JPH06504912A - サイトカイン誘導蛋白質ｔｓｇ−６、該ｔｓｇ−６蛋白質をコードするｄｎａおよび該ｔｓｇ−６蛋白質の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトカイン誘導蛋白質ＴＳＧ−６、該ＴＳＧ−６蛋白質をコードするＤＮＡお よび該ＴＳＧ−６蛋白質の利用 発明の背景 １且Ω公団 本発明は、結合組繊細胞中で腫瘍壊死因子もしくはインターロイキン−１によっ て誘導される蛋白質であるＴＳＧ−６，該ＴＳＧ−６蛋白質をコードするＤＮＡ およびｍＲＮＡ、前記蛋白質の機能性誘導体、前記蛋白質に固有の抗体、前記蛋 白質とＤＮＡとの製造方法、ならびに前記蛋白質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、Ｉｌｌｌ 性能導体および抗体の利用に関する。 １東技五Ω返男 腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）（以下、ｒＴＮ ＦＪと略することがある）は強力な多面発現性のサイトカインであり、腫瘍や病 原菌に対抗して宿主を防御するのに重要なものである。ＴＮＦは、数種の腫瘍性 疾患、感染症および自己免疫疾患の病理学にも関係がある。ＴＮＦの最も生物学 的な機能は標的細胞中の複雑な遺伝子プログラムのトリガリングし得ることであ る。ＴＮＦによって活性化される遺伝子のうち数種は特定されているが、未特定 のものも数多く残っている。 １に旦０二股煎葺且 ＴＮＦ　（ＴＮＦ−αおよび悪液質とも呼ばれる）はマクロファージによって産 出された活性モノサイトによって製造される蛋白質であり、もともとは細菌性ワ クチン（カルメットーゲランかん菌、ＢＣＧ）とエンドトキシンとを連続的に注 射された動物の血清中に発見されたものである（Ｃａｒｓｗｅｌ　１．Ｅ、Ａ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、見旦Δ　ヱ２　：　３ ６６６（１９７５））。ＴＮＦは活性Ｔ−リンパ球によって製造されたサイトカ インに構造的および機能的に関係がある。活性Ｔ−リンパ球とは、当初はリンフ ォトキシン（ＬＴ）と呼ばれていたものであり、ＴＮＦ−βとしてもよく知られ ているものである（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１２Ｂ：　１２６７　（１９６８）； ’　５ｐｉｅｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア２４（１９８４））、ＴＮＦとＬＴとをコー ド化する遺伝子は結合しており、ヒトの染色体の６番の短いアーム上の）ｌＬＡ −ＤＲ遺伝子座の近くにある（Ｓｐｉｅｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、前出）、ＴＮＦ とＬＴとは同じ細胞の表面にあるレセプターと結びついている＜Ａｇｇａｒｗａ ｌ、Ｂ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３上旦：６６５　（１９８５１）。 通常のヒトのＴＮＦは１５７個のアミノ酸からなる非グリコジル化蛋白質であり 、変性した状態では約１７ｋＤａの分子量を有する。成熟したＴＮＦ分子は前駆 体（ｐｒｅ−ＴＮＦ）から得られ、該前駆体はＮ末端にさらに７６個のアミノ酸 を有している（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、前出）、ＴＮＦをコー ドする遺伝子はマクロファージによって産出されるモノサイト群の細胞のみから 発現するものではない、７１数のヒト非モノサイト１ｍ瘍細胞系（ｈｕｍａｎｎ ｏｎ−ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）もＴＮＦを産 生ずることが示されている（Ｒｕｂｉｎ、Ｂ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、旦ｕ、Ｍ ｅｄ、　１旦４：１３５０　（１９８６）；Ｓｐｒｉｇｇｓ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦４＋６５６３　（１９８ ７））。ＴＮＦはＣＤ４°およびＣＤ８°の末梢血Ｔリンパ球によっても製造さ れ、また、種々の培養されたＴおよびＢ細胞系によっても製造される（Ｃｕｔｕ ｒｉ９Ｍ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、旦五２２Ｍ！旦、１旦８：１５８１（１９ ８７１；Ｓｕｎｇ、Ｓ、−５，Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、止、１五Ｌ２麗旦旦。 上旦旦：　１５３９　（１９８８））。 データが蓄積するにつれ、ＴＮＦは多面発現の生物学的活性を有する調節サイト カインであることがわかった。該活性には、リボ蛋白質リパーゼの合成の阻止ｅ ｒｕｓｓｉａ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、よ１旦ニア６５（１９ ８７））、細胞の成長の阻止もしくは細胞の成長の刺激（Ｖｉ　１ｅｅｋ、Ｊｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６≦３：６３２　（１９８６）；　Ｓｕｇ ａｒｍａｎ、Ｂ、Ｊ、ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　ス３０　：　９４３　（ １９８５）；　Ｌａｃｈｍａｎ、Ｌ、Ｂ、ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 工止旦：２９１３　（１９８７））、ある種のトランスフオームされた細胞に対 する細胞毒性作用（Ｌ、ａｃｈｍａｎ、Ｌ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、前出；　Ｄａｒ ｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、Ｚ、ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、３３：８３（１ ９８４ンン、抗ウイルス性作用（にｏｈａｓｅ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　 ４５：６５９　（１９８６）；Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｈ，Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ ｒｅ　３よびプロスタグランジンＥ２製造の刺激作用（Ｄａｙｅｒ、Ｊ、−Ｍ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦２：２１６３　（１９８５））および その他の活性がある。ＴＮＦの概要を知るためには、Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ、ｅｔ 　ａｌ。 、Ｎａｔｕｒｅ　３２旦：５８４　（１９８６）、Ｏｌｄ、Ｌ、Ｊ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３旦：６３０　（１９８６ンおよびＬｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｂ 、１ｎｖｅｓ　ｔ、　旦：　２３４　（１９Ｂ７）を見よ。 ＴＮＦには、Ｔ細胞の活性化（Ｙｏｋｏｔａ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏ　１．　上４０：５３１　（１９８８））、Ｂ細胞の活性化（Ｋｅｈｒｌ、 Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、上旦旦：　７８６　（１９８７） ）、モノサイトの活性化（Ｐｈｉｌｉｐ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３ ２３：８６　（１９８６））、胸腺細胞の活性化（Ｒａｎｇｅｓ、Ｇ、Ｅ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦ユニ　１４７２　（１９８８））、および 主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラス１分子とクラス１１分子との細胞 表面発現の刺激作用を含む、免疫調節作用も有する（Ｃｏｌ　ｌ　ｉｎｓ、Ｔ、 ｅｔ　ａｔ、。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ’、ＵＳＡ　８３：４４６（１９８６）； 　Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌｌ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３λ旦：　 ３０４　（１９８７））。 ＴＮＦは、さらに、種々の炎症促進作用（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＦ Ｘｃｔｉｏｎｓ）を有し、該作用により、血管内皮細胞への凝血促進作用の誘発 のような組織損傷（Ｐｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、ｅｂ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　±３６．１６８０．　（１９８６））、好中球とリンパ球との接着の増加（Ｐ ｏｂｅｒ、Ｊ、Ｓ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１旦８：３３１９（１ ９８７））、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板 活性化因子（ＰＡＦ）放出の刺激作用がおこる（Ｃａｍｕｓｓｉ、Ｇ、ｅｔａｌ 、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、上旦旦：　ｌ　３９０　（１９８７））、最近の研究 は、ＴＮＦが、多くの感染症（Ｃｅｒａｍｉ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎ。 １、Ｔｏｄａ　旦：　２８　（１９８８））および免疫疾患（Ｐｉｇｕｅｔ、Ｐ 、−Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、上旦旦：　１２’８０　（１９８ ７））の原因、ならびに数種の忠性腫瘍を伴う悪液質に関係があるとしているａ 　Ｍ　５ｃｈｉｅ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｂｒ、Ｊ、Ｓｕｒ　、工旦：　６７ ０−６７１　（１９８９）には、ＴＮＦが重度の敗血症の病理変化と関連する主 要な媒介物であるということが概説されている。 ＴＮＦは、造血前駆細胞の成長および分化に関連する活性作用も有している（Ｍ ｕｒｐｈｙ、Ｍ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦４：４４８７（１９ ８６））。該活性作用のうちあるものは間接的であり、顆粒球−マクロファージ ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）（Ｍｕｎｋｅｒ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、。 ＴＮＦによる′　ム　の したがって、ＴＮＦが非常に多くの作用を有し医学的に重要なサイトカインであ ることは明かである。その作用の大部分は、該サイトカインが作用する特定の細 胞中の遺伝子の活性化もしくは不活性化によって伝えられているようである。 このような形式の作用の１つの例外は、ある特定の標的細胞へのＴＮＦの急速な 細胞障害効果である。この効果は、ＲＮＡもしくは蛋白質合成の阻害因子によっ て増大し、遺伝子発現の変調によるものではないようである（Ｍａｔｔｈｅｗｓ 、Ｎ、、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４旦：４０５　（１９８３））、特定の遺伝 子の多くの産生物がＴＮＦで処理した細胞で十分に制御されていることが示され ており、それらのうちのいくつかについては以下で議論する。 ＴＮＦ変調遺伝子発現の最初の例の中には、ＴＮＦ処理がＭＩＩＣクラスｌ−ｍ ＲＮＡのレベルと、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と正常な皮膚繊維芽細胞の 増加を誘導することを示したものがある（Ｃｏｆｆｉｎｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、。 前出）。ＴＮＦによって誘導される他の分子（あるいは遺伝子ンの部分的なリス トを下記の表１に示した。外因的に添加したＴＮＦはモノサイトとモノサイト細 胞系におけるＴＮＦ合成を増加させるので、ＴＮＦは自己制御サイトカインであ り、このことは注目に（直する（Ｐｈｉｌｉｐ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ ｅ表１ 牌ＩＣＩ壊死…ｒに１角４される遺伝子および裏白レファレンス：　Ｉｌｌ　Ｉ ’ｏｂｅｒ、　Ｊ、Ｓ、　ｅＬ　ｉｆ、、　Ｊ、　Ｉａ＋ａ＋ｎｏ１．　ｌａｂ 、１６８０．１９３６．　（２P１１ａｊｊａｒ、　Ｋ＾、　ｅＬ　ｍｌ、、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｆｌｅｄ。 １６Ｆ、２３５．１！１８７．ｆ３１Ｋｎｈｎｓｅ、ｉｌ、ｅｔａｔ、、Ｃ（Ｉ ＩＩ４Ｓ＋Ｇ５９１１９８６１．ｔ４１１’ｒｉｚａｎ＋＋{＋ｉｅｒ、にｅＬ ａｌ、、Ｊ、Ｉ欄−―ｔ１１ａ五、＋３６゜ｑ７５．１旦１Ｍ？、１５１［１＋ Ｉｙｐｒ、Ｊ、−Ｍ、ａＬａｌ、、シー一旦３Ｐニー舛袷φ−１６２：２１Ｇ３ Ｉｌｌδ５１．１６＋１Pｏｎｇ、Ｇ、Ｉ１．Ｗ、ｅＬａ１．、＆Ｌｕｒａ３２ ３：８１９１１９δｆ１１．　１７１　Ｌｉｎ、　Ｊ、−Ｘ、　ｅＬ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２．１１９０１　＋９δ７．　P８１　 Ｉ’ａｌｏｓｂｅｌｌａ、　Ｖ、Ｊ、　ｅＬ　ｎｌ、、　Ｊ、　ｌ１ｉｏｌＣｌ ＋ｅｓ、２６２．　１９５０．　１！ｌδ７．　（９１Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、　 Ｔ、Ｓ、　ｅＬ　ａｌ、、　Ａｂｓ、２ｎｄｌｎＬｅｒ獅≠k、　Ｃｏｎｒ、　 ＴＮＦ、　ｐ、４．　＋９１９゜＋１０１１１ｅｖｉｌａｃ４ｕａ、Ｍ、Ｉ’、 ａＬａｌ、、Ｐｒａｃ、ＮａＬｌ、Ａｃ８ｄ、ＳｃｉυＳ＾Ｊ４．９２コδ、１ ０８７．１１P１ｋｄｃｎＨａ、Ｒ，Ｌ、ａｔａｌ、、Ｊ。 にと九１６６、７５１．１９１１８．　＋１２１にｉｒ＋＋Ｌｅｉｎ、　１１． 　ｅＬ　ａｌ、、　Ｊ、　［１ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　２６P．９５＋＋５．１ ９δ６．　＋１３１　ｌｏｎｇ、　Ｇ、１１．　ａｌ画、Ｓｒ、ｉｃｒ＋ｃｅ２ ４２．９４１．Ｉ！＋３８１＋４１Ｌｅ、、Ｊ、ｃＬｎｌ、、ｌａｂ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、ＳＧ：２コ４ｔｌ！Ｊ！１Vす る（Ｋｒｏｎｋｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　見ＳＡ　旦４：４６９（１９８７））−ヒト繊維芽細胞にお けるコラーゲンの合成が阻害され（Ｓｏｌｉｓ−Ｈｅｒｒｕｚｏ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ６ｍ、　２旦３＋５８４１　（１’９８８））、ＨＵＶＥ Ｃにおけるトロンボモデエリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌ　ｔ　ｎ）が阻害さ れることも報告されている（Ｃｏｎｗａｙ、　Ｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ。 旦：　５５８８　（１９８８））。これら全ての阻害作用はＤＮＡの転写のレベ ルで発現されるが、正確なメカニズムは未だわかっていない。 ＴＮＦによるシグナルの導入と遺伝子の活性化のメカニズムは非常に興味深いテ ーマである。多くの型の細胞において、ＴＮＦはホスホリパーゼ（殆どホスホリ パーゼＡ２のようであるが）を活性化させ、細胞のプールからアラキドン酸を遊 離させ（Ｓｕｆｆｙｓ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　ｌ１旦ニア３５　１５（１９８７））、エイコサノイドの 合成を増大させる（Ｄａｙｅｒ、Ｊ、−Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、前出）、ヒト繊維芽 細胞においては、ＴＮＦはＧＰＴアーゼ（ＧＰＴａｓｅ）の活性を刺激しくＩｍ ａｍｕｒａ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２旦３：１０２４７ 　（１９８９））、サイクリックＡＭＰのレベルを上げ、サイクリックＡＭＰ依 存性プロティンキナーゼの活性を高め、そして、プロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ ）を活性化させる（Ｚｈａｎｇ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦５：６８０２　（１９８８）；Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｄ、 Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３ユニ６６１　（１９８９）ン、ＴＮＦは 転写因子であるＮＦ−ｋＢも活性化し得、この作用が、ＴＮＦがＩＬ−２のレセ プターであるα鎖を誘導（Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ、Ｊ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ。 ｃ、Ｎａｔ［、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　１旦：２２３１　（１９８９））、 あるいは、潜在性ヒト免疫欠損ウィルスであるＨＩＶ−１を活動化させる（Ｇｒ ｉ　ｆ　ｆ　ｉｎ、Ｇ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３旦旦ニア０　（１ ９８９））メカニズムであると思われる。 ＴＮＦと　のサイド力インとの ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、　ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、　ＩＦＮ−〇、ＩＦＮ− βまたはＩＦＮ−γの個々の活性を様々な実験系で比較してみると、外見上の冗 長度とアンビギエイティー（ａｍｂ　ｉ　ｇｕ　ｉ　ｔｙ）とが非常に多いこと に気付く。 第一に、同じレセプターを利用する構造的に関連するサイド力イン（例えば、Ｔ ＮＦ−αおよびＴＮＦ−β、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β、ならびにＩＦＮ−α およびＩＦＮ−β）は同じように活動する。さらに驚くべきことに、異なるレセ プターに結合している構造的に関連性のないサイド力インも類似する生理学的効 果を有するのである。例えば、ＩＬ−１とＴＮＦとは類似する遺伝子活性化作用 を有し、類似する生物学的効果に帰結する（Ｌｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｂ。 Ｉｎｖｅｓｔ、旦：２３４　（１９８７））、ＩＦＮとＴＮＦとも同じ生物学的 作用を有する（にｏｈａｓｅ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　４５：６５９（１ ９８６）；Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｈ，Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：８１ ９　（１９８６）；Ｗｉ　１１　ｉａｍｓｏｎ、Ｂ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１旦：５３９７　（１９８７）；５ ｔｏｎｅ−Ｗｏｌｆｆ、Ｄ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１旦ユニ ８２８　（１９８４））。例えば、ＩＦＮとＴＮＦとは、ＭＨＣクラス■および クラスＩＩ遺伝子、２゛−５°オリゴーアデニレートシンセクーゼ、ＩＬ−６、 転写因子ＩＲＦ−１およびＴＮＦ遺伝子自身を含む、同じ遺伝子のうちのいくつ かを活性化させる（Ｖｉ　１ｃｅｋ、Ｊ、、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘ　ｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　、　Ｖｏｌ、　９５／ＩＩ、ｐ、３ ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌ　ｉｎ　（１９９０））ｅ自然の 状態では、細胞が巣−のサイド力インに晦されることはあるとしても稀である。 むしろ、成長因子について仮定されてきたように、生体内におけるサイド力イン の作用は［コンテクスチュアル（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ　；前後の関係上の、分 脈上の）」である（Ｓｐｏｒｎ、Ｍ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、　、Ｎａｔｕｒｅ３３２ ・２１７　（１９８８））。それ故に、自然の状態でサイド力インによって生起 される生物学的効果は、任意の微少環境に同時に存在する全てのサイド力インの 相乗的および拮抗的相互作用の総和を表すものである。さらに、１つのサイド力 インの合成が他のサイド力インによって建設的にあるいは否定的に調整され得る ように、サイド力インは３次元の網目状に配置されているようである。これらの 理由により、個別に作用するサイド力インの分子メカニズムは勿論のこと。 他との関連を持って作用するサイド力インの分子メカニズムを理解することが重 要である。 上記と対照的に、ＴＮＦとＩＦＮとの作用が類似であるとか相乗的であるとかい うより、むしろ、拮抗的である場合がある。例えば、ＴＮＦはヒトの二倍体繊維 芽細胞に対して分裂促進的であるが、ＩＦＮは該細胞の成長を阻害する（ＶｉＩ ｃｅｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｔ、、正、ユニ２工■ヱ旦、１旦３：６３２　（１９８６ ））。Ｔ　Ｎ’ＦとＩＦＮとが同時に存在する場合の細胞の反応は、質的にも量 的にも、ＴＮＦかＩＮＦがいずれか１つ存在する場合と異なる可能性がある（Ｌ ｅｅｕｗｅｎｂｅｒｇ、Ｊ、Ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、上旦 旦：１１８０　（１９８７１：　Ｒｅ１ｓ、Ｌ、Ｆ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６４：１６３５１　（１９８９）　；Ｆｅｉｍａｎ、　 Ｒ，ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、上旦旦：　２４４１　（１９８６）；Ｔ ｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｂｓｔｒ、　２ｎｄ　（ｎむ゛　Ｉ 　Ｃｏｎｆ、ＴＮＦ、　ｐ、７　（１９８９））。さらに複雑なことには、ある 細胞中でＴＮＦはＩＦＮ−βの合成を誘導する可能性がある（Ｒｅｉｓｅｔ　ａ ｔ、、前出）。ＴＮＦによるある遺伝子（例えば、Ｉ（ＬＡクラスＩなど）の活 性化にはＩＦＮ−〇が存在していなくてはならないのである（Ｌｅｅｕｗｅｎｂ ｅｒｇ　ｅｔａｌ、、前出）、ＩＦＮならびにＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは、 類似した複数の刺激に応じて、同じ微少環境で産生されることがよくある（Ｍｕ ｒｐｈｊ／。 Ｍ、ｅｔ　ａｔ、、前出；５ｔｏｎｅ−Ｗｏｌｆｆｅｔ　ａｌ、、前出；Ｂ１１ １　ｉａｕ、Ａ、、ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａ　旦：３７　（１９８８））ので 。 ＴＮＦとＩＮＦとの相互作用は、１！康なあるいは病態生理学的な状態において 。 人体に現れる症状に大きく関連している。 サイトカイン、特にＴＮＦと癌および感染症との関連は、しばしば宿主の異化の 状態に関連して、多くの態様をとる。癌患者に見られる。主要な、そして最も特 徴的な問題は体重の減少であり、それは、通常食欲減退と関連するものである。 それが原因となってひどく衰弱した状態は「悪液質」として知られる（概略は、 Ｋｅｒｎ、に、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐａｒｅｎｔ、Ｅｎｔｅｒ、Ｎｕｔ少１ 食欲減退および悪性腫瘍の成長に応じた身体の持続性ビランという症状を含む、 基礎生理学的障害はエネルギーの消費に対して食物の摂取が低下することに関係 しているかもしれない、多くの寄与因子が特定されてきているとはいえ、この共 通に観察されると共にしばしば寿命を縮めるような障害の原因は未だ正確にわか っていない（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、（Ｅｄｓ、）、Ｈａｒｒｉ ｓｏｎ’ｓ　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＯＦ　ＩＮＴＥＲＮＡＬＭＥＤＩＣＩＮＥ 、　１１ｔｈ　Ｅｄ、、ＭｃＧｒａｗ−）（ｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ、１９８７．　Ｃｈａｐ、７８．　ｐｐ、４２１−４３１）。 悪液質状態は重症の病的状態と関係があり、大多数の癌の原因である。ＴＮＦが 癌、感染症および他の異化状態における悪液質の重要な媒介物質であることを多 くの研究が示唆している。 細菌性感染症、敗血症および致命的な病気においては細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ ）または菌体内毒素が、Ｆｊｌ、倦怠感１食欲減退および悪液質を含む多くの病 態生理学的症状発現の原因であると考えられていた時期があった。最近になって 。 ＴＮＦは多くの菌体内毒素の作用を擬態することが観察され、そのことから、Ｔ ＮＦおよびマクロファージが産するモノサイト類、特にＩＬ−１の細胞から得ら れる関連するサイトカインが病気の臨床的症状発現の原因であるという提言が導 かれた。菌体内毒素は、ＴＮＦ　（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ、Ｓ、に、ｅｔ　ａｌ、 。 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１旦ユニ　２５８５−２５９１　（１９８６）Ｊならびに ■Ｌ−１（Ｄｉｎａｒｅｌ　ｌｏ、Ｃ，Ａ、、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、旦 ＝５１−９４　（１９８４））、インターロイキン−６（ＩＬ６）およびコロニ ー刺激因子を含む他のサイトカインの産生と分泌とを刺激するマクロファージが 産するモノサイトの強力な活性化体である。前記サイトカインのあるものはさら にＴ−リンパ球を刺激して１例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｒｏｂ ｂ。 Ｒ，Ｊ、、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａ　５：２０３−２０９（１９８４））等の 他のサイトカインを産生させる。 モノサイトから誘導されるサイトカインは、菌体内毒素（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ。 Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎ　、Ｍｅｄ、３上旦：１４８１−１４８６　（１９ ８８）　）、癌および他の異化状態（Ｎｏｒｔｏｎ、Ｊ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、、Ｎ ｕモン性反応の媒介物質であると考えられている。興味深いことに、ＴＮＦを少 量投与することによって誘導される変化のうちには、ＩＬ２を多量に投与するこ とによって引き起こされる変化にきわめて類似しているものがある（Ｒｅｍｉｃ ｋ、Ｄ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、５旦：　５８３−５９０　 （１９８７））。 ボランティアに菌体内毒素を投与すると、発熱、頻脈（ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ ）１代謝率の増加右よびストレスホルモンの放出を含む流感に似た急性の病気に かかった（Ｒｅｖｈａｕｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｓｕｒ　、上−λ３ ：１６２−１７０　（１９８８））。（肝機能と腎機能とが正常である）癌患者 をＴＮＦを段階的に処置して投与する（４−６３６μｇ／ｍ”　／２４ｈｒ）と いう処置を施した結果、投与量が５４５μｇ／ｍ”／２４ｈｒを越えると、健康 なヒトに国体内毒素（４豹ｇ／ｋｇ）を注射することによって誘発されるのと類 似した変化が起こった（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　互且り五旦工 り１旦４：２８０−２８６　（１９８８））、このことからＭ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ 　ｅらはＴＮＦは敗血症および菌体内毒素の反応の主要な宿主媒介物であると結 論した。最近になって、ヒトもしくはラットに５日に渡ってＴＮＦを静脈注射し 続けると食欲減退、液体保持、急性期反応およびマイナスの窒素収支（即ち、昔 から知られている異化の症状）が見られ、このことから、ＴＮＦが重症の病気に かかっている間に見られる多くの変化の原因である可能性があるという結論が導 かれた（Ｍｉｃｈｉｅ、Ｈ，ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Δｎｎ、Ｓｕｒ　、２旦旦：１ ９−２４　（１９８９））。癌性悪液質におけるＴＮＦの役割に関する他のデー タも考慮することにより、癌患者にｒＴＮＦを投与すると、Ｃ反応性蛋白質（Ｃ ＲＰ）の増加、血清内亜鉛の減少、前腕の外向きフラックス（ｆｏｒｅａｒｍ　 ｅｆｆｌｕＸ）における総アミノ膝皿の大きな増加および他の組織によるアミノ 酸の取り込ｌ肛の１豹 ＴＮＦやＩＬ−１のようなサイトカインは、感染症および癌への宿主の反応と同 様に炎症反応の仲介においても主要な役割を果たす、これらサイトカインの作用 の様式はやっと解明され出したところである１本願の発明者らは結合組繊細胞に おいてこのようなサイトカインによって誘導される一連の蛋白質と糖蛋白質とを 発見し研究を重ねてきた。研究の結果として、本願の発明者らは、このような、 ＴＳＧ蛋白質と呼ばれるサイトカインが誘導する蛋白質もしくは糖蛋白質、また はそれから得られるペプチドのような機能性誘導体、およびこれらのＴＳＧ蛋白 質もしくは糖蛋白質に固有の抗体が、数多くの診断および治療手続に利用するこ とが出来るのではないかと考えた。これら蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ およびその機能性誘導体は、慢性の炎症状態、特にリューマチ様関節炎を含む上 記の型のサイトカインの作用と関連する多くの病気、感染症および敗血症、なら びに癌の治療において有用である。 特に、本発明はＴＳＧ−６と呼ばれるサイトカインが誘導する蛋白質もしくは糖 蛋白質またはその機能性誘導体を提供し、前記蛋白質の分子が天然に産するもの であるときは元来付随している他の蛋白質もしくは糖蛋白質から実質的に分離し ているものを提供する。前記蛋白質分子の完全なものは、外見１約３２ｋＤａの 分子量を有し、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２のアミノ酸配列を有する。グリコジル化 した形態では、前記糖蛋白質は約３８−４１ｋＤａの範囲の分子量を有している ようである。 本発明は、さらに、ＴＳＧ−６もしくはその機能性誘導体をコードするＤＮＡ分 子に関し、該ＤＮＡ分子が天然に産するときは１元来付随している他のヌクレオ チドの連鎖、特に隣接する連鎖から実質的に分離しているものに関する。好まし い態様においては、前記ＤＮＡ分子はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド配 列を有する。本発明のＤＮＡ分子はゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡであり、単 鎖または二重鎖であればよい。 本発明はプラスミドのような発現伝達体としてのＤＮＡ分子を提供し、さらに、 該ＤＮＡ分子によって形質転換した（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）、または形質転 位した（ｔｒａｎｓ　ｆｅｃｔｅｄ）宿主の細胞を提供する。宿主は、酵母およ び哨乳類の細胞を含む、細菌または真核性の細胞であればよい。 さらに、元来付随している他の蛋白質もしくは糖蛋白質から実質的に分離してい るＴＳＧ−６蛋白質もしくは糖蛋白質、またはその機能性誘導体の製造方法も本 発明に含まれる。前記方法は、（ａ）培養条件下で前記蛋白質を発現し得る宿主 細胞を培養し、（ｂ）前記蛋白質または襟能性誘導体を発現し、（Ｃ）培地から 前記蛋白質または機能性誘導体を回収するステップを含む。 本発明はさらにＩＩ記ＴＳＧ−６に固有の抗体またはそのエピトープに関する。 好ましい抗体は雛−クローン性の抗体である。 さらに、本発明によって、生物学的試料中のＴＳＧ−６蛋白質の存在を検出する 方法も提供される。該方法は、（ａ）ＴＳＧ　６蛋白質を含んでいると思われる 生物学的試料に該蛋白質と結合し得る分子を接触させ、（ｂ）該分子のうちに前 記蛋白質と結合しているものがあるか否かを検出する、というステップを含む、 この方法を行うのに好ましい分子は抗体または抗体断片であり、最も好ましくは 単一クローン性の抗体である。そして、好ましい検出方法は免疫検定である。 本発明は、さらに、正常なまたは突然変異体のＴＳＧ−６蛋白質をコードする核 酸が被検者に存在することを検出する方法も含む、該方法は、（１１）被検者か ら得た細胞、その抽出物またはその培養上清を、雑種形成状態下で正常なまたは 突然変異体のＴＳＧ−６蛋白質の少なくとも一部分をコードするオリゴヌクレオ チドプローブと接触させ、（ｂ）該プローブの、前記細胞の核酸との雑種形成を 測定することによって前記核酸の存在を検出する。 というステップを含む、さらに、この方法は、ステップ（ａ）の前に、ＴＳＧ− ６蛋白貢をコードする細胞のＤＮＡの量を増やすというステップを有していても よい。 本発明は、またさらに、細胞中のＴＳＧ−６蛋白質の発現の誘導を測定する方法 に間する。該方法は、 （ａ）前記細胞をＴＳＧ−６蛋白質の発現を誘導し得る物質と接触させ。 （ｂ）雑種形成状態下でＴＳＧ−６蛋白質の少なくとも一部分をコードするオリ ゴヌクレオチドプローブとの雑種形成によって前記細胞中のＴＳＧ−６蛋白質を コードするｍ　ＲＮ　Ａの量を測定し、（ｃ）前記細胞中のＴＳＧ−６ｍＲＮＡ の量と前記誘導物質と接触させなかった細胞中のＴＳＧ−６ｍＲＮＡの量とを比 較する。 というステップを含む、（Ｃ）ステップにおいて、ＴＳＧ−６ｍＲＮＡの量が増 えているということは、誘導が起こったことを示す。 本発明によるＴＳＧ−６蛋白質の発現の誘導を測定する他の方法は、（ａ）前記 細胞をＴＳＧ−６蛋白質の発現を誘導し得る物質と接触させ、（ｂ）ＴＳＧ−６ 蛋白質を測定する方法として上記の方法を使用し、好ましくは免疫測定法により 、細胞の抽出物または上演中のＴＳＧ−６蛋白質の皿を測定し。 （ｃｌ細胞の抽出物または上清中のＴＳＧ−６蛋白質の鼠と、前記誘導物質と接 触させていない細胞の抽出物または上清中のＴＳＧ−６蛋白質の量とを比較する 。 というステップを含む、（Ｃ）ステップにおいて、ＴＳＧ−６蛋白質の量が増え ているということは、誘導が起こったことを示す。 本発明は、ある細胞においてＴＳＧ−６蛋白質の発現を誘導し得る化合物を特定 する方法にも用いることが出来る。その方法は、（ａ）該細胞を被検化合物と接 触させ。 （ｂ）上記の２つの方法のりものいずれかによってＴＳＧ−６ｍＲＮＡの誘導を 測定し、それによって前記化合物がＴＳＧ−６蛋白質の発現を誘導するかどうか を特定する。 というステップを含む。 本発明は、ある細胞のＴＮＦまたはＩＬ−１に反応する能力を測定する方法を提 供する。該方法は。 （ａ）その細胞を、ＦＳ−４細胞においてＴＳＧ−６遺伝子の発現を誘導し得る 量のＴＮＦと接触させ。 （ｂ）上記の２つの方法のうちのいずれかによってＴ　Ｓ　Ｇ　−６ｍ　ＲＮ　 ＡまたはＴＳＧ−６蛋白質の発現が誘導されたかどうかを測定し、それによって 前記細胞のＴＮＦに反応する能力を測定する、 というステップを含む。 区亙Ω皿単久説用 図１は、ＴＮＦで処理されたＦＳ−４細胞における８種のＴＳＧをコードするｃ ＤＮＡに対応するｍＲＮＡの誘導を示すノーザンプロットである。成長を阻止し た複数のＦＳ−４細胞をＯｈでＴＮＦ　（２０ｎｇ／ｍｌ）に接触させた。それ ぞれ異なる時間が経過した後に、破損されていない細胞からＲＮＡが単離され、 ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で単離されたＲＮＡを分画し１分画したＲ ＮＡをゼータプローブプロット膜に移し　ｓａｐでラベルしたＴＳＧｃＤＮＡの 各インサートとのハイブリッドを形成した。各１７−ンに等量のｍＲＮＡが負荷 されたかどうかを確認するために、プロットの大部分も、約１．０ｋｂの不変ｍ 　ＲＮ　Ａに特異的に反応するａｍｐでラベルしたｐＨｅ７によってｃＤＮＡの インサートの内部を探査した。 図２は、ＴＮＦによって誘導される８種のＴＳＧｍＲＮＡの誘導の動きを示す一 連のグラフである。図１に示されているノーザンプロットのオートラジオグラム をレーザー比重計で走査した。各ｍＲＮＡごとに、１００％の誘導が示せるよう に最高密度帯を標準化した。 図３は、ＴＳＧ−６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と演鐸されたアミノ酸配列を示 す、ヌクレオチドとアミノ酸との残基は主要なオーブンリーディングフレームの 最初のメチオニンから番号を付けた。シグナル配列と推定される部分に下線（太 線）を付した。窒素原子に結合したグリカンが糖鎖を形成する可能性がある位置 には二重破線を付した。コンドロイチン硫酸が結合し得る位置とコンセンサス配 列は環マークのついた破線で示した。前記ｍＲＮＡを破壊するコンセンサス配列 モチーフＡＴＴＴＡ（Ｓｈａｗ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　４６：６５９（ １９８６））にもマークを付け（細線）、ポリアデニル化シグナル＜−−−−− ）はアンダーラインを付した。 図４は、前記ＴＳＧ−６蛋白質の二次構造の推定概要図である。考えられるシグ ナルペプチド配列、ならびに、軟骨結合蛋白質／プロテオグリカンコア／リンパ 球ホーミングレセプターであるＣＤ４４およびＣ１ｒ　Ａ鎖に相同する部位が示 されている。Ｎ−糖鎖を形成し得る２つの位置（丸と棒）とコンドロイチン硫酸 結合の装置（アステリスクと棒）も示した。 図５のＡは２ヒトリンパ球ホーミングレセプターＣＤ４４／Ｈｅｒｍｅｓ、ラッ トの軟骨結合蛋白質およびラットのプロテオグリカンコア蛋白質の公知の配列は 推定されるＴＳＧ−６蛋白質の配列に対応する。５８．８２．１０３右よび１２ ７番のシスティンは、前記４つの配列全てに保持されていることに注意せよ。 図５のＢは相補成分のα−フラグメント、即ちＣ１ｒと共にＴＳＧ−６蛋白質の Ｃ末端部の配列（１３６〜２４０のアミノ酸）を示している。 図６はＴＳＧ−６細菌発現ベクターの概要図を示す０図６のＡは、ＴｒｐＥとＴ ＳＧ−６との融合蛋白質の発現ベクターであるｐＡＴＨ−ＴＳＧ−６を示す。 図６８はＭＳ２とＴＳＧ−６との融合蛋白質の発現ベクターであるｐＥＸ−ＴＳ Ｇ−６を示す。 図７は、ＴｒｐＥとＴＳＧ−６との細菌融合蛋白質の発現と精製とを示すゲルパ ターンである。ｐＡＴＨ−２１またはｐＡＴＨ−ＴＳＧ−６で形質転換した旦、 ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ細胞は３−β−インドールアクリル酸で誘導した。全細胞 のライゼートは５Ｏ５−ＰＡＧＥ　（１０％）とクーマシーブルーで着色した蛋 白質で分析した。 レーンｌ：２４時間の誘導後、ｐＡＴＨ−２１で形質転換した細胞の全細胞抽出 物 レーン２と３：３時間（レーン２）または２４時間（レーン３）や誘導後、ｐＡ ＴＨ−ＴＳＧ−６で形質転換した細胞の全細胞抽出物レーン３に示されている細 菌の可溶性蛋白質の７Ｍ尿素抽出物は調製した５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。Ｔ ｒｐＥとＴＳＧ−６との融合蛋白質は２回の電気溶出によって精製され、５ＤＳ −ＰＡＧＥ　（１０％）によって分析した。 レーン４：′Ｆｎ回の溶出液（２０μｇ）レーン５．６１３よび７：第２回の溶 出液（それぞれ、５０ｕｇ、２０μｇおよび５回ｇ） レーンＭ：ｋＤａで示されたＭｗを有するマーカー蛋白質図８は、ＭＳ２とＴＳ Ｇ−６との細菌融合蛋白質の発現と精製を示すゲルパターンテあ６．ｐＥＸ−Ｔ ＳＧ−６で形質転換したＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２本Ｈ＊Ｔ「ｐ細胞は高温で誘導さ れた（４２℃）。非誘導（２８℃）および誘導（４２℃）細胞からの全ライゼー トは図６で行ったように分析した。 レーンｌ：誘導前の全細胞ライゼート レーン２：誘導後の全細胞ライゼート レーン３〜６・調製した５ＤＳ−ＰＡＧＥのゲル切片から電気溶出した融合蛋白 質（それぞれ、５．ｔｏ、２０および５０μｇ）図９はＴｓＧ−６（７）発現ベ クターであるｐＳＶ−ＴＳＧ−６（図９Ａ）およびｐＭＡＭ−ＴＳＧ−６Ｃ図９ Ｂ）の概要図である。 図１Ｏは様々な安定したトランスフエクタント中でのＴＳＧ−６ｍＲＮＡの発現 のノーザンプロット分析を示す、左図はｐＳＶ−ＴＳＧ−６で形質移入した細胞 のプロットを示す。右図はｐＭＡＭｎｅｏ−ＴＳＧ−６で形質移入した細胞のプ ロットを示す。 図１１は、様々な細胞系におけるＴＳＧ−６ｍＲＮＡのＴＮＦによる誘導のノー ザンプロット分析を示す、ＴＮＦ　（２０１ｇ／ｍ　１　）を融合性細胞に添加 した。４時間後に全ＲＮＡを抽出し、ノーザンプロット分析にかけた。ｒＣＴＬ （ｃｏｎｔｒｏＮＪはＴＮＦによる処理を行っていないことを示し、ｒＴＮＦ」 はＴＮＦによる４時間の処理を行ったことを示す。以下の細胞について試験を行 った。 ＦＳ−４：正常なヒト２倍体包皮繊維芽細胞ＧＭ−６３７：　ＳＶ４０で形質転 換した２倍体繊維芽細胞系ＬＩ９３７　：細網肉腫からのヒトマクロファージ様 細胞系Ａ６３７　：ヒト横紋筋肉腫細胞系 ＨＵＶＥＣ：ヒト請静脈内皮細胞 Ａ３４９　：ヒト肺癌細胞系 Ｃｏ１ｏ２０５：ヒト大腸腺癌細胞系 ＨＴ２９：ヒト大腸腺癌細胞系 ＭＥＬ：　ＳＫ−ＭＥＬ−１９、皮膚悪性黒色腫細胞系図１２は、繊維芽細胞と 形質転換繊維芽細胞系におけるＴＳＧ−６ｍＲＮＡのＴＮＦによる誘導のノーザ ンプロット分析を示す、ＴＮＦ　（２０ｎｇ／ｍｌ）を融合性細胞に添加した。 全ＲＮＡを抽出してノーザンプロット分析にかけた。 ＦＳ−４８およびＦＳ−４９は異なる提供者からの正常なヒト２倍体包皮繊維芽 細胞である。ＷＩ−３８は正常なヒト２倍体胎児肺繊維芽細胞系である。ＷＩ− ３８ＶＡ１３は５Ｖ−４０で形質転換したＷｌ−３８細胞系である。ＦＳ−４（ ＳＶＩ）、ＦＳ−４（ＳＶ２）およびＦＳ−４（ＳＶ３）は、前記ＳＶ４０巨大 Ｔ抗原をコードするＤＮＡを含むｐＳＶ３−ｎｅｏプラスミドでのりボフエクジ ョンによってイモータライズ（ｉｍｍｏｒｔａｌ　ｉ　ｚｅｄ）されたＦＳ−４ 細胞である。 図１３は、ＦＳ−４細胞または形質移入したＧＭ−６３７細胞の無血清培養の濃 縮上演のウェスターンプロットを示す６図Ａでは、イムノアフィニティークトマ トグラフィーによって精製された抗ＴＳＧ−６抗体を用いてバンドを展開した。 図Ｂでは、同じウサギから採取したプレイミューン（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）血 清を同様に精製したものでバンドを展開した。 レーンｌ：予め染色した分子量標準体 レーン２　：　ｐＲ３Ｖｎｅｏ　（ＧＮ４）で形質移入したＧＭ−６３７細胞の 上清レーン３　：　ＴＳＧ−６ｃＤＮＡ　（ＧＳＶ−Ｌ５）で形質移入したＧＭ −６３７細胞の上清 レーン４：未処理ＦＳ−４細胞の上清 レーン５　：ＴＮＦ　（２０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間誘導したＦＳ−４細胞の上 清レーン６：ビオチン化した分子量標準体図１４は、ＴＳＧ−６蛋白質をＧＳＶ −１５細胞の培養上演中に検出することが出来るが、細胞ライゼート中には検出 することが出来ないことを示すウェスターンプロット図である。ＴＳＧ−６ｃＤ ＮＡによって形質移入したＧＭ−６３７細胞（ＧＳＶ−Ｌ５細胞）の無血清培養 の上演および対照用に形質移入したＧＳＶ−ｎｅｏ細胞の上清を１００倍に濃縮 した。また、ライゼートを調製するために、細胞を５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液 中で直接溶解した。これら試料は親和性精製した抗ＴＳＧ−６抗体を用いてウェ スターンプロット分析を行った。 レーンｌ：予め染色した分子量標準体 レーン２：ＧＳＶ−ｎｅｏ細胞の濃縮した上清レーン３　：　ＧＳＶ−Ｌ５細胞 の濃縮した上清レーン４：ＧＳＶ−ｎｅｏ細胞のライゼートレーン５　：　ＧＳ Ｖ−Ｌ５細胞のライゼート図１５は、セファローゼに結合したヒアルロン酸（Ｈ Ａ）にＴＳＧ−６蛋白質が結合していることを示すウェスターンプロット図であ る。ＧＳＶ−Ｌ５細胞（無血清）の濃縮上漬け、バッチ式で、対照用のセファロ ーゼ（ＤＥＣで活性化し、酢酸でブロックした）（レーンｌ、２）またはＩＩＡ −セファローゼ（レーン３．４）のいずれかで培養した。溶出液（レーン２．４ ）と同様に上清（レーンｌ、３）も抗ＴＳＧ−６抗体を用いたウェスターンプロ ットによって分析した。 レーン１：対照用セファローゼに吸収させた後の上清レーン２：対照用セファロ ーゼからの溶出液レーン３：ＨＡ−セファローゼに吸収させた後の上清レーン４ ：ＨＡ−セファローゼからの溶出液図１６は、ヒアルロン酸（ＨＡ）−セファロ ーゼカラムから溶出したＴＳＧ−６蛋白質のウェスターンプロット分析を示す、 １０％のウシの胎児の血清を用いた培養液で培養したＧＳＶ−Ｌ５細胞の濃縮し てない上清をＨＡ−セファローゼカラムに吸収させ、ｐＨ８，５の高濃度含塩緩 衝液であるトリス−ＨＣｌで溶出した。溶出液は親和性精製した抗ＴＳＧ−６抗 体を用いたウェスターンプロットによって分析した。 図１７は、軟骨の軟骨細胞におけるプロテオグリカンの放出へのＴＳＧ−６蛋白 質の関わりについての仮説モデルを示している。 発明の好適な態様の詳細な説明 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によってヒトＦＳ−４繊維芽細胞中で活性化された多く の遺伝子は、本発明によってｒＴＮＦ−刺激遺伝子」　（以下においてＴＳＧと 略する。）と命名された。そのような遺伝子、右よびそれらがコードする蛋白質 及び糖蛋白質が、より一般的にはＴＮＦ、ＩＬ−１およびある場合にはインター フェロンを含むサイトカインによって誘導される。蛋白質、ペプチド断片などの 機能性誘導体（ｆｎｃｔｉｏｎａｉ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）および蛋白質に対 する抗体が、そのようなサイトカイニンの活性または不活性が疾病と病態生理学 に関連する状態とに対する処置および総断に対する重要な多くの方法において、 有益である。そのような疾病として、リウマチ様関節炎、癌、および、特にグラ ム陰性バクテリアによる感染症がある０本発明は、いずれもＴＳＧ−６と称され るこれらの遺伝子のひとつとその蛋白質産生物とに関する０本発明は、ＴＳＧ− ６ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｂよび実質的に純粋な形態の蛋白質、ペプチド断片のよう な蛋白質の機能性誘導体、蛋白質に対して特異的な抗原、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ配列 よび蛋白質の産生方法、これらの分子を上述した疾病状態の診療、治療および研 究に使用する方法を提供する。 「実質的に純粋（ｓｕｂａｔａｎｔｉｌｌｙ　ｐｕｒｅ）Ｊとは、他の蛋白質、 ＤＮＡ配列、またはｍＲＮＡ配列をそれぞれ実質的に含まず、またはそれと共に 天然に通常に見出される他の汚染物を実質的に含ず、かつそれ自体天然に見出さ れない形態で存在する、本発明のいかなる蛋白質またはペプチド、またはいかな る蛋白質またはペプチドをエンコードするいかなるＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を 意味する。 「実質的に他の蛋白質を含まない」とは１本来的に関与している他の蛋白質およ び糖蛋白質の１重量ベースで少なくとも９０％以上が、また所望するときには少 なくとも９９％以上が精製除去され、それ故にそれらを実質的に含んでいないこ とを意味する。そのような精製除去は、ＴＳＧ−６蛋白質を発現しまたは含有す るその細胞１組織または液を、蛋白質精製技術たとえば、抗体たとえば蛋白質に 対して活性なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のような抗体を保持する免疫吸着剤 カラムに供することにより達成することができる。ＴＳＧ−６はヒアルロン酸に 結合するという事実により、ＴＳＧ−６蛋白質または糖蛋白質は、ヒアルロン酸 が結合している親和性カラムを使用することによって精製されることができる。 また、精製は、硫酸アンモニウム沈殿法、モレキエラーシーブクロマトグラフ法 およびイオン交換クロマトグラフ法などの標準方法の組みあわせによって、達成 されることができる。 本発明の方法は、正常のまたは突然変異のＴＳＧ−６遺伝子を同定し、または、 細胞または組織に付随された、または細胞により分泌されたＴＳＧ−６蛋白質の 存在またはその量を測定することに使用される。そのような方法は、（ａ）リウ マチ様関節炎に伴う特別のプロテオグリカン損傷に右ける炎症状態、（ｂ）グラ ム陰性バクテリア感染、および（ｃ）白血球癒着に付随する疾患に対する感受性 またはその存在の同定に使用されることができる。 一つの態様において１本発明は１元々付随しているヒト起源の不純物を実質的に 含んでいない、自然に存在するＴＳＧ−６蛋白質または糖蛋白質に関する。 本発明のＴＳＧ−６蛋白質は、生化学的にまたは物理化学的に１種々の細胞また は組織源から精製されることができる。自然に存在するＴＳＧ−６蛋白質の調製 のためには、結合組繊細胞たとえば繊維芽細胞がより好ましい、また、固相支持 体上の所望された配列のポリペプチドの合成方法および支持体からのそれらの次 の分離法は良く知られている。 ＴＳＧ−６遺伝子は単離され、または合成されることができるので、所望すると きには、ＴＳＧ−６ポリペプチド、またはその機能性誘導体は、原核生物中の哺 乳類起源の他の蛋白質または糖蛋白質、または非哺乳類性真核生物中の蛋白質ま たは糖蛋白質を実質的に含有しないで５合成されることができる１本発明によっ て意図されるように、＋＊乳類細胞たとえばトランスフェクトされたＧＭ−６７ 中で組み替え手段により産生されたＴＳＧ−６蛋白質または糖蛋白質分子は、自 然に存在する蛋白質配列またはその機能性誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｅ ｒｉｖａｔｉｖｅ）のいずれかである、自然に存在する蛋白質または糖蛋白質は 組み替え技術により産生される場合には、それは、本来的に付随する他の蛋白質 および糖蛋白質を実質的に含まずに提供される。 本発明の好ましい使用は、抗体に結合し、ヒアルロン酸に結合するなどの生物学 的活性をなお保持しているＴＳＧ−６分子の断片の、化学合成またはＤＮＡ組み 替え技術による産生である０本発明の方法のいくつかのためのより短いペプチド の有益性の中でも、（１）より大きな安定性と広汎性、および（２）より少ない 免疫原性が挙げられる。ここで議論されるように、本発明におけるＴＳＧ−６蛋 白質またはペプチドは、たとえば免疫原性の低減、溶解度の増進または出産の強 化、または浄化（ｅ　ｌ　ｅａｒａｎｃｅ）または分解変質の阻止などの薬剤設 計の目的のためにさらに修飾される（ｍｏｄ　ｉ　ｆ　ｉ　ｅｄ）ことができる 。 また、ＴＳＧ−６蛋白質、およびここに述べられた全ての使用のための同様な生 物的活性を有するＴＳＧ−６蛋白質の機能性誘導体の可溶化形態も、本発明の範 囲内に含まれる。ＴＳＧ−６転写から誘導されたＴＳＧ−６の全ての活性化体お よびＴＳＧ−６活性を有する全ての突然変異蛋白質もまた本発明の範囲内に含ま れる。 機能性誘導体とは、ＴＳＧ−６の［断片」、「突然変異体Ｊ、「類似体（Ａｎａ ｌｏｇ）Ｊまたは「化学的誘導体」を意味する０機能性誘導体は、本発明にした がってその有用性を発揮するＴＳＧ−６の官能性を少なくとも有する部位を保持 する。 ＴＳＧ−６蛋白質の「断片」は、分子のいずれのサブセットすなわちより短いペ プチドである。 ＴＳＧ−６の「バリアント」は、ペプチド全体またはＴＳＧ−６の断片のいずれ かに実質的に類似の分子を指す、バリアントペプチドは、当業者に公知の方法を 使用してバリアントペプチドの直接化学合成により都合良く調製されることがで きる。 また、ペプチドのアミノ酸配列バリアントは５合成されたペプチドをコードする ＤＮＡ中の突然変異によって調製されることができる。そのようなバリアントは 、たとえば、アミノ酸配列内の残渣かもの脱離、または挿入、または置換を含む 。脱離、挿入および置換のいかなる組みあわせもまた、最終コンストラクト（ｃ ｏｎｓ　ｔｒｕｃ　ｅ）が所望の活性を有するという条件下で、その最終コンス トラクトに到着するように行われる。自明なこととして、バリアントペプチドを コードするＤＮＡ中で発生するであろう突然変異は、読み取り枠を変えてはなら ず、そして好ましくは、第二次ｍＲＮＡを生成することのできる補足的な領域を 生成しないであろう（参照、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃ− ａｔｉｏｎ　Ｎｏ、ＥＰ７５，４４４）。 をコードするＤＮＡ中におけるヌクレオチドの部位限定的（ｓ　ｉ　ｔｅ−ｄｅ ｒｅｃｔｅｄ）突然変異生成、それによってバリアントをコードするＤＮＡを生 成し、その後に組み替え細胞培地中でＤＮＡを発現することにより調製される。 バリアントは典型的には、非バリアントペプチドと同様の、定性的生物学的活性 を示す。 一般には、ここにおいて部位限定的突然変異は、関連するペプチドをコードする ＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得ることにより達成され る。所望された突然変異配列を有する糖蛋白質プライマーが、たとえばｒＣｒｅ ａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＬＪＳＡ）７５ 　：　５７６５　（１９７８）Ｊの方法によって、一般的に合成的に調製される 。このプライマーは、その後、ベクターを有する一本鎖蛋白質配列でアニールさ れ、およびＥ、Ｃｏ１１ポリメラーゼ　■　フレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片のよ うなりＮＡ合成に供されて突然変異を有する鎖の合成が完成する。そのように２ 第二の鎖中の突然変異した配列が、所望された突然変異を発生させる。このヘテ ロ二本鎖は、その後適当な細胞を形質転換するために使用され、そして、突然変 異配列配置を有する組み替えベクターを含むクローンが選択される。この突然変 異した蛋白質領域は、蛋白質産生のための適当なベクター、一般には、適当な宿 主の形質転換のために用いられることのできるその種の発現ベクターで除去され および置き換えられることができる。 また１通常のまたはバリアントＴＳＧ−６蛋白質をコードするＤＮＡは、相同的 組み替え技術によって改変されることができる。その相同的組み替え技術は、タ ーゲットとする遺伝子が転写活性遺伝子内で突然変異を誘発し、または突然変異 を修正するための、過去数年間の内に発達した技術である（参照、Ｋｕｃｈｅｒ ｌａｐａｔｉ、　Ｌ二旦エエ１旦　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｍ。 １、Ｂｉｏｌ、ユ旦：３０１　（１９８９））、相同的組み替え技術は、補乳類 ゲノムの特異な領域に特別な突然変異を誘起するための方法として（参照、Ｔｏ ｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４４＋４１９−４２８．１９８６；Ｔｈｏｍ ａＳおよびＣａｐｐｅＣｈｉ、Ｃｅｌ　ｌ　ｌ１：５０３−５１２　（１９８７ ）；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｓ、Ｓ ｃｉ。 址旦Δ　８５　：　５８３−８５８７　（１９８８）’）、または欠損遺伝子内 で特別な突然変異を修正するための方法として（参照、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３旦０　：　５７６−５７８　（１９８７）　） 発達した。相同的組み替えについての上記引用の内容はそれを参照することによ ってこの明細書中に組み入れられる。 末端挿入の例は、組み替え体宿主から成熟したペプチド分子の分泌を促進するた めに、異形であろうと相同であろうと、ペプチド分子のＮ末端にシグナル配列を 融合することを含む。 バリアントの他のグループは、ペプチド分子中の少なくとも１個の、好ましくは 唯一のアミノ酸残渣が除かれ、そして異なる残渣がその場所に挿入されたもので ある。そのような置換が好ましくは、ペプチド分子の特性を細かく修飾する（ｍ ｏｄｕｌａｔｅ）ことが望まれるときに以下のリストに従って、行われる。 機能的な、または免疫学的な特性における実質的な変化が、上記リストに右ける ａｌ換よりもより保存的でない置換を選択することにより、すなわち、（ａ）置 換の領域におけるペプチドバックボーンの構造たとえばシート構造または螺旋構 造、（ｂ）目標サイトでの分子の電荷または疎水性、または（ｃ）　ＩＩＮ鎖の 嵩高さを維持する効果において著しく相違する残基を選択することにより１作り 出される。一般に実質的な変化を生起すると期待される置換は、（ａ）グリシン および／またはプロリンが他のアミノ酸によって置換されるか、または削除され るか。 または挿入されこと；　（ｂ）親木性残基たとえばセリルまたはスレオニルが疎 水性残基たとえばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、または アラニルのために（またはそれによって）置換されること；　（Ｃ）システィン 残基がいかなる他の残基のために（またはそれによって）置換されること：　（ ｄ）電電的陽性の側鎖を有する残基たとえばリシル、アルギニルまたはヒスチヂ ルが電気的陰電荷を有する残基のために（またはそれによって）置換されるとと ；または（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基たとえばフェニルアラニンがそのような 嵩高い側鎖を有しない残基たとえばグリシンのために（またはそれによ）て）Ｗ 換されること、である。 たいていの削除および挿入、ならびに特に置換は、ペプチド分子の特性に急激な 変化をもたらすと期待されない、しかしながら、置換、削除または挿入の正確な 効果をそれを行うに先立って予期することが困難であるとき、当業者は、その効 果が日常的なスクリーニング分析法により評価されるであろうと認識するであろ う、たとえば、ＴＳＧ−６バリアントが１部位特異的な（ｓ　ｉ　ｔｅ−ｓｐｅ ｓｉ　ｆ　ｉ　ｃ）突然変異生成またはＴＳＧ−６でコードする核酸の相同的組 み賛え、組み替え細胞培地中でのバリアント核酸の発現、および要するときには 、細胞培地からの精製たとえば抗体を含有するカラム上におけるイムノアフィニ ティー吸着によって、典型的に作られる。 ＴＳＧ−６蛋白質の「類似体」は、分子全体またはその断片のいずれかと実質的 に同様の非天然の分子である。 ５Ｇ−６蛋白質の「化学誘導体」は１通常は蛋白質の一部ではない付加的な化学 的部分を含有する。ペプチドの共有結合性修飾が本発明の範囲内に含まれれる。 そのような修飾が、ペプチドの標的アミノ酸残基と、選択された側鎖または末端 残基と反応することのできる有機誘導剤と反応させることにより分子中に導入さ れることができる。 システイニル残基が、もっとも一般的にα−八へアセテート（右よび相当するア ミン）だと＾ば２−クロロ酢酸、またはクロロアセトアミドと反応してカルボキ シメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基は またプロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロ ピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ −２−ピリジル　ジスルフィド、メチル　２−ピリジル　ジスルフィド、ｐ−ク ロロ安息香酸水銀塩、２−クロロマー上エリニトロ二トロフェノール、またはク ロロ−７−二トロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘 導される。 ヒスチジル残基が、ｐＨ５，５〜７．０でジエチルプロカーボネート（ｄ　ｉ　 ｅｔｈｙ　ｌ　ｐｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）との反応によって誘導される。なぜ なら。 この試薬はヒスチジル側鎖に比較的に特異的であるからである。ｐ−ブロモフェ ナシル　プロミドはまた、反応がｐＨ６，０でＯ，ＩＭのカコジル酸ナトリウム で好適に達成されるから、有益である。 リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応 する。これらの試薬による誘導は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有す る。α−アミノ基含有残基を誘導するための他の適当な試薬は、メチル　ピコリ ンイミデートなとのイミドエステル；ビリドキサルホスフエート、ビリドキサル ；りロロボロハイドライド：トリニトロベンゼンスルホン酸；０−メチルイソウ レア：２．４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼで触媒されたグリオ キサレートとの反応を含む。 アルギニル残基が、一つまたはいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオ キサール、２，３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオン、Ｐ５よびニ ンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残酸の誘導には、グアニジ ン官能基の高いｐＫａのために、反応がアルカリ条件下で行われることを要する 。さらに、これらの試薬はアルギニンε−アミノ基と同様にリシンの基と反応す ることができる。 チロシル残基の特異な修飾は、特別なラベルをチロシル残基に芳香族ジアゾニウ ム化合物またはテトラヒドロメタンとの反応によって導入する特別な興味をもっ て、それ自体広汎に研究されてきた。もっとも一般的には、Ｎ−アセチルイミジ ゾル（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ　１ｍ１ｄｉｚｏｌ）およびテトラニトロメタンが。 ０−アセチル　チロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するために使 用される。 カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）が、カルボジイミド（Ｒ’ 　−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’　）たとえばｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリニ ル−（４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エチル−３−（４−アゾニア−４ ，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって１選択的に修飾され る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基が、アンモニウムイオンとの反 応によって、アスパラギニルおよびグルタミル残基に転換される。 グルタミニルおよびアスパラギニル残基がしばしば脱アミノ化されて相当するグ ルタミルおよびアスパルチル残基になる。また、これらの残基は温和な酸性条件 の下に脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態が本発明の範囲内にあ る。 二官能性試薬による誘導が、水不溶性支持マトリックスまたは他の巨大分子担体 にペプチドを架橋させるために役立つ、一般的に使用される架橋剤には、たとえ ば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド 、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド　エステルたとえば４−アジドサリシリツク酸 とのエステル、たと＾ば３，３°−ジチオビス（スクシン−イミジルプロピオネ ート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモニ官能性イミドエステル 、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド を含む。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートの ような誘導試薬が、光の存在下に架橋を形成することのできる光活性な中間体を 生成する。また、シアノーゲン臭素活性炭水化物（ｃｙａｎｏｇｅｎ　ｂｒ。 ｍ１ｄｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅｓ）のような反応 性水不溶性マトリックス右よびＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ５３．９６９，２８７ ．３，６９１，０１６．４，１９５，１２８．４，２４７，６４２．４，２２９ ．５３７および４，３３０，４４０に記載された反応性基質ｔ！ｓ、蛋白質の固 定に用いられる。 他の修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水 酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメ チル化（参照、Ｔ、Ｅ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ上５ｔｒｕｃｔｕ ｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ　Ｐｒｏ　ｅｒｔｉｅｓ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍ ａｎ　＆　Ｃｏ、、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ７９〜８６　（１９８３ ））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびある場合にはＣ−末端のカルボキシ ル基のアミド化を含む。 そのように誘導された部分は、溶解性、吸着性、生物学的半減期などを改善する ことができる。その部分は、また、蛋白質の好ましくないいかなる副作用をも除 き、または弱めることができる。そのような効果をもたらすことのできる部分５ ｔｏｎ、ＰＡ　（１９８０）に開示されている。 ＤＮＡの組み替え技術の一般原理を発表している基準参照的研究として、Ｗａｔ ｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　。 ｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　ｒおよび■、Ｔｈｅ　Ｂｅｎｌａｍｉ ｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、、ｐ ｕｂｌ　１ｓｈｅｒ、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ　（１９８７）；Ｄａｒｎｅ ｌ　ｌ、Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ 　。 ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、Ｉｎｃ、、ｐｕｂｌｉ ｓｈｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９８６）；Ｌｅｗｉｎ、Ｂ、Ｍ、。 Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｌｙ　＆　５ｏｎｓ、ｐｕｂｌｉｓｈｅ ｒｓ、Ｎｗｅ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、（１９８５）；Ｏｌｄ、Ｒ，ｗ、、　ｅｔ　 ａｌ、、Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ： Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉ ｎｚ、２ｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｌｎ ｉａ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｕｂｌ　１ｓｈｅｒ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ　（１９８ １）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、ＮＹ　（１９８９）がある、これらの参照文献の内容は、これによってこれ を参照することによりこの明細書中に組み入れられる。 「クローニング」は、特別な遺伝子または他のＤＮＡをベクター分子にインサー トする生体外組み替え技術の使用を意味する。所望の遺伝子を成功裡にクローニ ングするために、ＤＮＡ断片を発生させ、その断片をベクター分子に結合し、複 合ＤＮＡ分子をそれが副生することのできる宿主細胞中に導入し、Ｊ３よび受容 体宿主細胞から目標遺伝子を有するクローンを選択する方法を用いることが必要 である。 ｒｃＤＮＡＪは、ＲＮＡ依ｔ＃ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用により ＲＮＡ鋳型から産生された相補的またはコピーＤＮＡを意味する。このような「 ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクター中に運び込まれた目的とするＲＮ Ａ分子に相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。 ｒｃＤＮＡライブラリー」は、生物の全体的に発現可能なゲノムからなるｃＤＮ Ａインサートを含組み替えＤＮＡ分子の集積を意味する。そのよりなｃＤＮＡラ イブラリーは、当業者に公知の方法およびたとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（同上） に記載された方法により調製されることができる。一般に、ＲＮＡは、特別な遺 伝子をクローニングすることが望まれるその生体細胞から最初に単離される。 本発明の目的に取って好ましいのは哺乳類、より好ましくはヒトの細胞株である 。 ＴＳＧ−６配列の部分を示すオリゴヌクレオチドは、相同遺伝子の存在をスクリ ーニングするために、およびそのような遺伝子をクローニングするために有効で ある。そのようなオリゴヌクレオチドを合成するための技術が、Ｗｕ、Ｒ。 ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ　、Ｎ１ｃ１．Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉ。 上、ス１　：１０１−１４１　（１９７８）に開示されている。 遺伝子コードが退化するので、１以上のコドンが特別のアミノ酸をコードするた めに使用されることができる（参照、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、Ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｔｏｌｏ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ、４ｔｈ　Ｅｄ、、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、Ｍｅｎｌｏ　Ｐ ａｒｋ、ＣＡ　（１９８７））。遺伝子コードを使用することにより、−または それ以上の異なるオリゴヌクレオチドが同定されることができる。そして、それ らの各々はアミノ酸をコードすることができる。特別なオリゴヌクレオチドが現 実のｘｘｘをコードする事実上の配列からなるであろうという見込みが、異常な 塩基対関係と特別なコドンが真核性細胞中で（特別なアミノ酸をコードするため に）実際に使用されるその配列とを考慮することにより、推定されることができ る。そのような［コドン使用頻度則Ｊ　（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｒｕｌｅＳ ）が、Ｌａｔｈｅ、Ｒ，ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、、ｌ１：　 ｔ−ｔ２　（１９８５）に開示されているｅ　Ｌ　ａ　ｔ　ｈ　ｅの「コドン使 用頻度則」を使用することにより、ＴＳＧ−６配列をコードすることのできる「 もっとも可能な」ヌクレオチド配列を有する。単一のオリゴヌクレオチドまたは 一組のオリゴヌクレオチドが同定される。 しばしばアミノ酸配列がたった一個のオリゴヌクレオチドによりコードされるこ とができるにもかかわらず、しばしばアミノ酸配列がいかなる一組の同様なオリ ゴヌクレオチドによりコードされることができる０重要なことに、この−組の全 ての構成員が、ＴＳＧ−６ペプチド断片をコードすることのできるオリゴヌクレ オチドを含み、および、そのように、ペプチド断片をコードする遺伝子のように いくつかのオリゴヌクレオチド配列を潜在的に含んでいるのに、その−組の構成 員の一個だけが、遺伝子のヌクレオチド配列と同定されるヌクレオチド配列を含 有する。その構成員が一組の中に存在し、およびその−組の中の他の構成員の存 在下においてさえもＤＮＡとハイブリッドすることができるから、蛋白質をコー ドする遺伝子をクローニングするために単一のオリゴヌクレオチドを使用するの と同じ手法で、未分画の一組のオリゴヌクレオチドを使用することができる。 ＴＳＧ−６断片をコードすることのできる理論的に「もっとも可能な」配列を含 有することのできる。オリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドが、 「もっとも可能なＪ配列または一組の配列をハイブリッドすることのできるとこ ろの相補的なオリゴヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドを同定するた めに使用される。そのような相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＴＳ Ｇ−６遺伝子（同上のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）を同定し、単離するためのプ ローブとして使用されることができる。 ＹＳＧ−６遺伝子の断片をコードすることができる（または、そのようなオリゴ ヌクレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドに相補的である）適当なオリゴヌ クレオチドまたは一組のオリゴヌクレオチドは、（上述の手法を使用して）同定 され１合成され、右よび、ＤＮＡに対し、またはより好ましくは、ＴＳＧ−６遺 伝子を発現することのできる細胞たとえばＴＮＦ処理ＦＳ−４細胞から得られた ｃＤＮＡに対し、公知の手段によりハイブリッド形成される。 配列をコードする「もっとも可能なＪＴＳＧ−６蛋白質に相補的な一本鎖オリゴ ヌクレオチド分子は、当業者に良（知られた手法を使用して合成されることがで きる（参照、Ｂｅｌａｇａｊａ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍｌ　 ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎ１ｅｒｌｉｃｈ、Ｄ、Ｐ、。 ｅｔ　ａｔ、、Ｅｄｓ、、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、Ｎｙ　（１９７６）；Ｗｕ、 Ｒ、，５ｃｉｅｎｃｅ　２０３：６１４−６２５　（１９７９））、さらに、Ｄ ＮＡ合成が、自動合成を使用して達成されることができる。核酸ハイブリダイゼ ーション技術は、同上のＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＨａｙｍｅｓ、Ｂ、Ｄ、ら によって開示されている（Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａ ｔｉｏｎ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　ｐＲＥＳＳ、Ｗ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９８５）参照）、その引用文献は、それを参照す ることによりこの明細書の内容に組み込まれる。そのような技術または上記され た同様の技術によって、ヒト　アルデヒド脱水素酵素（参照、Ｈｓｕ、Ｌ、Ｃ。 、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：３７ ７１−３７７５　（１９８５）のために、フィブロネクチン（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｓ 、、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｂｉｏｌ、Ｏｒ　ａｎ、Ｊ、４：２５１９−２５２ ４　（１９８５））のために、ヒトエストロゲン受容体遺伝子（Ｗａｌｔｅｒ、 Ｐ、、ｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉエ　旦旦Ａ 　旦：　７８８９−７８９３　（１９８５））のために、組織型プラスミノーゲ ン活性化体（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３０１　：２ １４−２２１　（１９８３））のために、およびヒト胎盤のアルカリホスファタ ーゼに相補的なりＮＡ　（Ｋａｍ、Ｗ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３０１： ２１４−２２１　（１９８３））のために遺伝子を成功裡にコードすることがで きる。 ＴＳＧ−６遺伝子をクローニングする別の方法において、発現ベクターのライブ ラリーが、ＤＮＡ、好ましくは、（ＴＳＧ−６を発現することのできる細胞たと えばＴＮＦ処理したＦＳ−４細胞からの）ｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニ ングすることにより調製される。それからライブラリーが、抗ＴＳＧ−６抗体に 結合し、およびＴＳＧ−６蛋白質またはペプチドまたはその断片と同じアミノ酸 配列を有するポリペプチドをコードすることのできるヌクレオチド配列を有する 蛋白質を発現することのできる構成員のためにスクリーニングされる。この態様 において、ＤＮＡまたはより好ましくはｃＤＮＡが、ＴＳＧ−６蛋白質を発現す ることのできる細胞から抽出され、およびそれから精製される。精製されたＣＤ ＮＡは、（剪断、エンドヌクレアーゼ消化等により）切断され、ＤＮＡ断片また はＣＤＮＡ断片のプールが形成される。このプールからのＤＮＡ断片またはＣＤ ＮＡ断片は、その後、各構成員が単一にクローン化されたＤＮＡ断片またはＣＤ ＮＡ断片を有する発現ベクターのゲノムライブラリー（ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｉｂ ｒａｒｙ）を産生するために、発現ベクター中でクローニングされる。 「ベクター」は、その中へＤＮＡ断片がインサートされまたはクローン化される プラスミドまたはバクテリオファージから誘導されたＤＮＡ分子である。ベクタ ーは、−またはそれ以上の制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）を有 し、クローニングされた配列が再生産される特定の宿主または伝達体生物中で自 立的複製を行うことができる。 「発現ベクター」は、（適当な転写調節配列および／または翻訳調節配列の存在 のために）ベクター中でクローンされたＤＮＡ　（またはｃＤＮＡ）分子を発現 し、およびそれによってポリペプチドまたは蛋白質を生産することのできるベク ターである。クローニングされた配列の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞 中に導入されるとき、発生する。もし原核性発現ベクターが用いられるならば、 適切な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することのできるいかなる原核 細胞であっても良く、また、もし真核性発現ベクターが用いられるならば、適切 な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することのできるいかなる真核細胞 であっても良い。重要なことに、真核性ＤＮＡが介在配列を有しているので、か つ、そのような配列が原核細胞中で正確に反応することができないので、原核性 ゲノム発現ベクターライブラリー（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｏｍｉｃｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）を生産するためにＴＳＧ−６を発現するこ とのできる細胞からｃＤＮＡを用いることが好ましい＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製 し、およびゲノムライブラリー（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｌ　１ｂｒａｒｙ）を生産す るためのプロセスはＳａｍｂｒｏｏｋらの同上の文献に開示されている。 ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ９分子の「機能性誘導体」は、ＴＳＧ− ６蛋白質の「断片」または「バリアント」をコードするポリヌクレオチド分子を 意味する。それは、相補的ポリヌクレオチド分子でハイブリッドすることのでき るような機能を保持する化学的誘導体であり得る。ポリヌクレオチド、またはオ リゴヌクレオチドのような化学誘導体は、核酸融合検定（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃ ｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ）を通じてＴＳＧ−６配列を 検出する分子プローブとして有益である。 本発明のＴＳＧ−６蛋白質またはその機能性誘導体をコードするＤＮＡ配列は、 平滑末端または付着末端による連結、望ましくない結合を避けるための適当なア ルカリホスファターゼ処理としての相補末端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ　１ｎｏｆ 　ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）、および適当なりガーゼによる結合を含む従来 の技術に従ってベクターＤＮＡで組み変えられることができる。そのような操作 技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの同上の文献に開示されているし、また当業者に良 く知られている。 ＤＮＡのような核酸分子は、もし転写調節情報名よび翻訳調節情報を有する核酸 配列を有し、かつそのような配列がポリペプチドをコードする核酸配列に「作用 的に結合」されているならば、「発現可能である」と称される。操作的な結合は １発現されようとする調節ＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列が遺伝子発現を可能にす る方法で結合されているところの結合である。遺伝子発現に要求された調節領域 の正確な特徴は生体により変化しているが、一般的にはプロモータ領域を含む、 そしてそのプロモータ領域は、原核生物中では、ＲＮＡに転写されるときには蛋 白質合成の開始のシグナルとなるであろうＤＮＡ配列と、プロモータ（それはＲ ＮＡ転写の開始に間する。）との両方を含むプロモータ領域を含む、そのような 領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピングボックス、ＣＡＡＴ配列等の転 写上よび翻訳の開始と共に含まれた５°非コ一ド配列を含む。 蛋白質をコードする遺伝子配列に対する非コード領域３°は、上述の方法により 得られることができる。この領域は、ターミナーション右よびポリアゾニレ−ジ ョンのような転写末端調節配列のために保持されることができる。このように蛋 白質をコードするＤＮＡ配列に自然に隣接する３°領域を保持することにより、 転写終了シグナルが提供されることができる。転写終了シグナルが発現宿主細胞 中で十分に機能的でないときには、宿主細胞中で機能的な３°領域が置換されて も良い。 一方の配列で始まり他方の配列に拡張されて行き、二つの配列が同じＲＮＡ上に 転写され、またはＲＮＡ転写が行われるという有様で核酸分子の二つの配列が互 いに結合されているときには、核酸分子の二つの配列が「作用的に結合された」 と称される。このように、もしプロモータ配列で開始する転写が、作用的に結合 した第二配列のＲＮＡ転写に及んで行くようならば、プロモータ配列とＤＮＡま たはＲＮＡのいかなる他の第２の配列とのような二つの配列が、作用的に結合さ れている０作用的に結合するために、二つの配列が直ちに互いに隣接している必 要はない。 プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、および作用的に結合 した核酸配列の転写を促進することのできる二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であ る。ここで使用されたように、「プロモータ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによ って転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖上に見出されるところの、プロモータの 配列である。「プロモータ配列相補体Ｊ　（ｐｒｏｍｏｔｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）は、核酸分子である。そしてその核酸分子の配列は 「プロモータ配列」に相補的である。このために、−水銀となりだ「プロモータ 配列相補体」に隣接するプライマーＤＮＡまたはＲＮＡの拡張（ｅｘｔｅｎｓｉ ｏｎ）または「プロモータ配列」の拡張によって、もしその拡張が「プロモータ 配列」または「プロモータ配列相補体」に沿って進行するならば、二重鎖分子が 産生される。この機能性プロモータは、「プロモータ配列」を有する二重鎖分子 のその鎖（右よび「プロモータ配列相補体」を有する分子の鎖ではなくて）に作 用的に結合されるところの、核酸分子の転写を指示するであろう。 あるＲＮＡポリメラーゼは、そのようなプロモータに対して極めて大きな特異性 を示す、バクテリオファージＴ７．Ｔ３および５Ｐ−６のＲＮＡポリメラーゼが 特に良（特徴付けられ、大きなプロモータ特異性を示す、これらのポリメラーゼ の各々に対して特異的であるプロモータ配列は、また、二重鎖ＤＮＡの鋳型の二 重鎖の一本だけを使用つまり転写するポリメラーゼを指揮する。いずれの鎖が転 写されるかの選択は、プロモータ配列の配向によって決定される。この選択は、 ＲＮＡはヌクレオチド５゛−リン酸基の３°−水酸基末端に付加することにより 酵素的に重合されるから、転写の方向を決定する０本発明のプロモータ配列は、 原植生物右よび真核生物、またはウィルスに右ける配列であっても良い、適切な プロモータは抑制性（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）、または、より好ましくは構成 性（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）である０強いプロモータが好ましい。 本発明は、真核性の発現が好ましいにもかかわらず、原核細胞または真核細胞の いずれかにおけるＴＳＧ−６蛋白質（またはその機能性誘導体）の発現を含む。 好ましい原核性宿主は、大腸＠　（Ｅ、Ｃｏ　ｌ　ｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌ ｌｕＳ）、ストレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア（Ｓｅ ｒｒａｔｉａ）、等を含む、もっとも好ましい原核性宿主はＥ、Ｃｏ１１である 。他の腸内細菌たとえばサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｅｎｅｌｌａ　 ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉ　ｕｍ）またはセラチアマルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉ ａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および種々のシュドモナス種が、使用されることが できる。原核性宿主は、発現されたプラスミド内で複製単位上よび制御配列に適 合性を有していなければならない。 ＴＳＧ−６蛋白質は、原核性細胞（たとえばＥ、Ｃｏｌ　ｔ、Ｂ、サブチリス、 シェードモナス、ストレプトマイセス等）中で、それ自身によりまたは蛋白質融 合の部分としてのいずれかで発現されることができる。融合蛋白質としての発現 につき、それは、原核性蛋白質に、適切な読み取り枠中で結合されなければなら ない。好ましい融合蛋白質の「パートナ−」は、Ｅ、Ｃｏ１１のｍ蛋白質、また はバクテリオファージ蛋白質たとえばＭＳ２ファージ（以下の例を参明）の蛋白 質である。原核性宿主中でＴＳＧ−６蛋白質（またはその機能性誘導体）を発現 するためには、配列をコードするＴＳＧ−６を機能的な原核性プロモータに作用 的に結合する必要がある。コンストラクチイブ（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）プ ロモータの例として、バクテリオファージλの上ユ１プロモータ、ｐＢＲ３２２ のβ−ラクタマーゼ遺伝子の旦ユ」、プロモータ、およびｐＢＲ３２５のクロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＣＡＴプロモータ等を挙げること ができる。誘導原核性プロモータの例は、バクテリオファージλの主要右プロモ ータまたは主要左プロモータ（ＰＬおよびＰ＋＋）、Ｅ、Ｃｏ１１の１工２プロ モータ、ｒｅｃＡプロモータ、１ａｃＺプロモータ、１ａｃＩプロモータ、およ びｌ旦ユブロモータ、α−アミラーゼ（参照、Ｕｌｍａｎｎ、１．。 ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１旦１１７６−１８２　（１９８５ ）およびＢ、スブチルスの５−２８−特異的プロモータ（参照、Ｇｉｌｍａｎ。 Ｍ、Ｚ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３２：１ｌ−２０（１９８４）、バチルス のバクテリオファージのプロモータ（参照、Ｇｒｙｃｚａｎ、Ｔ、Ｊ、、Ｉｎ： Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、ＮＹ　（１９８２））、　！３よびス トＧｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２立３：４６８−４７８　（１９８６））を含む、原核 性プロモータは、Ｇｌ　ｉｃｋ、Ｂ、Ｒ，（Ｊ、Ｉｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 上：２７７−２８２　（１９７８））、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、Ｙ、（Ｂｉｏｃ ｈｉｍｉｅ　６旦：　５０５−５１６　（１９８６））、およびＧｏｔｔｅｓｍ ａｎ、Ｓ。 （Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、旦：４１５−４４２　（１９８４））によっ て良（調査されている０本発明において、もっとも好ましいプロモータはバクテ リオファージλのＰＬであり、また、蛋白質がバクテリオファージλのＰＬ温度 感受性リプレッサーの制御の下で発現されることができる（実施例を参照のこと ）。 原核性細胞の適切な発現にはまた。遺伝子コード配列を上流側に結合したリポソ ームの存在を要する。そのようなリポソーム結合部位はたとえばＧｏｌｄ。 Ｌ、ら（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、且：３６５−４０４　（１９８ １１）により開示されている。 好ましい宿主は、イースト、昆虫、菌類および生体内または組織培養のいずれか である哺乳類細胞を含む真核性宿主である。＋１１乳類細胞は、正確なひた形成 （ｆｏｌｄｉｎｇ）または正確な部位でのグリコシレージョンを含む翻訳後一時 的変異を蛋白質分子に与える。宿主として有用なは乳類細胞は、たとえばＶＥＲ ＯまたはＣＨＯなどの繊維芽細胞起源の細胞、またはたとえばハイブリドーマＳ Ｐ２１０−Ａｇ１４またはマウスの骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８などのリンパ球系 起源の細胞、！３よびそれもの誘導体を含む、もっとも好ましい宿主は、ＴＮＦ で処理してもＴＳＧ−６遺伝子を発現することのないもの、たとえばＧＭ−６３ ７、ＳＶ４０形質転換ヒト繊維芽細胞系列である。 哺乳類細胞宿主に関し、多くの可能なベクター系が、ＴＳＧ−６の発現に利用さ れることができる。広汎な転写調節配列および翻訳調節配列が、宿主の性質に応 じて用いられることができる。転写および翻訳の調節シグナルが、ウィルス系た とえばアデノウィルス、牛の乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス４０　（Ｓｉｎ ｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）などから誘導されることができる。そしてそのよう な調節シグナルは高レベルの発現を有する特別な遺伝子に付随している。また、 哺乳類発現産生物たとえばアクチン、コラーゲン、ミオシンなどからのプロモー タが使用されることができる。抑制または活性を引き起こす転写開始調節シグナ ルが選択され、その結果、遺伝子の発現が変調されることができる。温度を変化 させることにより発現が抑制され、または開始されることができるように温度感 受性であり、あるいは化学的規制（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ） たとえば代謝物を受け易い調節シグナルが重要である。 イースト細胞宿主は、それがグリコシレージョンなどの翻訳後のペプチド修飾を 引き起こすことができるという実質的な利益を与える。イースト中で所望の蛋白 質を産生ずるために使用されることのできるプラスミドの高コピー数（ｈｉｇｈ 　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ）および強いプロモータ配 列を使用するところの、多数の組み替えＤＮＡストラテジ−（ｒｅｃｏｍｂｉｎ ａｎｔ　ＤＮＡ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）が存在する。イーストは、クローン化 された哺乳類遺伝子産生物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペ プチドすなわちプレーペプチドを分泌する。 冨グルコース培地でイーストが成長したときに大量に生産された解糖酵素（ｇｌ ｙｃｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ）のためにコードする、活発に発現した遺伝 子からプロモータおよびターミネーシジンエレメント（ｔｅｒｍｉｎａｔｉ。 ｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を組み込んだ、いかなる一連のイースト遺伝子発現系をも 使用することができる。既知の解糖遺伝子は、非常に異なる転写制御シグナルを 提供することができる。たとえば、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモ ーターシグナルおよびターミネータシグナルが使用されることができる。 昆虫でのＴＳＧ−６またはその機能性誘導体の産生け、たとえば、当業者に公知 の方法によってＴＳＧ−６を発現させようと企図しているバキュロウィルスで昆 虫宿主を感染させることにより、達成されることができる。このように、一つの 態様では、ＴＳＧ−６をコードする配列はウィルス性ポリヘトリン蛋白質（Ｖｉ ｒａｌ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｐｒｏｔａｉｎ）の調節領域に作用的に結合さ れていても良い０組み替えバキュロウィルスで感染させると、培養された昆虫細 胞、または生きた昆虫そのものが、全蛋白質産生の２０〜５０％の量でＴＳＧ− ６蛋白質を産生ずることができる。生きた昆虫が使用されるときには、鱗翅目の 昆虫の幼生が、この発明による大規模のＴＳＧ−６蛋白質の生産のための、好ま しい宿主である。 上において議論されたように、真核性宿主中でのＴＳＧ−６蛋白質の発現には、 真核性調節領域の使用が要求される。そのような領域は、一般には、ＲＮＡ合成 開始を指示するに十分なプロモータ領域を含んでいるであろう、好ましい真核性 プロモータは、ＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、 、Ｎａｔｕｒｅ　Ｌｏｎｄｏｎ）２９旦：　３０４−３１０　（１９８１））； ＭＭＴＶ　ＬＴＲ＠域に付随したＲ５Ｖプロモータ：マウスメタロチオネイン！ 遺伝子のプロモータ（Ｈａｍｅｒ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 １　：　２７３−２８８　（１９８２））；ヘルペスウィルスＴＫプロモータ（ ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、、Ｃｅｌ　ｆ　３１　：３５５−３６５　（１９８２） ；イーストｇａ１４遺伝子プロモータ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｓ、Ａ、、ｅｔ　ａ ｌ、、Ｐｒ。 ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ユ旦５込上７９：６９７１−６９７５　（ １９８２）；Ｓｉ　１ｖｅｒ、Ｐ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−〇す旦ノ（Ｌ上」２：５９５１−５９５５　（１９８４） ）を含む。 広く知られているように、真核性ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳は、最初のメチオニンをコ ードするコドンで開始される。この理由のために、真核性プロモータとＴＳＧ− ６蛋白質（またはその機能性誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の結合が、 メチオニン（すなわちＡＵＧ）をコードすることのできるいかなる介在コドンを 含有していないことが好ましい、そのようなコドンの存在は、（もし、ＡＵＧコ ドンがＴＳＧ−６をコードする配列と同じ読み取り枠中にあるならば）蛋白質融 合を形成し、あるいは、（もしＡＵＧコドンがＴＳＧ−６をコードする配列と同 じ読み取り枠内にないならば）フレームシフト突然変異を招来する。 ＴＳＧ−６をコードする配列および作用的に結合されたプロモータは、直線状分 子またはより好ましくは閉鎖した共有結合型の環状分子のいずれかである非−複 製ＤＮＡ　（ＲＮＡ）分子として、原核性または真核性のいずれかの細胞中に導 入されることができる。そのような分子は自律的複製を行うことができないので 、ＴＳＧ−６蛋白質の発現が、導入された配列の一過性発現となることがある。 また、恒久的発現が、導入された配列を宿主染色体中に組み込むことにより起こ る。 一つの態様においては、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体に組み込むことので きるベクターが使用される。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定に組み込 んだ細胞か−またはそれ以上のマーカを導入することによって選択されることが でき、それによって、発現ベクターを有する宿主細胞を選択することができる。 マーカは、栄養素要求体に、抗生物質、または銅などの重金属による殺生物性に 対する耐性を与える０選択可能な標識遺伝子は発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直 接に結合されるか、あるいは、コトランスフェクシ３ン（ＣＯ−七ｒａｎｓｆｅ ｓｔｉｏｎ）による同じ細胞中へ導入されることができる。付加的要素が、蛋白 質ｍＲＮＡを結合する一本鎖の最適合成のために、必要とされても良い。 これらの要素は、転写プロモータと同様のスプライシングシグナル、エンハンサ −１および終結シグナルを含む、そのような要素に組み込まれたｃＤＮＡは、Ｏ ｋａｍｕｒａ、　Ｈ，、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、旦：２８　（１９ ８３）に記述されたものを含む。 好適な態様においては、導入された配列は、受容体宿主中の自立的複製の可能な プラスミドまたはウィルス性ベクターに取り込まれる。いかなる広汎なベクター も、この発明の目的のために使用することができる。特別なプラスミドまたはウ ィルス性ベクターを選択する重要な因子は、ベクターを有している受容体細胞が 認識され、かつベクターを有していない受容体細胞から選択されるその容易性； 特別な宿主中で所望される多数のベクターの複製；および異なる種の宿主細胞間 でベクターを「シャトル」することができることを所望されていること、である 、好ましい原核性ベクターは、大腸菌中でそれらを複製することのできるプラス ミド（たとえばｐＢＲ３２２，Ｃｏ１Ｅ１．ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡＣＹＣ１８４、 πｖｘ）を含む、そのようなプラスミドは、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同 上の文献参照）により開示されている。バチルスプラスミドは、ｐｃ１９４、ｐ Ｃ２２１、ｐＴ１２７などを含む、そのようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚ３０７ −３２９）により開示されている。適切なストレプトマイセスプラスミドは、ｐ ｌＪｌｏｌ　（Ｋｅｎｄａｌ　ｌ、に、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、１旦９：４１７７−４１８３　（１９８７））およびストレプトマイセ スバクテリオファージたとえばφＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ、に、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ 、、Ｉｎ：５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　。 ｎ　Ａｃｔｉｎｏｍ　ｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏ　、Ａｋａｄｅｍｉａｉにａ ｔｄｏ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ　（１９８６）、ｐｐ、４５−５４ ）を含む、シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎ、Ｊ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ。 、（Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、８：６９３−７０４（１９８６））およ びＩｚａｋｉ、に、（止ｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ上ｏ１．３３ニア２９−７４２（ １９７８１１により良く調べられている。 好ましい真核性プラスミドは、ＢＰＶ、ワクチニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、ＳＶ ４０．２−ミクロンサークル（２−ｍｙｃｒｏｎ　ｃｕｅｃｌｅ）等、またはそ れらの誘導体を含む、そのようなプラスミドはこの技術分野において良く知られ ている（参照、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ 、Ｓｙｍｐ、１９　：　２６５−２７４　（１９８２）；　Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、 Ｒ，。 Ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　 Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ：Ｌｉｆｅ　Ｃｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒ１ｔａ ｎｃｅ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ １ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐ、４４５−４７０　（１９８１）； Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｃｅｌ　ｌ　２旦：２０３−２０４　（１９８２）； Ｂｏｌｌｏｎ、Ｄ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｃＩＬｎ、　）ｌｅｍａｔｏｌ、 。 ｎｃｏｌ、１０：３９−４８　（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｉｎ： Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ　：Ａ　Ｃｏｍ　ｒｅｈｅｎｓｉｂｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ Ｖｏｌ、３　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、ＮＹ、ｐｐ、５６３−６０８　（１９８０））。 コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を有するベクターまたはＤＮＡ配列が発 現のために調製されると、ベクターまたはＤＮＡコンストラクトは、適切な宿ａ ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＪ　、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｆｉｅｃｔ ｉ。 ｎ）、接合（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎＪ　、プロトプラスト融合（１）ｒｏｔｏ ｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ）、　リン酸カルシウム沈殿法、およびジエチルアミ ノエヂル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンの適用などの生化学的 手段、および電気穿孔法、直接微少注入法（ｄｉｒｅｃｔ　ｍ１ｃｒｏｉｎｊｅ ｃｔｉ□ｎ）、ｊＳよび微少噴出性爆射法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　 ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４０：１５３８　（１９８８）などの機械的手段により、導入されることがで きる。 ベクターの導入後、受容体細胞が選択的媒体中で成長する。その選択的媒体は、 ベクター含有の細胞の成長のために選択される。クローニングされた遺伝子の配 列は、ＴＳＧ−６蛋白質を産生させ、またはこの蛋白質の断片を産生させる。こ れはトランスフオームされた細胞中で起こり、あるいはこれらの細胞を分化させ る。 発現した蛋白質または融合蛋白質が、単離され、および従来の条件下に、たとえ ば抽出法、沈殿法、クロマトグラフ法、アフィニティクロマトグラフ法、電気泳 動法などにより精製される。たとえば、細胞が、遠心分離法によって、あるいは 、適切な緩衝剤、リスト（ｌｙｓｅｄ）、　！３よびたとえばＤＥＡＥ−セルロ ース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸アガロース（ｐｏ　ｌ　ｙｒ　ｉ 　ｂｏｃｙｔｉｄｙｌｉｃ　ａｃｉｄ−ａｇａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイ トを使用したカラムクロマトグラフ法によって、または電気泳動法またはイムノ ブレシビテーション法によって、収集されることができる。また、ＴＳＧ−６ま たはその機能性誘導体が抗ＴＳＧ−６抗体の使用によって単離されることができ る。そのような抗体は、以下に述べられるもののいくつかである、良く知られた 方法により得られることができる。 ＴＳＧ−６またはその機能性誘導体をコードする遺伝子コンストラクト（ＣＯｎ ｓｔｒｕｃｔｓ）は、遺伝子治療に使用されることができる。病気に対して強化 された感受性を有する異常なＴＳＧ−６分子は、正常の、または修飾されたＴＳ Ｇ−６蛋白質をコードするＤＮＡでトランスフェクションされた所望の系列の細 胞（たとえば繊維芽細胞）の融合によって、融合された細胞が内生細胞集団を置 き換えるであろう条件下で、置き換えられることができる。 この発明はさらに、生殖細胞および体細胞中に、この発明におけるＴＳＧ−６蛋 白またはその機能的誘導体をコードする組換えＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮ Ａ）を持ったヒト以外の真核生物であるトランスジェニック動物（好ましくは、 マウス等のげっ歯頚）に関する。 トランスジェニック動物またはその前段階のもの（ａｎ　ａｎｃｅｓｔｏｒｏｆ 　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ）を得るためには、胚の段階で、好ましくは、単細胞で あるうちにもしくは受精卵（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ　ｏｏｃｙｔｅ）の段階、通 常８細胞期以前にＴＳＧ−６ＤＮＡを導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）する。 ここでは、［導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）Ｊという言葉は、動物のゲノム に組み込まれ（ｉ　ｎｃｏｒｐｒａｔｅ　ｗｉ　ｔｈ）、その動物中で発現する ことによって、その動物中に目的の蛋白質を存在せしめる遺伝子のことをいう。 このような遺伝子が動物の胚のゲノム中に、染色体上に組み込まれかつ発現され るように、導入される手段がいくつかある。一つの方法は、その遺伝子を自然に 胚に形質転換させ、そして染色体上の発現されつる遺伝子座にその遺伝子が組み 込まれた動物を選択する方法である。 より発現を確実にする他の一つの方法は胚中へ導入する前に、その遺伝子または その遺伝子の制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）に修飾を加える 方法である。このような方法の一つは、既に修飾した遺伝子が組み込まれたベク ターを胚に形質転換する方法である。また、他の方法は、誘起され、もしくは構 造的に活性を有するプロモーターに転写が制御される遺伝子、または一つもしく はそれ以上の塩基対の置換、欠損、付加によって活性化した遺伝子を用いる方法 である。 目的の遺伝子配列を受精卵の段階で導入すると導入遺伝子はトランスジェニック 動物の全ての生殖細胞上よび体細胞中に存在させることが確実となり、またこの ような細胞のいづれに右いても発現される可能性がある。また、初めのトランス ジェニック動物中の生殖細胞中の導入遺伝子の存在は、さらに、この動物の子孫 もこの遺伝子を全ての生殖細胞および体細胞中に持つことを意味する。 自分の体細胞および生殖細胞の一部にこの発明のＴＳＧ−６ＤＮＡを有するヒト 以外のキメラ哺乳動物、例えばトランスジェニック哺乳動物を作成する際、双実 胚における細胞の一部のみが形質転換した動物等もこの発明に含まれる。 Ｌｅｄｅｒ、米国特許第４，７３６，８６６号に記載のヒト以外のトランスジェ ニック哺乳動物を作成するための手法は、この発明のこの発明のヒト以外のトラ ンスジェニック哺乳動物を作成するための手段として用いることができる。また 、Ｐａ１ｍ１　ｔｅｒ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０ ：　４６５−９９　（１９８６）に記載のいくつかの手法も本願発明に用いるこ とができる。ＴＳＧ−６遺伝子を持った動物は、結合組繊細胞へのＴＮＦの働き によって媒介される慢性炎症性疾患の予防、克服、治療のための化合物または物 理療法の試験に用いることができる。このような試験はこの発明のトランスジェ ニック動物を用いた試験により、最適な投与量に設定することができるので、高 い精度を実現することができる。このような病気の例としては、リウマチ性関節 炎、肉芽腫性の疾患などがあるが、これらに限定されない、この発明におけるト ランスジェニック動物は細胞培養の細胞源としても用いることができる。 この発明は更に、ＴＳＧ−６蛋白質のエピトープに特異的な抗体に関する。更な る実施態様として、前記抗体は細胞中、細胞のもしくは器官の抽出物中または生 物の体液中の、ＴＳＧ−６蛋白質の検出またはその定量に用いる。 また前記抗体は、ＴＳＧ−６の活動を抑制するためにも用いることができ、それ によって、ＴＮＦに刺激された真核細胞吸着と密接な関係のある状態を防ぎ、処 置できるのみならず、ＴＳＧ−６の過剰生産または異常な生産もしくは異常な活 動と密接な関係のある疾患、例えば、リウマチ様関節炎、感染または敗血症を含 む炎症性疾患の予防と治療に用いることができる。 ここでいう「抗体」とは、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体（以下ｍＡ ｂと称するときもある。）、キメラ抗体右よび抗イデイオタイプ抗体も含む。 抗体が分子と特異的に反応することができ、それによって抗体に前記分子を結合 することができるならば、その抗体はその分子を［結合することが可能」と表現 する。「エピトープ」とは抗体によって認識され、かつその抗体に結合される構 造部位をいう、抗原決定基もしくは「抗原決定基」は、一般的にアミノ酸や糖側 鎖等の化学的に活性を有する表面の分子団より構成され、固有の電荷特性（Ｃｈ ａｒｇｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）のみならず、固有な３次元構造を も有する。 「抗原」とは、抗体が結合でき、さらには動物にその抗原に結合可能な抗体の産 生を誘起することが可能な分子または分子の構成部位をいう。 抗原は一つかそれ以上のエピトープを有する。上述した特有の反応は、抗体が高 度に選択的に、対応する抗体とのみ反応すること、そして他の抗原によって誘導 された多数の抗体には結合しないことを示す、蛋白質中のエピトープを推定する には、アミノ酸配列を視覚的に調べるか、コンピューター、例えばＪａｍｅｓｏ ｎ　ｅｔ　ａｔ、、ＣＡＢＩＯ３４：１８１−１８６　（１９８８）に記載のプ ログラム「ペプチドストラクチャー」を用いて分析すれば良い、このプログラム は生じる水素結合の位置と強さくｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ　ｖａｌｕｅＳ ）を決定でき、それによって、全蛋白質のアミノ酸配列の内、どのペプチド配列 が最も大きな免疫原性を有する可能性が高いかを、それらの潜在的２次構造に基 づいて決定するために用いることができる。このようなペプチドは、化学的に合 成することができ、また、それに代えて、組換えＤＮＡ法によって、かつ好まし く合成することができる。ＴＳＧ−６蛋白質のコンピューター分析によって、そ れぞれ分子の異なる部位より、各々１５のアミノ酸よりなる３つの配列を選択し た。これらの合成ペプチドをＮＹＵ癌センターペプチド合成研究所において合成 した。一つの配列はそのプロテオグリカンコア蛋白質、軟骨結合蛋白質、ＣＤ４ ４との高い相同性により選択されたが、他の二つの配列はＴＳＧ−６蛋白質の他 の部位に仔在し、他の公知の蛋白質との明確な相同性はなかった。キイホールリ ンベット　ヘモシアニン（ＫＬＨ）との結合（ｃｏｕｐｌ　ｉｎｇ）を容易にす るため、こらの合成ペプチド各々のＮ末端またはＣ末端にシスティン残基を付加 した。運搬体蛋白質として使うためである。Ｈａｒｔｌｏｗ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、 、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐ ｒｉｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８に記載された手法により、異なる二つの 機能を有する試薬ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロスクシンイミド　エ ステル（ＭＢＳ）を用いて、１５のアミノ酸より成るペプチド（１５ｍｅｒｓ） をＫＤＩ−（と結合させ、得られた各ペプチドーＫＬＨ？１合体によりウサギを 免疫した。それぞれ２羽のウサギを免疫し、抗体を産生させた０合成ペプチドに 対する抗体の産生の落とし穴は、産生された抗体が元の蛋白質に結合しない可能 性があることである。このため、もう一つの方法によっても抗体産生を行なった 。適度に発現するプラスミド（実施例参照）を用いて、細菌の産生する蛋白質の 融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）として、ＴＳＧ−６蛋白質を調製 した。この融合蛋白質を精製して、ウサギに接種した。このような融合蛋白質お よび合成ペプチドはいづれも、モノクロナール抗体を産生させるためにげっ歯頚 の動物に接種することができる。 ポリクロナール抗体は、抗原を接種された動物の血清由来の抗体分子の異種起源 の抗体の集合体（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）である。 モノクロナール抗体は、特定の抗原に対する実質的に同一起源を持つ抗体の集団 である。ＭＡｂｓは公知の方法により得ることができる１例えば、にｏｈｌｅｒ 　ａｎｄ　Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７　（１ ９７５）や米国特許第４，３７６．１１０号を参照、これらの抗体は、ＩｇＧ、 ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびこれらのサブクラスに属するものも含む、免疫グ ロブリンであってもよい、この発明のｍＡｂを産生ずるハイブリドーマは　１ｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ　ｖｉｖｏでも培養することができる。１ｎｖｉｖｏでの生 産がｍＡｂｓを高濃度で産生するので、現時点では、この方法が好ましい６個々 のハイブリドーマの細胞をブリスタンを与えた（ｐｒｉ　ｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍ ｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入し、目的のｍＡｂｓを高濃度に含有す る腹水を得た。腹水または培養上清より、当業者にはよく知られているカラムク ロマトグラフ法によって精製し、アイソタイプのｍＡｂ、ｒｇＭまたはＩｇＧを 得ることができる。 キメラ抗体はその異なった部位がそれぞれ異種の動物起源である分子であり。 例えばマウスの抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有す る抗体である。 キメラ抗体およびその製造方法は、この技術分野においてよく知られている（Ｃ ａｂｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８ １：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、見旦Δ　１工：　６８５−６８５５　 （１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３上２　： 　６４３−６４６　（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔ ｕｒｅ　ｌ１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎ ｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　１７１４９６（１９８５年２月１９日公開）；Ｋ ｕｄｏｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｔｏ ｎ　１８４１８７　（１９８６年６月１１日公開）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　 ａｔ、、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＃ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９　（１９８７年５月７日公開）；Ｓｕｎ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、亘ＳＡ　８４：２１４−２ １８　（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４旦： １０４１−１０４３　（１９８８））。これらの参考文献に記載の方法を参照さ れたい。 抗イデイオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に存在する固有の決 定基を認識することができる抗体である。抗−Ｉｄ抗体は、ｍ　Ａ　ｂ源である 動物と同種で同一の遺伝子型の動物（例えば、マウス系）に、そのｍ　Ａ　ｂを 免疫することにより産生させることができる。免疫された動物は免疫原としての 抗体のイディオタイプの決定基を、これらイディオタイプの決定基に対する抗体 を産生ずることにより、認識し、反応する。 抗−Ｉｄ抗体は、さらに別の動物に免疫反応を起こさせ、いわゆる抗−抗−Ｉｄ 抗体を産生させるためにも使用できる。抗−抗−Ｉｄ抗体は、抗−Ｉｄ抗体を誘 導したｍＡｂとの構造的相同性を有している。このため、ｍＡｂのイディオタイ プの決定基に対する抗体を用いることによって、同一の特性を有する抗体を産生 ずる他のクローンを見分けることができる。 このようにこの発明におけるＴＳＧ−６蛋白質に対応するｍ　Ａ　ｂ　Ｓは、例 えばＢａ１ｂ／ｃマウスなどの適当な動物をそれによって免疫することにより、 抗−Ｉｄ抗体を産生ずるに用いることができる。このように免疫されたマウスの 牌臓細胞は、抗−Ｉｄ　ｍＡｂｓを分泌する抗−１ｄハイブリイドーマの作成に 用いることができる。さらに抗−Ｉｄ　ｍＡｂは、キーホール　リンベット　ヘ モシアニン（ＫＬＨ）等の担体に結合することができ、さらに、Ｂａ１ｂ／ｃマ ウスを免疫することができる。これらのマウスの血清中には、ＴＳＧ−６蛋白質 のエピトープに特異的であるもとのｍＡｂの特性を有する抗−抗−Ｉｄ抗体が含 まれている。 「抗体」という言葉は、抗体が無傷（ｉｎｔａｃｔ）な分子のみならず、その断 片例えば、抗原に結合可能であるＦａｂ　ａｎｄ　Ｆ　（ａｂ’　）ｍなども含 めた意味である。Ｆａｂ　ａｎｄ　Ｆ　（ａｂ’　）＊断片は、無傷の抗体から Ｆｃ断片が欠失したものであり、血液循環によりより早く消失し、無傷な抗体に 比較し、非特異的な組織との結合は遥かに少ないと思われる（Ｗａｈｌ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、２４：３１６−３２５　（１９８３））。 この発明において有用なＦａｂ　ａｎｄ　Ｆ　（ａｂ’　）ｘ断片やその他の断 片は、ここで開示されている無傷な抗体についてのＴＳＧ−６蛋白質の検出およ び定量方法に適用でき、それの持つ意義は大きい。 この発明における抗体もしくはその断片は、細胞の表面または細胞内にＴＳＧ− ６蛋白質を発現した細胞を定量的に、また定性的にする検出（ａｅｔｅｃｔ）す ることができる、蛍光標識抗体と蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーもしくは蛍 光光度計との組合せよりなる免疫蛍光法によって行なうことができる。 この発明の抗体は、組織学的に、つまり免疫蛍光法または、免疫電子顕微鏡法に よるｉｎ　５ｉｔｕのＴＳＧ−６蛋白質の検出に応用できる。１ｎｓｉｔｕの検 出は、患者より組織（細胞または組織）試料を取り出し、このような組織に対し 、この発明の標識抗体を作用させることによりできる。この際、好ましくは抗体 （または断片）をこの生物学的試料に散布するか重層する。このような操作によ って、ＴＳＧ−６蛋白質を検出できるだけでなく、被験組織に右けるその分布も 調べることができる。このようなｉｎ　５ｉｔｕでの検出を目的にし、通常の゛ 技術を有するものであれば、この発明を用いて、従来の数々の組織学的手法（例 えば染色操作等）を改良することができる。 さらにこの発明の抗体は生物学的試料中の可溶性ＴＳＧ−６Ｓチー存在を検出す ることにも用いることができる。この場合には、抗体は、ＴＮＦによって誘起さ れるＴＳＧ−６に閏達する炎症性疾患、感染１敗血症やその類似の疾患の被検体 におけるＴＳＧ−６の存在または量を追跡する手段となる。 このようなＴＳＧ−６蛋白質の免疫学的検定方法は基本的に、生物体液、組織抽 出物またはリンパ球、白血球もしくは組織培養によって得られた新鮮な細胞など の生物学的試料を、ＴＳＧ−６蛋白質と結合可能で、かつ検出可能な抗体の存在 下にインキュベートする操作と、この分野において知られている数々の手段のい づれかによって、その抗体を検出する操作とを含む。 生物学的試料は１例えばニトロセルロースやその他の固体であり、細胞、細胞粒 子または可溶性蛋白質を固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）することの可能な支持体 等の層支持体もしくは担体（ここではどちらも同じ意味で用いる。）上で扱うの が良い、支持体を適当な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識されたＴＳＧ−６ 蛋白質の抗体で処理する。そして再度緩衝液で洗浄し、結合しなかった抗体を除 去する。そして、支持体に残った標識を従来の方法により検出すればよい、ここ でいう、「層支持固体もしくは担体」とは、抗原または、抗体が結合できる支持 体であればよく、特に制限なく用いることができる。 よく知られた支持体もしくは担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ レン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミレース（ａｍｙｌａｓｅ） 、修飾または非修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩（ｇａｂｂｒＯ Ｓ）および磁鉄鉱等を挙げることができる。この発明の目的のための担体の性質 は、不溶性でも良いし、ある程度までは可溶性であってもよい、この支持部材は 、結合する分子が、抗原または抗体に結合できるかぎりは、実質的にいかなる形 状を有していてもよい、冒頭に示したように球状であっても、試験管の内周面の ように円柱状であっても、さらに棒の外周面であってもよい、さらに、表面がシ ートや試験用小片（ｔｅｓｔ　５ｔｒｉｐ）のように平坦であってもよい。当業 者には、抗原または抗体を結合するのに適した他の沢山の好ましい担体が知られ 、極めて普通の実験によって同様な成果を得ることが可能である。 抗ＴＳＧ−６抗体のロフトごとの結合活性は周知の方法によって決定することが できる。当業者は極く普通の実験方法を採用することによって、操作条件や最適 な分析方法を決定することができる。 通常の分析に際し、また個々の場合において必要なときには、他の洗浄、撹拌、 振とう、濾過等の操作を加える。 ＴＳＧ−６に特異的な抗体を検出しつるように標識する方法の一つは、それを酵 素と結合して用いる酵素免疫定量法（Ｅ　Ｉ　Ａ）である、この酵素は、適当な 其質を与えることによって反応し５分光光度計や蛍光光度計により、または視覚 的に検出しつる反応物を生成する。検出可能に標識するために、用いることので きる酵素としては、マレイン酸脱水素酵素、スタフィロコッカスエンドヌクレア ーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、α−グ リ七ロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、せいようわさび過酸化 酵素、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、 β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコー ス−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等 が挙げられるが、これらに制限されない。 酵素反応に、色素または色素産生の其質を用いることによって、比色法によって 、検出することができる。また其質と反応させた場合を、同様に調製したスタン ダードと比較することによって検出することができる。 検出は他の数多くの免疫学的手法によっても検出することができる０例えば放射 性同位体でｔｌｌｌＬだ抗体または抗体の断片を用いた。放射免疫定量法（ＲＩ Ａ）によって、ＴＳＧ−６蛋白質を検出することが出来る（Ｃｈａｒｄ、Ｔ、、 −Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａ ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ＋　（Ｉｎ：Ｗｏｒｋ、Ｔ、Ｓ ｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ　Ｙ。 ｒｋ（１，９７８１この内容も本願に適用できる。）、放射性同位体はガンマカ ウンター、液体シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーによ って検出可能である。 また蛍光物質で抗体を標識することもできる。蛍光標識した抗体をある特定の波 長の光りにあてると蛍光発色により検出することができる。蛍光標識に最も多（ 用いられている化合物は、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、フィコ エリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルデヒド（ｐｈｔ ｈａ　１　ｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ ）である。 また抗体は、蛍光を発する””Ｅｕや他のランタノイド系列の金属を用いても、 検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン５酢 酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン４酢ｆｉｌ　（ＥＤＴＡ）などのキレート剤 を用いて、抗体に結合させることができる。 また、抗体は、化学発光性物質を用いても、検出可能に標識することができる。 化学発光性物質標識抗体の存在は、化学反応による発光を検出することによって 、［認することができる。特に有用な化学発光性標識物質は、ルミノール、イソ ルミノール、セロマチイックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ　 ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩。 シュウ酸塩エステルである。 また、同様に生物発光性（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）物質を用いても、抗 体を、検出可能に１ＩＩｊｌｌすることができる。生物発光は生物組織内におい て確認された化学発光の一種であり、触媒活性を有する蛋白質によってより強く 発光する。生物発光性蛋白質の存在は１発光の有無によって検出できる。標識を する目的で有用な生物発光に関する物質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよ びエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）である。 この発明の抗体は、免疫学的定量法、ｒｔｗｏ−ｓ　ｉ　ｔｅ」または「サンド イッチ」法としても知られているが、この方法にも応用することができる。典型 的な免疫学的定量法においては、多量の非標識抗体（または、抗体の断片）を固 体である担体に結合させ、検出可能にｅｌｌｌＬだ可溶性抗体を多量に添加する ことにより、固定された抗体、抗原および標識抗体の３者複合体を形成させて検 出及び／または定量を行なうことができる。 典型的で好ましい免疫学的測定法には、固定化担体に固定しである抗体に、試料 を接触させ、固定化抗体と抗原との二価の複合体を形成させることによって抗原 を試料中より「抽出」する「フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）Ｊ分析法も含まれる 。適当な時間インキュベートした後、固定化担体を洗浄し、液体試料を洗い流し 、未反応の抗原を除去する０次に未知量のｍ＊抗体（レポーター分子として機能 する。）を含有する液体に浸す、二回目のインキュベートにより、標識抗体と非 標識抗体を介して支持体に結合した抗原とを結合させた後、再度洗浄し、未反応 の標識抗体を除去した。 この発明の抗体の利用が同様に有用である他の、「サンドイッチ」分析法として は、いわゆる［同時分析法（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ａｓｓａｙ）Ｊや「逆 分析法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ａｓｓａｙ）Ｊがある。同時分析法は測定試料に同時 に、担体に固定化された抗体および標識抗体を添加する一回のインキュベート操 作を含む、インキュベート終了後、支持体を洗浄し、試料液および結合しなかっ た標識抗体を除去した。支持体に結合した標識抗体は、普通の「フォワード」サ ンドイッチ分析法で測定することができる。 ［逆分析法（ｒｅｖｅｒｃｅ　ａｓｓａｙ）Ｊでは、液状試料にまず、段階的に 標識抗体を添加した後に、適当な時間インキュベートする、次に固定化された非 ＰＪ識抗体が添加する。さらに、二回目のインキュベートを行なった後１通常の 操作により、固定層を洗浄し、試験試料の残りや未反応の標識抗体を除去する。 支持体に固定化され標識抗体は、同時分析法やフォワード分析法によりて測定す ることができる。 この発明によると、患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）より、ＴＳＧ−６蛋白質に特異的な 循環抗体を検出することもできる。上述のような、この発明の蛋白質またはその 機能的誘導体を用いた免疫学的測定法により診断が可能である。 癌患者の循環内毒素量は多く　（Ｈａｒｒｉｓ、Ｒ，１，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ Ｉ　ｉｎ、ＰＢｔｌｌ、３ヱ：　４６７−４７０　（１９８４））、特に悪液質 の高い発生率と関連のあるとものとして、知られているタイプの腫瘍を有する患 者において多い（Ｈｕｍｂｅｒ−ｓｔｏｎｅ、Ｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃ ｅｒ　旦ス：１６１９−１６２４　（１９８８））、おそらく、この高い内毒素 濃度は、腫瘍自体が原因ではなく、むしろ患者に一般的な普通の衰弱の反映であ ると考えられる０重篤な病気時に右ける。内在性細菌の内容物の排出（ｔｒａｎ ｓ　Ｉ　ｏｃａ七ｆａｎ　ｆｒｏｍ　ｇｕｔ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｉｕｓ　ｂ ａｃｔｅｒｉａ）やエンドトキシンの増加は、栄養不良に依存するものであり、 その細胞性免疫障害は悪化要因である可能性がある（Ｗｉ　１ｍｏｒｅ、Ｄ、Ｗ 、ｅｔ　ａｌ、。 Σ且り且旦工ｌ　１旦４：９１７−９２３　（１９８８））、悪液質性ガン患者 は栄養不良を起こし、また細胞性免疫の抑制が多く見られるように、内在性生物 の転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）は、高いエンドトキシン濃度を説明する ものである。ガン患者の抹消血単核細胞にはよ＜、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで高い自律 的ＴＮＦ産生が認められる（Ａｄｅｒｋａ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔｉ 　：１１９０−１１９２　（１９８５））、マクロファージ活性化因子への反応 としてのＴＮＦ産生は転移の進んだガン患者では、抑制されている。しかしガン が局部的である患者については、抑制されていない。 これらは、腫瘍細胞による単球／マクロファージの継続的な刺激によって、また 同時に腫瘍細胞自体のＴＮＦ産生によって、ガン患者においてもＴＮＦが産生さ れているという意見を支持する。ＴＮＦは他の病気を有するガン患者２２６人の 血清を調べた結果、５０％の人の血清中に検出された。これに対し、健康な人で は３％、他の病気のないガン患者では１８％であった（Ｂａｌｋｗｉｌｌ、Ｆ、 ｅｔ　ａｔ、、Ｌａｂｃｅｔ　ｉ　ｉ　：１２２９−１２３２　（１９８７）） 。 ＴＮＦｌｉｌは様々な細菌性およびウィルス性の病気によって上昇する。これら の病気にはＡＩＤＳ　（Ｌａｈｄｅｖｉｒｔａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｍｅｒ、 Ｊ。 鼠旦亘、旦５：２８９−２９１　（１９８Ｂ））、髄膜炎菌性髄膜炎や敗血症（ Ｗａａｇｅ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、（Ｌａｎｃｅｔ　土：３５５−３５７（１９８ ７））も含まれる。ラットの熱傷／感染モデルを用いた実験では、熱傷のみで感 染させていないコントロールのラットに対し、熱傷と感染の両方のラットは、全 ての個体において肝臓のＴＮＦ　ｍＲＮＡ値が上昇した（Ｍａｒａｎｏ、Ｍ、Ａ 。 ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｓｕｒ　、上２３＋　１３８３−１３８８　（１９８ ８））、また熱傷と感染を与えた動物は、より大きな代謝反応をを示した（悪液 質Ｊ、ＴＮＦが重症の敗血症への主要な仲介物であることが確認された（Ｍｉｃ ｈｉｅ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、Ｂｒ、止、旦旦しユ、工旦：６７０−６７１　 （１９８９））。 このように、ＴＮＦやＩＬ−１などのサイトカインまたは細菌の内毒素に対する 患者の反応の測定が可能であるこの発明の方法は、個々の患者の癌や感染症の持 つ衰弱化作用に対する感受性を予想するのに有用である。同様に、この発明は、 ＴＮＦの作用によって活性化した反応を中断させる効果によって、このような病 気の予防および治療に役立つ、ここで用いられているように、炎症反応、感染症 または悪性腫瘍等の「予防」には、病気の攻撃の開始（ｃｌｉｎｉｃａｌｏｎｓ ｅｔ）前にＴＳＧ−６蛋白質誘導体または、抗体（上述の記載参照）を投与する ことを含む。「治療」には病気の攻撃の開始（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｏｎｓｅｔｌ 後の防御構成物（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｓｔ　ｔｉｏｎ）の投与が 含まれる。炎症、悪性腫瘍または感染の起きた後に、この発明のＴＳＧ−６蛋白 質融合体または抗こうＴＳＧ−６抗体をうまく投与することは、病気の「治療」 を含む。 この発明のＴＳＧ−６蛋白質、ペプチドまたは抗体は、その目的、例えばリウマ チ様関節炎、他の炎症性疾患、悪性腫瘍、感染その他の処置といった目的を達成 する限り、その投与方法には限定はない、投与の方法としては、例えば、皮下、 静脈、皮肉、筋肉、腹腔、鼻腔、経皮、舌下への非経口投与が挙げられる。 またそれに代えてもしくはとそれと共に、局所的にまた、経口でも投与すること ができる。非経口投与は大丸薬や時間をかけた潅流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によ っても良い、慢性炎、リウマチ様関節炎、悪性腫瘍等の症状を予防、抑制、治療 のための典型的な処方は、ＴＳＧ−６蛋白質誘導体または抗体の効果的な量の投 与を、−日または数日、乃至６か月の間投与する。 投与量は患者または被験者の年令、性別、健康状態、体重や、同時に行なわれて いる処置、またはこのような処置の頻度、さらには目的とする効果の性質などの 考慮して決定される。以下に記載する効果的投与量の範囲は、この範囲に限定さ れるものではな（、好ましい投与量の例として記載した。しかし、最適な投与量 は個々の患者によって、この分野における通常の技術を有する者によって、決定 されるものである。 各処方に要求される投与の総置は、−回の投与または複数回の投与により行なわ れる。この発明の蛋白質、その機能的誘導体または抗体は、単独で投与されるこ ともあるし、また他のウィルス感染やウィルスによる他の症状に対する処置と同 時に行なわれることもある。 効果的なＴＳＧ−６蛋白質、その機能的誘導体、またはその抗体の投与量は、体 重１ｋｇ当たりＯ，Ｏｌｕｇ−１００ｕｇであり、好ましくは体重１ｋｇ当たり ｌＯμｇ〜５０ｕｇである。 非経口の投与液は滅菌済水系または非水系の溶液、懸濁液、乳化液であって。 当業者にはよく知られた補助試薬や賦形剤を含んでも良い、また、極く普通（ｒ ｏｕｔｉｎｅ）の方法により、錠剤またはカプセル状等の製剤に加工することも できる。 この発明の蛋白質、ペプチドまたはその抗体を含有する製剤は、この発明の目的 の効果を得るために必要な量の蛋白質、ペプチドまたは抗体を含有することがで きるかぎり、どのような形状のものも用いることができる。さらに、製剤に、活 性成分の製剤化を助ける。製薬に用いることのできる賦形剤や補助成分等の担体 を含有させてもよい。 製剤は注入または経口による投与に適した溶液を含み、０．０１〜９９％、好ま しくは、２０〜７５％の活性成分（即ち、ＴＳＧ−６蛋白質または抗体）が賦形 剤と共に含まれる。経口投与の場合に取りつる製剤の形態には１錠剤またはカプ セル状等がある。直腸より投与する形態としては、座薬も含まれる。 コンドロイチン硫酸を多く含有するプロテオグリカンは２組織に負荷時の圧縮に 対する抵抗性を与えるので、軟骨のマトリックスの基本的構成成分である。この プロテオグリカンの欠損は、例えば、リウマチ様関節炎、骨関節炎や関連する病 気に起こるものであるが１重大な軟骨機能の障害を引き起こす、ＴＮＦおよびＩ Ｌ−１は軟骨のプロテオグリカンの分解に関与することが知られ（Ｓａｋｌａｔ ｖａｌａ、Ｊ、ｅｔ　ａｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２２４：４６１　（１９８４ ）：止、ユニ■ユ笠旦旦、上６２：１２０８　（１９８５）；５ａｋｌａｔｖａ ｌａ、Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２２：５４７　（１９８６））、その再合成を阻 害する。細胞外マトリックスにおいて、プロテオグリカンコアはプロテオグリカ ンのコア蛋白質とヒアルロン酸との両方に結合するリンク蛋白質を介して、ヒア ルロン酸に結合することによって、集合体を安定化させている。 ＴＳＧ−６蛋白質のＮ末端側の半分は、軟骨プロテオグリカンコア蛋白質および 軟骨結合蛋白質と有意の相同性を示す。この発明によると、結合組織中で、ＴＮ ＦまたはＩＬ−１はＴＳＧ−６の分泌を誘導する。そして、そのＴＳＧ−６は、 結合蛋白質またはプロテオグリカンコア蛋白質とその相同性をもった領域によっ て相互に作用する。ＴＳＧ−６が結合蛋白質およびプロテオグリカンコア蛋白質 の両者と競合し、ヒアルロン酸と結合することによって、プロテオグリカン集合 体の安定性が失われ、プロテオグリカンが遊離する。 ＴＳＧ−６のＣ末端側の半分は相補的Ｃ１ｒ−Ａ鎖の作用領域と高い相同性を有 する。相補的構成Ｃ１ｒとＣ１ｓ　（作用領域を介して、Ｃ１ｒと相互作用する 。）はセリンプロテアーゼである。そのためＮ末端側の部分を介して、ヒアルロ ン酸類と結合するとともに、ＣＩｒ類似の部位にプロテアーゼを引き付ける。 その結果、プロテアーゼによるのペプチドグリカンの部分分解が生じる。その様 式を図示した図１７を参照されたい。 このように、この発明のＴＳＧ−６蛋白質のＮ末端側の部位に特異的な抗体、ま たはその機能的誘導体、好ましくはプロテオグリカンコア蛋白質もしくは軟骨結 合蛋白質と相同性を有するＮ末端側の部分に由来するペプチドは、軟骨プロテオ グリカンの損傷（損傷はＴＮＦによって誘起され、ＴＳＧ−６蛋白質によって仲 介される。）を抑制するために役立つ、さらに、この発明のＴＳＧ−６蛋白質の Ｃ末端側の部位に特異的な抗体、またはその機能的誘導体、好ましくはプロテオ グリカンコア蛋白質もしくは軟骨結合蛋白質と相同性を有するＣ末端側の一部分 に由来するペプチドは、軟骨プロテオグリカンの漏出崩壊（ＩＩＩ出崩墳は、Ｔ ＮＦによって誘起され、ＴＳＧ−６により仲介される。）を抑制するために役立 つこのようにして、この発明によると、ＴＳＧ−６の抗原決定基に特異的に結合 する抗体またはＴＳＧ−６の一部に対応する前述のペプチドを使用することによ り、リウマチ様関節炎やその他の炎症性の結合組織疾患などのプロテオグリカン の損傷が見られる病気を処置、治療することができる。 軟骨細胞は、ＴＳＧ−６蛋白質の生産のため、またはＴＳＧ−６に対する抗体も しくはＴＳＧ−６の機能的誘導体を用いた処理の効果を評価するために用いるこ とができる。軟骨細胞は、結合組繊細胞の一つであり、前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎ ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のサイトカインＴＮＦＪ３よびＩＬ−１に対する高い感 受性を有する。ＴＮＦおよびＩＬ−１はリウマチ様関節炎等の炎症性疾患の主要 な特性である軟骨の吸収を刺激する（Ｓａｋｌａｔｉｖａｌａ、Ｊ、、５ｕｐｒ ａ）。さらに、ＦＳ−４１！１維芽細胞がそれらのサイトカインに反応するのと 同様に、炎症の発生の一部として、軟骨細胞もＴＮＦまたはＩＬ−１で処理する ことにより、ＩＬ−６が分泌される。 ヒト関節軟骨より、基準的方法（Ｐｉｅｔｅｒ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｔｈｒ ｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、２５：１２１７　（１９８２）；Ｍｅｌｅｊｃｚｙｋ。 Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１上ｎ、旦Ｕユｍｍｕｎｏ１．工５：４７７　（１９８９ ））を用いた段階的酵素消化法により、細胞を単離した０次に、石灰化層を避け て、軟骨の表面の層より常法に従って、１ｃｍ”の軟骨チップを調製した。軟骨 表面に付着している可能性のある他の種類の細胞を除去するため、最初に、この チップにヒアルロニダーゼ処理（０，５ｍｇ／ｍ１．１５分間、室温下）を施し 、続いてＰＢＳで五目洗浄した。 次に、チップを０．０５ｃｍ”程度の大きさに切り刻んで、旋回培養器を用いて 、１０％のＦｅ２の存在下に、３７℃で、１８時間コラゲナーゼ（２ｍ　ｇ　／ 　ｍｌ）およびＤＮアーゼ（０，１ｇ／ｍｌ）により、消化させた。得られた軟 骨細胞を組織培養用フラスコを用いて、ＤＭＥＭおよびｌＯ％ＦＣ３の存在下に 培養した。２４時間後、ピペットにより、注意深く細胞を取り出し、洗浄した後 、細胞濃度５ｘｌＯ’ｃｅｌ　ｉｓ／７５ｃｍ”　ｆｒａｇｋで、ＴＮＦ　（２ ０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、再度４時間培養した。ＴＮＦ処理を行なつた細胞群よ りグアニジンチオシアネート／ホットフェノール法（Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ、Ｊ、 Ｒ，ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２旦ユニ１１０２４　（１９８２） によって、ＲＮＡの全量を回収した。ノーサンプロット法によって、誘導された ｍＲＮＡを測定した。またこれに代えて、ここに記載したようにＴＳＧ−６に対 する抗体を試料抽出物または培養土清中のＴＳＧ−６蛋白質の測定に用いること もできる。 この発明において、好ましい動物検体は、哺乳動物である。「哺乳動物」とは、 哺乳類に属する生物を示している。この発明は、獣医学の分野への応用も目的と しているが、特にヒトの治療等への応用が有意義である。 この発明は、検体における正常な、または変異のＴＳＧ−６蛋白質もしくはｍＲ ＮＡの存在やその程度を評価する方法を提供する０例えば、ＴＮＦまたはＩＬ− １による刺激、細菌感染等の外因性の刺激に対する反応としてのＴＳＧ−６の過 剰生産は、炎症性または放血反応の重要な指標となる。 ハイブリダイゼーシコン法におけるＴＳＧ−６ｍＲＮＡの定量、および免疫分析 法等におけるＴＳＧ−６蛋白質の測定法を提供することによって、この発明はリ ウマチ様関節炎等の炎症の悪化、感染症または敗血症に対する患者の感受性を評 価する方法をも提供するものである。 患者の細胞中のＴＳＧ−６ＤＮＡまたはｍＲＮＡの有無を調べるために、ＴＳＧ −６ＤＮＡ配列の各部位をコードしたオリゴヌクレオチドプローブを用いた。 好ましいプローブとしては、ＴＳＧ−６配列の少なくとも１２ヌクレオチド、好 ましくは１５以上のヌクレオチドをコードした核酸配列に対するものである。こ れらの様なプローブを用いることによって、質的に、量的にも分析することがで きる１例えばノーサンプロット法（実施例参照）を、細胞または組織の調製液中 のＴＳＧ　６ｍＲＮＡの発現量の測定に用いることができる。 このような方法は、下記に示す選択的増幅手段を用いることによって、一つの固 体から得られたような極少量のＤＮＡによっても行なうことができる。精製した ＤＮＡ断片を増幅することのできる組換えＤＮＡによる方法が知られている。 このような方法は通常、ＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに目的とするＤＮＡ断片 を組み込み、ベクターの増幅し、および増幅された核酸断片の回収操作を含む。 このような方法の具体例はｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ、（米国特許番号４，２３７ ．２２４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、（前述の文献）などに記載がある 。 近年、このような目的の核酸をｉｎ　ｖｉｔｒｏで酵素的に増幅させる方法が開 発されている。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応法」またはｒＰＣＲ法」− ２７３（１９８６）；Ｅｒ１ｉｃｈ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、ＥＰ５１．４２４；Ｅ Ｐ８４，７９６．ＥＰ２５８，０１７．ＥＰ２３７，３６２；Ｍｕｌ　ｌ　ｉｓ 。 Ｋ、、ＥＰ２０１，１８４；Ｍｕｌ　Ｉ　ｉｓ　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、、ＵＳ４，６ ８３．２０２　；Ｅｒｌ　ｉｃｈ、Ｈ，、ＵＳ４，５８２，７８８；５ａｉｋｉ 、Ｒ，。 ｅｔ　ａｌ、、ＵＳ４，６８３，１９４゜ポリメラーゼ連鎖反応法によって、未 精製のサンプルであるとしてもまた、サンプル中に一つのコピーしかない場合で あっても、特定のＤＮＡ領域を選択的に増幅することができる。 この方法により一水銀ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡともに増幅することが可能である。 この方法は、目的の核酸分子を鋳型とした、ポリメラーゼの触媒による複製のた めに、二つのオリゴヌクレオチドプローブをプライマーとして用いることが重要 である。 ＰＣＲ法においては、二つのオリゴヌクレオチドプローブの細かい性質が、この 方法が成功するか否かの重要な鍵である。よく知られているように、ＤＮＡおよ びＲＮＡはリン酸基の５°−３°結合によって与えられる方向性を有している。 ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は一つの配列の５°末端のリン酸残基ともう一つの 配列の３゛末端の水酸基とがリン酸ジエステル結合を形成することにより連結さ れる。ポリメラーゼによる核酸分子の増幅は、５°ヌクレオチド三リン酸を核酸 分子の３°末端の水酸基に加えることで進行する。このようにして、ポリメラー ゼは核酸分子の３°末端まで作用する。これらの本質的な特性をＰＣＲ法のオリ ゴヌクレオチドプローブの選択に利用する。ＰＣＲ法のプローブのオリゴヌクレ オチド配列は、増幅したい核酸の特定領域の両側または片側の配列と同一または 相補的な配列を有するものを選択すれば良い。 詳しくは、「第１の」プローブのオリゴヌクレオチド配列は、目的の領域の３′ 側のヌクレオチド配列とハイブリダイズするような配列を、「第２の」プローブ は目的の領域の５゛側に存在する配列と同一の配列を有するものを選択すれば良 い。どちらのプローブも３°水酸基を何するため、核酸合成のプライマーとして 用いることができる。 ＰＣＲ法における反応条件としては、このようなハイブリッド化および核酸合成 の条件と、変性させ一本鎖にする条件とを用い、これらを繰り返す。反応の最初 のステップでは、サンプル中のｖｋａは一時的に加熱され、ついで冷却される。 これは存在しつる全ての核酸の二本鎖を変性させ、−木調とするためである０次 に、目的の核酸分子に比べはるかに多い量の「第１の」プローブおよび「第２の 」プローブをサンプルに加える。ハイブリッド化および核酸合成の条件下でイン キュベートすることにより、「第１の」プローブが増幅させる領域の３°例の部 分で核酸分子とハイブリダイズする。サンプルの核酸が二本鎖である場合には、 「第２の」プローブは核酸分子の相補的な鎖に、増幅しようとする配列に相補的 な配列の３°の部位に、ハイブリダイズする。これにポリメラーゼを添加するこ とによって、「第１の」プローブおよび（核酸分子が二本鎖であった場合には、 ）「第２の」プローブがそれぞれの３°末端側に伸長する。「第１の」プローブ の伸長によって、目的の核酸の配列を有するオリゴヌクレオチドが合成される。 「第２の」プローブの伸長によって、目的の核酸の配列に相補的な配列を有する オリゴヌクレオチドが合成される。 ＰＣＲ法は特定の核酸の領域を指数関数的に増幅することができる。なぜなら、 「第１の」プローブの伸長による産物は、必然的に、「第２の」プローブの配列 に相補的な配列を含み、「第２の」プローブ伸長による産物の生産のための鋳型 として用いることができるからである。同様に「第２の」プローブの伸長による 産物は、必然的に、「第１の」プローブの配列に相補的な配列を含み、「第１の 」プローブ伸長による産物の生産のための鋳型として用いることができるからで ある。このように、合成と変性を繰り返すことによって、幾何級数的に目的の核 酸分子を増幅させることができる。ＰＣＲ法については、以下の文献に記載され ている　Ｍ−ｕｌｌｉｓ、に、Ｂ、（Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｒｉｎ　ＨａｒｂｏｒＳ　 ｍ　、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏ１．５１：２６３−２７３　（１９８６）：５ａｉｋ ｉ、Ｒ，に、、ｅｔ　ａｌ、（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　３：１ＯＯ８−１０ １２（１９８５）；Ｍｕｌ　ｌ　ｉｓ、に、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、（Ｍｅｔｈ２旦 ＡＩＹ−ユ旦ユ、工至互：　３３５−３５０　（１９８７））、以上本発明に関 し一般的に説明したが、以下の実施例を参照することによって本発明がより容易 に理解されよう。実施例は例示的に示したものであって、特に指定しない限り１ 本発明を限定するものではない。

【実施例】

（実験１） ＴＮＦ　されたＦＳ−４のｃＤＮＡライブラリーの−お　びＴＮＦ−ｃＤＮＡの 林料 Ｅ、ｃｏｌｉ由来の組換えヒトＴＮＦ（比活性：　３ＸｌＯ’　Ｕ／ｍｇ）は、 大阪にあるサントリー生物医学研究所のＭ、Ｔｓｕｊ　ｉｍｏｔｏにより供給さ れた。Ｅ、ｃｏｌｉ由来の組換えヒトＩＬ−１ａ（比活性：　１ＸｌＯ＠Ｕ／ｍ ｇ）は、ナトシー（Ｎｕｔｌｅｙ）にあるホフマンーラーロッシュ社のＡｌｖｉ ｎＳｔｅｒｎおよびＰｅｔｅｒ　Ｌｏｍｅｄｉｃｏから得られた。Ｅ、ｃｏｌｉ 由来の組換えヒトγ−インターフェロン（比活性：２．ｌＸｌ０’）は、ケンブ リッジにあるバイオジエン社から供給されたものである。Ｅ、ｃｏｌｉ由来のヒ トインターフェロン−ａ（ベータセロン、比活性：　２Ｘ１０”　Ｕ／ｍｇ）は 、アラメダ（Ａ　ｌ　ａｍｅｄａ）にあるトリトン・バイオサイエンス社から得 られた。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、ベッドフォードにあるコ ラボレイティブ・リサーチ社から得られた。ポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ）は、ミルウ オーキーにあるＰ−Ｌ・バイオケミカルズ社から得られた。Ｎ’−２°−０−ジ ブチル・アデノシン・サイクリック３°、５°−モノフォスフェート、シクロへ キシミド、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌ　ｉｎ）、１２−０−テトラデカノ イルフォルポル＝１３−アセテート（ＴＰＡ）、カルシウム・イオノフオアＡ２ ３１８７およびイソブチルメチルキサンチンは、セントルイスにあるシグマ・ケ ミカル社から得られた。インターナル・リファレンス（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅ ｆｅｒｎｃｅ）ｃＤＮＡとして用いられるｐＨｅ７ブラスミド（Ｋａｃｚｍａｒ ｅｋ、Ｌ、ｅ七　ａｔ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０４：１８３−１８７　 （１９８７））は、ニューヨークのロックフェラー大学のＰ、Ｂ、Ｓｅｈｇａｌ から供給されたものである。 凱楢Ω唱１ ヒト２培体ＦＳ−４包皮繊維芽細胞系（Ｖｉｌｃｅｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、旦ｒ ｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１旦：３９０９−３９１３　（１ ９７３））は、全ての実験においてパッセージ・レベル（ｐａｓｓａｇｅ　ｌｅ ｖ　ｅ　）　−１−５で使用された。ＦＳ−４細胞は、６ｍＭのＨＥＰＥ３．３ ｍＭのトリシン、５０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５％の熱不活性（５６ ℃、３０分）ウシ胎児の血清（ＦＢＳ；ギブコ・ラボラトリーズ社製）を添加し たイーグル最少培地（Ｅ−ＭＥＭｌ中で培養された。４ＸｌＯ’個の細胞が実験 のため１７５ｃｍ”のフアシヨン・フラスコ中に接種され３７℃で培養され、こ の細胞が密集成長するように６日間以上培養された。細胞の密集成長による単層 はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄され、これに０．２５％のＦＢＳ を含有する前記各成分を含有するイーグル最少培地（Ｅ−ＭＥＭ）が補充された 。この培養物は、細胞を静止期にさせるため、前記培地中でさらに３７℃で７２ 時間培養され、その後、この発明において特定された適当な試薬で処理された。 ｃＤＮＡの　“およびｃＤＮＡ−イブラリ−の細胞質ＲＮＡは、以前に記載され た文献のように（Ｌｉｎ、Ｊ、−Ｘ、ｅｔ−１上、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６２：１１９０８−１１９１１　（１９８７））、ｌＯｎｇ／ｍｌのＴＮＦで ３時間処理された静止期のＦＳ−４細胞から分離された。ポリ（Ａ）’　ＲＮＡ は、先ずこれをオリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ−Ｌ・バイオケミカルズ社製； 　ｔｙｐｅ７）に結合させ、次いでこれを溶出させる一連の工程の１サイクルに より選択された。二本鎖ｃＤＮＡは、ゲイゼルスバーグ（Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）にあるベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製のｃＤＮＡ合成システ ムを用いることにより１０ｕｇのポリ（Ａ）′″ＲＮＡから作られた。二本鎖ｃ ＤＮＡは、旦立旦Ｒ１メチラーゼによりメチル化され。 Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化された。旦旦旦ＲＩリンカ−はｃＤＮ Ａ上に結合され、旦旦旦Ｒ１により切断された。６００塩基対より大きいｃＤＮ Ａは分画され、セファロースＣＬ４Ｂカラム・クロマトグラフィーによりリンカ −・フラグメントかも分離され、λ−ｇｔｌｏの旦ｃｏＲ１部位に結合された。 このライブラリーは、ギガバック・パフケージング・エキストラクト（ストラタ ジーン社製）でｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングされた。 ｃＤＮＡライブラリーのＦ　ｄｉｆｉ’ｅｒｅｎｔｉａｌ　スフ１−ニンえ−ｇ ｔｌＯｃＤＮＡライブラリーは、１０００　（ＰＦＵ／直径１５０ｍｍのプレー ト）の密度でＥ、ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２上に蒔かれた。ニトロセルロース・フィ ルターは、各プレートにおけるプラークを複製するために用いられた。ｓｌＰで 標識された一水銀ｃＤＮＡプローブによるフィルターのブレハイブリダイゼーシ ョンおよびハイブリダイゼーションは、以前に記載された文献の通りに行なわれ た（Ｌｅｏｎａｒｄ、Ｄ、Ｇ、Ｂ、ｅｔ　ａｌｌ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅｌ　１Ｂｉ ｏ１．７＋３１５６−３１６７（１９８７））−プローブは、ｌＯｕｇのポリ（ Ａ）’　ＲＮＡを基にベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ化のｃＤＮＡ合成シ ステムを用いて合成された。最初の鎖の合成反応は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよび ｄＴＴＰを各０．５ｍＭ、ｄＣＴＰを０．１ｍＭ、ダクチノマイシンを１００ｕ 　ｇ／ｍ　ｌ、並びにａ−ｓ″ＰＰ標識たｄＣＴＰ　（３００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ 　；アイ・シー・エヌ・ファーマシューティカルズ社製）を２００ｕＣｉ含有す るように調整された。ｃＤＮＡの合成後、ＲＮＡは０．２ＭのＮ　ａ　ＯＩ（中 で７０℃、２０分間のインキュベーションにより引き離された。この反応はＭＣ Ｉで中和され。 合成されたｃＤＮＡは２Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿された 。ベレットは、２００ｕｌのＴＥ（ｌｏｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＭ のＥＤＴＡ）中に懸濁され、ハイブリダイゼーション用溶液およびフィルターに 添加された。二つのプローブ、即ち、一方はＴＮＦで処理されていないＦＳ−４ 細胞のポリ（Ａ）”　ＲＮＡかも作られ、他方はＴＮＦ　（１０ｎｇ／ｍｉ）で ３時間処理されたＦＳ−４細胞のポリ（Ａ）”　ＲＮＡかも作られた二つのプロ ーブの内の一つは、各二つのレプリカ・フィルターをパイプリダイズするのに用 いられた。ハイブリダイゼーション後、このフィルターは、２倍濃度のＳＳＣ（ １倍濃度のＳＳＣは、Ｏ，１５ＭのＮａＣ１に０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウ ムを加えたものである）Ｊよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の洗 浄液中で６５℃で１時間、前記洗浄液を１回あるいは２回交換して洗浄された。 フィルターは、遮蔽板と共に一７０℃で１〜２日間強制的にコダック社製ＸＡＲ −５フィルムに露光された。前記二つのプローブによるハイブリダイゼーション 標識の異なる強さを示したいくつかのプラークが選択された。これらのクローン は、さらにもう１度鑑別（ｄｉ　ｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）スクリーニングに供さ れ、プラークは精製された。 ｃＤＮＡのサブクローニング、インサート、およびクロス・ハイブリダイゼー乞 ユ乞巨究 ゲル化する前の０．７％のアガロース中に懸濁したＥ、ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２細 胞が、１５０ｍｍのプレート中に分注された。λ−クローンがその後プレート上 で格子配列状にスポットされた。四枚のニトロセルロースフィルターは各プレー トから移す手段であり、処理された後、使用時まで保管された。プラーク精製さ れた組換え体のクローンからのｃＤＮＡインサートを調製するため１組換え体の 溶解物のｌｏｍｌは、不純物が除去され、この溶解物に混入する染色体ＤＮＡを 除去するために２μｇ／ｍｌのＤＮアーゼで消化された。そして、２．５％ＳＤ Ｓと０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ９，５）と０．２５ＭのＥＤＴＡとの混合液２ｍ ｌが添加され、プレートはファージを溶解させるために６５℃で１５分間培養さ れた。この溶液は、１０Ｍ酢酸アンモニウムの２．０ｍｌを添加する前に室温に まで冷却された。試料は氷で２０分間冷却され、ＤＮＡベレットを得るために１ ５０００　Ｘ　ｇで４℃、１０分間遠心分離された。前記ペレットは、２Ｍｇ／ 　ｍ　１のＲＮアーゼ（ベーリンガー社製）を含有するＴＥ緩衝液の１ｏｏｕｌ 中に懸濁され、制限酵素１旦ｏＲＩで切断された＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサート は分離され、Ｍ１３ｍｐ１９ベクターの旦立旦Ｒ１部位にサブクローンされた。 クロスハイブリダイゼーションおよびノーザン・プロット実験のためのプローブ として用いるｃＤＮＡインサートは、バックグランドを最小化するためにＥｃ旦 旦ｒでの切断による組換え体Ｍ１３のクローンから調製された。プローブは迅速 に調製された。ハイブリダイゼーション条件は、前記鑑別（ｄｉ　ｆｆｅｒｅｎ ｔｉａｌ）スクリーニング実験と同様である。 ノーザン・プロット 細胞質ＲＮＡは、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲル上で分画され 、ゼータ−プローブ・プロッティング・メンプラン（リッチモンドにあるパイロ ・ラット・ラボラトリーズ社製）上にプロットされた。細胞質ＲＮＡはル−ンに つきｌＯｕｇ供された。ノーザン・プロットにおけるブレハイブリダイゼーショ ンおよびハイブリダイゼーションは、前述の文献（Ｌｉｎ、Ｊ、−Ｘ、ｅｔａｔ 、、）に記載された通りに行なわれた。フィルターは、Ｍ１３の組換え体クロー ンからの”ｐｌ！識されたｃＤＮＡインサートおよび／または”Ｐｔ５１１１１ されたインターナル・リファレンス（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｅｒｎｃｅ）ｐ Ｈｅフィンサートでプローブされた。ノーザン・プロットの結果は、レーザー・ デンシトメーターで定量された。 【嵐公近 Ｍ１３の組換え体クローンからの一本ｌｌＤＮＡ！ＩＦ型が調製きれ、各ｃＤＮ Ａ末端から数えて数百のヌクレオシドからなるヌクレオチドの配列は、ジデオキ シヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　工４　：　５４６３−５４６８　（１９７７））によ り決定された０部分的なヌクレオチド配列が遺伝子バンクに登録された配列と比 較された（リリース（ｒｅ　ｌ　ｅａｓｅ）６０．０）。 ■ ＦＳ−４細胞は密集成長した後、その培地がｏ、２５％のウシ胎児の血清（ＦＢ Ｓ）を含む培地に交換され、さらに３７℃で７２時間培養された。こうして得ら れた細胞は組換えヒトＴＮＦ　（Ｌｏｎｇ／ｍｌ）にさらされた、細胞質ＲＮＡ は、ＴＮＦで３時間インキュベートされた後、分離された（Ｌｉｎ、Ｊ、−Ｘｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１１９０８　（１９８７））。 ＴＮＦでの３時間の培養は、以下の理由で選択された。ＴＮＦは、静止期のＦＳ −４細胞中で２０−３０分以内に幾つかのメツセンジャーＲＮＡレベルの増加を 誘導することが知られているが、これらの「里心性（ｅａｒｌｙ　ｒｅｓｐｏｎ ｓｅ）ＪメツセンジャーＲＮＡの幾つかは３０−１２０分の間に僅かにそのレベ ルが増加するだけである（例えば、ｃ−ｆｏｓおよび立二二り旦　メツセンジャ ーＲＮＡ；Ｌｉｎ、Ｊ、−Ｘ、ｅｔ　ａｌ、、上述の文献）、このような里心性 の遺伝子産物は他の遺伝子を活性化させるのに重要であるが、これらの遺伝子産 物が僅かに誘導されるという事実は、これら遺伝子産物がＴＮＦにより誘導され た表現型の変化に応答し得る活性化エフェクター分子ではないことを示唆した。 それ故に、ＴＮＦ処理後により安定して増加されるメツセージに相当するｃＤＮ Ａについて研究が開始された。 ポリ（Ａ）”　ＲＮＡは細胞質ＲＮＡがら分離され、これを基に二本鎖ｃＤＮＡ は合成された。２ＸＩＯ”個の組換え体クローンからなる。ＴＮＦ処理されたＦ Ｓ−４細胞からのｃＤＮＡライブラリーは、ＴＮＦ誘導遺伝子の配列決定のため に、コントロール細胞（ＴＮＦ処理されていないＦＳ−４細胞）およびＴＮＦ処 理されたＦＳ−４細胞にそれぞれ由来するポリ（Ａ）’　ＲＮＡから調製された ”ＰｆｉｌｉｃＤＮＡプローブでの鑑別（ｄｉ　ｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ハイブ リダイゼーションによりスクリーニングされた。コントロール細胞に由来するｃ ＤＮＡでプローブしたときでなく、ＴＮＦ処理された細胞に由来するｃＤＮＡで プローブしたときに強いシグナルを発するプラークが、ＴＮＦ誘導性遺伝子であ ると仮定して拾い上げられた。 およそ３ＸＩＯ’個のプラークがスクリーニングされ、二回のスクリーニング操 作の後、これらの内の４７個のブラニクが明らかにＴＮＦ誘導性遺伝子を含んで いると記録された。これらはＴＳＧＩ−４７（ＴＳＧ＝　ｒＴＮＦで刺激された 遺伝子配列」）と名付けられた。Ｎ別（ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｌ）スクリーニン グにより選択されたＴＳＧクローンの間で表現される異なるメツセンジャーＲＮ Ａの数を決定するため、インサートはクロスハイブリダイゼーシ（ンにより配列 の相同性について試験された。クローンされた計４４個のｃＤＮＡは、互いにク ロスハイブリダイゼーションさせられることにより実験された。これらの実験は 、計８つの特異的な非交差反応性（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇ）ｃＤ ＮＡを示した０表２を要約すると、４４個のクローンの間において、あるｃＤＮ Ａ　（ＴＳＧ−２１，ＴＳＧ−２７およびＴＳＧ−３７１はかなり低い存在量で あったのに対し、幾つかのｃＤＮＡ　（ＴＳＧ−８およびＴＳＧ−１４１は高い 頻度で表現された。メツセンジャーＲＮＡに相当する大きさは０．８〜４．５キ ロ塩基対であった。 表２　ＴＮＦに特異的な４４個のｃＤＮＡクローン中における各ＴＳＧｃＤＮＡ の存在量ｌ）各４４個のｃＤＮＡインサートはんｇｔｌｏベクターから分離さｔ ＬＭ１３ｍｐ１９ベクターにサブクローンされた。Ｍ１３ベクター由来のインサ ートはニック・トランスレーションにより［３１ｐ］標識され各４４個のλｃＤ ＮＡでハイブリッド化された。クロスハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡが同 じｍＲＮＡ種から得られたことの証拠として用いられた。 （実験２） ＴＮＦに−°されたメッセンジ　−ＲＮＡにおする　゛の分離された８つの別個 独立のＴＳＧｃＤＮＡのレベルが、ＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞中において調 節されるメツセンジャーＲＮＡレベルに実際に相当していることを確かめるため 、静止期にあるＦＳ−４細胞は０．５〜１６時間の範囲の異なる間隔でＴＮＦ　 （２０ｎｇ／ｍｌ）処理され、細胞質ＲＮＡは分離され（Ｌｉｎ、Ｊ、−Ｘ、ｅ ｔ　ａｌ、、上述の文献）、各８つのｃＤＮＡに相当するメツセンジャーＲＮＡ のレベルは、ノーザン・プロット分析およびオートラジオグラムのデンジトメト リック・スキャンニングにより定量された（図１８よび図２）、メツセンジャー ＲＮＡレベルの増加は、約３−フォールド（ｆｏｌｄ）（ＴＳＧ−２１１から１ ００−フォールド（ｆ　ｏ　１　ｄ）　（ＴＳＧ−６Ｊ３よびＴＳＧ−８）以上 までの範囲であった。 メツセンジャーＲＮＡ刺激の３つの異なるパターンが注目された。第一のパター ンは、メツセンジャーＲＮＡレベルが２〜４時間で最大まで増加し、その後緩や かに減少することを特長としていた（ＴＳＧ−１およびＴＳＧ−６）、第二のパ ターンは、メツセンジャーＲＮＡレベルが１．５−４時間で最大まで急速に増加 し、以後少な（とも１６時間までプラトーな状態になることを特長としていた（ ＴＳＧ−８，ＴＳＧ−１２、ＴＳＧ−１４およびＴＳＧ−３７１，第三のパター ンは、メツセンジャーＲＮＡレベルが初めに若干減少し、続いて１６時間の観察 を通してメツセンジャーＲＮＡレベルのゆるやかでゆっくりと増加することを特 長としていた。 （実験３） ｒＳＧｃＤＮＡの 分離されたｃＤＮＡが既に同定された遺伝子と相同であるかどうかを決定するた めに、８つのｃＤＮＡの全てが１部分的（３００−４００塩基対について）にシ ーフェンスされ、決定された塩基配列は遺伝子バンクで入手できる塩基配列と対 照することによりチェックされた。４つのｃＤＮＡ　（ＴＳＧ−１，７ＳＧ−８ 、ＴＳＧ−２１およびＴＳＧ−２７）の塩基配列は既に同定された遺伝子と相同 的であることがわかった。これらの内、ＴＳＧ−１は、インターロイキン−８と して知られる。β−トロンボグロブリン様蛋白質３−１０ｃ　（Ｓｃｈｍｉｄ。 Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９：２５０　（１９８７））の遺 伝子に相当した。ＴＳＧ−８は、最近クローンされた単球走化性活性化因子（Ｍ ＣＡＦ）（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｔｏｋｉｎｅ　上：２ （１９８９））の遺伝子と同一であった。ＴＳＧ−２１およびＴＳＧ−２７は。 それぞれコラゲナーゼ遺伝子およびストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅ　ｌｙｓ　ｉ ｎ）遺伝子と同じであることがわかり、ＴＳＧ−３７は、メタロチオネイン■を コードすることがわかった。残り３つのｃＤＮＡの部分塩基配列は、それらが今 まで同定されていない遺伝子の塩基配列であったことを示し、公知の遺伝子との 顕著な相同性を示さなかった。 ＴＮＦによる。およびインターロイキン−１によるインターロイキン−８にＴＳ Ｇ−１）の誘導が、最近観察された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、に、ｅｔ　ａｌ２ ．上述の文献；Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６７：１８Ｂ３　（１９８Ｂ））−好中 球走化性因子であるインターロイキン−８は、血小板第４因子（ＰＦ−４）。 インターフェロン（ｒＦＮ）−Ｔｍ誘導性蛋白質であるＩＰ−１０、ＰＤＧＦ誘 導性遺伝子であるＪＥ、ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２と称される蛋白質、並びに ＧＲＯ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、に、ｅｔ　ａｔ、、上述の文献；　Ｌａｒｓｅ ｎ、　Ｃ，Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１４６４　（ １９８９）　）を含む幾つかの炎症性サイトカイン群に構造的に関係している。 これらの蛋白質のほとんどに走化性が現われた。 ＴＮＦおよびインターロイキン−１によるヒト繊維芽細胞におけるＭＣＡＦ　（ ＝ＴＳＧ−８１の誘導については最近記述がなされている（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍ ａ、に、６ｔ　ａｌ、、上述の文献）、ｌ［Ｉ味深いことに、ＭＣＡＦはインタ ーロイキン−８と著しいアミノ酸配列の類似性を示しく２１％）、これらは共に 類似の位置に４つのシスティンを有する。コラゲナーゼ（ＴＳＧ−２１）はまた 、滑膿細胞および繊維芽細胞中でＴＮＦ誘導性であることが早くから報告されて いた（Ｄａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、上述の文献）。コラゲナーゼを誘導するＴＮ Ｆの能力は、炎症中の組織の改編（ｒｅｍｏｄｅｒ　ｉｎｇ）におけるＴＮＦの 役割に関係しているらしい。ＴＮＦによるストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅ　Ｉｙ ｓ　ｉｎ）の誘導は報告されていないが、ストロメリシン（ｓ　ｔｒｏｍｅ　ｌ ｙｓ　ｉｎ）メツセンジャーＲＮＡはインターロイキン−１により誘導され得る ことが最近示された（Ｑｕｉｎｏｎｅｓ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：８３３９　（１９８９１）、コラゲナーゼ様の ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）は、コラーゲンを分解する金属蛋白 質分解酵素であり、これらは共にフィブロネクチン、ラミニンおよび軟骨のプロ テオグリカンを分解することができる。コラゲナーゼおよびストロメリシン（ｓ ｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）は共に、慢性関節リウマチに生ずる、細胞外マトリック ス分解の増加に重要であると考えられている。 最後に、メタロチオネインＩＩ　（ＭＴ−ｎ）（＝ＴＳＧ−３７）は、重金属投 与、リボ多糖体の注射を含む様々なストレスにより、乃至はインターフェロンお よびインターロイキン−１を含むサイトカインにより、誘導され得ることが示さ れている（Ｋａｒｉｎ、Ｍ、、Ｃｅ１ｌ　４１：９−１０（１９８５））、重金 属イオンに結合する能力に加えて、ＭＴ−ｎはまた、炎症反応の間、活性化され たマクロファージおよび好中球により放出されたラジカル・スカベンジャーとし て作用することができる。ＭＴ−Ｕ誘導は、このように組織破壊の予防における 保護的な役割を担っている（Ｔｈｏｒｎａｌ　ｌｅｙ、ｐ、Ｊ、、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ２１上立り且り且工Δ旦ｔａ　８ヱユ：　３６−４４　（１９８５））。 シーフェンスにより同定された５つのＴＳＧｃＤＮＡの全てが、炎症過程におい て重要な蛋白質をコードする遺伝子に相当していたことは意義深いことである。 これらの結果は、免疫応答および炎症反応において重要な働きをする新規な遺伝 子の同定において、ヒト繊維芽細胞に由来するＴＮＦ誘導性ｃＤＮＡクローニン グにおける現在のアプローチの有用性を支持するものであった。 （実験４） するサイトカインおよび　の　の−によるＴＳＧメツセンジ　−ＲＮＡ１県０パ ヱニ２ 表３は、ノーザン・プロット分析により、様々な試薬にさらされたＦＳ−４細胞 における。８つの別個独立のＴＳＧｃＤＮＡに相当するメツセンジャーＲＮＡレ ベルが調定された多くの実験の概要を提供するものである。３つのメツセンジャ ーＲＮＡ　（ＴＳＧ−８，ＴＳＧ−１２およびＴＳＧ−１４に相当する）は、蛋 白質合成阻害剤であるシクロへキシミド（ＣＩ（Ｘ）により誘導され得るもので あった。幾つかの場合において、ＣＨＸの添加がメツセンジャーＲＮＡの合成を 阻害（ｂｌｏｃｋ）Ｌなかったか（ＴＳＧ−１２およびＴＳＧ−１４）、あるい はＴＮＦによるメツセンジャーＲＮＡの誘導能力を増加させた（ＴＳＧ−１，Ｔ ＳＧ−６およびＴＳＧ−８）ことは、メツセンジャーＲＮＡの増加がＴＮＦの直 接の作用の結果であることを示し、蛋白質の媒介を要求しなかった。対照的に、 残る３つのメツセンジャーＲＮＡのＴＮＦによる誘導は、ＣＨＸの存在下で阻害 され、あるいは減少した。５つのメツセンジャーＲＮＡ　（ＴＳＧ−８、ＴＳＧ −１２、ＴＳＧ−２１，ＴＳＧ−２７およびＴＳＧ−３７）は、ＩＦＮ−〇によ る誘導性であり、これらの内の２つ（ＴＳＧ−８およびＴＳＧ−１２）はＩＦＮ −γに応答した。ＩＦＮ−〇による同時処理は、ＴＮＦによるＴＳＧ−１（＝Ｉ Ｌ−８）メツセンジャーＲＮＡの誘導能力を減少させ、ＴＳＧ−６およびＴＳＧ −３７メツセンジヤーＲＮＡの誘導能力を増加させた。全てのメツセンジャーＲ ＮＡは、インターロイキン−１により、！３よび二本鎖ＲＮＡポリ（Ｉ）　・ポ リ（Ｃ）あるし１はフォルボールエステル ・１３−アセテート（ＴＰＡ）により誘導され得るものであり，これらの試薬に より誘導の影響は異なっていた。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、ＴＳＧ−２１ （＝コラゲナーゼ）およびＴＳＧ−２７　（＝ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌ ｙｓｉｎ）メツセンジャーＲＮＡレベルを増加させる点において適度に効果があ り，他の幾つかのメツセンジャーＲＮＡ　（ＴＳＧ−８．ＴＳＧ−１２およびＴ ＳＧ−１４）を弱く刺激した，ＰＤＧＦおよび形質転換成長因子−β（ＴＧＦ− β）は、ジブチリル・サイクリックＡＭＰ　（ｄＢｃＡＭＰ）およびフオスホジ エステラーゼ阻害剤であるイソブチル・メチル・キサンチン（ＩＢＭＸ）のよう に弱い影響があっただけであった。 表３を要約すると、ＴＮＦに独占的に応答したメツセンジャーＲＮＡは存在しな かったことは明らかである．しかしながら、少なくとも２つのメツセンジャーＲ ＮＡ　（ＴＳＧ−１即ちインターロイキン−８およびＴＳＧ−６）は、他の刺激 に比べてＴＮＦにより著しく強く誘導された，ＴＳＧ−１即ちインターロイキン −８およびＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡは、近似したパターンの誘導能力（ ＴＮＦによる誘導におけるＩＦＮ−βとＩＦＮ−γとの作用の見かけ上の差異を 除き）を有することは興味深いことである．ＴＳＧ−８の誘導能力のパターンが ＴＳＧ−１２のそれと近似していたことは明らかであり、ＴＳＧ−２１　（コラ ゲナーゼ）およびＴＳＧ−２７　（ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓ　ｉ　 ｎ））メツセンジャーＲＮＡはまた、近似した誘導能力のパターンを有していた ．ＴＳＧ−３７メツセンジヤーＲＮＡ　（メタロチオネイン旧は．ＴＮＦおよび ＩＦＮ−βの両方により強く誘導され得るものであった。 表３　ＦＳ−４細略中におけるＴＳＧメツセンジャーｎＮ八にへするＩｉ々なＭ ！ｆ）彩胃ｌ）増殖を止められたＦＳ−４１ｇｌは、以Ｆのｆｌで処１された； ＴＮＦ　（２０％ｇ／ｍｌ）、（、ｌ（Ｘ　ｌ蓋Ｏｕｇ／ｍｌ）。 ＴＦＮ−０（５０００／ｍｌｌ　、Ｉ　ＦＮ−ｙ　（１０００／ｍｌｌ　、ｌ　 Ｌ−１ａ　（Ｉ　ｎｇ／ｍｌｌ　ＥＧＦ　（２５％ｇ／ｍＩj。 ｒ’１）ＧＦ　（５ｎｇ／ｍｌｌ　、ＴＧＦ−０（２ｎｇ／ｍｌ＋　、ポリ（１ １−ポリ（Ｃ１（５０ｕｇ／ｍｌｌ　、ＴＰ八（Ｉ　ＯＯｎｇ／ｎｉ１．八２３ １８７１１ｕ間）、フォルスコリン（１０ｕＭｌ　、ｄＢｃＡＭＰ　（１００ｕ Ｍｌ　、ＩＢＭＸ　（ｌｏｏｕＭ）、この処理は、ＴＳＧ−２１およびＴＳＧ− ２７のメツセンジャーｎＮ＾レベルが１６時間の処理後決定されたことを除き、 全て２時幅１で行なわれた。（ＴＮＦＪｊよびＣＩＩＸの混合物の長時Ｍの処ｑ ｕｗ灘であったので、ＴＮＦＪ３よびＣＩＩＸで処理された群にＪ３ＩするＴＳ Ｇ−２１およびＴＳＧ−２７のメツセンジャーＲＮへレベルは処理後４時間で決 定されＬ−）全細自質（実験５） ＴＳＧ−６の６　なりＮＡ　テ、　びに、この　のＣＤ４４　ヘルメス　Ｈｅｒ ｍｅｓ　および　εンク・　に　る新規な部分塩基配列を有する３つのＴＳＧｃ ＤＮＡ　（ＴＳＧ−６，ＴＳＧ−１２およびＴＳＧ−１４）の内、ＴＳＧ−６は 、さらなるシーフェンスのために選択された。ノーザン・プロット分析は、ＴＳ Ｇ−６ｃＤＮＡが、１．５キロ塩基対の見かけ上の大きさである、ＴＮＦ誘導性 メツセンジャーＲＮＡの一本のバンドにハイブリッド化されたことを示した。Ｔ ＳＧ−６ｃＤＮＡと共にクロス−ハイブリッド化された６つのんクローンの間で 、λ５−ＴＳＧ−６クローンは、約１．４キロ塩基対という最も長いインサート を有していたので、これがシーフェンス分析に用いられた。およそ１．４キロ塩 基対のλ５−ＴＳＧ−６インサートは、Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージのＥ ｃｏＲ１部位にサブクローンされた。塩基配列決定の忠実性を保証するため、塩 基配列方向の欠失クローンが、Ｍ１３クローン中の両方向に、Ｅｘｏ［ＩＩ／Ｓ ｌ法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、上述の文献）により生成された。この方向欠失ク ローンはその後、ジデオキシヌクレオチド法（サンガー、Ｆ、ｅｔ　ａｔ、、上 述の文献）による塩基配列を決定するのに用いられた。 ＴＳＧ−６ｃＤＮＡはｌ、４１４個の塩基を有し、明らかに、６９個の塩基によ る翻訳されない５゛領域と、８３１個の塩基が連続するオーブン・リーディング ・フレームと、翻訳されない３°領域とからなることがわかった（図３）、翻訳 されない３゛領域内に、多重ＡＴ−リッチ領域が存在した。メツセンジャーＲＮ Ａ配列のＡＵＵＵＡが、不安定さを与えると考えられていることは、メツセージ の急速な消失（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を招き、ＴＮＦでの４時間にわたる連 続処理後に見られるＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡレベルの減少を説明するか も知れない（図１ＩＩ照）、共通のポリアデニル化信号（ＡＡＴＡＡＡ）はまた 、３°末端に位置されていた。 最も大きいオーブン・リーディング・フレーム（８３１個の塩基）から、２７７ 個のアミノ酸のポリペプチドが予測された。巨大な長さのオーブン・リーディン グ・フレームは他に見られなかった。推測上のメチオニン開始は、典型的な消化 性シグナル・ペプチド（図３および図４）を示唆し、電荷を有する部位が後に続 ＜１１個の疎水性アミノ酸により続けられる。加えて、予測されたＴＳＧ−６蛋 白質のアミノ酸配列は、Ｎにリンクした糖鎖形成の可能な２つの部位と、コンド ロイチン・サルフェートとのリンク部位とを含んでいる（図３および図４）。 データペースにおける蛋白質の有用なアミノ酸配列とＴＳＧ−６ｃＤＮＡに由来 するアミノ酸配列との比較は、興味深い相同性を示した０図５は、ＴＳＧ−６遺 伝子産物のＮ末端モチーフ（３７番目のアミノ酸と１２７２７番目ミノ酸との間 のアミノ酸残基）は、ラットの軟骨リンク蛋白質（３５，８％の同一性を有する ）、ラットのプロテオグリカン・コア・蛋白質（３８，９％の同一性を有する） 、オよびヒト・リンパ球のホーミング・レセプタ−ＣＤ４４／ｇｐ９０ヘルメス （Ｈｅｒｍｅｓ）（３２，６％の同一性を有する）の最近発表されたアミノ酸配 列（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、１．ｅｔ　ａｌ、、上述の文献ＨＧｏｌｄｓｔｅ ｉｎ、Ｌ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、、上述の文献）との高い相同性を有することを示し ている。加えて、ＴＳＧ−６遺伝子産物のＣ末端部位は、相補的成分たるＣ１ｒ 　Ａ鎖のα−フラグメントとの間でおよそ３０％のアミノ酸配列の相同性を示し た。 ＴＳＧ−６ｃＤＮＡによりコードされた蛋白質の予測されたアミノ酸配列と、Ｃ Ｄ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）系統群との間の相同性は特に興味深い。ＣＤ ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）膜蛋白質は、リンパ球の「帰巣（ｈｏｍｉｎｇ Ｎリンパ節、およびＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）膜蛋白質の様々な他の 組織への結合に（Ｓｔｏｏｌｍａｎ、ｉ　Ｍ、、上述の文献）関係している。Ｃ Ｄ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）が造血細胞系１間葉細胞系および上皮細胞系 で発現されたという事実は、多目的接着受容体としてのこの蛋白質の作用を示唆 している。ＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）と、プロテオグリカン・コア・ 蛋白質の領域でもあり、軟骨リンク蛋白質の領域でもある二つの繰返し領域との 間の顕著な相同性については、！に近記述がなされている（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖ ｉｃ、１．ｅｔ　ａｌ、、上述の文献；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｌ、Ａ、ｅｔａｌ 、、上述の文献）、軟骨リンク蛋白質およびプロテオグリカン・コア・蛋白質に おいては、これらの相同的な領域が、蛋白質問相互作用を通してヒアルロン酸お よびその他のプロテオグリカンへのこれらの蛋白質の結合に関係していると考え られている。ＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）におけるこのエピトープの存 在は、リンパ球の往来における細胞マトリックス相互作用の重要性に関係してい るかも知れない。 ＴＳＧ−６領域と公知のアミノ酸配列との高い相同性（約６０％）は、リンク蛋 白質およびプロテオグリカン・コア・蛋白質のヒアルロン酸結合領域に存在する 。推測される二次構造によると、この領域はこれらの蛋白質の全てに高く保持さ れるジスルフィド結合により形成される伸びたループ部分に現われる（図５）、 さらに、コンドロイチン・サルフェートにリンクする可能性のある部位の存在は 、ＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）によくあることだが、ＴＳＧ−６蛋白質 自身がいわゆる「一時的な（ｐａｒｔ　ｔｉｍｅ）Ｊプロテオグリカンであるか も知れないことを示唆する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ、、上述の文献）。 ＴＳＧ−６蛋白質の分泌された形態が、白血球の往来および／または化学走化性 において、ある役割を果たしていると予測された。ＴＳＧ−６蛋白質は、白血球 の表面構造に結合すると、白血球の接着特性および／またはその他の作用を変え ると推測された。ＴＳＧ−６蛋白質は１例えばヒアルロン酸および可能なその他 の構造等、ＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）と同じリガンドを認識するよう であり、この場合には、可溶性ＴＳＧ−６が、ＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅ ｓ）分子により媒介されるリンパ球接着を干渉すると推測される。可溶性ＴＳＧ −６はまた。細胞外マトリックスへの細胞接着を阻害すると推測される。 ＴＳＧ−６蛋白質はまた、細胞表面、即ち膜に組合された蛋白質であるかもしれ ず、この場合において、繊維芽細胞（あるいはその他の細胞）の表面におけるＴ ＳＧ−６蛋白質の発現は、白血球接着に重要な役割を果たしている。ＴＳＧ−６ 蛋白質の細胞表面での発現は、細胞外マトリックス分子に対してのＴＳＧ−６蛋 白質を生産する細胞の接着特性を変える。このように、ＴＳＧ−６の発現は。 細胞の成長を刺激するかあるいは阻害する。および細胞の形態を変える。という ＴＮＦのよ（実証された能力に関係しているかも知れない、これに関して、細胞 の成長を調節する他のサイトカインであるＴＧＦ−〇が２デコリン（細胞表面の 結合を維持する分泌されたプロテオグリカンの一部）を含む様々なプロテオグリ カンの合成を刺激すること（Ｂａｓｓｏｌｓ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、上述の文献） に注目することは興味のあることである。この作用は、細胞の形態および成長特 性における変化に直接的に関係し得る。デコリンのよりなＴＳＧ−６ポリベブチ ドは、およそ３０キロダルトンの分子量および一つのコンドロチン・サルフェー ト・リンク部位を有する。幾つかの膜プロテオグリカン（ＣＤ４４／ヘルメス（ Ｈｅｒｍｅｓ）のマウスの相同体を含む）が細胞骨格と相互作用することが知ら れており、このことは、増加したＴＳＧ−６蛋白質の発現が細胞の成長あるいは 形態における変化を導き得るその他の櫟構の可能性を提供している。 したがって、ＴＳＧ−６（分泌されたあるいは細胞に組合された）が、細胞の成 長、細胞の運動性および細胞間の相互作用を含む、生命を維持する細胞特性の大 なる影響を有し得ることは明らかである。ＴＳＧ−６のヒアルロン酸への結合能 力（上述参照）、およびヒアルロン酸が細胞表面および細胞外マトリックスの重 要な成分であるという事実を考慮すると、可溶性ＴＳＧ−６が細胞接着を阻害す ると仮定される。他の細胞上よび細胞外マトリックス間での細胞接着は１体内に おける遠い部位に転移する悪性腫瘍細胞の能力に重要である。ある有用なＴＳＧ −６の応用としては、特に組換えＤＮＡ技術により調製されたＴＳＧ−６が、予 防あるいは治療薬として腫瘍細胞の転移を抑制することである。 ＴＳＧ−６蛋白質のＣ末端側の半分と相補的成分であるＣ１ｒとの間の相同性は （図５Ｂ）、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ成分間の相互作用を招＜、Ｃａ”°結合部位で あると考えられているＣ１ｒ領域にある。これは、ＴＳＧ−６の相同的な領域は 、Ｃａ″′″結合部位であり、おそらく蛋白質問相互作用に関係しているかも知 れないことを示唆している。 （実験６） Ａの ＴＳＧ−６の細菌性融合蛋白質を発現させるために、我々はλ６クローン由来の ＥｃｏＲＩｃＤＮＡインサートを用いた。λ６クローンは、図３に示されるＴＳ Ｇ−６ｃＤＮＡ配列において、５゛末端側における４０２塩基対および３゛末端 側における４塩基対を欠失するｃＤＮＡインサートを含んでいる。１１５番目の イソロイシンから２４８番目のアスパラギン酸までをつなぐＴＳＧ−６オーブン ・リーディング・フレームの一部をコードするＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　（４０ ６塩基対）制限断片は、Ｌ６クローンのＥｃｏＲＩｃＤＮＡインサートから分離 され、ｐＡＴＨ２１ベクター（Ｓｐｒｉｎｄｌｅｒ、に、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ ２旦オーブン・リーディング・フレームの一部分（３７キロダルトン）のポリリ ンカー下流における同じ制限部位にクローンされ、結果としてＴｒｐＥ／ＴＳＧ −６５！現プラスミドであるｐＡＴＨ−ＴＳＧ−６（図６Ａ）となった。 同じ制限断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）はまた、細菌性発現ベクターであるｐ ＥＸ３４Ａにインサートされ、結果としてＭＳ２／ＴＳＧ−６発現プラスミドで あ６ｐＥＸ−ＴＳＧ−６となった（図６Ｂ）、ｐＥＸ３４Ａは、ＭＳ２ポリメラ ーゼのＮ末端部位に融合された異種蛋白質の生産をつかさどるｐＥＸ２９の誘導 体（にｌ　１ｎｋｅｒｔ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、４９： ３２９−３３５　（１９８５１）であり、λバクテリオファージの温度誘導性Ｐ −Ｌ・プロモーターによりコントロールされる。 発現プラスミドｐＡＴＨ−ＴＳＧ−６は、コンピテントＥ、ｃｏｌ　１ＨＢｌ。 ｌ細胞に移された。２％カザミノ酸、２０μｇ／ｍｌのＬ−トリプトファンおよ び１５０ｇｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９培地中の、この形質転換され た細胞は、Ａｓ。。＝０．５　（吸光度６００ｎｍ）の細胞密度に増殖した。融 合蛋白質の合成を誘導するために、予め温められた。Ｌ−トリプトファンを含ま ない培地中に細胞は懸濁された。更なる１時間の培養の後、２０μｇ／ｍｌの３ −〇−インドールアクリル酸が添加され、そして更に２４時間培養が続けられた １図７は、予測された大きさの蛋白質（およそ５４キロダルトン）が３−〇−イ ンドールアクリル酸の添加後に事実上誘導されたことを示している。 その他のＴＳＧ−６融合蛋白質の発現のために、組換えプラスミドｐＥＸ−ＴＳ Ｇ−６は、コンピテントＥ、ｃｏｌ　１Ｋ１２＊Ｈ＋ｋＴｒｐ　（Ｒｅｍａｕｔ 、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　１旦：８１−０３　（１９８１））に移され、 そしてそれはλＰ−Ｌ・プロモーターの温度感受性リプレッサーを含んでいる。 この細胞は、２８℃に選択された条件下で高密度に培養された。ＭＳ２／ＴＳＧ −６融合蛋白質の合成を誘導するために、予め温められた、抗生物質を含まない ＬＢ培地の４容量で細胞は希釈され、その後、好ましい酸素供給の条件下、４２ ℃で３時間培養された０図８は、予測された大きさのＭＳ２／ＴＳＧ−６融合蛋 白質（約３２キロダルトン）は特に高い温度で誘導されたことを示している。 両融合蛋白質の精製は、本質的には、５ｔｒｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、により記述 されたようにして（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５７：９８３−９９１　（１９８５））行 なった。ＩＬの培養から得た細胞は、ベレット化され、ＴＥＮ溶液（ｌｏｍＭの トリス塩酸、ｐＨ８，０，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣ１）で洗浄され 、リゾチーム（ｍｇ／ｍｌ）で溶解され、超音波により最終的に破壊された。 不溶性画分く材料）は、遠心分離（２０，０００ｇで３０分）により回収され、 続いて３７℃で３０分間、２０ｍ１の３Ｍウレアおよび５ｍｌの７Ｍウレアで抽 出された。融合蛋白質を含有する７Ｍウレア抽出液は、準備したＳＤＳポリアク リルアミド電気泳動により更に精製された。電気泳動後、この融合蛋白質は、ゲ ルから取除かれ、電気溶出され、要求された濃度に濃縮された。電気溶出された 融合蛋白質の純度が分析用ゲル上でチェックされた。２回の電気溶出の後、純度 の高い融合蛋白質が、ＳＯＳポリアクリルアミド電気泳動においてＥ、ｃｏｌｉ 蛋白質のバンドが検出されることなく得られた（図７におけるレーン７）。 （実験７） ６Ｍ６３７　へのＴＳＧ−６ｃＤＮＡの　ｔトランスフエ　ジョンＴＳＧ−６の 生物学的作用は、ＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡの誘導による、ＴＮＦに対す る応答を示さない細胞系におけるＴＳＧ−６ｅＤＮＡの発現により研究され得る 。かかる目的のために、我々は、ＴＮＦでの処理によってはＴＳＧ−６メツセン ジヤーＲＮＡを発現しない、ＳＶ４０がトランスフオームされたＧＭ６３７細胞 における。ＴＮＦによるＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡの誘導性を実験したく 図１Ｏ参照）、構造発現因子としての発現プラスミドｐＳＶ−ＴＳＧ−６（図９ Ａ）は、プラスミドｐ３Ｖβ１において、β−チューブリン・イソ型ｍβｌのコ ード領域を全長のＴＳＧ−６ｃＤＮＡに置換することにより構築された（Ｌｅｗ ｉｓ、Ｓ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４９：５３９−５４８（１９８７）） 、より容易なりローニングのための適当な制限酵素部位を開発するために、我々 は、１ａｃプロモーター（Ｐ　１　ａｃ）に関係するセンス（ｓｅｎｓｅ）ある いはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）オリエンテーション（Ｏｒｉｅｎｔａ ｔｉｏｎ）において、ＥｃｏＲ１部位に全長のＴＳＧ−６ｃＤＮＡを有するＭ１ ３ｍｐ１８ベクターを用いた。ＴＳＧ−６ｃＤＮＡの５°領域を含むＨｉｎｄ［ ［Ｉ−ＮｃｏＩフラグメントは、アンチセンス・コンストラクト（ａｎｔｉｓｅ ｎｓｅ　ｃｏｎｓｔｒａｃｔ）から分離され、ＴＳＧ−６ｃＤＮＡの３゛領域を 含むＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントは、センス・コンストラクト（ｓｅｎｓｅ 　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）から分離された０両フラグメントは、切断されたプラス ミドｐｓβｌのＨｉｎｄ［ｎ／ＫｐｎＩ部位に結合された。 誘導性発現プラスミドｐＭＡＭ−ＴＳＧ−６（図９Ｂ）はまた、アンチセンス・ コンストラクト由来のＸｂａｌ−Ｎｃｏｒフラグメントおよびセンスコンストラ クト由来のＮｃｏＩ−５ａｌＩフラグメントを、切断されたプラスミドｐＭＡＭ ｎｅｏのＮｈｅＩ／５ａｌＩ部位に結合させることにより構築された１発現ベク ターｐＭＡＭ−ＴＳＧ−６は、デキサメタシンの存在下においてクローンされた 遺伝子の制御可能な高いレベルの発現をもたらす、デキサメタシン誘導性ＭＭＴ Ｖ　ＬＴＲプロモーターに連結されたＲ５Ｖ−ＬＴＲエンハンサ−を含んでいる 。抗生物質Ｇ４１８を含む培地中での増殖によるトランスフエクタントの選択の ために、前記発現ベクターはまた、ＳＶ４０レイター・プロモーターにより駆動 される１ｃｏｌｉ　ｎｅｏ遺伝子を含んでいる。 この構築されたプラスミドの両方は、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ，）　−ＤＮ Ａ沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、、Ｖｉｒｏｌｏ　５２：４５６　（１９７３ ））の使用によりＧＭ−６３７細胞系をトランスフェクトするのに用いられた。 ｐＳＶ−ＴＳＧ−６での安定なランスフェクションの幾つかの場合においては、 Ｇ４１８耐性を付与するｐＲ３Ｖｎｅｏ　（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，ｅｔ　ａｔ。 、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１　：５５１　（１９８３））が共にトランスフェクト された。リン酸カルシウム（ＣａＰＯ，）−ＤＮＡ沈殿の安定したトランスフェ クシヨンのため、ＧＭ−６３７細胞は、１０％子ウシつ児血清およびゲンタマイ シン・スルフェートを含有するＭＥＭ培地中で３７℃で５％のＣｏｔガス圧下で 保存された。細胞は、−週間で三鷹ｌ：５の割合で分裂した。ヒトＧＭ−６３７ 細胞をトランスフェクトするために、トランスフェクションに先立って、５ｍｌ の培地が入った６０ｍｍのプレートに５ＸｌＯ’の細胞が接種されたプレートが １日間種培養された。ＴＳＧ−６発現プラスミドであるｐＭＡＭ−ＴＳＧ−６， あるいはｐＳＶ−ＴＳＧ−６とｐＲ３Ｖｎｅｏとの混合物は、０．２５ｍ１のＣ ａＣｌ２と共に混合された０等量の２倍濃度のＨＢＳ溶液（ｐＨ７，０５；２８ ０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＨＣＩ、１．５ｍＭのＮａｇ　ＨＰＯ４”２Ｈｔ 　０．１２ｍＭのデキトロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ）が添加され、この溶液 は室温で２０分間培養された。ＣａＰＯ，−ＤＮＡ懸濁液は、プレート上に滴下 され、混合された。５％のＣＯを分圧において３７℃で５時間細胞を培養した後 、トランスフェクトされた細胞は、１倍濃度のＨＢＳ中で１５％グリセリンを用 いて３０秒間処理することによりグリセリン・ショックを与えられ、更に２０時 間培養された。密集成長した細胞の単層は、ネオマイシン耐性マーカーを発現す る細胞を選択するためにＧ４１８　（８００ｕｇ／ｍｌ）を含有する培地中に再 び蒔かれた。コロニーは、クローニング・リングの使用を通してトランスフェク ション・プレートから分離され、２４穴プレート中でサブクローンされ、単層培 養に広げられた。ＴＳＧ−６ｃＤＮＡの発現のため、複数の独立したトランスフ エクタントが選択され、ノーザン・プロット分析により試験された。 図１Ｏは、幾つかのトランスフエクタントはＴＮＦの存在しない条件下でＴＳＧ −６メツセンジヤーＲＮＡを発現することを示している。主要なバンドは、ＦＳ −４細胞中でＴＮＦにより誘導されたＴＳＧ−６−メツセンジャーＲＮＡに相当 するバンドと同じ大きさであった。このバンドの上方部分は、ポリアデニル化シ グナルにおけるＴＳＧ−６ｃＤＮＡの不完全なプロセッシングの結果によるもの かもしれない、これらのｉランスフエクタントにおけるＴＳＧ−６タンパクの発 現は、前記ＴＳＧ−６細菌性融合タンパクに対して生成されたポリクローナル抗 血清助剤を用いたウェスタン・プロット分析により確認された（上述参照）。 （実験８） ＴＮＦによるＴＳＧ−６メツセンジ　−ＲＮＡの　：　Ａ　につい二匹隻葺 ＴＮＦによるＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡの誘導性が、ノーザン・プロット 分析により様々な細胞系において試験された。検知可能なＴＳＧ−６メツセンジ ヤーＲＮＡの存在は、ホーミング・レセプターＣＤ４４に対するＴＳＧ−６蛋白 質の相同性を考慮すると興味深かった。ＴＮＦに高い応答性を示し、ＴＮＦの炎 症性作用の分析に有用性を示す一つの細胞の類型であるヒト請静脈内皮細胞（Ｈ ＵＶＥＣ）が試験された。また、ＳＶ４０・ウィルス性トランスフオームされた ヒト２倍体繊維芽細胞の系である。ＧＭ−６３７細胞が試験された０図１１は、 ＴＮＦの刺激によっては、これらの細胞がＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡを発 現しないことを示している。他に選択された細胞系（Ｕ９３７．Ａ６３７、Ｃｏ １ｏ２０５．ＨＴ２９およびＳＫ−ＭＥＬ−１９）もまた、ＴＮＦ処理後にＴＳ Ｇ−６メツセンジヤーＲＮＡを生産しなかった。これらの細胞系はＴＮＦの作用 に応答性を示しているので（Ｌｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、１９８７．上述の文献） 、この非応答性はＴＮＦレセプターが細胞表面に欠失していることに原因するの ではない。これらの発見は、ＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡの発現は正常な結 合組織起源の細胞にのみ制限されている可能性を示している。 この考えを確かめるために、他の正常な繊維芽細胞（ＦＳ−４８，ＦＳ−４９右 よびＷＩ−３８１における、およびＳＶ４０・ウィルスでトランスフオームさレ タ繊維芽細胞（ＷＩ−３８ＶＡ１３．ＧＭ−６３７１あるいは５Ｖ４０−ラージ Ｔ抗原のみでトランスフオームされた繊維芽細胞（ＦＳ−４−３Ｖ１．ＦＳ−４ −５Ｖ２．ＦＳ−４−５Ｖ３）Ｌ：ｊ；け６．ＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡ の誘導性が試験された。ＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡは、ＳＶ４０・ウィル ス性トランスフオームされた繊維芽細胞（Ｗｌ−３８ＶＡ１３．ＧＭ−６３７） 中ではなく、全ての正常な繊維芽細胞中で実際に誘導された。興味深いことに、 ＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡのＴＮＦによる誘導は、ＳＶ４０・ラージＴ抗 原てトランスフェクトされたＦＳ−４細胞中で著しく減少した（図１２）。これ は、これらのトランスフエクタントのＴＮＦ応答性の全体的な減少に原因がある ではなかった。例えば、ＴＮＦで刺激された他の遺伝子（上述）によりコードさ れたＴＳＧ−１４メツセンジヤーＲＮＡは、ＴＮＦ処理後におけるＦＳ−４細胞 中よりもラージＴ抗原トランスフエクタント中でより高く誘導される。“腫瘍” 形質転換の程度がＴＳＧ−６メツセンジヤーＲＮＡの誘導性に対する影響を調節 していると結論された。 （実験９） ポリクローナル　゛の−　およびイミュノ・アフ　ニテ　−・クロマト　ラフ　 −による　ＴＳＧ−６の 先ず初めに、ウサギが、完全フロイント・アジュバント中に懸濁されたエニエ旦 ／ＴＳＧ−６融合蛋白質の約２００μｇで免疫され、不完全フロイント・アジュ バント中に懸濁された前記蛋白質の前記量で２〜３週の間隔で追加免疫された。 注射は、静脈に行なわれた最終の追加免疫を除き、全て皮下に行なわれた。 免疫化された後、ウサギは６日間採血された。５ｔｒｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（ 上述の文献）に従ってイミ二ノ・ブロッティングを行なうことにより、血清が分 析された。 ＬＬ！工／　Ｔ　Ｓ　Ｇ　−６融合蛋白質に対して生じた抗体は、ＦＳ−４細胞 およびその他のヒトの細胞の上演あるいは抽出液からの蛋白質における広い領域 に非特異的に結合することを示す。この融合蛋白質に右けるＴＳＧ−６領域に特 異的な抗体を得るため、抗血清はＭＳ２／ＴＳＧ−６融合蛋白質がカップリング されたイミュノ・アフィニティー・マトリックスで精製された。 イミ１ノ・アフィニティー・クロマトグラフィー・マトリックスは、以下のよう にして調製された。精製されたＭＳ２／ＴＳＧ−６融合蛋白質の５ｍｇが。 ０．５ＭのＮａＣ１で粗透析された。３ｍｌのＥ　ＨＡ−セファロース４８（フ ァルマシア社製）の３ｍｌが０．５ＭのＮａＣ１で粗洗浄され、精製されたＭＳ ２／ＴＳＧ−６融合蛋白質が添加された。ｐＨは４．５に調整され、１ｍｌの蒸 留水に溶解された４０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルボジイミド・ヒドロクロライド（アルドリッヒ・ケミカル社製）が、撹拌の 間滴下された。その後、ｐＨは４．５に再調整され、カップリング反応が連続的 な撹拌条件下で一昼夜行なわれた。２００μｌの酢酸が、マトリックス上のアミ ノ残基をブロックするため更に４時間添加された。最後に、マトリックス材料は 、ｐＨが４．０であるＯ、ＬＭの酢酸緩衝液上よび０．５ＭのＮａＣ１と、ｐＨ ８，３であるＯ、ＩＭの重炭酸ナトリウム緩衝液および０．５ＭのＮａＣ１とで 交互に洗浄され、保管のためトリス緩衝生理食塩水中に懸濁された。 イミュノ・アフィニティー・クロマトグラフィーのために、０．５ｍｌのＭＳ２ ／ＴＳＧ−６セフアロースを、０．０５％のトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　（ ＴＴＢＳ）を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＴＢＳ）（２０ｍＭのトリス。 ０．５ＭのＮａＣ１，ｐＨ７，５）で安定させた。ＴｒｐＥ／ＴＳＧ−６融合蛋 白質に対して生じる抗血清の１ｍｌが、０．５ｍｌのＭＳ２／ＴＳＧ−６セフア ロースおよび０．５ｍｌのＴＴＢＳと共に混合され、この混合物は一定の撹拌速 度で４℃で一昼夜りリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中でインキュベートされ た。この懸濁された固体相マトリックス材料は遠心管中に移され、１０ｍ１のＴ ＴＢＳで洗浄された。その後、沈殿物はエッペンドルフチューブに移され、遠心 分離され（１４，ＯＯＯｒｐｍで２分間）、その上清は注意深く除去された。ｐ Ｈが２．５であるＯ、１Ｍグリシン−塩酸緩衝液の１ｍｌが添加され、ゲルは２ 分間勢いよく振とうされた。更に遠心分離した後、上演は直ちに固体トリスで中 和された。 （実験１０） ＴＮＦ　されたＦＳ−４およびＴＳＧ−６ベクターでトランスフェクトされたＧ Ｍ−６３７の　、および　えＴＳＧ−６，の予測されたＴＳＧ−６蛋白質のアミ ノ酸配列は、推測上メチオニンから開始し、その後に１１個の疎水性アミノ酸お よび電荷を有する部分が続（特長を有している。ＴＳＧ−６蛋白質のアミノ酸配 列の一部は消化性のシグナル・ペプチドの特長を有する。ところで１分泌型およ び膜結合型（完全型あるいはフォスファチジルイノシトールとリンクした型）の 両方で存在することが知られている蛋白９１　；Ｃａｍｅｒｉｎｉ、Ｄ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４２ニア８　（１９８９））、ＴＳＧ−６蛋白質は、 細胞膜と相互作用し得るＣ−末端部分に右いて疎水性アミノ酸が伸びているので 、グリコシルーホスファチジルイノシトール構造によって細胞表面に結合させら れているのかも知れない、これらの可能性を識別するため、（ａ）７〜２４時間 ＴＮＦで処理されたＦＳ−４細胞、あるいは（ｂ）ＴＳＧ−６ｃＤＮＡでトラン スフェクトされたＧＭ−６３７細胞（ＧＳＶ−Ｌ５と称する）の培養上演あるい は抽出物のどちらにＴＳＧ−６蛋白質が存在するのかを調べる実験が行なわれた 。 ５％ＦＣ５を含有するＭＥＭ培地中でＦＳ−４細胞が密集培養された後、前記培 地は、０．２５％ＦＣ３と前記培地中に３日間維持された細胞とを含むＭＥＭ培 地と交換された。その後、この培地は除去され、ＦＳ−４細胞には２０　ｎ　ｇ ／ｍｌのＴＮＦ−αを含む、あるいは含まない０．２５％ＦＣＳを含有するＭＥ Ｍ培地が供給された。５時間後、この培地は可欠アミノ酸を含有する無血清のＭ ＥＭ培地と交換された。（ＴＮＦ処理された培養には再び２０ｎｇ／ｍｌのＴＮ Ｆ−σが供給された）、ＧＳＶ−Ｌ５細胞は、１０％ＦＣ３および８００　ｕ　 ｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＭＥＭ培地中に密集成長した。その後、培地は非 必須アミノ酸を含有する無血清のＭＥＭ培地に交換された。そして、培養土清右 よび細胞のペレットが集められ、化学的に処理された後、ＦＳ−４ｇよびＧＳＶ −Ｌ５細胞は１合計７〜２４時間培養された。細胞培養の上清は、遠心分離によ り集められ、不純物が除去され、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置中で約１００− フォールド（ｆｏｌｄ）まで濃縮された。細胞のベレットは無血清培地で洗浄さ れ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動サンプル・バッファー中に溶解された。 試料のウェスタン・プロット分析のため、ミニ・プロティン■・エレクトロフォ レシス・セル（バイオ・ラッド社製）中で１２．５％ポリアクリルアミドゲルが 用いられた。電気的転写は、転写培地としてのニトロセルロース（トランス−プ ロット・トランスファ・メディウム、バイオ・ラット社製）を用いて１ＯＯＶで １時間行なわれた。トリス緩衝生理食塩水中で１％−プロット（ｂｌｏｔｔｏ） −でブロック（ｂｌｏｃｋ）した後、精製されたウサギ抗ＴＳＧ−６抗血清が第 一抗体として用いられ、ビオチニル化されたヤギ抗ウサギ・イミュノグロブリン が第二抗体として用いられ、アビジン−ビオチニル化されたアルカリホスファタ ーゼ複合体（ベクタスタイン、ベクター・ラボズ社製）が検出システムとして用 いｃ）ｈだ。 ｉ”ｒｐＥ／ＴＳＧ−６融合蛋白質のＴＳＧ−６領域に特異的な、免疫精製され た抗体は、コントロール細胞の上清でなく、ＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞ある いはＧＳＶ−Ｌ５細胞の濃縮された上清中において１つあるいはそれ以上のバン ドを検出した（図１３．パネルＡ〕。これらのバンドは、同じウサギからの免疫 精製されたプレーイミュノ（ｐｒｅ−ｉ−ｍｍｕｎｅ）血清では検出されなかっ た（図１３．パネルＢ）、ＧＳＶ−Ｌ５細胞（図１４）あルイはＦＳ−４細胞の 溶解物中においては、免疫精製された抗体によるバンドは検出されなかった。Ｔ ＮＦ処理されたＦＳ−４細胞およびＧＳＶ−Ｌ５細胞の無血清培養上溝中で検出 される主要なバンドは、３８〜４１キロダルトンに相当しく図１３．パネルＡ） 、ＴＳＧ−６蛋白質のグリコジル化されたモノマーを示していると考えられる。 １１Ｏキロダルトンよりも大きい分子量に相当するバンドは、ＧＳＶ−Ｌ５細胞 （図１３．パネルＡ）およびＦＳ−４細胞の無血清培養上演中で時折観察され、 そしてこのバンドは、右そら＜ＴＳＧ−６蛋白質のオリゴマー型あるいはグリコ サミノグリカンがリンクした形態を示している。およそ３２キロダルトンの分子 量に相当し、おそらく非グリコジル化の、あるいは部分的にグリコジル化された ＴＳＧ−６モノマーを示しているその他のバンドは、血清が含まれるＧＳＶ−Ｌ ５倍養から免疫精製されたＴＳＧ−６試料中において観察され（図１６）、無血 清のＧＳＶ−Ｌ５培養の濃縮された上清中において時々観察された（図１５）。 （実験１１） ヒアルロン　へのＴＳＧ−６の　Ａ ＴＳＧ−６蛋白質のヒアルロン酸結合特性を分析するために、ヒアルロン酸は、 アフィニティー・クロマトグラフィーのマトリックスとして使用されるセファロ ースにカップリングされた。 軟骨プロテオグリカン・コア・蛋白質およびリンク蛋白質のヒアルロン酸への結 合は、高い特異性であるが、イオン相互作用により少なくとも部分的に維持され ているということが知られている。軟骨プロテオグリカン・コア・蛋白質のヒア ルロン酸結合領域に高く維持された（Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１５７：１２７　（１９７６））、およびリンク蛋白質に 右ける（Ｌｙｏｎ、Ｍ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ、８８１ 　：２２　（１９８６））塩基性アミノ酸残基は、この相互作用にとって欠くこ とができないものである。ヒアルロン酸中のウロン酸残基の修飾はまた、蛋白質 −ヒアルロン酸相互作用を妨害する（Ｃｈｒｉｓｔｎｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、 Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、Ｊ、１６７：７１１　（１９７７））、高い塩濃度はリンク蛋白質の ヒアルロン酸への結合を妨げ、リンク蛋白質−ヒアルロン酸複合体を溶解する（ Ｇｏｅｔｉｎｃｋ、Ｐ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、ｉ０５： ２４０３　（１９８７１：Ｔｅｍｇｂｌａｄ、Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１９ ９：２９７　（１９８１））。 ＴＳＧ−６蛋白質はプロテオグリカン・コア・蛋白質のヒアルロン酸結合領域と かなりの相同性を示すので、ＴＳＧ−６蛋白質の）ＩＡ（ヒアルロンａｔ）−セ ファロースへの結合を証明するために計画された実験において、高い塩濃度は溶 離のために用いられた。 ヒアルロン酸をセファロースにカップリングさせるために、ウシの気管に由来す るヒアルロンＷＩ（シグマ・ケミカル社製）が０．５ＭのＮａＣ１で粗透析され た。ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）の５ｍｌは、０．５ＭのＮ ａＣ１で粗洗浄され、ヒアルロン酸溶液と混合された。ｐＨは４．５に調整され 、１ｍｌの蒸留水中に溶解された４０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル ）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロライド（アルドリツヒ・ケミカル社 製）は、一定の撹拌条件下で滴下されたａｐｌは１時間の間４．５に維持された 。−昼夜反応混合物を攪拌した後、ＥＡＨ−セファロース上のアミノ残基をブロ ックするため、２００μｌの酢酸が更に４時間添加された。最終的にマトリック ス材料は、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０，０，５ＭのＮａＣ１を含有）およ びＯ，１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，５，０，５ＭのＮａＣ１を含有）を交 互に用いて数回洗浄され、リン酸緩衝生理食塩水中に再び懸濁された。コントロ ールのセファロースは、ヒアルロン酸を用いないことをを除いて前記と同様にし て調製された。 同様にして活性化され、ブロックされたコントロールのセファロース・マトリッ クスではなく、ＨＡ−セファロースへのＴＳＧ−６蛋白質の結合を証明するため に、ＧＳＶ−Ｌ５細胞の濃縮された無血清培養上演が用いられた。ＨＡ−セファ ロースあるいはコントロールのセファロース（どちらも２００ｕ　１ずつ）は、 ５００μｌの濃縮されたＧＳＶ−Ｌ５細胞の上清および５００ｕｌのリン酸緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ）と共に一昼夜４℃で一定の撹拌条件下でインキユベートさ れた。その後、上清は取り去られ、抗ＴＳＧ−６抗体を用いたウェスタン・プロ ッティングにより分析された。セファロースはｌｏｍｌのＰＢＳおよび０．０５ ％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するｌｏｍｌのＰＢＳで洗浄された 。その後、ＨＡ−セファロースもコントロールのセファロースも、３ＭのＮａＣ １を含有する。ｐｔｉが８．５で２０ｍＭのトリス−塩酸のｌ　ｍ　ｌで溶出さ れた。この処理操作は、エツペンドルフ・チューブ中で行なわれた。勢のよい撹 拌および遠心分離の後、上演は取り去られ、トリス緩衝生理食塩水で透析され、 ウェスタン・プロッティングにより分析された（図１５）、コントロールのセフ ァロース・マトリックスは検出可能なＴＳＧ−６蛋白質を結合していなかったの に対し、ＨＡ−セファロースは、事実上、濃縮されたＧＳＶ−Ｌ５培養土清中に 存在する全てのＴＳＧ−６蛋白質を結合していた。無血清培地中で長時間培養（ ２０〜２４時間）された後のＧＳＶ−Ｌ５からの上清中において検出可能な、約 ３２キロダルトンの分子量を示しているバンドは、おそらく非グリコジル化ある いは部分的にグリコジル化されたＴＳＧ−６モノマーを表わしている。 血清が含まれている培地（１０％ＦＣ３）中で培養されたＧＳＶ−Ｌ５培養上演 が、ＨＡ−セファロースによるアフィニティー・クロマトグラフィーに用いられ たとき、３つの明瞭なバンドがウェスタン・プロットにおいて検出可能であった （図１６）、約３２キロダルトンの分子量に相当する一つのバンドは、おそら（ 非グリコジル化された、あるいは部分的にグリコジル化されたＴＳＧ−６千ツマ −を示している。３８〜４１キロダルトンの分子量に相当する主要なバンドは、 おそらくＮ−グリコジル化されたモノマーを示している。１１０キロダルトンよ りも大きい分子量に相当する三つめの（より散在した）バンドは、ＴＳＧ−６オ リゴマーあるいはＴＳＧ−６のグリコサミノグリカンとリンクした形態を示して いると考えられた。 （実験１２） ＴＳＧ−６お 重要なリンパ球・ホーミング・レセプターたるＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅ ｓ）との相同性に基づき、ＴＳＧ−６は白血球接着において、ある役割を果たし ていることが予測される。このＴＳＧ−６の白血球接着における役割により、ヒ トーＰＨＡ芽細胞−（植物性血球凝集素（ＰＨＡ）およびインターロイキン２の 存在下で培養された末梢血Ｔ細胞）の接着における著しい増加が導かれたという ことを示すために、かかる予測はＴＮＦでＦＳ−４細胞を処理することにより試 験された。ＴＮＦは、接着性分子たるＩＣＡＭ−１（Ｄｕｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ。 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：２４５　（１９８６））の調節に より少なくとも部分的に媒介された内皮細胞への白血球接着を増加させる。ＴＮ Ｆはまた。ＨＵＶＥＣ中の好中球接着性分子たるＥＬＡＭ−１を調節する（Ｂｅ ｖｉ　１ａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、ｅｔ　ａｍ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：９２３８（１９８７）；５ｃｉｅｎｃｅ　２４旦：１１ ６０（１９８９１）。 白血球（例えばＰＨＡ芽細胞）接着および好中球接着の定量分析は、発行された 文献（Ｄｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、上述の文献ＨＢｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ ａｌ、、上述の文献）の方法に本質的に従って行なわれた。この出願の中で記載 された。ＴＳＧ−６蛋白質に特異的な抗体は、ＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞へ のＰＨＡ芽細胞の接着の増加を阻害するそれらの能力について実験された。 ウサギ抗ＴＳＧ−６抗体での、および、特にＴＮＦ誘導時においてＣＤ４４／ヘ ルメス（Ｈｅｒｍｅｓ）に相同的なＴＳＧ−６エピトープに特異的なポリクロー ナル抗体およびｍＡｂでのＦＳ−４細胞の処理は、Ｔ細胞接着を減少させること がわかった。 この相互作用の特異性は、ＴＳＧ−６に結合しないＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒ ｍｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ　Ｂｕｔｃｈｅｒ博士（スタッフォード大学）により生 産された）に特異的なｍＡｂを用いて証明された（Ｊａｌ　ｋａｎｅｎ、Ｓ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅｌ　ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５：９８３　（１９８７））、抗 ＣＤ４４／ヘルメス（ＨｅｒｍｅｓＪ抗体が前記接着反応を阻害しなかったこと は。 ＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞中に右けるＣＤ４４／ヘルメス（Ｈｅｒｍｅｓ） の発現でなくＴＳＧ−６の発現に原因することを示している。 ＴＳＧ−６の誘導を経由した。ＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞の接着におけるＩ ＣＡＭ−１の役割が、ＩＣＡＭ−１および／またはそのリガンドＬＦＡ−１に特 異的なｍＡｂを用いて分析された（Ｄｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、上述の文献１ 、ＩｃＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対する抗体は、Ｔ細胞のレベルでＴＮＦ処理 されたＦＳ−４細胞へのＰＨＡ芽細胞接着を減少させることがわかった。ＴＳＧ −６に対する抗体およびＣＤ４４に相同的な部分に相当するＴＳＧ−６のペプチ ドはまた。ＦＳ−４細胞レベルでＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞へのＰＨＡ芽細 胞接着を阻害することがわかった。 ＦＳ−４細胞への好中球接着におけるＴＳＧ−６の重要性右よびＥＬＡＭ−１の 役割は（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、上述の文献）、上述のような抗 ＴＳＧ−６抗体およびＥＬＡＭ−１に特異的なｍＡｂを用いて評価された０両タ イプの抗体がＴＮＦ処理されたＦＳ−４細胞への好中球接着を阻害するというこ とが示されたことは、好中球上のＥＬＡＭ−１および繊維芽細胞におけるＴＳＧ −６（あるいはＴＳＧ−６依存性プロセス）間の相互作用を示している。 （実験１３） 外科手術あるいは生体組織検査を経験した患者から得られた関節の軟骨片（およ そ？Ｉ！潤重量で４ｍｇ）が１０％ＦＣ５を含有するＤＭＥＭ中に３７℃で４８ 時間維持された。各軟骨片は、それから９６穴プレートの穴に移され、何も添加 しない、あるいはヒトＴＮＦを添加した、あるいはヒトＴＮＦおよび抗ＴＳＧ− ６抗体を添加した０、２ｍｌの培地中で培養された。培地は約３日で交換され、 培養は約６日後に終った。この軟骨の外植体は培地から移され、パパインで完全 に消化された。この消化物の、およびこの培地のコンドロイチン・サルフェート 含有量が、メタクロマティック染料であるジメチルメチレン・ブルーを使用する ことにより評価された（Ｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２５６：１０８４７　（１９８１））、ＴＮＦが軟骨由来のプロテオグ リカンの放出を誘起しているということ、および抗ＴＳＧ−６抗体がこの分解反 応を阻害するということは、ＴＳＧ−６がＴＮＦにより誘起されるプロテオグリ カン放出の媒介物であることを示している。 （実験１４） ヒト　ｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　におするＴＳＧ−６の上述のウェスタ ン・プロットの方法は、様々な関節痛患者の関節液および血清中におけるＴＳＧ −６の存在を検出し、その定量を評価するために用いられた。 表４に示すように、関節液試料のほとんどが、３９キロダルトンに相当するノ＼ ンドを相対的に高いレベルで有している。同じ固体からの血清は前記バンドを低 いレベルで有していたことは、ＴＳＧ−６が炎症した関節中で生産されたことを 示している。 寿４　関ｌ１１１沓率者の関節液および血清におけるＴＳＧ−６タンパクのレベ ル細菌性敗血症患者の血清が試験された（表５）、４人の敗血症患者の全員がＴ ＳＧ−６蛋白質の検出可能なレベルを有し、この内の３人のレベルは、健康な人 のコントロールに比べて著しく上昇していた。 味する。 細菌性のリボ多糖体（ＬＰＳ）の注射により、健康なボランティアの体内でＴＳ Ｇ−６蛋白質が誘導され得るか否かを調べるために試験が行なわれた。ボランテ ィアは、標準菌体内毒素（旦、ｃｏｌｉ　０１１３）の４ｎｇ／ｋｇの注射を受 けた。その後、適宜の時間における血清がサンプルされた。結果は１表６に示す 通り、ボランティア中１．２および５の人においては、注射後３および／または ６時間経過した時点においてＴＳＧ−６のはつきりした上昇が観察されたことを 示した。ＴＳＧ−６の上昇は、他のボランティアからの血清においてもまた観察 された。 上記の参考文献の記載はここでの言及により、特別に組込まれたか否かのいずれ にせよ、全てこの出願の内容に組込まれる。 この発明の精神および範囲からはずれない限りにおいて、また不適当な実験でな い限りにおいて、同等のパラメーター、濃度および条件の広い範囲内において同 様の技術でこの発明を実行することができる。 この発明の詳細な具体的態様に間して、この発明が記載されていた間、更なる修 正が可能であることが考えられた。この出願は、この発明の原則に一般的に従い 、この発明が属する技術の分野に右ける公知のあるいは慣習的なプラクティスの 範囲内に入るような変更であって、かつ、以下に示されたクレームの範囲内から 外れることな（、この出願の本質的特長に適合するような変更を含む、この発明 のいくつかのバリエーション、使用あるいは応用をも包含することを意図してい る。 シーフェンス・リスト （１）一般的情報： （ｉ）出願人：　Ｌｅｅ、Ｔａｅ　）（。 Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｌ、Ｈａｎｓ　ＧｅｏｒｇＶｉ　１ｃｅｋ、Ｊａｎ （ｉ　ｉ）発明の名称：サイトカイン誘導タンパクＴＳＧ−６，該ＴＳＧ−６タ ンパクをコードするＤＮＡおよび該ＴｓＧ−６タンパクの利用（ｉｉｉ）配列の 数：２ （ｉｖ）通信宛先 （Ａ）宛先：Ｂｒｏｗｄｙ　ａｎｄ　Ｎｅｉｍａｒｋ（Ｂ）ストリート：４１９ 　５ｅｖｅｎｔｈ　５ｔｒｅｅｔ、ＮＷ（Ｃ）シティ：ワシントン （Ｄ）ステイト：ＤＣ （Ｅ）郵便番号：　２０００４ （Ｖ）コンピューターの読み込み形式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンビニ−ター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）　オベシー＋４：／グ・ システム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＣ５（Ｄ）”）フトウエア：Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ’＃１．２４（ｖｉ）本願に関するデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）アト−ニー／エージェントに関する情報（Ａ１名前：Ｌｉｖｎａｔ 、５ｈｕｅｌ（Ｂ）登録番号：３３，９４９ （Ｃ）リファレンス／ドケットの番号：ＶＩＬＣＥＫ＝１（ｉｘ）通信先 （Ａ）電話番号：２１２−６２８−５１９７（Ｂ）ファクシミリ番号：　２１２ −７３７−３５２８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに関する情報：（ｉ）配列 の特徴 （Ａ）長さ：１４１４塩基対 （Ｂ）種：核酸 （Ｃ）ストランドの別ニー水銀 （Ｄ）トポロジーニー次配列 （ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源種： （Ａ）生物：ホモ・サピエンス （Ｇ）細胞種：繊維芽細胞 （Ｈ）細胞系：　ＦＳ−４ （ｉ　ｘ）特徴 （Ａ）名前／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）配置：６９番目の塩基〜８９９番目の塩基（Ｃ）その他の情報： （ｘｉｌ配列の描写：ＳＥＱ　ｉＤ　ＮＯ：ｌ：＋２１ＳｎＱ　１０　ＮＯ：２ に関する情報：１ｉ１配列の特ｒｌｊ＝ （＾）長さ：２７７１４のアミノ酸 （Ｃ）トポロジー・−次配列 Ｎｅｔ　Ｔｈｒ　ｉＪｕ　Ｌｙｓ　ｒ’ｍ　Ｌ＊ｕ　Ｓｅｔ　八３ｐ　Ａｌａ　 Ｓａｔ　Ｖａｌ　丁＋＋ｒ　八Ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｍ２２５　２３０　２ ３Ｓ　２４０ （：１ｎ　Ｉｌ＠Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍ＠七＾Ｎｐ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　！ｊ＠ｒ　Ｉ、ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｕｒ　（ｉｌｎ　ａ撃■ Ｌｙｅ　Ａｇｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｌ＋ｒ　Ｓ＠ｒ　丁ｈｒ　Ｃ１ｙ 　Ａ＠ｎ　Ｌｙｓ　＾ｌＩｎ　Ｐｈｅ　Ｌ＠Ｌｌ　＾Ｉｓ　fｌｙ ２Ｇ０　２６５　２〕０ （％ｌ　１１ｉＮ　（％）＃■ （％）　＃鼾　（％ｌ　ｉｌｌ？Ｉｆｆ（％）＃罰　（％）爺Ｃ （％）　曽鄭　ｔ％ｌ　鯖樅 ロロ　ｏｏ　ｏｏ　ロ０　００　０ロ　ロ。　ロトＮ４　１０ｖ６４ｍ　ロロ　 ψ閂　へ−ロリ　啼ト４−ｑＦ＋−１ｗｌ−％ｏｒｓ　％ＯＮ　ｒ＋Ｎ　ト１　 −へ肘　韮　を左　ｕＨミ　鼎　吋　お 話；に　Ｆ　ｅＡ　９Ｅ　ｇ’ｉ：　ａａ　’；：左”３’；３　’ｇ５　・６ 曇’ａＡ　”Ｆ）５　’韮”！ｙ、”Ｅ”。 ｕ５　ｇ５　ＨＢ　Ｅ５ＨＢ　Ｈ，ｑ　Ｈｐ　Ｈ，Ｈ’６Ｃ’？！＊：Ａ　２： ｉ　Ｈｆｆ　（シ　２片　５ｍ　２５°ｔ、３Ｅ　°話°と３　°詩’Ｌ”！５ 　″！誕°話ａｈ　Ｅ＃　ｉ＝　吋ｇ’ａ　、ａ　ＱＡ　５：ｌコ　専　ジ５ｉ ミ　■　ジ誕　Ｅ２　吋、訂・ｌ−お−ミミ・吋・目ｊ−睦・ｑ召關　話　ｉ＃ 、ａ、５　Ｈ，ａ　ミ９　話　トよツ！　吋　關　Ｆ、５　ｔｉＥ　吋　ジ５　 ■、■　、ミミ、恥、ｉミ、訂、■、■、ジａ図４ ｋ　ペ　ロ　関　（Ｍ＆ａ＋０−−−　ぺ　ψ　０１ト　エ　ｈ、＋１＋　へ　 ψ　関　ト　−　χ　χ　１　〉−図７ Ｍ　＋２　Ｍ３４５６ ＦＳ−４図１０Ａ １巻 ＦＳ−４（ＴＮＦ　／Ｉｈ１ ｉＩ　ＧＭ６３７ 魯　ＧＭ　６３７　（ＴＮＦ　４ｈ） 図１０８ 図１１　Ａ　図１１　Ｂ 、４７八　１　２　ス　Ａ　Ｗ　ｅ の 図］Φハ　°　′　、）４５　′） Ｄ 平成５年７月１４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然に存在するときには本来的に付随する他の蛋白質または糖蛋白質を実質 的に含まない、種瘍壊死因子で誘導された蛋白質または糖蛋白質分子であるＴＳ Ｇ−６またはその機能性誘導体。 ２．請求項１に記載の分子であって、見掛けの分子量が変性条件下で、約３２ｋ Ｄａであるもの。 ３．請求項１に記載の分子であって、見掛けの分子量が変性条件下で、約３８な いし約４１ｋＤａであるもの。 ４．請求項１に記載の分子であって、見掛けの分子量が変性条件下で、少なくと も１００ｋＤａであるもの。 ５．請求項１に記載の分子であって、該Ｎ末端アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ： ２のＮ末端アミノ酸配列であるもの、またはその機能性誘導体。 ６．そのＤＮＡ分子が天然に存在するときには本来的に付随するところの、隣接 する核酸配列を実質的に含まない、ＴＳＧ−６またはその機能性誘導体をコード するＤＮＡ分子。 ７．請求項５に記載のヒトＴＳＧ−６蛋白質をコードするＤＮＡ分子であって、 他のヒト核酸配列を実質的に含まないもの。 ８．請求項６に記載のＤＮＡ分子であって、ｃＤＮＡであるもの。 ９．請求項６に記載のＤＮＡ分子であって、ゲノムＤＮＡであるもの。 １０．請求項６に記載のＤＮＡ分子であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチ ド配列を有するもの。 １１．請求項６に記載のＤＮＡ分子であって、発現媒体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｖｅｈｉｃｌｅ）であるもの。 １２．請求項１１に記載のＤＮＡ分子であって、該媒体がプラスミドであるもの 。 １３．請求項１１に記載の分子によって形質転換された原核細胞宿主。 １４．請求項１２に記載の宿主であって、細菌であるもの。 １５．請求項１１に記載の分子によって形質転換された真核細胞宿主。 １６．請求項１５に記載の宿主であって、酵母細胞または哺乳類細胞であるもの 。 １７．それが本来的に付随する他の蛋白質または糖蛋白質を実質的に含まないヒ トＴＳＧ−６蛋白質分子またはその機能性誘導体を製造する方法であって、（ａ ）培養条件下で該ＴＳＧ−６蛋白質を発現する能力のある宿主細胞を培養し、 （ｂ）該蛋白質またはその機能性誘導体を発現させ、（ｃ）該培養物から該蛋白 質またはその機能性誘導体を回収する、ことからなる方法。 １８．請求項１７に記載の方法であって、宿主が原核細胞である方法。 １９．請求項１７に記載の方法であって、宿主が真核細胞である方法。 ２０．請求項１に記載の蛋白質に対して特異的な抗体。 ２１．請求項２０に記載の抗体であって、単クローン性であるもの。 ２２．生物学的試料中におけるＴＳＧ−６蛋白質の存在を検出する方法であって 、（ａ）該ＴＳＧ−６蛋白質の含有が疑われている生物学的試料を、該蛋白質と 結合する能力ある分子と接触させ、そして（ｂ）該蛋白質に結合した該分子を検 出する、ことからなる方法。 ２３．請求項２２に記載の方法であって、該分子が抗体または抗体の断片である 方法。 ２４．請求項２３に記載の方法であって、該抗体が単クローン性抗体である方法 。 ２５．請求項２２に記載の方法であって、該分子がヒアルロン酸分子である方法 。 ２５．被検体内の通常のＴＳＧ−６蛋白質または突然変異ＴＳＧ−６蛋白質をコ ードする核酸の存在を検出する方法であって、（ａ）該被検体から得られた細胞 、またはその抽出物、またはその培養物の上清を、ハイブリッド形成条件下で、 通常のＴＳＧ−６または突然変異ＴＳＧ−６の少なくとも一部をコードするオリ ゴヌクレオチドプローブと接触させ、そして（ｂ）該プローブの該細胞の核酸へ のハイブリッド形成を測定し、それによって該核酸の存在を検出する方法。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）の前にさらに（ｃ ）該細胞中の該ＴＳＧ−６蛋白質をコードするＤＮＡの量を選択的に増加させる 、 ことを含む方法。 ２８．細胞中でのＴＳＧ−６の発現の誘導を測定する方法であって、（ａ）該細 胞を該ＴＳＧ−６の発現を誘導することのできる物質ヒ接触させ、（ｂ）該ＴＳ Ｇ−６の少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブでハイブリッ ド形成条件下にハイブリッド形成によって該細胞中の該ＴＳＧ−６をコードする ｍＲＮＡの量を測定し、 （ｃ）該細胞中のＴＳＧ−６をコードするｍＤＮＡの量を、該物質と接触しなか った該細胞中のＴＳＧ−６をコードするｍＲＮＡの量と比較し、かくして該ｍＲ ＮＡの量の増加により該誘導の生起が示される方法。 ２９．細胞中におけるＴＳＧ−６の発現の誘導を測定する方法であって、（ａ） 該細胞を該ＴＳＧ−６の発現を誘導することのできる物質と接触させ、（ｂ）請 求項２２に記載の方法を用いて該細胞の抽出物または上清中の該ＴＳＧ−６蛋白 質の量を測定し、 （ｃ）該細胞抽出液または上清中のＴＳＧ−６蛋白質の量と、該物質に接触しな かった場合の該細胞の抽出液または上清中のＴＳＧ−６の量とを比較することか らなり、 それによりＴＳＧ−６蛋白質の量の増加が該誘導の生起を示す方法。 ３０．細胞中におけるＴＳＧ−６の発現を誘導することのできる化合物を同定す る方法であって、 （ａ）該細胞を該化合物と接触させ、そして（ｂ）請求項２７に記載の方法によ ってＴＳＧ−６ｍＲＮＡの誘導を測定し、その場合に誘導物質が該化合物であり 、それによって該化合物を同定する方法。 ３１．ＴＳＧ−６蛋白質の細胞からの分泌を誘導することのできる化合物を同定 する方法であって、 （ａ）該細胞を該化合物と接触させ、 （ｂ）請求項２２に記載の方法を用いて、該細胞の上清中の該ＴＳＧ−６蛋白質 の存在を測定し、 それによって該化合物を同定する方法。