JPH0645550B2 - 抗癌剤 - Google Patents
抗癌剤Info
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- JPH0645550B2 JPH0645550B2 JP2171978A JP17197890A JPH0645550B2 JP H0645550 B2 JPH0645550 B2 JP H0645550B2 JP 2171978 A JP2171978 A JP 2171978A JP 17197890 A JP17197890 A JP 17197890A JP H0645550 B2 JPH0645550 B2 JP H0645550B2
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- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/80—Scrophulariaceae (Figwort family)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ナンバンギセルの種子より抽出されるインタ
ーロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起能を有
する抽出物からなる抗癌剤に関する。
ーロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起能を有
する抽出物からなる抗癌剤に関する。
インターロイキンまたインターフェロン誘起剤は、ヒ
ト、動物の細胞に作用して、インターロイキン（Ｉ
Ｌ）、インターフェロン（ＩＦＮ）を誘起する物質であ
る。このような作用を有する天然物質は種々知られてお
り、例えば、漢方薬「当帰」を熱水で処理し、その抽出
液からＩＦＮ誘起活性を有する物質が単離され（特開昭
５３−３２１０７号公報）、また漢方薬「桑白皮」から
同様にＩＦＮ誘起活性物質が単離されて（特開昭５３−
９９３１３号公報）いる。
ト、動物の細胞に作用して、インターロイキン（Ｉ
Ｌ）、インターフェロン（ＩＦＮ）を誘起する物質であ
る。このような作用を有する天然物質は種々知られてお
り、例えば、漢方薬「当帰」を熱水で処理し、その抽出
液からＩＦＮ誘起活性を有する物質が単離され（特開昭
５３−３２１０７号公報）、また漢方薬「桑白皮」から
同様にＩＦＮ誘起活性物質が単離されて（特開昭５３−
９９３１３号公報）いる。
ナンバンギセル（Aeglnetia Indica L;AIL）は、強壮剤
として知られ、ハマウツボ科ナンバンギセル属の１年生
無葉緑植物で、ススキ、ミョウガ、サトウキビ等の根に
寄生し、果実のうちに無数のほこりのように細かい種子
を入れている。（広川書店、総合薬用植物、第１０６〜
１０７頁、昭和１１年発行） 本発明者等は、このナンバンギセルの種子からの抽出物
質が、著しいＩＬ−２、及びＩＦＮ−γ誘起活性を有す
る成分を有し、かつ副作用を有しないことを見出し、先
に出願した。
として知られ、ハマウツボ科ナンバンギセル属の１年生
無葉緑植物で、ススキ、ミョウガ、サトウキビ等の根に
寄生し、果実のうちに無数のほこりのように細かい種子
を入れている。（広川書店、総合薬用植物、第１０６〜
１０７頁、昭和１１年発行） 本発明者等は、このナンバンギセルの種子からの抽出物
質が、著しいＩＬ−２、及びＩＦＮ−γ誘起活性を有す
る成分を有し、かつ副作用を有しないことを見出し、先
に出願した。
本発明は、このナンバンギセルの種子からの抽出物から
なる抗癌剤の提供を課題とする。
なる抗癌剤の提供を課題とする。
本発明の抗癌剤は、ナンバンギセルの種子から抽出され
るインターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘
起能を有する抽出物からなることを特徴とする。
るインターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘
起能を有する抽出物からなることを特徴とする。
このインターロイキン−２、及びインターフェロン−γ
誘起剤は、ナンバンギセルの種子より 、蒸溜水、特に蒸溜水がリン酸緩衝生理食塩水により
抽出されるか、また、 、ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノールにより
抽出され、得られた水層をプロナーゼ処理し、その沈澱
除去液を限外濾過して回収されるか、 、ナンバンギセルの種子より水飽和フェノールにより
抽出され、得られた水層を酢酸カリウム、及びエタノー
ル処理し、その沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、そ
の透析内液よりＲＮＡを除去後、得られた水層を更に酢
酸カリウム、及びエタノール処理し、沈澱除去液を蒸溜
水に対して透析し、その透析内液を濃縮することにより
得られるものである。
誘起剤は、ナンバンギセルの種子より 、蒸溜水、特に蒸溜水がリン酸緩衝生理食塩水により
抽出されるか、また、 、ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノールにより
抽出され、得られた水層をプロナーゼ処理し、その沈澱
除去液を限外濾過して回収されるか、 、ナンバンギセルの種子より水飽和フェノールにより
抽出され、得られた水層を酢酸カリウム、及びエタノー
ル処理し、その沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、そ
の透析内液よりＲＮＡを除去後、得られた水層を更に酢
酸カリウム、及びエタノール処理し、沈澱除去液を蒸溜
水に対して透析し、その透析内液を濃縮することにより
得られるものである。
以下、ナンバンギセルの種子よりインターロイキン−
２、及びインターフェロン−γ誘起能を有する抽出物の
抽出方法について具体的に説明する。
２、及びインターフェロン−γ誘起能を有する抽出物の
抽出方法について具体的に説明する。
〔抽出例 １〕 ナンバンギセルの種子のリン酸緩衝生理食塩水抽出物
（以下、粗抽出物という）の調製 ナンバンギセルの種子40ｍｇに、カルシウムイオン、マ
グネシウムイオンを含有しない 0.1モルリン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ7.2 ）１ mｌを加え、乳鉢中において粉砕
した。この粉砕物を15000xg 、15分間、４℃て遠心処理
し、得られた上清を、0.45μｍ径のミリボアフィルター
を通して無菌化し、本発明の抽出物を得た。
（以下、粗抽出物という）の調製 ナンバンギセルの種子40ｍｇに、カルシウムイオン、マ
グネシウムイオンを含有しない 0.1モルリン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ7.2 ）１ mｌを加え、乳鉢中において粉砕
した。この粉砕物を15000xg 、15分間、４℃て遠心処理
し、得られた上清を、0.45μｍ径のミリボアフィルター
を通して無菌化し、本発明の抽出物を得た。
〔抽出例 ２〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量の水飽和
n-ブタノールを加え、０℃で15分間攪拌した。この混和
物を35000xg で20分間遠心して、分離した下層の水層を
集めた。なおブタノール層および沈澱物は更に 2回ブタ
ノール抽出を行ない、得られる水層分画を更に遠心処理
して不溶物を除去し、蛋白質分解酵素であるプロナーゼ
を最終濃度20μｇ/mｌになるように添加し、37℃で一夜
処理した。このプロナーゼ処理によりプロナーゼを含む
蛋白質からなる白色沈澱が生じ、この沈澱を遠心処理に
より除去した。
n-ブタノールを加え、０℃で15分間攪拌した。この混和
物を35000xg で20分間遠心して、分離した下層の水層を
集めた。なおブタノール層および沈澱物は更に 2回ブタ
ノール抽出を行ない、得られる水層分画を更に遠心処理
して不溶物を除去し、蛋白質分解酵素であるプロナーゼ
を最終濃度20μｇ/mｌになるように添加し、37℃で一夜
処理した。このプロナーゼ処理によりプロナーゼを含む
蛋白質からなる白色沈澱が生じ、この沈澱を遠心処理に
より除去した。
次いで、沈澱除去液をカットオフ分子量3500、コアサイ
ド3000の限外濾過膜（アミコン社、米国）を使用し、圧
力1.5 kg/cm２で濃縮し、本発明の抽出物を得た。収量
はウロン酸定量によりナンバンギセルの種子１ｇにつき
45 mｇであった。
ド3000の限外濾過膜（アミコン社、米国）を使用し、圧
力1.5 kg/cm２で濃縮し、本発明の抽出物を得た。収量
はウロン酸定量によりナンバンギセルの種子１ｇにつき
45 mｇであった。
〔抽出例 ３〕 上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、等容量の水飽和
フェノールを加えて 0℃で30分間攪拌した後、200xg で
10分間遠心処理し、水層を分離した。水層中に混入して
いるフェノールをエーテルで抽出除去し、水層に溶解し
たエーテルは窒素ガスを通気することにより除去した。
このようにして得られるフェノール抽出物に酢酸カリウ
ムを2 ％(w/w) の割合で添加し、10倍容量の95％エタノ
ールを添加し、４℃、一夜静置した後形成される沈澱物
を蒸溜水に溶解させた。
フェノールを加えて 0℃で30分間攪拌した後、200xg で
10分間遠心処理し、水層を分離した。水層中に混入して
いるフェノールをエーテルで抽出除去し、水層に溶解し
たエーテルは窒素ガスを通気することにより除去した。
このようにして得られるフェノール抽出物に酢酸カリウ
ムを2 ％(w/w) の割合で添加し、10倍容量の95％エタノ
ールを添加し、４℃、一夜静置した後形成される沈澱物
を蒸溜水に溶解させた。
この溶液に上記同様２％の割合に酢酸カリウムを添加し
た後等容量のエタノールと混和させ、 0℃で30分間静置
した。その後5000xg、20分間遠心し、主としてＲＮＡを
含有する沈澱を廃棄した。更に上清に６倍容量のエタノ
ールを添加し、１時間静置した後生じた沈澱を5000xg、
20分間遠心処理して集め、蒸溜水に溶解させ、蒸溜水に
対して透析した。
た後等容量のエタノールと混和させ、 0℃で30分間静置
した。その後5000xg、20分間遠心し、主としてＲＮＡを
含有する沈澱を廃棄した。更に上清に６倍容量のエタノ
ールを添加し、１時間静置した後生じた沈澱を5000xg、
20分間遠心処理して集め、蒸溜水に溶解させ、蒸溜水に
対して透析した。
この透析内液には多糖類と微量のＲＮＡが混在している
ので、ＲＮＡを破壊する目的で１ mｌあたり30〜40μｇ
の牛膵由来ＲＮＡ分解酵素(Pancreatic RNase)を添加
し、38℃で１時間処理した。処理後、酢酸カリウム２％
と６倍容量のエタノールを添加し、生じた沈澱を遠心処
理により集め、蒸溜水に溶解し、200 xgで遠心処理し
た。得られた上清を蒸溜水に対して透析し、透析内液を
濃縮し抽出例３による標品とした。収量はウロン酸定量
によりナンバンギセルの種子１ｇあたり38 mｇであっ
た。
ので、ＲＮＡを破壊する目的で１ mｌあたり30〜40μｇ
の牛膵由来ＲＮＡ分解酵素(Pancreatic RNase)を添加
し、38℃で１時間処理した。処理後、酢酸カリウム２％
と６倍容量のエタノールを添加し、生じた沈澱を遠心処
理により集め、蒸溜水に溶解し、200 xgで遠心処理し
た。得られた上清を蒸溜水に対して透析し、透析内液を
濃縮し抽出例３による標品とした。収量はウロン酸定量
によりナンバンギセルの種子１ｇあたり38 mｇであっ
た。
本発明における抽出物質は、ナンバンギセルの種子から
蒸溜水、特にリン酸緩衝生理食塩水により抽出される
か、またはモリソン等の方法（Morrison＆Leive. Fract
ions of Lipopolysaccharide from Escherichia coli
0111:B4 Prepared by Two Extraction Procedures.J.Bi
ol.Chem.250 ;2911-2919、 1975）、更に同様の方法であ
るウエストファール等の方法（Westphal,O,.and Luderi
tz,O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchriden
grammnegativer Bakterien Angew.Chem. 66 ;407-417、
1954）により得られる高分子多糖体である。
蒸溜水、特にリン酸緩衝生理食塩水により抽出される
か、またはモリソン等の方法（Morrison＆Leive. Fract
ions of Lipopolysaccharide from Escherichia coli
0111:B4 Prepared by Two Extraction Procedures.J.Bi
ol.Chem.250 ;2911-2919、 1975）、更に同様の方法であ
るウエストファール等の方法（Westphal,O,.and Luderi
tz,O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchriden
grammnegativer Bakterien Angew.Chem. 66 ;407-417、
1954）により得られる高分子多糖体である。
抽出物質における多糖類の製造、組成は、いまだ充分に
は判明していないが、ナンバンギセルの種子を抽出する
際に、ウエストファール等の方法により水飽和フェノー
ルで抽出すると、蛋白質成分が殆ど結合していない多糖
類が得られ、一方、モリソン等の方法を使用し、水飽和
n-ブタノールにより抽出すると、脂質であるリピドＡが
蛋白により結合した多糖類が抽出されるものと思われ
る。
は判明していないが、ナンバンギセルの種子を抽出する
際に、ウエストファール等の方法により水飽和フェノー
ルで抽出すると、蛋白質成分が殆ど結合していない多糖
類が得られ、一方、モリソン等の方法を使用し、水飽和
n-ブタノールにより抽出すると、脂質であるリピドＡが
蛋白により結合した多糖類が抽出されるものと思われ
る。
本発明における抽出物質は、後述するように水可溶性、
n-ブタノール不溶性であり、ＲＮＡ（オルシノール反応
を利用したメジャバウム（Mezbaum）法、および紫外部
吸収による）は含有されてなく、分子量は10万〜20万の
範囲と思われる。
n-ブタノール不溶性であり、ＲＮＡ（オルシノール反応
を利用したメジャバウム（Mezbaum）法、および紫外部
吸収による）は含有されてなく、分子量は10万〜20万の
範囲と思われる。
次に、このようにしてナンバンギセルの種子から抽出さ
れる物質が、インターロイキン２、及びインターフェロ
ン−γの誘起能を有することを説明する。
れる物質が、インターロイキン２、及びインターフェロ
ン−γの誘起能を有することを説明する。
まず、上記各抽出例により抽出した多糖類分画について
の化学分析は、次のように行った。
の化学分析は、次のように行った。
ウロン酸の定量は、カルバゾール反応を利用したビター
等の方法（Bitter,T.,and Ewins,R. A modified carbaz
ole reaction for uronic acids.Biochem.J.81;43,196
1.）により、またＲＮＡはオルシノール反応を利用した
メジャバウムの方法｛Mezbaum,W.Color reactions of n
ucleic acid components; In The nucleic acids.(Char
gaff,E.,and Davidson,J.,editors). Academic Press,
New York. 1; 283-305,1939．｝、及び紫外部吸収を指
標として定量した。また蛋白質定量はフォリン等の方法
（Follin,O.,and Clocalteau,V. On tyrosine and tryp
tophane determination in proteins. J.Biol.Chem.73;
627-650,1927.）、及び紫外部吸収を指標として定量し
た。
等の方法（Bitter,T.,and Ewins,R. A modified carbaz
ole reaction for uronic acids.Biochem.J.81;43,196
1.）により、またＲＮＡはオルシノール反応を利用した
メジャバウムの方法｛Mezbaum,W.Color reactions of n
ucleic acid components; In The nucleic acids.(Char
gaff,E.,and Davidson,J.,editors). Academic Press,
New York. 1; 283-305,1939．｝、及び紫外部吸収を指
標として定量した。また蛋白質定量はフォリン等の方法
（Follin,O.,and Clocalteau,V. On tyrosine and tryp
tophane determination in proteins. J.Biol.Chem.73;
627-650,1927.）、及び紫外部吸収を指標として定量し
た。
（ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γ活性検索） 検索用標品の調製 ヘパリン添加ヒト末梢血より密度勾配遠心法（密度、1.
077 、Boyum,A. Isolation of mono-nuclear cells and
granulocytes from human blood. Scan.J.Clin.Inves
t. 21 ;77-89,1967.）を用いて、末梢血単核球（以下、
ＰＢＭＣという）を分離し、10％胎児牛血清を含有する
白血球増殖培養液（RPM1-1640）を使用して107/ mｌの
細胞浮遊液を調製した。
077 、Boyum,A. Isolation of mono-nuclear cells and
granulocytes from human blood. Scan.J.Clin.Inves
t. 21 ;77-89,1967.）を用いて、末梢血単核球（以下、
ＰＢＭＣという）を分離し、10％胎児牛血清を含有する
白血球増殖培養液（RPM1-1640）を使用して107/ mｌの
細胞浮遊液を調製した。
このＰＢＭＣの浮遊液１ mｌに上記各抽出例で抽出した
各分画を各々１ mｌ添加し、５％炭酸ガスを含む空気中
で37℃で24時間、48時間培養した。この培養上清を 500
xg、15分間遠心した後、ミリボアフィルターを通して無
菌化した標品を得、以下に記載するＩＬ−２、及びＩＦ
Ｎ−γ活性検索に供した。
各分画を各々１ mｌ添加し、５％炭酸ガスを含む空気中
で37℃で24時間、48時間培養した。この培養上清を 500
xg、15分間遠心した後、ミリボアフィルターを通して無
菌化した標品を得、以下に記載するＩＬ−２、及びＩＦ
Ｎ−γ活性検索に供した。
ＩＬ−２活性測定法 細胞増殖がＩＬ−２依存性であるＣＴＬＬ細胞を、96穴
マイクロプレートに、１０％被検標品を含む増殖培養液
500μｌに 5×10３個のＣＴＬＬ細胞を浮遊させ各ホー
ルに植え込み、５％炭酸ガス培養器中で37℃で24時間培
養した。その後各ホールに３Ｈ−チミジン（アマシャム
社、英国）50μCiを添加して更に16時間培養を継続し、
３Ｈ−チミジンの取り込み量を液体シンチレーションカ
ウンターで測定した。この場合、ＩＬ−２力価の算定
は、組み換え型ＩＬ−２（シオノギ社製）を、最終濃度
5.0 、2.5 、1.25、0.63、0.31単位／ mｌになるように
調製した標準標品によりＣＴＬＬ細胞を処理した場合の
３Ｈ−チミジンの取り込み量より換算した。
マイクロプレートに、１０％被検標品を含む増殖培養液
500μｌに 5×10３個のＣＴＬＬ細胞を浮遊させ各ホー
ルに植え込み、５％炭酸ガス培養器中で37℃で24時間培
養した。その後各ホールに３Ｈ−チミジン（アマシャム
社、英国）50μCiを添加して更に16時間培養を継続し、
３Ｈ−チミジンの取り込み量を液体シンチレーションカ
ウンターで測定した。この場合、ＩＬ−２力価の算定
は、組み換え型ＩＬ−２（シオノギ社製）を、最終濃度
5.0 、2.5 、1.25、0.63、0.31単位／ mｌになるように
調製した標準標品によりＣＴＬＬ細胞を処理した場合の
３Ｈ−チミジンの取り込み量より換算した。
ＩＦＮ−γ活性測定法 ヒト羊膜由来ＦＬ細胞（106）を60mm径のプラスチック
ペトリ皿に植え込み、５％炭酸ガス培養器中で37℃、２
日間培養し、ＦＬ単層細胞を調製した。
ペトリ皿に植え込み、５％炭酸ガス培養器中で37℃、２
日間培養し、ＦＬ単層細胞を調製した。
次に被検標品 0.2 mｌに最少必須培地 0.8 mｌを添加し
て、被検標品の５倍希釈したもの0.5mｌによりＦＬ単層
培養細胞を12時間、37℃で処理した。その後この処理Ｆ
Ｌ単層培養細胞における水疱性口内炎ウィルス（Vesicu
lar Stomatitis virus、以下、ＶＳＶという）のブラッ
ク形成能を、未処理ＦＬ単層培養細胞でのＶＳＶブラッ
ク形成能との比較により算定した。ＩＦＮ力価はＶＳＶ
ブラック形成能を50％減じるために必要な被検標品の最
高希釈率でもって表現される。
て、被検標品の５倍希釈したもの0.5mｌによりＦＬ単層
培養細胞を12時間、37℃で処理した。その後この処理Ｆ
Ｌ単層培養細胞における水疱性口内炎ウィルス（Vesicu
lar Stomatitis virus、以下、ＶＳＶという）のブラッ
ク形成能を、未処理ＦＬ単層培養細胞でのＶＳＶブラッ
ク形成能との比較により算定した。ＩＦＮ力価はＶＳＶ
ブラック形成能を50％減じるために必要な被検標品の最
高希釈率でもって表現される。
ＩＦＮのタイピング方法 被検標品中に含有されるＩＦＮのタイピングは、被検標
品 0.2 mｌに抗ＩＦＮ−α/ β抗体（米国国立衛生研究
所(NIH)INC．米国）を0.2mｌ、そして被検標品 0.2 mｌ
に抗ＩＦＮ−γ抗体（インターフェロン サイエンシー
ズ INC．米国） 0.2 mｌを添加して、30分間、37℃で
培養した後、最少必須培地 0.6 mｌを添加して総容量１
mｌとし、この標品 0.5 mｌによりＦＬ単層培養細胞を
37℃、12時間処理し、上記同様にＶＳＶブラック減少率
を測定した。尚抗ＩＦＮ−α/ β抗体、或いは抗ＩＦＮ
−γ抗体は、ＩＦＮ−α、またはＩＦＮ−βの100 単
位、或いは抗ＩＦＮ−γの100 単位を中和する力価を有
するように調製し、試験に供した。
品 0.2 mｌに抗ＩＦＮ−α/ β抗体（米国国立衛生研究
所(NIH)INC．米国）を0.2mｌ、そして被検標品 0.2 mｌ
に抗ＩＦＮ−γ抗体（インターフェロン サイエンシー
ズ INC．米国） 0.2 mｌを添加して、30分間、37℃で
培養した後、最少必須培地 0.6 mｌを添加して総容量１
mｌとし、この標品 0.5 mｌによりＦＬ単層培養細胞を
37℃、12時間処理し、上記同様にＶＳＶブラック減少率
を測定した。尚抗ＩＦＮ−α/ β抗体、或いは抗ＩＦＮ
−γ抗体は、ＩＦＮ−α、またはＩＦＮ−βの100 単
位、或いは抗ＩＦＮ−γの100 単位を中和する力価を有
するように調製し、試験に供した。
抽出物のクロマトグラフィー 抽出例２で調製した抽出物を、カラムクロマトグラフィ
ー（Sephadex G-200 ファーマシア、スェーデン、カラ
ムサイズ；φ0.9cm ×30cm）を使用し、0.15モルNa Cl-
0.02 モル Tris- H Cｌ緩衝液（ｐＨ7.4）により溶出さ
せ、１分画２ mｌとして２０分画採取した。それぞれの
分画について、ＰＢＭＣ１×10７個／ mｌを24穴プレー
トの各ホールに植え込み、更に、各分画 0.1 mｌずつ添
加して24時間、37℃で培養した。その後培養上清を採取
し、ＩＦＮ活性、ＩＬ−２活性を測定した。
ー（Sephadex G-200 ファーマシア、スェーデン、カラ
ムサイズ；φ0.9cm ×30cm）を使用し、0.15モルNa Cl-
0.02 モル Tris- H Cｌ緩衝液（ｐＨ7.4）により溶出さ
せ、１分画２ mｌとして２０分画採取した。それぞれの
分画について、ＰＢＭＣ１×10７個／ mｌを24穴プレー
トの各ホールに植え込み、更に、各分画 0.1 mｌずつ添
加して24時間、37℃で培養した。その後培養上清を採取
し、ＩＦＮ活性、ＩＬ−２活性を測定した。
次に、抽出例１で抽出した粗抽出標品のＩＬ−２誘導能
測定方法を示す。
測定方法を示す。
抽出例１で抽出した粗抽出標品とＰＢＭＣとを、２４時
間、４８時間培養して調製した培養上清について、上記
ＩＬ−２力価の測定方法により測定した。
間、４８時間培養して調製した培養上清について、上記
ＩＬ−２力価の測定方法により測定した。
第８図は標準ＩＬ−２（組み換えＩＬ−２）を用いて作
成された定量曲線であり、横軸は標準ＩＬ−２（単位／
mｌ）、縦軸は３Ｈ−チミジンの取り込み量を表す。上
記２４時間、４８時間培養して調製した培養上清につい
ての、それぞれの３Ｈ−チミジンの取り込みを示すカウ
ント数（単位はDPM）を計測し、第８図によりそのカウ
ント数に相当するＩＬ−２（単位／ mｌ）を求めた結果
を第１表に示す。
成された定量曲線であり、横軸は標準ＩＬ−２（単位／
mｌ）、縦軸は３Ｈ−チミジンの取り込み量を表す。上
記２４時間、４８時間培養して調製した培養上清につい
ての、それぞれの３Ｈ−チミジンの取り込みを示すカウ
ント数（単位はDPM）を計測し、第８図によりそのカウ
ント数に相当するＩＬ−２（単位／ mｌ）を求めた結果
を第１表に示す。
第１表により本発明におけるナンバンギセルの種子の粗
抽出標品は、ＩＬ−２誘導能を有していることが確認さ
れる。
抽出標品は、ＩＬ−２誘導能を有していることが確認さ
れる。
次に、抽出例１で調製したナンバンギセルの種子の粗抽
出標品のＩＦＮ産生能測定方法を示す。
出標品のＩＦＮ産生能測定方法を示す。
抽出例１で調製したナンバンギセルの種子の粗抽出標品
とＰＢＭＣとを、24時間、或いは48時間培養した後採取
し、得られた上清を10倍に希釈したものにより、ＦＬ単
層培養細胞を処理してＶＳＶブラック形成能を測定し
た。またブラック減少率は下式により算出される。２回
にわたって実験した結果を第２表に示す。
とＰＢＭＣとを、24時間、或いは48時間培養した後採取
し、得られた上清を10倍に希釈したものにより、ＦＬ単
層培養細胞を処理してＶＳＶブラック形成能を測定し
た。またブラック減少率は下式により算出される。２回
にわたって実験した結果を第２表に示す。
第２表により、ナンバンギセルの種子の粗抽出標品は、
ＩＦＮ産生能を有していることが確認される。特に24時
間標品は、48時間標品に比較してＩＦＮ活性が高値であ
る。
ＩＦＮ産生能を有していることが確認される。特に24時
間標品は、48時間標品に比較してＩＦＮ活性が高値であ
る。
続いて、ナンバンギセルの種子の粗抽出標品より誘導さ
れるＩＦＮのタイピング方法を示す。
れるＩＦＮのタイピング方法を示す。
ナンバンギセルの種子の粗抽出標品によりＰＢＭＣを24
時間処理して得た培養上清を５倍に希釈した標品を本実
験で使用した。２回実験し、その測定結果を第３表に示
す。
時間処理して得た培養上清を５倍に希釈した標品を本実
験で使用した。２回実験し、その測定結果を第３表に示
す。
尚、表の数値はブラック数を示し、２プレートの平均値
を示す。（ ）内の数値は、未処理対照ＦＬ単層培養細
胞上でのＶＳＶブラック数に対する抗体処理、或いは未
処理被検ＩＦＮ標品で処理したＦＬ単層培養細胞上での
ＶＳＶブラック数の減少率（％）を示している。
を示す。（ ）内の数値は、未処理対照ＦＬ単層培養細
胞上でのＶＳＶブラック数に対する抗体処理、或いは未
処理被検ＩＦＮ標品で処理したＦＬ単層培養細胞上での
ＶＳＶブラック数の減少率（％）を示している。
本実験によりナンバンギセルの種子の粗抽出標品は、Ｉ
ＦＮ−γ誘導能を有していることが確認される。
ＦＮ−γ誘導能を有していることが確認される。
また、ナンバンギセルの種子の粗抽出標品を上記クロマ
トグラフィーにかけ、その各分画におけるＩＬ−２、及
びＩＦＮ誘導能の検索、及びウロン酸（OD 530 nm、カ
ルバゾール反応）、蛋白質（OD 280nm）の定量を行い、
その結果を第９図に示す。尚この測定においてＩＦＮ力
価は５倍希釈品についてのＶＳＶブラック減少率（％）
を示す。
トグラフィーにかけ、その各分画におけるＩＬ−２、及
びＩＦＮ誘導能の検索、及びウロン酸（OD 530 nm、カ
ルバゾール反応）、蛋白質（OD 280nm）の定量を行い、
その結果を第９図に示す。尚この測定においてＩＦＮ力
価は５倍希釈品についてのＶＳＶブラック減少率（％）
を示す。
第９図からわかるように、各分画におけるＩＬ−２、及
びＩＦＮ誘導能、ウロン酸量、及び蛋白質量は同一の傾
向を示しており、このことから本発明の粗抽出物は単一
物質であることが想定される。
びＩＦＮ誘導能、ウロン酸量、及び蛋白質量は同一の傾
向を示しており、このことから本発明の粗抽出物は単一
物質であることが想定される。
次に、ナンバンギセルの種子から抽出例２、および抽出
例３により調製した分画をそれぞれ 500μｇウロン酸定
量による）ずつ用いて、ＰＢＭＣを２４時間刺激して、
その培養上清についてＩＬ−２力価を測定した。ＰＢＭ
ＣはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの６人の人から調製した。
ＩＬ−２力価の測定結果について下記第４表に示す。
例３により調製した分画をそれぞれ 500μｇウロン酸定
量による）ずつ用いて、ＰＢＭＣを２４時間刺激して、
その培養上清についてＩＬ−２力価を測定した。ＰＢＭ
ＣはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの６人の人から調製した。
ＩＬ−２力価の測定結果について下記第４表に示す。
単位は、単位／ mｌ。
第４表からわかるように、抽出例２、抽出例３により調
製した抽出物はいずれもＩＬ−２誘導能を有するが、抽
出例２による抽出物はより強いＩＬ−２誘導能を保有す
ることが明らかである。
製した抽出物はいずれもＩＬ−２誘導能を有するが、抽
出例２による抽出物はより強いＩＬ−２誘導能を保有す
ることが明らかである。
また下記第５表に抽出例２、抽出例３により調製した抽
出物のＩＦＮ−γ力価の測定結果を示す。測定にあたっ
ては、まず抽出例２、抽出例３により調製した各多糖類
分画により24時間、ＰＢＭＣを処理して得た培養上清を
５倍に希釈し、この希釈した標品を抗ＩＦＮ−γ処理し
たもの、または未処理のものにわけ、次いでこの標品を
ＦＬ単層培養細胞を処理してＶＳＶブラックを形成さ
せ、抗ＩＦＮ−γ処理、または未処理のＦＬ単層培養細
胞でのＶＳＶブラック数を比較したものである。尚、数
値は減少率（％）を示す。
出物のＩＦＮ−γ力価の測定結果を示す。測定にあたっ
ては、まず抽出例２、抽出例３により調製した各多糖類
分画により24時間、ＰＢＭＣを処理して得た培養上清を
５倍に希釈し、この希釈した標品を抗ＩＦＮ−γ処理し
たもの、または未処理のものにわけ、次いでこの標品を
ＦＬ単層培養細胞を処理してＶＳＶブラックを形成さ
せ、抗ＩＦＮ−γ処理、または未処理のＦＬ単層培養細
胞でのＶＳＶブラック数を比較したものである。尚、数
値は減少率（％）を示す。
この第５表から分かるように抽出例２、抽出例３により
抽出されたものは、共に強いＩＦＮ−γ誘導能を保有し
ていることがわかる。
抽出されたものは、共に強いＩＦＮ−γ誘導能を保有し
ていることがわかる。
次に、抽出例２で調製した多糖類分画でＰＢＭＣを24時
間刺激して得た培養上清について、ＩＬ−２、及びＩＦ
Ｎ力価を測定した結果を第１０図に示す。ＩＦＮ力価は
ＰＢＭＣ上清を５倍希釈した標品についてＶＳＶのブラ
ック減少率により測定した。尚、黒丸によりＩＬ−２活
性の推移を示し、白三角によりＩＦＮ力価の推移を示
す。
間刺激して得た培養上清について、ＩＬ−２、及びＩＦ
Ｎ力価を測定した結果を第１０図に示す。ＩＦＮ力価は
ＰＢＭＣ上清を５倍希釈した標品についてＶＳＶのブラ
ック減少率により測定した。尚、黒丸によりＩＬ−２活
性の推移を示し、白三角によりＩＦＮ力価の推移を示
す。
第１０図からわかるように、多糖類の量に応じてＩＬ−
２、ＩＦＮ力価共に増大することがわかる。
２、ＩＦＮ力価共に増大することがわかる。
また、バルブ−シ−マウス（Ba1b-Cマウス）10匹の腹腔
に抽出例２で調製した多糖類を、ウロン酸定量で５００
μｇを１ mｇ、３ mｇを注射したが、２８日後において
も異常は認められなかった。
に抽出例２で調製した多糖類を、ウロン酸定量で５００
μｇを１ mｇ、３ mｇを注射したが、２８日後において
も異常は認められなかった。
本発明は、上記各抽出例により抽出されるＩＬ−２、Ｉ
ＦＮ誘起剤が、抗癌剤として作用することを見出したも
のである。
ＦＮ誘起剤が、抗癌剤として作用することを見出したも
のである。
以下、実施例により本発明を説明する。
尚、下記実施例においては、動物としてｄｄＹマウス
を、腫瘍細胞としてｄｄＹマウスに移植可能なSarcoma-
180（以下、S-180 という）を用いた。また、下記実施
例においては、上記抽出例２により得られるものを抽出
物２、抽出例３により得られるものを抽出物３と称す
る。
を、腫瘍細胞としてｄｄＹマウスに移植可能なSarcoma-
180（以下、S-180 という）を用いた。また、下記実施
例においては、上記抽出例２により得られるものを抽出
物２、抽出例３により得られるものを抽出物３と称す
る。
〔実施例１〕 腹水型腫瘍に及ぼす抽出物２の治療効果 ｄｄＹマウスに、２ｘ１０６個のS-180 腫瘍細胞を腹腔
内に移植し生存率を見た。
内に移植し生存率を見た。
第１図に示すように、抽出物２の投与を受けないマウス
（△印）はS-180 の移植を受けた１７日目までにすべて
マウス（６匹）が腫瘍死した。
（△印）はS-180 の移植を受けた１７日目までにすべて
マウス（６匹）が腫瘍死した。
それに対して、腫瘍移植の同日から２日ごとに抽出物２
を 0.6mg／kg（□印）、1.2 mg／kg（＋印）、2.5 mg／
kg（◇印）を腹腔内に投与したマウスはいずれも生存率
が上昇した。
を 0.6mg／kg（□印）、1.2 mg／kg（＋印）、2.5 mg／
kg（◇印）を腹腔内に投与したマウスはいずれも生存率
が上昇した。
即ち、腫瘍移植後２９日目までに、抽出物２を0.6 mg／
kg投与したマウスは６匹中３匹が、また1.2 mg／kg投与
群では６匹中５匹が、更に2.5 mg／kg投与群では６匹中
４匹が生存した。
kg投与したマウスは６匹中３匹が、また1.2 mg／kg投与
群では６匹中５匹が、更に2.5 mg／kg投与群では６匹中
４匹が生存した。
尚、データには示さないが、正常マウスに0.6 mg／kg〜
2.5 mg／kgを２日おきに投与しても認むべき副作用はな
かった。
2.5 mg／kgを２日おきに投与しても認むべき副作用はな
かった。
次に、担癌マウスにおける腹腔内腫瘍細胞の増殖を体重
増加で評価した結果を第２図に示す。
増加で評価した結果を第２図に示す。
抽出物２の投与を受けなかった担癌マウス は、腫瘍を腹腔内に移植後20ｇ以上の体重増加を示した
が、0.6 mg／kg 、1.2 mg／kg 、2.5 mg／kg の投与を受けて２９日目まで生存したマウスの体重増加
はいずれも５ｇ以内であった。
が、0.6 mg／kg 、1.2 mg／kg 、2.5 mg／kg の投与を受けて２９日目まで生存したマウスの体重増加
はいずれも５ｇ以内であった。
〔実施例２〕 （S-180 腫瘍を腹腔内に移植後、抽出物２の投与を受け
長期生存したマウスに投薬を中止後、再度S-180 を移植
した場合の影響） 長期生存（２９日以上）したマウスに、投薬を中止し、
再度、S-180 腫瘍細胞を腹腔内に再移植した結果を第３
図において、□印で示す。
長期生存したマウスに投薬を中止後、再度S-180 を移植
した場合の影響） 長期生存（２９日以上）したマウスに、投薬を中止し、
再度、S-180 腫瘍細胞を腹腔内に再移植した結果を第３
図において、□印で示す。
また、対照群として無処置のｄｄＹマウスにS-180 を移
植した場合を△印で示す。
植した場合を△印で示す。
第３図から明らかなように、長期生存マウスにおいて
は、再移植後においても対照群に比して著明に生存率が
高かった。
は、再移植後においても対照群に比して著明に生存率が
高かった。
また、これらの実験群における体重変化を第４図に示
す。
す。
第４図からわかるように、長期生存マウスにS-180 を再
移植した場合 には、対照群 に比して体重増加の抑制が顕著であった。
移植した場合 には、対照群 に比して体重増加の抑制が顕著であった。
〔実施例３〕 （抽出物２と抽出物３の抗腫瘍効果に関する比較） ｄｄＹマウスに２ｘ１０６個のS-180 腫瘍細胞を移植
後、25mg／kgの抽出物２、或いは同量の抽出物３を２日
目ごとに投与して生存率を見た。その結果を第５図に示
す。
後、25mg／kgの抽出物２、或いは同量の抽出物３を２日
目ごとに投与して生存率を見た。その結果を第５図に示
す。
第５図からわかるように、生存率は抽出物２投与群（□
印）が抽出物３投与群（＋印）に比してわずかに高かっ
た。
印）が抽出物３投与群（＋印）に比してわずかに高かっ
た。
次に、これらの処理マウスにおける腫瘍増殖の抑制度を
体重増加の抑制度で見た結果を第６図に示す。
体重増加の抑制度で見た結果を第６図に示す。
この場合にも、抽出物２投与群 が抽出物３投与群に比して僅かに抑制度が強かった。い
ずれの投与群も無処理マウスに腫瘍を移植したとき と比較した場合には著明な抑制効果が見られた。
ずれの投与群も無処理マウスに腫瘍を移植したとき と比較した場合には著明な抑制効果が見られた。
〔実施例４〕 （皮下移植腫瘍への抽出物２の抗腫瘍効果） ｄｄＹマウス背部皮下に、１ｘ１０６個のS-180 の腫瘍
細胞を移植後５日目より腫瘍内に抽出物２を連日投与し
た後の腫瘍の大きさで比較した結果を第７図に示す。
細胞を移植後５日目より腫瘍内に抽出物２を連日投与し
た後の腫瘍の大きさで比較した結果を第７図に示す。
これからわかるように、0.5 mg／kg投与群 、2.5 mg／kg投与群 とも非投与群 に比して著明な腫瘍増殖抑制が見られたが、特に2.5 mg
／kg投与群においてはほぽ完全に腫瘍の増殖は抑制され
た。
／kg投与群においてはほぽ完全に腫瘍の増殖は抑制され
た。
本発明は、ナンバンギセルの種子からの抽出物を担癌マ
ウスに投与した場合に、腫瘍増殖抑制作用を有すること
を見いだしたもので、データに示す投与量では認むべき
副作用はなく、癌治療に有用であることが期待される。
ウスに投与した場合に、腫瘍増殖抑制作用を有すること
を見いだしたもので、データに示す投与量では認むべき
副作用はなく、癌治療に有用であることが期待される。
第１図は、腹水型腫瘍に及ぼす本発明の抗癌剤の治療効
果を生存率で説明するための図、第２図は、担癌マウス
における腹腔内腫瘍細胞の増殖を体重増加で説明するた
めの図、第３図は、腫瘍を腹腔内に移植後、本発明の抗
癌剤の投与を受け長期生存したマウスに投薬を中止後、
再度腫瘍を移植した場合の影響を説明するための図、第
４図は、第３図に示す実験群における体重変化を示す
図、第５図は、本発明の抗癌剤である抽出物２と抽出物
３の抗腫瘍効果に関する比較を示す図、第６図は、第５
図に示す処理マウスにおける体重増加の抑制度を示す
図、第７図は、皮下移植腫瘍への抽出物２の抗腫瘍効果
を説明するための図、第８図、第９図、第１０図はナン
バンギセルの種子からの抽出物がＩＬ−２及びＩＦＮ誘
起能を有することを説明するための図である。
果を生存率で説明するための図、第２図は、担癌マウス
における腹腔内腫瘍細胞の増殖を体重増加で説明するた
めの図、第３図は、腫瘍を腹腔内に移植後、本発明の抗
癌剤の投与を受け長期生存したマウスに投薬を中止後、
再度腫瘍を移植した場合の影響を説明するための図、第
４図は、第３図に示す実験群における体重変化を示す
図、第５図は、本発明の抗癌剤である抽出物２と抽出物
３の抗腫瘍効果に関する比較を示す図、第６図は、第５
図に示す処理マウスにおける体重増加の抑制度を示す
図、第７図は、皮下移植腫瘍への抽出物２の抗腫瘍効果
を説明するための図、第８図、第９図、第１０図はナン
バンギセルの種子からの抽出物がＩＬ−２及びＩＦＮ誘
起能を有することを説明するための図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 姫野 國祐 徳島県徳島市八万町大坪248―41 (56)参考文献 特開 平２−83331（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】ナンバンギセルの種子から抽出され、イン
ターロイキン−２及びインターフェロン−γ誘起能を有
する抽出物からなる抗癌剤。 - 【請求項２】前記抽出物が、ナンバンギセルの種子より
水飽和ブタノールにより抽出され、得られた水層をプロ
ナーゼ処理し、その沈澱除去液を限外濾過して回収され
るものである請求項１記載の抗癌剤。 - 【請求項３】前記抽出物が、ナンバンギセルの種子より
水飽和フェノールにより抽出され、得られた水層を酢酸
カリウム、及びエタノール処理し、その沈澱除去液を蒸
溜水に対して透析し、その透析内液よりＲＮＡを除去
後、得られた水層を更に酢酸カリウム、及びエタノール
処理し、沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、その透析
内液を濃縮することにより得られるものである請求項１
記載の抗癌剤。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2171978A JPH0645550B2 (ja) | 1990-06-27 | 1990-06-27 | 抗癌剤 |
| EP19910911865 EP0489178A4 (en) | 1990-06-27 | 1991-06-27 | Antitumor agent |
| PCT/JP1991/000864 WO1992000086A1 (en) | 1990-06-27 | 1991-06-27 | Antitumor agent |
| US08/048,206 US5366725A (en) | 1990-06-27 | 1993-04-20 | Method for the treatment of cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2171978A JPH0645550B2 (ja) | 1990-06-27 | 1990-06-27 | 抗癌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0459732A JPH0459732A (ja) | 1992-02-26 |
| JPH0645550B2 true JPH0645550B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=15933273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2171978A Expired - Fee Related JPH0645550B2 (ja) | 1990-06-27 | 1990-06-27 | 抗癌剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0489178A4 (ja) |
| JP (1) | JPH0645550B2 (ja) |
| WO (1) | WO1992000086A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987007659A1 (en) * | 1986-06-14 | 1987-12-17 | Iwase Prince Kabushiki Kaisha | Sewing machine |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837257A (en) * | 1996-07-09 | 1998-11-17 | Sage R&D | Use of plant extracts for treatment of HIV, HCV and HBV infections |
| PT1829565E (pt) | 2001-12-20 | 2010-04-26 | Bone Support Ab | Novo substituto mineral de osso |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0030444B1 (en) * | 1979-12-03 | 1985-01-30 | Kitasato Kenkyusho | A process for preparing substances having interferon inducing activity |
| JPS57118519A (en) * | 1980-12-02 | 1982-07-23 | Kitasato Inst:The | Preparation of interferon-inducing agent |
| JPS61263923A (ja) * | 1985-05-17 | 1986-11-21 | Tsumura Juntendo Inc | インタ−ロイキン−２誘起剤 |
| JPH0283331A (ja) * | 1988-09-17 | 1990-03-23 | Shinya Okubo | インターロイキン−２、及びインターフェロン−γ誘起剤とその製造方法 |
-
1990
- 1990-06-27 JP JP2171978A patent/JPH0645550B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-06-27 WO PCT/JP1991/000864 patent/WO1992000086A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1991-06-27 EP EP19910911865 patent/EP0489178A4/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987007659A1 (en) * | 1986-06-14 | 1987-12-17 | Iwase Prince Kabushiki Kaisha | Sewing machine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0459732A (ja) | 1992-02-26 |
| WO1992000086A1 (en) | 1992-01-09 |
| EP0489178A1 (en) | 1992-06-10 |
| EP0489178A4 (en) | 1993-04-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19950411 |
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