酸 （ＬＴＡ）により誘導された炎症反応を抑制する効果を示す。胸膜炎を誘導する ＬＴＡの能力は、投与濃度と好中球の進入との線型関係を伴って確立されている 。！、ＴＡが、Ｅｌ、ＡＭ−１を介して内皮を活性化し、インビトロにおいて好 中球に癒着させることも示されている（参照、以下の例６）。

本例では、我々は、ＬＴＡの胸膜腔への両側の注射によりラットでの胸膜炎を誘 導した１、このテスト動物において、この次に、ＰＢＳ−１モノクロｅ−ル抗体 が尻尾の血管に注射された。４時間後、２−の腔が洗浄され、そして参出液の好 中球の濃度に関して評価さねた。。

手順・ １．１、ＴＡ（Ｓｉｇｍａ触媒＃Ｌ−２５１５１，ｏｔ　８９Ｆ４０６１）を、 無菌の内毒素及びピロゲンを含まない生理食塩水中で２ｍｌ！／ｍｌに調製し、 そして−７０℃で保存した。これを、１．４１ｍ１のＬＴＡ　２．４３ｍ１の生 理食塩水への溶解により７５０μｇ／ｍｌの保存溶液にした。最終濃度は、３０ ０μｇ／　４００７１１／ラツトであ−）だ。

２、　ＰＢＳ−１がｆｆｌ製された腹水（Ｌｏｔ　６）は４．５＋Ｈ／ｍｌであ り、これをＤＰＢＳで希釈し７、最終濃度３．３３ｍｇ＃ｎｌとした。ラット毎 の投り量は、６００μＩであり、２ｍｇ（１０ｍｇ／Ｍｇ）を含み、１．５分音 波破砕されｔ−１゜３６体重約１９５グラムの生後９３力月の雌の１ｅｖｖｉｓ ラットを使用した。

全てを、メタファンの吸入により鎮静にした。

４、このラットを、３つのグループに分１ｊた。

Ａ、対照ｎ＝１・胸膜腔への両側に２００μｌのＤＰＢＳを受り入わた。

６００μｌの無菌の、ピロゲン及び内毒素を含まない生理食塩水が、胸膜への注 射の１時間後の尻尾の血管への注射を介して受入れられた。

Ｂ、　ＬＴＡ及びＰＢＳ−１で処理された。ｎ＝４　胸膜腔への両側に２００μ ｌのＤＰＢＳ中の１５０μｇの１、ＴＡを受け入れた。６００μｌのＰＢＳ−１ （１０ｍｇ／ｋｇ、全２ｍｇ）が、胸膜への注射の１時間後の尻尾の血管への注 射を介して受入れられた。

Ｃ，ＬＴＡのみで処理された二〇＝４　胸膜腔への両側に２００μ　ｌのＤＰＢ Ｓ中の１５０μｇのＬＴＡを受け入れた。６００μｌのＤＰＢＳが、胸膜への注 射の１時間後の尻尾の血管への注射を介して受入れられた。

５、このラットは、Ｉｃｅシリンジに付けた３０ゲージの鋭くない先端をもった 針を使用し、第３と第５の肋骨の間に注射された。尻尾の血管への注射は、血管 がより突き出るように熱ランプの下で最初に熱することにより処理され、そして ３ｃｃのシリンジに付けた２６ゲージの針を使用して行われた。

６、このラットを、尻尾の血管への注射後、３．５時間再度檻に入れた（全時間 ４．５時間）。

７、このラットは、メタファンの吸入に供せられた。

８、腹膜腔を、横隔膜を露出するため開口した。小さな切開を、横隔膜の両側に 施し、そして、ｉｃｅシリンジの鋭くない先端（針無し）を使用して１ｍｌのヘ パリン化したＤＰＢＳで両側を洗浄し、そして結合した。

９、それぞれの容量を記録し、その細胞を、計数及びペレット化した。

それらを、１００μｌの生理食塩水に再懸濁し、そして、鑑別分析のために即効 性鑑別染料を使用し染色されるべきそれぞれから、すりつけられたスライドを作 った。

例に の例は、バクテリアの生産物であるリボ多糖類（ＬＰＳ）及びリボティコ酸（Ｌ ＴＡ）が、血管内皮細胞上にＥＬＡＭ−１を発現することを証明する。これを行 うため、ヒトの好中球（ＰＭＮｓ）が培養されたヒトの内皮細胞に結合する能力 を、ＬＰＳ及びＬＴＡの各種濃度でのインビボにおける処理に従って計測した。

手順＝ １、ＬＰｓ（Ｌｏｔ　＃３６Ｆ４０１９）及びＬＴＡ（Ｓｉｇｍａ、＃　Ｌ−２ ５１５，Ｌｏｔ　８９Ｆ４０６１）の保存溶液を、使用の直前に、生理食塩水中 １ｍｇ／ｍｌで音波処理により調製した。この保存溶液を、新鮮なりＧＭ−ＵＶ 培地（Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ）で希釈し、１００　μｇ／ｍ１．５０μｇ／ｎ＋１ ．　２５μｓ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、６　μｇ／ｍｌ。

３　μｉ１０＋ｔ、　１．５　μｇ／ｍ１．０．７５μｇ／ｍ１．０．３７μｇ ／ｍｌ、　０．１９μｇ／ｍｌ。

及び０．０９　ｕ　ｇ／ｍｌの処理濃度を作った。ＨＵＶＥＣコード＃コード− 続く１つの９６ｗｅｌｌのＣｏ５ｔｅｒの鮮血であって４回継代培養しゼラチン 上で集蜜したものをインキュベーターから取り出した。それぞれのＷｅＵ内の培 地を、パスツールピペットで取り除かれ、そして、０．２ｍｌの新鮮なりＧＭ− 聞培地（Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ）で、またはＬＰＳもしくはＬＴＡの処理希釈と同 容量で置き換えた。それぞれの希釈を、３回ずつ分析した。

２、このプレートを、４時間、５％ＣＯｔを備えた３７°Ｃのインキュベーター に戻した。

３、好中球（ＰＭＮｓ）を、例１のように調製した。ＰＬＩＮｓを、調製の間じ ゆう室温で維持した。１．０４ｘｌＯ”のＰＭＮを、回収し、そして、同じ緩衝 液であるが５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むものの中に再懸濁し、６ｘ ｌＯ’　／２５　μｌ　とした。

４、刺激を与えられたＨＵＶＥＣ検定プレートを、インキュベーターから取り除 き、そしてそのｗｅｌｌを、５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含 むＲＰＭＩ　１６４０で２回洗浄した。２回目の洗浄後、そのｖｖｅｌｌを、同 じ緩衝液１００μｌで再び満たした。

５、０．０２５ｍ１の細胞懸濁液を、その刺激を与えられた検定プレート上のそ れぞれのｗｅｌｌに添加した。

６、そのプレートを、３７℃で５分間インキュベートした。

７、非結合細胞を、ｐ２００多チャンネルピペットを使用した系統的再懸濁、次 の培地０．２ｍｌの添加及び除去により、その検定プレートのｗｅｌｌから取り 出した。

８、培地の全てを、そのｗｅｌｌから取り除き、そして５０　ｕｌの可溶化緩衝 液を添加した。これは、０．１％ＮＰ−４０界面活性剤を含むクエン酸緩衝液（ ２４，３ｍｌの０．１Ｍクエン酸、ｔｏ、　５ｇ１５００ｍｌ＋２５．７ｍｌの ０．２Ｍリン酸ナトリウム２塩基、１４．２ｇ１５００ｍｌ及びＳＱ　）Ｉ！　 Ｏｔｏ　１００ｍ１）から構成された。

９、このプレートを、回転振とう機で１０分間インキュベートし、そして次に、 ０．０５ｍ１の０ＰＤＡ溶液［８ｍｇの０−フェニレン−ジアミン、Ｓｉｇｍａ 触媒＃Ｐ−１５２６１，８ｕｌの３０％Ｈ１０２及び１０ｍ１のクエン酸緩衝液 （同上）１を、それぞれのｗｅｌｌに添加した。反応は、１５分間の進行を許さ れ、そして次に、２５μｌの４Ｎ　Ｈ，ＳＯ４を、その反応を停止するために添 加した。

１０、試薬のブランクを、１００μｌ容量の可溶化緩衝液と５０μｌの４ＮＨ２ ＳＯａをもつ０ＰＤＡ溶液との混合により調製した。

１１．１００μｌの表面の液を、２ｗｅ　ｌ　ｌのそれぞれから取り除き、そし てフレキシブルＥＬＩＳＡ検定プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。そのプレー トを、４９２ｎｍで分光光度計にて、３０分以内に走査した。

本実験の結果は、図４に表され、ＬＰＳとＬＴＡの両方が、好中球の、ヒト内皮 細胞への癒着分子を誘導することを示した。ＬＰＳは、０゜２と５μｇ／ｍｌの 間で最も効果があった。ＬＴＡは、５と５０μｇ／ｍｌの間で最も効果があった 。それぞれの最適濃度において、ＬＰＳは、ＬＴＡよりも２−３倍多い好中球の 癒着を誘導した。

例７ 本例は、例６で見られた好中球の、ＬＰＳ及びＬＴＡにより活性化された内皮へ の癒着が、ＥＬＡＭ−１に仲介されることを示す。それぞれの内毒素を用いた内 皮の活性化の最適時間も調査された。我々は、ヒト好中球（ＰＭＮｓ）の、活性 化剤の添加後の各種時間での、ＥＢ３−１の存在または非存在下での、ＬＰＳ及 びＬＴＡにより活性化された培養ヒト内皮細胞への結合能力を測定した。

手順 １．１．ＬＰＳ（Ｌｏｔ　＃３６Ｆ４０１９）及びＬＴＡ（Ｓｉｇｍａ、＃　Ｌ −２５１５，Ｌｏｔ　８９Ｆ４０６１）の保存溶液を、使用の直前に、生理食塩 水中１ｍｇ／ｍｌで音波処理により調製した。この保存溶液を、新鮮なりＧＭ− ＵＶ培地（Ｃ１ｏｎｅｔ　１ｃｓ）で希釈し、ｌＯｕｇ／ｍｌのＬＴＡ及び０． ２　μｇ／ｍｌのＬＰＳの処理濃度を作った。ＨＵＶＥＣ：１−ド＃１１７に続 く１つの４８ｗｅｌｌのＣｏ５ｔｅｒの鮮血であって４回継代培養しゼラチン上 で集蜜したものを、インキュベーターから取り除いた。８つの時間点、Ｔ＝Ｏ， ２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１８時間及び２４時間で、 それぞれの６ｗｅ　ｌ　ｌ内の培地を、パスツールピペットで取り除き、そして 、ＬＰＳ（３ｗｅｌｌｓ）またはＬＴＡ（３ｗｅｌｌｓ）の処理希釈を含む０． ５ｍｌの新鮮なりＧＭ−ＬＩＶＵＶ培地１ｏｎｅｔｉｃｓ）で置き換えた。

２、このプレー・ｌ・を、４時間、５％ＣＯ，を備えた３７℃のインキュベータ ーに戻した。

３、好中球（ＰＩＪＮｓ）を、例１のように調製した。ＰＭＮｓは、調製の間じ ゅう室温で維持した。それらを、同じ緩衝液であるが５ｍｇ／ｍｌのウシ血清ア ルブミンを含むものの中に再懸濁し、２ｘｌＯ”　１５０μｌとした。

４、刺激を与えられたＨＵＶＥＣ検定プレートを、インキュベーター・から取り 出し、そしてその冑ｅｌｌを、５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を 含むＲＰＭ［１６４０で２回洗浄した。２回目の洗浄後、そのｗｅｌｌを、同じ 緩衝液３００μｌで再び満たした。この培地を、再びそれぞれの３連の１つのｗ ｅｌｌから取り除き、そしてＥＢ３−Ｉ　Ｍａｂを含むハイブリドーマ培養の上 清液で置き換えた。そのプレートを、抗体と３７℃で１０分間インキコベートし 、そして次に、インキュベーターから取り除いた。

５、０．０５ｍ１のＰＭＮ懸濁液が、その刺激を与えられた検定プレート上のそ れぞれのｗｅｌｌに添加された。

６、そのプレートは、３７°Ｃで５分間インキュベートされた。

７、非結合細胞を、繰り返しの運搬ピペットを使用した系統的再懸濁、次の、培 地０．３ｍｌの添加及び除去により、その検定プレートのｗｅｌｌから取り除い た。

８、培地の全てを、そのｗｅｌｌから取り除き、そして２００μｌの可溶化緩衝 液を添加した。これは、０．１％ＮＰ−４０界面活性剤を含むクエン酸緩衝液（ ２４，３ｍｌのＯ，１Ｍクエン酸、１０．５ｇ１５００ｍｌ＋２５．７ｍｌの０ ゜２Ｍリン酸すｌ・リウム２塩基、１４．２ｇ１５００ｍｌ及びＳＱ　［４２０ ｔｏ　１００ｍＩ）から構成された。

９、このプレー１−を、回転振とう機で１０分間インキコベートし、そして次に 、０．２ｍｌの０ＰＤＡ溶液［８ｍｇの０−フェニレン−ジアミン、Ｓｉｇｍａ 触媒＃Ｐ−１５２６，８ｕｌの３０％Ｈ２０，及び１０ｎ＋１のクエン酸緩衝液 （同Ｉ−）１を、それぞれのｗｅｌｌに添加した。反応は、１５分間の進行を許 され、そして次に、５０〃ｌの４Ｎ　Ｈｚ　ＳＯａを、その反応を停止するため に添加した。

１０、試薬のブランクを、１００μｌ容量の可溶化緩衝液と５０μｌの４Ｎ　Ｈ ！　ＳＯ４をもつ０ＰＤＡ溶液との混合により調製した。

ｉｆ　ｉｏｏμｌの−Ｅ清液を、２ｗｅ　ｌ　ｌのそれぞれから取り除き、そ（ ッてフレキシブルＥＬ［ＳＡ検定プレー）　（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。そのブ レー川・を、４９２ｎｍで分光光度計にて、３０分以内に走査した。

本実験の結果は、図５に示され、ＬＰＳ及びＬＴＡが、内皮細胞とのインキュベ ーションで４と６時間の間にピークをもつヒト内皮細胞上の好中球癒着分子を、 誘導することを示す。この経過時間は、ＴＮＦ及びＩＬ−１βによるＢＬＡＭ− １の誘導のために前もって示されたものと一致する。テストされたそれぞれの時 間点で、ＰＭＮの癒着は、抗−ＥＬＡＭ−１モノクロナ一ル抗体により完全に抑 制されたに違いなく、ＬＰＳ及びＬＴＡの両方が、ヒト内皮上でＥＬＡＭ−１の 発現を誘導したことを示す。

例８ 本例は、ＬＰＳにより誘導された死亡率を抑制するＥＢ３−１の能力が補体の固 定に依存しないことを示す。第一＝−に、ＥＢ３ｉ　Ｆ（ａｂ）’　２フラグメ ント及び酸処理ＥＢ３〜ｌの相対妨害効果を決定するための実験が行われた。完 全な［ｇＧ　！のｐＨ２，５６０分間の処理が、補体の固定能力を永久に破壊す ることは、前もって示されている。（Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ、　、１゜他、１９ ８０．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２８２２−２８２８、引用により本明 細書に取り込む） １１（：　ｒでラベルされたＨＬ−６０細胞の、ＩＣ−１βにより活性化された 内皮細胞への癒着を、ＥＢ３−１モノクロナ一ル抗体（酸処理Ｋｇ及びＦ（ａｂ ）’　！　）の２つの調製物の滴定量の存在下で測定し／、：。結合の５０％抑 制が、約０，５μｇ／ｍｌでＦ（ａｂ）’　２　を使用して達成された。酸処理 ［ｇの約２μｇ／ｌｎｌが、等価な癒着抑制を与えるために必要とされた。

我々は、次に、ＥＢ３−１の２つの修飾形態を放射性ヨード化し、そしで、半減 期を以五のように決定した。

α−相（分）　β−相（分） 非修飾ＥＢ３−１　２　３５６ ｐＨ２，５処理ＥＢ３−１　３．２４０８ＥＢ３１　Ｆ（ａｈ）’　！　２．３ 　１３６ＥＢ３１の血液浄化曲線が、図６に示される。これらのデータ及び曲線 上面積の計算に基き、我々は、ＬＰＳ誘導死亡率のラットモデルにおいて、ＥＢ ３−１の２つの修飾形態を使用した。我々は、その動物に投与し、致死量の１、 ＰＳ投与の後２及び４時間の間におけるＥＢ３−１の全ての３形態のための、お およそ同じピーク濃度及び曲線上面積を与えた。それ故、ｌＯプラット４グルー プが、Ｔ・０でＬＰＳの静脈内致死量を受け入れた。次に、Ｔ＝２時間で、全て が、以下のようなＥＢ３−１の形態を受け入れた。

グループＩ　−無治療 グループＩ［−Ｅ８３−１−１．０ｍｌ／ｋｇでの静脈内ポーラス５＋ｎｇ／Ｊ グループｌｌｌ−酸処理ＥＢ３−１−　静脈内ポーラス５ｍｇ／ｋｇグループＩ Ｖ　−ＥＢ３−Ｉ　Ｐ（ａｂ）’ｚ　−７，５ｍｇ／ｋｇ　Ｔ’２時間５．０　 ｍｇ／ｋｇ　Ｔ＝３時間 ２．５　ｍｇ／ｋｇ　Ｔ＝４時間 この投与法は、５ｍｇ／ｋｇでの非修飾のＥＢ３−１で得られたような血液浄化 曲線下の同じ面積に近似する。図７に示された結果は７、保護の機構が補体の固 定に複雑には関係しないことを示唆する。さらに、我々は、本免疫ｒｇＧ３が、 ヒトの補体を固定し、モして／または、Ｆ０レセプタへの結合により細胞を動員 するところの、潜在的に毒性の能力を廃止する方法を例証した。

本発明は、明確及び理解を目的として、説明及び例により、幾分詳細に記載され たが、特定の変更及び修飾が、付属の請求項の範囲内で実施されることができる のは明らかであろう。

ＩＺ１２４時間 顛Ｔｌ−ＥＬＡＮ−１（ＮＧ／ＫＧ） ＦＩ６．ｌ 顛Ｔｌ−ＥＬＡＭ　−Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、Ｊ。

八ＧＺＭＬ ＦＩｏ、４ ＩＪ’１ 処理 Ｆ／Ｇ、７ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ 、　５Ｅ （７２）発明者　ウィンケルヘイク、ジェフリー　エル。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９２１０６゜サンディエゴ、　＃３２３．ロ ーズクランストライブ　１２２０

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．患者においてＥＬＡＭ−１により仲介される細胞間の癒着を阻害するための 方法であって、医薬として許容される担体及びＥＬＡＭ−１上の機能的エピトー プを認識する免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物の治療的有効投与量をその 患者に投与することを含んで成る方法。
2. ２．上記の免疫グロブリンが、ＩｇＧ２である請求項１に記載の方法。
3. ３．上記の免疫グロブリンが、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセス番号ＨＢ１０５９１と 指定された細胞系により分泌される請求項１に記載の方法。
4. ４．上記の細胞間の癒着が、炎症反応と関係する請求項１に記載の方法。
5. ５．上記の炎症反応が、敗血症のショックである請求項４に記載の方法。
6. ６．上記の炎症反応が、成人の呼吸困難症候群または損傷関連の敗血症である請 求項４に記載の方法。
7. ７．上記の細胞間の癒着が、転移と関係する請求項１に記載の方法。
8. ８．上記の医薬組成物が、静脈内に投与される請求項１に記載の方法。
9. ９．上記の治療的有効投与量が、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重 の間にある請求項８に記載の方法。
10. １０．上記の治療的有効投与量が、約５ｍｇ／ｋｇ体重から約１５ｍｇ／ｋｇ体 重の間にある請求項８に記載の方法。
11. １１．患者においてＥＬＡＭ−１により仲介される病的反応の治療方法であって 、医薬として許容される担体及びＥＬＡ−１上の機能的エピトープを認識する免 疫グロブリンを含んで成る医薬組成物の治療的有効投与量をその患者に投与する ことを含んで成る方法。
12. １２．上記の免疫グロブリンが、ＩｇＧ３である請求項１１に記載の方法。
13. １３．上記の免疫グロブリンが、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセス番号ＨＢ１０５９１ と指定された細胞系により分泌される請求項１３に記載の方法。
14. １４．上記の病的反応が、炎症反応でる請求項１１に記載の方法。
15. １５．上記の病的反応が、敗血症のショックである請求項１１に記載の方法。
16. １６．上記の病的反応が、成人の呼吸困難症候群または損傷関連の敗血症である 請求項１１に記載の方法。
17. １７．上記の免疫グロブリンが、リボソーム内に埋め込まれている請求項１１に 記載の方法。
18. １８．上記のリボソームが、抗炎症化学療法剤をカプセルの中に封入している請 求項１７に記載の方法。
19. １９．ＥＬＡＭ−１上の機能的エピトープに結合することができ、且つ患者内で ＥＬＡＭ−１により仲介される病的反応を抑制することができる免疫グロブリン を含んで成る医薬組成物。
20. ２０．上記の免疫グロブリンが、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．アクセス番号ＨＢ１０５９１ と指定された細胞系により分泌される請求項１９に記載の方法。
21. ２１．上記の病的反応が、敗血症のショックである請求項１９に記載の方法。