JPH04287699A - キサンチンおよび低級アルキル置換キサンチン誘導体でｄｎａを標識するための方法および化合物ならびにその場で染色体を検出するための試薬 - Google Patents
キサンチンおよび低級アルキル置換キサンチン誘導体でｄｎａを標識するための方法および化合物ならびにその場で染色体を検出するための試薬Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡを標識するための
方法と化合物に関する。本発明は異なった染色体特異的
なプローブの多様性のハイブリダイゼーションによる、
染色体または染色体の領域の検出または同定にも関する
。特に本発明はこれらの染色体特異的なプローブの本来
の染色体の構造が本質的に損われないように、そして異
なる染色体間、同じ染色体の異なる部分間または染色体
と他の細胞の構造物間の物理的な関係を保存するように
調製された粉砕された細胞からの染色体へのインシチュ
ハイブリダイゼーションに関する。
方法と化合物に関する。本発明は異なった染色体特異的
なプローブの多様性のハイブリダイゼーションによる、
染色体または染色体の領域の検出または同定にも関する
。特に本発明はこれらの染色体特異的なプローブの本来
の染色体の構造が本質的に損われないように、そして異
なる染色体間、同じ染色体の異なる部分間または染色体
と他の細胞の構造物間の物理的な関係を保存するように
調製された粉砕された細胞からの染色体へのインシチュ
ハイブリダイゼーションに関する。
【０００２】
【従来の技術】インシチュハイブリダイゼーションの技
術は当該技術分野ではよく知られており、染色体または
染色体の領域を検出するために種々の応用例がある。こ
れらの応用例は以下のものに限定されるわけではないが
、出生前の診断、遺伝子地図作製、体細胞ハイブリダイ
ゼーションと悪性腫傷のそして他の疾病の特異的な染色
体遺伝子マーカーの検出を含む。ハイブリダイゼーショ
ンは染色体の標的ＤＮＡの配列とハイブリダイゼーショ
ン後に多様な物理的または化学的手段で検出できるよう
に修飾されたプローブの配列の間でその場で行なわれる
。標的の染色体ＤＮＡの調製は染色体と細胞の構造物の
破壊の量が最小になり、そしてプローブとのハイブリダ
イゼーションが可能なように行なわれる。染色体の標的
ＤＮＡの調製のための方法は当該技術分野ではよく知ら
れている（例えばゴールおよびパーデュー（Ｇａｌｌ
ａｎｄ Ｐａｒｄｕｅ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６４：６００（１９６９），ジ
ョンら（Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）２２３：５８２（１９６９），ラドキ
ンおよびストーラー（Ｒｕｄｋｉｎ ａｎｄ Ｓｔ
ｏｌｌａｒ），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６５：
４７２（１９７７）を見よ。）。
術は当該技術分野ではよく知られており、染色体または
染色体の領域を検出するために種々の応用例がある。こ
れらの応用例は以下のものに限定されるわけではないが
、出生前の診断、遺伝子地図作製、体細胞ハイブリダイ
ゼーションと悪性腫傷のそして他の疾病の特異的な染色
体遺伝子マーカーの検出を含む。ハイブリダイゼーショ
ンは染色体の標的ＤＮＡの配列とハイブリダイゼーショ
ン後に多様な物理的または化学的手段で検出できるよう
に修飾されたプローブの配列の間でその場で行なわれる
。標的の染色体ＤＮＡの調製は染色体と細胞の構造物の
破壊の量が最小になり、そしてプローブとのハイブリダ
イゼーションが可能なように行なわれる。染色体の標的
ＤＮＡの調製のための方法は当該技術分野ではよく知ら
れている（例えばゴールおよびパーデュー（Ｇａｌｌ
ａｎｄ Ｐａｒｄｕｅ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６４：６００（１９６９），ジ
ョンら（Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）２２３：５８２（１９６９），ラドキ
ンおよびストーラー（Ｒｕｄｋｉｎ ａｎｄ Ｓｔ
ｏｌｌａｒ），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６５：
４７２（１９７７）を見よ。）。
【０００３】ＤＮＡやＲＮＡを含む非常に多くのハイブ
リダイゼーションプローブが当該技術分野では知られて
いる。
リダイゼーションプローブが当該技術分野では知られて
いる。
【０００４】上のゴールおよびパーデュー（Ｇａｌｌ
ａｎｄ Ｐａｒｄｕｅ）の論文にはランプブラシ（
ｌａｍｐｂｒｕｓｈ）染色体上の特異的な配列の検出の
ためにトリチウムを含むヌクレオチドで標識した相補的
ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブの使用が記載されている。
ａｎｄ Ｐａｒｄｕｅ）の論文にはランプブラシ（
ｌａｍｐｂｒｕｓｈ）染色体上の特異的な配列の検出の
ためにトリチウムを含むヌクレオチドで標識した相補的
ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プローブの使用が記載されている。
【０００５】上のジョンら（Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ
．）の論文にはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを検出する
ための １２５Ｉで標識したｃＲＮＡプローブの使用が
記載されている。
．）の論文にはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを検出する
ための １２５Ｉで標識したｃＲＮＡプローブの使用が
記載されている。
【０００６】ランデジェントら（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ
ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７３：３
５４−３５７（１９８６）にはクローニングされたゲノ
ミックＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション
後に、ヒト第４染色体の特異的な部分の検出が記載され
ており、ゲノミックＤＮＡプローブはハンティングトン
舞踏病のために、その遺伝子に遺伝学的に連続されてい
た。
ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７３：３
５４−３５７（１９８６）にはクローニングされたゲノ
ミックＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション
後に、ヒト第４染色体の特異的な部分の検出が記載され
ており、ゲノミックＤＮＡプローブはハンティングトン
舞踏病のために、その遺伝子に遺伝学的に連続されてい
た。
【０００７】ファンデッケンおよびボーマン（ｖａｎ
Ｄｅｋｋｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎ），Ｃｙｔ
ｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．４８：１８８
−９（１９８８）には動原体（セントロメア）と末端小
粒（テロメア）に見られる繰り返し配列に特異的な、ク
ローニングされた蛍光標識プローブとのハイブリダイゼ
ーション後に、ヒト第１染色体の特異的な検出が記載さ
れている。
Ｄｅｋｋｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎ），Ｃｙｔ
ｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．４８：１８８
−９（１９８８）には動原体（セントロメア）と末端小
粒（テロメア）に見られる繰り返し配列に特異的な、ク
ローニングされた蛍光標識プローブとのハイブリダイゼ
ーション後に、ヒト第１染色体の特異的な検出が記載さ
れている。
【０００８】エマリッヒら（Ｅｍｍｅｒｉｃｈ ｅｔ
ａｌ．），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８１：
１２６−１４０（１９８９）には縦に並んだ繰り返しヒ
トＤＮＡに対するクローニングされたプローブとのハイ
ブリダイゼーション後にヒト第１および第１５染色体の
特異的な検出が記載されている。
ａｌ．），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８１：
１２６−１４０（１９８９）には縦に並んだ繰り返しヒ
トＤＮＡに対するクローニングされたプローブとのハイ
ブリダイゼーション後にヒト第１および第１５染色体の
特異的な検出が記載されている。
【０００９】ピータースら（Ｐｉｅｔｅｒｓ ｅｔ
ａｌ．），Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ
ｅｔ．５３：１５−１９（１９９０）には染色体に特異
的な標識プローブを用いたハイブリダイゼーション後に
個人の精子細胞の中からのヒト染色体の検出が記載され
ている。
ａｌ．），Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ
ｅｔ．５３：１５−１９（１９９０）には染色体に特異
的な標識プローブを用いたハイブリダイゼーション後に
個人の精子細胞の中からのヒト染色体の検出が記載され
ている。
【００１０】ファンデッケンら（ｖａｎ Ｄｅｋｋｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１
：１５３−１６４（１９９０）には染色体特異的な標識
ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション後に正
常なヒト血球の間期と中期の核の中からの第１とＹ染色
体をフローサイトメトリーにより検出したことが記載さ
れている。
ｎ ｅｔ ａｌ．），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１
：１５３−１６４（１９９０）には染色体特異的な標識
ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション後に正
常なヒト血球の間期と中期の核の中からの第１とＹ染色
体をフローサイトメトリーにより検出したことが記載さ
れている。
【００１１】キービッツら（Ｋｉｅｖｉｔｓ ｅｔ
ａｌ．），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１：１０５−１
０９（１９９０）にはマウス：ヒト体細胞雑種について
標識された全ゲノミックＤＮＡを用いてハイブリダイゼ
ーションを行ない、そして非標識の全ヒトゲノミックＤ
ＮＡを用いて上記の標識されたＤＮＡを前処理した後に
、ヒトリンパ球調製物の中に特異的な染色体または染色
体の部分が検出されたことが記載されている。
ａｌ．），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１：１０５−１
０９（１９９０）にはマウス：ヒト体細胞雑種について
標識された全ゲノミックＤＮＡを用いてハイブリダイゼ
ーションを行ない、そして非標識の全ヒトゲノミックＤ
ＮＡを用いて上記の標識されたＤＮＡを前処理した後に
、ヒトリンパ球調製物の中に特異的な染色体または染色
体の部分が検出されたことが記載されている。
【００１２】ＤＮＡとＲＮＡプローブの標識のための方
法は当該技術分野ではよく知られている。これらの方法
は修飾されたヌクレオチドの酵素による取り込み、修飾
されたヌクレオチドを含むプローブの化学的な合成およ
びヌクレオチドの直接的な修飾を含む。修飾は標識また
はハプテンの付加のためのヌクレオチドの誘導体化およ
び標識またはパプテンの直接的な付加を含む。伝統的な
方法は ３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，３２Ｐおよび １２５
Ｉのような放射性同位元素の取り込みを含んだ。放射性
標識を取り込んだプローブの本来の不安定性と対応する
短かい有効期間と健康と廃棄物の取り扱いの懸念が、プ
ローブＤＮＡおよびＲＮＡの標識のために多くの非放射
性の化合物の採用を促した。
法は当該技術分野ではよく知られている。これらの方法
は修飾されたヌクレオチドの酵素による取り込み、修飾
されたヌクレオチドを含むプローブの化学的な合成およ
びヌクレオチドの直接的な修飾を含む。修飾は標識また
はハプテンの付加のためのヌクレオチドの誘導体化およ
び標識またはパプテンの直接的な付加を含む。伝統的な
方法は ３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，３２Ｐおよび １２５
Ｉのような放射性同位元素の取り込みを含んだ。放射性
標識を取り込んだプローブの本来の不安定性と対応する
短かい有効期間と健康と廃棄物の取り扱いの懸念が、プ
ローブＤＮＡおよびＲＮＡの標識のために多くの非放射
性の化合物の採用を促した。
【００１３】米国特許４，８３３，２５１号にはＤＮＡ
プローブの直接的および合成的な修飾が記載されており
、ＤＮＡの誘導体化をＮ〔４〕（置換アミノ）シトシン
として記載されている。この誘導体化は酵素法または固
相化学法によって合成されたＤＮＡへの誘導体化された
ヌクレオチドの取り込みによって行なうと記載されてい
る。誘導体化は熟練した人にはよく知られた技術を用い
て真核生物のゲノムＤＮＡからまたは原核生物にクロー
ニングされたＤＮＡから調製された一本鎖ＤＮＡの直接
的な修飾によっても行なうことができると記載されてい
る。
プローブの直接的および合成的な修飾が記載されており
、ＤＮＡの誘導体化をＮ〔４〕（置換アミノ）シトシン
として記載されている。この誘導体化は酵素法または固
相化学法によって合成されたＤＮＡへの誘導体化された
ヌクレオチドの取り込みによって行なうと記載されてい
る。誘導体化は熟練した人にはよく知られた技術を用い
て真核生物のゲノムＤＮＡからまたは原核生物にクロー
ニングされたＤＮＡから調製された一本鎖ＤＮＡの直接
的な修飾によっても行なうことができると記載されてい
る。
【００１４】米国特許４，６２６，５０１号はＤＮＡと
ＲＮＡの配列のアデノシンおよびシトシン残基において
これらの残基のそれぞれＮ−６およびＮ−４の窒素原子
と化合物３−（４−ブロモ−３−オキソブタン１−スル
ホニル）−プロピオン酸および多くの関連化合物との結
合による誘導体化を教えている。
ＲＮＡの配列のアデノシンおよびシトシン残基において
これらの残基のそれぞれＮ−６およびＮ−４の窒素原子
と化合物３−（４−ブロモ−３−オキソブタン１−スル
ホニル）−プロピオン酸および多くの関連化合物との結
合による誘導体化を教えている。
【００１５】チェンら（Ｔｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．
），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
１：３４６６−３４７０（１９８４）には、一本鎖およ
び二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡプローブのグアノシンヌク
レオチドに特異的にハプテンである２−アセチルアミノ
フルオレンを付加することが記載されている。
），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
１：３４６６−３４７０（１９８４）には、一本鎖およ
び二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡプローブのグアノシンヌク
レオチドに特異的にハプテンである２−アセチルアミノ
フルオレンを付加することが記載されている。
【００１６】ドレーパー（Ｄｒａｐｅｒ），Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９８９−１００
２（１９８４）は重亜硫酸塩の触媒によるアミノ基転移
によるポリヌクレオチドの誘導体化を教え、そして蛍光
性の化合物であるニトロベンゾフラザンを用いた誘導体
化したポリヌクレオチドの標識が記載されている。
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９８９−１００
２（１９８４）は重亜硫酸塩の触媒によるアミノ基転移
によるポリヌクレオチドの誘導体化を教え、そして蛍光
性の化合物であるニトロベンゾフラザンを用いた誘導体
化したポリヌクレオチドの標識が記載されている。
【００１７】当該技術分野でよく知られた多くの方法は
非放射的に標識されたプローブの検出のために発達して
きた。これらの方法は蛍光で標識された化合物の直接的
な検出および間接的な方法を含み、後者は次に直接的に
または間接的に検出されるレポーター分子の結合に依存
している。これらのレポーターをもとにした方法は、抗
体により標的：タンパクのハイブリッド分子自身または
プローブへ誘導体化したハプテンを認識する免疫学的な
方法およびプローブへ誘導体化したハプテン分子との特
異的な相互作用をもとにしたアフィニティー法を含む。 これらのレポーター分子の検出は、蛍光性標識の付着に
より、基質を検出できる生産物へ酵素的に変換する酵素
に結合することにより、または視覚的にまたは電子顕微
鏡で検出できる金、鉄または銀のような電子密度の高い
原子に結合することによって行なわれる。
非放射的に標識されたプローブの検出のために発達して
きた。これらの方法は蛍光で標識された化合物の直接的
な検出および間接的な方法を含み、後者は次に直接的に
または間接的に検出されるレポーター分子の結合に依存
している。これらのレポーターをもとにした方法は、抗
体により標的：タンパクのハイブリッド分子自身または
プローブへ誘導体化したハプテンを認識する免疫学的な
方法およびプローブへ誘導体化したハプテン分子との特
異的な相互作用をもとにしたアフィニティー法を含む。 これらのレポーター分子の検出は、蛍光性標識の付着に
より、基質を検出できる生産物へ酵素的に変換する酵素
に結合することにより、または視覚的にまたは電子顕微
鏡で検出できる金、鉄または銀のような電子密度の高い
原子に結合することによって行なわれる。
【００１８】ラドキンおよびストーラー（Ｒｕｄｋｉｎ
ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）３１７：４７２−４７３には、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａハイブリッドに対する蛍光で標識された抗体の使用に
よるインシチュハイブリダイゼーションの検出が記載さ
れている。
ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）３１７：４７２−４７３には、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａハイブリッドに対する蛍光で標識された抗体の使用に
よるインシチュハイブリダイゼーションの検出が記載さ
れている。
【００１９】ランデジェントら（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ
ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３：３５
４−３７５（１９８６）には、ハンティングトン舞踏病
遺伝子のための２−アセチルアミノフルオレンを結合さ
せたコスミドプローブのインシチュハイブリダイゼーシ
ョンを検出するためのセイヨウワサビのペルオキシダー
ゼに結合した抗体の使用が記載されている。
ｅｔ ａｌ．），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３：３５
４−３７５（１９８６）には、ハンティングトン舞踏病
遺伝子のための２−アセチルアミノフルオレンを結合さ
せたコスミドプローブのインシチュハイブリダイゼーシ
ョンを検出するためのセイヨウワサビのペルオキシダー
ゼに結合した抗体の使用が記載されている。
【００２０】ガーソンら（Ｇａｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：
４７６１−４７７０（１９８７）にはヒトＮ−ｍｙｃお
よびγ−ＮＧＦ遺伝子のためのビオチン化したプローブ
のハイブリダイゼーションの検出のためのアルカリホス
ファターゼを結合したストレプタビジンの使用が記載さ
れている。
ｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：
４７６１−４７７０（１９８７）にはヒトＮ−ｍｙｃお
よびγ−ＮＧＦ遺伝子のためのビオチン化したプローブ
のハイブリダイゼーションの検出のためのアルカリホス
ファターゼを結合したストレプタビジンの使用が記載さ
れている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】従来技術は核酸のプロ
ーブを標識および誘導体化するための多様な酵素的およ
び化学的な方法の例を含む。そのようなプローブは多く
の直接的および間接的な検出系によって検出されうる。 本発明はキサンチンおよびキサンチンの低級アルキル置
換誘導体でＤＮＡを標識するための方法と化合物および
染色体または染色体の領域のＤＮＡの配列に相補的で且
つキサンチンおよびキサンチンの低級アルキル置換誘導
体で共有結合により標識した多くの異なるＤＮＡの配列
を含む試薬に関する。これらの試薬は染色体のその場で
の検出を可能にする。染色体または他の標的に結合させ
たキサンチンでまたは低級アルキル置換キサンチンの誘
導体で標識したＤＮＡは免疫学的な技術によって都合よ
く検出されうる。
ーブを標識および誘導体化するための多様な酵素的およ
び化学的な方法の例を含む。そのようなプローブは多く
の直接的および間接的な検出系によって検出されうる。 本発明はキサンチンおよびキサンチンの低級アルキル置
換誘導体でＤＮＡを標識するための方法と化合物および
染色体または染色体の領域のＤＮＡの配列に相補的で且
つキサンチンおよびキサンチンの低級アルキル置換誘導
体で共有結合により標識した多くの異なるＤＮＡの配列
を含む試薬に関する。これらの試薬は染色体のその場で
の検出を可能にする。染色体または他の標的に結合させ
たキサンチンでまたは低級アルキル置換キサンチンの誘
導体で標識したＤＮＡは免疫学的な技術によって都合よ
く検出されうる。
【００２２】次のことを提供することが本発明の目的で
ある。１．キサンチンまたはキサンチンの低級アルキル
置換誘導体でＤＮＡを標識するための方法と化合物、２
．染色体または染色体の領域をその場で検出するための
試薬、３．そのような試薬を調製するための方法、およ
び４．染色体または染色体の領域をその場で検出するた
めのそのような試薬の使用方法。
ある。１．キサンチンまたはキサンチンの低級アルキル
置換誘導体でＤＮＡを標識するための方法と化合物、２
．染色体または染色体の領域をその場で検出するための
試薬、３．そのような試薬を調製するための方法、およ
び４．染色体または染色体の領域をその場で検出するた
めのそのような試薬の使用方法。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明は抗原性の標識を
ＤＮＡに共有結合で結合させるための方法と化合物およ
び抗原で標識したＤＮＡを提供し、ここでは標識の抗原
性のある部位はキサンチンまたは低級アルキル置換キサ
ンチン誘導体である。キサンチンまたは低級アルキル置
換キサンチン誘導体の標識とは式Ｉ：
ＤＮＡに共有結合で結合させるための方法と化合物およ
び抗原で標識したＤＮＡを提供し、ここでは標識の抗原
性のある部位はキサンチンまたは低級アルキル置換キサ
ンチン誘導体である。キサンチンまたは低級アルキル置
換キサンチン誘導体の標識とは式Ｉ：
【００２４】
【００２５】（式中、Ｒ１ ，Ｒ２ およびＲ３ は各
々独立して水素または炭素原子数１〜６の低級アルキル
置換基であり、好ましくは水素またはメチル基である）
の標識を意味する。好ましい標識はキサンチン誘導体（
式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，およびＲ３ が水素であるもの）
、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、７−
メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン（テオ
フィリン）、１，７−ジメチルキサンチンおよび１，３
，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）である。最
も好ましい標識はテオフィリンおよびカフェインの誘導
体である。
々独立して水素または炭素原子数１〜６の低級アルキル
置換基であり、好ましくは水素またはメチル基である）
の標識を意味する。好ましい標識はキサンチン誘導体（
式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，およびＲ３ が水素であるもの）
、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、７−
メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン（テオ
フィリン）、１，７−ジメチルキサンチンおよび１，３
，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）である。最
も好ましい標識はテオフィリンおよびカフェインの誘導
体である。
【００２６】本発明は、共有結合で結合された多数のキ
サンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体の標
識を含み且つ検出すべき核酸に相補的な１つまたはそれ
以上のＤＮＡの配列よりなる、核酸の配列のその場での
検出のための試薬を提供する。好ましい標識はテオフィ
リン（１，３−ジメチルキサンチン）およびカフェイン
（１，３，７−トリメチルキサンチン）である。
サンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体の標
識を含み且つ検出すべき核酸に相補的な１つまたはそれ
以上のＤＮＡの配列よりなる、核酸の配列のその場での
検出のための試薬を提供する。好ましい標識はテオフィ
リン（１，３−ジメチルキサンチン）およびカフェイン
（１，３，７−トリメチルキサンチン）である。
【００２７】本発明は、検出すべき染色体または染色体
の領域の異なる部分に対して実質的に相補的な塩基配列
をもち、そしてアミノ基転移を起こされた多くのシトシ
ン塩基をもち、そしてそれらのアミノ基転移を起こされ
たシトシン塩基のいくつかに共有結合で結合されたキサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体の標
識をもち、検出すべき染色体または染色体の領域に対す
る試薬の特異的な結合性を実質的に保持しながら免疫学
的な技術で十分に検出される前記のキサンチンまたは置
換されたキサンチン誘導体で標識されたいくつかのシト
シン塩基をもち、ハイブリダイズしていないＤＮＡの配
列からなる染色体または染色体の領域のその場での検出
のための試薬を包含する。
の領域の異なる部分に対して実質的に相補的な塩基配列
をもち、そしてアミノ基転移を起こされた多くのシトシ
ン塩基をもち、そしてそれらのアミノ基転移を起こされ
たシトシン塩基のいくつかに共有結合で結合されたキサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体の標
識をもち、検出すべき染色体または染色体の領域に対す
る試薬の特異的な結合性を実質的に保持しながら免疫学
的な技術で十分に検出される前記のキサンチンまたは置
換されたキサンチン誘導体で標識されたいくつかのシト
シン塩基をもち、ハイブリダイズしていないＤＮＡの配
列からなる染色体または染色体の領域のその場での検出
のための試薬を包含する。
【００２８】本発明は以下の工程からなる染色体のその
場での検出のための試薬を作るための方法も含む。
場での検出のための試薬を作るための方法も含む。
【００２９】（ａ）検出すべき染色体または染色体の領
域に相補的なＤＮＡを含むプラスミドのＤＮＡを断片に
分解すること、（ｂ）ＤＮＡの断片にアミノ基転移を起
こすこと、および（ｃ）キサンチンまたは低級アルキル
置換キサンチン誘導体の標識を、アミノ基転移を起こさ
れたＤＮＡの断片に共有結合で結合させること。
域に相補的なＤＮＡを含むプラスミドのＤＮＡを断片に
分解すること、（ｂ）ＤＮＡの断片にアミノ基転移を起
こすこと、および（ｃ）キサンチンまたは低級アルキル
置換キサンチン誘導体の標識を、アミノ基転移を起こさ
れたＤＮＡの断片に共有結合で結合させること。
【００３０】より具体的には本発明は以下の工程からな
る染色体または染色体の領域のその場での検出のための
試薬を調製するための方法を含む。
る染色体または染色体の領域のその場での検出のための
試薬を調製するための方法を含む。
【００３１】（ａ）検出すべき染色体または染色体の領
域に対して実質的に相補的な塩基配列をもちハイブリダ
イズをしていないＤＮＡの配列中のいくつかのシトシン
塩基のアミノ基転移を起こすこと：および（ｂ）キサン
チンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体の標識を
アミノ基転移を起こされたシトシン塩基の少なくとも一
部分に共有結合させ、その際キサンチンまたは低級アル
キル置換キサンチン誘導体の標識と共有結合で結合させ
たシトシン塩基部分の数は、検出すべき染色体または染
色体の領域に対する試薬の特異的な結合の性質を実質的
に保持しつつ、検出されるキサンチンまたは低級アルキ
ル置換キサンチン誘導体のシグナルを十分に生じさせる
数であるようにすること。
域に対して実質的に相補的な塩基配列をもちハイブリダ
イズをしていないＤＮＡの配列中のいくつかのシトシン
塩基のアミノ基転移を起こすこと：および（ｂ）キサン
チンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体の標識を
アミノ基転移を起こされたシトシン塩基の少なくとも一
部分に共有結合させ、その際キサンチンまたは低級アル
キル置換キサンチン誘導体の標識と共有結合で結合させ
たシトシン塩基部分の数は、検出すべき染色体または染
色体の領域に対する試薬の特異的な結合の性質を実質的
に保持しつつ、検出されるキサンチンまたは低級アルキ
ル置換キサンチン誘導体のシグナルを十分に生じさせる
数であるようにすること。
【００３２】さらに本発明は以下の工程からなる染色体
または染色体の領域のその場での検出のための方法を提
供する。
または染色体の領域のその場での検出のための方法を提
供する。
【００３３】（ａ）試薬中の非特異的に結合するＤＮＡ
と結合させ、それによって遮へいされた試薬を作るため
に、ハイブリダイゼーションの条件下で本発明の試薬に
過剰の遮へいＤＮＡを加えること、（ｂ）検出すべき染
色体または染色体の領域とハイブリダイゼーションを生
じる条件下で遮へいされた試薬を接触させること、およ
び（ｃ）免疫学的技術によって検出すべき染色体または
染色体の領域への遮へいされた試薬の結合を検出するこ
と。
と結合させ、それによって遮へいされた試薬を作るため
に、ハイブリダイゼーションの条件下で本発明の試薬に
過剰の遮へいＤＮＡを加えること、（ｂ）検出すべき染
色体または染色体の領域とハイブリダイゼーションを生
じる条件下で遮へいされた試薬を接触させること、およ
び（ｃ）免疫学的技術によって検出すべき染色体または
染色体の領域への遮へいされた試薬の結合を検出するこ
と。
【００３４】キサンチンまたはキサンチンの低級アルキ
ル置換誘導体で共有結合で標識されたＤＮＡ試薬を提供
することも本発明の別の目的である。検出すべき染色体
または染色体の領域の異なった部分に相補的な多数のＤ
ＮＡの配列を含んでいるような、染色体または染色体の
領域のその場での検出のための試薬を提供することは本
発明の具体的な目的である。試薬中の多数のＤＮＡの配
列は、該ＤＮＡ配列に共有結合で結合された多数のキサ
ンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体、好ま
しくはテオフィリンまたはカフェインの標識を含む。こ
れらのキサンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換
誘導体、好ましくはテオフィリンまたはカフェインの標
識は、興味のある染色体または染色体の領域とハイブリ
ダイズするＤＮＡが免疫学的な技術を用いることで検出
されることを可能にする。キサンチンまたはキサンチン
の低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリンま
たはカフェインの標識はＤＮＡの配列を構成するアデノ
シン、グアノシン、シトシンまたはチミジンのいずれか
の塩基に共有結合で結合される。好ましい態様では、キ
サンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体、
好ましくはテオフィリンまたはカフェインの標識は、Ｄ
ＮＡの配列中のアミノ基転移を起こされたいくつかのシ
トシン塩基へ共有結合で結合される。キサンチンまたは
キサンチンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオ
フィリンまたはカフェインの標識をもっているアミノ基
転移を起こされたシトシン塩基の数は、興味のある染色
体または染色体の領域に対するＤＮＡの配列の特異的な
結合の性質を同時に実質的に保持しながら、免疫学的な
技術によって検出できるだけのキサンチンまたはキサン
チンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリ
ンまたはカフェインの標識の量を提供するのに十分なも
のとする。
ル置換誘導体で共有結合で標識されたＤＮＡ試薬を提供
することも本発明の別の目的である。検出すべき染色体
または染色体の領域の異なった部分に相補的な多数のＤ
ＮＡの配列を含んでいるような、染色体または染色体の
領域のその場での検出のための試薬を提供することは本
発明の具体的な目的である。試薬中の多数のＤＮＡの配
列は、該ＤＮＡ配列に共有結合で結合された多数のキサ
ンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体、好ま
しくはテオフィリンまたはカフェインの標識を含む。こ
れらのキサンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換
誘導体、好ましくはテオフィリンまたはカフェインの標
識は、興味のある染色体または染色体の領域とハイブリ
ダイズするＤＮＡが免疫学的な技術を用いることで検出
されることを可能にする。キサンチンまたはキサンチン
の低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリンま
たはカフェインの標識はＤＮＡの配列を構成するアデノ
シン、グアノシン、シトシンまたはチミジンのいずれか
の塩基に共有結合で結合される。好ましい態様では、キ
サンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体、
好ましくはテオフィリンまたはカフェインの標識は、Ｄ
ＮＡの配列中のアミノ基転移を起こされたいくつかのシ
トシン塩基へ共有結合で結合される。キサンチンまたは
キサンチンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオ
フィリンまたはカフェインの標識をもっているアミノ基
転移を起こされたシトシン塩基の数は、興味のある染色
体または染色体の領域に対するＤＮＡの配列の特異的な
結合の性質を同時に実質的に保持しながら、免疫学的な
技術によって検出できるだけのキサンチンまたはキサン
チンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリ
ンまたはカフェインの標識の量を提供するのに十分なも
のとする。
【００３５】染色体または染色体の領域のその場での検
出のための試薬を作るための方法を提供することが本発
明の別の具体的な目的である。好ましい方法の最初の段
階は、ファージの染色体ライブラリーに由来するプラス
ミドのＤＮＡを断片に分解することである。これらのＤ
ＮＡの断片はアミノ基転移を起こされて、機能的なキサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体が、
このアミノ基転移を起こされたＤＮＡ断片へ共有結合で
結合される。本発明ではキサンチンまたはキサンチンの
低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリンまた
はカフェインの標識が共有結合で結合されたアミノ基転
移を起こされたシトシン塩基の数は、検出すべき染色体
または染色体の領域に対する試薬の特異的な結合の性質
を同時に実質的に保持しながら、キサンチンまたはキサ
ンチンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィ
リンまたはカフェインの標識の免疫学的に検出できる量
を生じさせるのに十分なものである。
出のための試薬を作るための方法を提供することが本発
明の別の具体的な目的である。好ましい方法の最初の段
階は、ファージの染色体ライブラリーに由来するプラス
ミドのＤＮＡを断片に分解することである。これらのＤ
ＮＡの断片はアミノ基転移を起こされて、機能的なキサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体が、
このアミノ基転移を起こされたＤＮＡ断片へ共有結合で
結合される。本発明ではキサンチンまたはキサンチンの
低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィリンまた
はカフェインの標識が共有結合で結合されたアミノ基転
移を起こされたシトシン塩基の数は、検出すべき染色体
または染色体の領域に対する試薬の特異的な結合の性質
を同時に実質的に保持しながら、キサンチンまたはキサ
ンチンの低級アルキル置換誘導体、好ましくはテオフィ
リンまたはカフェインの標識の免疫学的に検出できる量
を生じさせるのに十分なものである。
【００３６】染色体または染色体の領域のその場での検
出のための方法を提供することは本発明のさらに具体的
な目的である。一般に、好ましい方法は本発明の試薬を
ハイブリダイゼーションの条件下で検出すべき染色体ま
たは染色体の領域と接触させることによって行なわれる
。
出のための方法を提供することは本発明のさらに具体的
な目的である。一般に、好ましい方法は本発明の試薬を
ハイブリダイゼーションの条件下で検出すべき染色体ま
たは染色体の領域と接触させることによって行なわれる
。
【００３７】キサンチンまたはキサンチンの低級アルキ
ル置換誘導体で共有結合で標識されたＤＮＡに相補的な
任意の核酸の配列の検出のための方法を提供することが
本発明の別の目的である。キサンチンまたは低級アルキ
ル置換キサンチン誘導体の標識は、蛍光性のまたは酵素
によって標識された抗体のようなレポーター遺伝子をど
のようなプローブ−標的複合体へ取り込むことも可能に
する。標的は染色体のＤＮＡであってもよく、さらには
メッセンジャーまたはリボゾームＲＮＡのようなＲＮＡ
；ミトコンドリアＤＮＡのような染色体外のＤＮＡ；ま
たはバクテリアまたウイルスのＤＮＡのような原核生物
のＤＮＡであってもよい。ＤＮＡプローブの分析はイン
シチュハイブリダイゼーション、溶液中のハイブリダイ
ゼーション、固相上に固定された核酸へのハイブリダイ
ゼーション、またはこれらのみに限定されるわけではな
いがニトロセルロース、ナイロンおよび当該技術分野で
知られている他の合成誘導体を含む多くの転写媒体のい
ずれかの上に固定された核酸またはタンパク質の転写物
へのハイブリダイゼーションを含むことができる。テオ
フィリンまたはカフェインのようなキサンチンまたはキ
サンチンの低級アルキル置換誘導体の標識の存在は免疫
学的な技術によって検出される。キサンチンまたはキサ
ンチンの低級アルキル置換誘導体は抗体を誘導しうるハ
プテンである。例えば抗テオフィリン抗体を標的の染色
体に結合された試薬のテオフィリン部分と反応させる。 この抗テオフィリン抗体に特異的に反応性をもち、且つ
酵素または蛍光標識で標識された二次抗体をテオフィリ
ンを含んでいるＤＮＡの染色体への結合を間接的に決定
するために次に抗テオフィリン抗体に結合させる。 免疫学的な技術部分での熟練者等にはテオフィリンまた
はカフェインのようなハプテンの存在を免疫学的に決定
するための多くの技術が知られている。
ル置換誘導体で共有結合で標識されたＤＮＡに相補的な
任意の核酸の配列の検出のための方法を提供することが
本発明の別の目的である。キサンチンまたは低級アルキ
ル置換キサンチン誘導体の標識は、蛍光性のまたは酵素
によって標識された抗体のようなレポーター遺伝子をど
のようなプローブ−標的複合体へ取り込むことも可能に
する。標的は染色体のＤＮＡであってもよく、さらには
メッセンジャーまたはリボゾームＲＮＡのようなＲＮＡ
；ミトコンドリアＤＮＡのような染色体外のＤＮＡ；ま
たはバクテリアまたウイルスのＤＮＡのような原核生物
のＤＮＡであってもよい。ＤＮＡプローブの分析はイン
シチュハイブリダイゼーション、溶液中のハイブリダイ
ゼーション、固相上に固定された核酸へのハイブリダイ
ゼーション、またはこれらのみに限定されるわけではな
いがニトロセルロース、ナイロンおよび当該技術分野で
知られている他の合成誘導体を含む多くの転写媒体のい
ずれかの上に固定された核酸またはタンパク質の転写物
へのハイブリダイゼーションを含むことができる。テオ
フィリンまたはカフェインのようなキサンチンまたはキ
サンチンの低級アルキル置換誘導体の標識の存在は免疫
学的な技術によって検出される。キサンチンまたはキサ
ンチンの低級アルキル置換誘導体は抗体を誘導しうるハ
プテンである。例えば抗テオフィリン抗体を標的の染色
体に結合された試薬のテオフィリン部分と反応させる。 この抗テオフィリン抗体に特異的に反応性をもち、且つ
酵素または蛍光標識で標識された二次抗体をテオフィリ
ンを含んでいるＤＮＡの染色体への結合を間接的に決定
するために次に抗テオフィリン抗体に結合させる。 免疫学的な技術部分での熟練者等にはテオフィリンまた
はカフェインのようなハプテンの存在を免疫学的に決定
するための多くの技術が知られている。
【００３８】好ましい態様では、過剰な遮へいＤＮＡが
ハイブリダイゼーションの条件下で試薬に加えられる。 この遮へいＤＮＡは次に試薬中の非特異的結合性の全て
のＤＮＡと結合し、それによって遮へいされた試薬を作
る。この遮へいされた試薬はハイブリダイゼーションの
条件下で興味のある染色体または染色体の領域と次に接
触させることができる。
ハイブリダイゼーションの条件下で試薬に加えられる。 この遮へいＤＮＡは次に試薬中の非特異的結合性の全て
のＤＮＡと結合し、それによって遮へいされた試薬を作
る。この遮へいされた試薬はハイブリダイゼーションの
条件下で興味のある染色体または染色体の領域と次に接
触させることができる。
【００３９】本発明はさらに、キサンチンまたは低級ア
ルキル置換キサンチン誘導体の標識が免疫学的な技術に
よって検出できて、ＤＮＡがその結合の性質を保持して
いる状況でそこに共有結合で結合された１つまたはそれ
以上の該キサンチンまたは低級アルキル置換キサンチン
の基をもつＤＮＡからなる試薬をも含んでいる。
ルキル置換キサンチン誘導体の標識が免疫学的な技術に
よって検出できて、ＤＮＡがその結合の性質を保持して
いる状況でそこに共有結合で結合された１つまたはそれ
以上の該キサンチンまたは低級アルキル置換キサンチン
の基をもつＤＮＡからなる試薬をも含んでいる。
【００４０】本発明はテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒ
ドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−
（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルであ
る化合物も含む。
ドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−
（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルであ
る化合物も含む。
【００４１】本発明はカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒド
ロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（
Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルである
化合物も含む。
ロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（
Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルである
化合物も含む。
【００４２】本発明は共有結合で結合された多くのテオ
フィリンまたはカフェインの標識を含んでおり、且つ検
出すべき核酸に相補的な１つまたはそれ以上のＤＮＡの
配列からなる核酸の配列のその場での検出のための試薬
も含む。
フィリンまたはカフェインの標識を含んでおり、且つ検
出すべき核酸に相補的な１つまたはそれ以上のＤＮＡの
配列からなる核酸の配列のその場での検出のための試薬
も含む。
【００４３】本発明のさらなる目的と好ましい態様は以
下に述べる好ましい態様および特許請求の範囲で論じら
れるだろう。
下に述べる好ましい態様および特許請求の範囲で論じら
れるだろう。
【００４４】本発明はキサンチンおよびキサンチンの低
級アルキル置換誘導体を用いてのＤＮＡの標識のための
方法および化合物および染色体または染色体の領域のそ
の場での固定のための試薬および方法を包含する。本発
明は、ＤＮＡの配列は多数の部位でアミノ化されて、官
能器を導入されたキサンチンの誘導体またはキサンチン
の低級アルキル置換誘導体の共有結合の結合によってキ
サンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体を
用いてアミノ化を受けた部位で標識されており、且つ検
出すべき染色体または染色体の領域の異なる部分に相補
的な、多数のＤＮＡ配列からなる試薬を包含する。
級アルキル置換誘導体を用いてのＤＮＡの標識のための
方法および化合物および染色体または染色体の領域のそ
の場での固定のための試薬および方法を包含する。本発
明は、ＤＮＡの配列は多数の部位でアミノ化されて、官
能器を導入されたキサンチンの誘導体またはキサンチン
の低級アルキル置換誘導体の共有結合の結合によってキ
サンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体を
用いてアミノ化を受けた部位で標識されており、且つ検
出すべき染色体または染色体の領域の異なる部分に相補
的な、多数のＤＮＡ配列からなる試薬を包含する。
【００４５】本発明で用いられるＤＮＡの配列の源はこ
れのみに限定されるわけではないが、特定の染色体から
単離されたＤＮＡ、または当該技術分野の熟練者によく
知られた方法で調製されたそのようなＤＮＡのライブラ
リーを含む。ＤＮＡを単離するための個々の染色体はフ
ローサイトメトリーによる微小細胞または体細胞雑種の
分離または個々の中期または間期の細胞からの直接単離
のような多くの標準的方法のいずれかによって調製され
うる。そのようなＤＮＡの他の源は標準的な方法によっ
て調製された特定の染色体のＤＮＡのライブラリーであ
り、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ）またはヒトまたは他のクローニングされた遺
伝学的な材料の他の貯蔵所のような当該技術分野の人々
に知られた伝統的な源から入手できる。多くの染色体ラ
イブラリーはＡＴＣＣから入手できるが、代表的なライ
ブラリーは次のものである。
れのみに限定されるわけではないが、特定の染色体から
単離されたＤＮＡ、または当該技術分野の熟練者によく
知られた方法で調製されたそのようなＤＮＡのライブラ
リーを含む。ＤＮＡを単離するための個々の染色体はフ
ローサイトメトリーによる微小細胞または体細胞雑種の
分離または個々の中期または間期の細胞からの直接単離
のような多くの標準的方法のいずれかによって調製され
うる。そのようなＤＮＡの他の源は標準的な方法によっ
て調製された特定の染色体のＤＮＡのライブラリーであ
り、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ）またはヒトまたは他のクローニングされた遺
伝学的な材料の他の貯蔵所のような当該技術分野の人々
に知られた伝統的な源から入手できる。多くの染色体ラ
イブラリーはＡＴＣＣから入手できるが、代表的なライ
ブラリーは次のものである。
【００４６】
これらのＡＴＣＣ寄託微生物はアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗ
ｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄから入手できる。本発明ではそのようなＤＮＡの配
列は当該技術分野の人々に知られている多くの酵素的な
手段のいずれかによって試験管内で合成されることもで
きるであろうことを予期している。ヒト染色体特異的な
ＤＮＡライブラリーという題名のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ４：５３７（１９８６）の論文にも、ヒト染色体
のライブラリーの調製が記載されている。
ルチャーコレクション，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗ
ｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄから入手できる。本発明ではそのようなＤＮＡの配
列は当該技術分野の人々に知られている多くの酵素的な
手段のいずれかによって試験管内で合成されることもで
きるであろうことを予期している。ヒト染色体特異的な
ＤＮＡライブラリーという題名のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ４：５３７（１９８６）の論文にも、ヒト染色体
のライブラリーの調製が記載されている。
【００４７】本発明で用いられるＤＮＡは当該技術分野
の熟練した人々によく知られた方法によってこれらの源
から単離される。これらに限られるわけではないが超音
波処理、ＤＮａｓｅＩによる限定的消化、ヤエナリ（ｍ
ｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる限定的消化お
よび細い内径の針を通してＤＮＡを剪断することを含ん
だ多くの物理的、化学的または酵素的な処理のいずれか
によって、このＤＮＡは次に様々な長さの断片の不均一
な混合物に切断される。断片の平均の大きさの好ましい
長さは約３００ｂｐであるが、得られるＤＮＡ断片混合
物は１００〜５００塩基対の長さの範囲内であろう。こ
れらの手順は、検出すべき染色体の異なった部分に相補
的な多くのＤＮＡの配列を提供する。実際に染色体のＤ
ＮＡの異なった部分に相補的なＤＮＡの断片が何万はな
くても何千は提供される。
の熟練した人々によく知られた方法によってこれらの源
から単離される。これらに限られるわけではないが超音
波処理、ＤＮａｓｅＩによる限定的消化、ヤエナリ（ｍ
ｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる限定的消化お
よび細い内径の針を通してＤＮＡを剪断することを含ん
だ多くの物理的、化学的または酵素的な処理のいずれか
によって、このＤＮＡは次に様々な長さの断片の不均一
な混合物に切断される。断片の平均の大きさの好ましい
長さは約３００ｂｐであるが、得られるＤＮＡ断片混合
物は１００〜５００塩基対の長さの範囲内であろう。こ
れらの手順は、検出すべき染色体の異なった部分に相補
的な多くのＤＮＡの配列を提供する。実際に染色体のＤ
ＮＡの異なった部分に相補的なＤＮＡの断片が何万はな
くても何千は提供される。
【００４８】ＤＮＡの断片は当該技術分野の人々に知ら
れた多くの化学的な手段のいずれかによって、好ましく
はヌクレオチド塩基であるシトシンのアミノ基の炭素４
（Ｃ−４）原子のアミノ基転移によって誘導体化される
。誘導体化はこれに限定されるわけではないがヒドラジ
ンおよびエチレンジアミンのような２から１０の炭素原
子をもつアルキレンジアミンおよびこれに限定されるわ
けではないがアミノ酸、ペプチド、エーテル誘導体また
は他の多くの有機または無機の連結分子の任意のものも
含んだ化合物も含んだ多様なジアミン化合物のこの塩基
のＣ−４の位置への付加という結果になるだろう。ＤＮ
Ａ断片はその中に含まれるシトシン残基の５〜２５％が
アミノ基転移されるが、最適アミノ基転移は１２〜２４
％である。全ヌクレオチド残基の約１〜７％がアミノ基
転移を起こされ、最適アミノ基転移は全塩基の２〜５％
である。アミノ基転移を起こされたＤＮＡの配列は、そ
のような配列と共有結合を形成できる反応性のある官能
基をもったキサンチンまたは低級アルキル置換キサンチ
ン誘導体の多くの化合物のどんなものとも共有結合で結
合される。アミノ基転移を起こされたＤＮＡの配列をそ
れぞれテオフィリンまたはカフェインで標識するために
使われうる好まれる化合物は、テオフィリン−８−Ｎ−
（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル
−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エス
テルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルである。アミノ基
転移を起こされたＤＮＡの配列はモル比で１００〜３０
０倍過剰の好ましくはモル比で約１５０倍過剰の官能基
を導入されたテオフィリンまたはカフェイン化合物と反
応される。アミノ基転移を起こされた部位の約８０〜１
００％がテオフィリンまたはカフェインで標識される。
れた多くの化学的な手段のいずれかによって、好ましく
はヌクレオチド塩基であるシトシンのアミノ基の炭素４
（Ｃ−４）原子のアミノ基転移によって誘導体化される
。誘導体化はこれに限定されるわけではないがヒドラジ
ンおよびエチレンジアミンのような２から１０の炭素原
子をもつアルキレンジアミンおよびこれに限定されるわ
けではないがアミノ酸、ペプチド、エーテル誘導体また
は他の多くの有機または無機の連結分子の任意のものも
含んだ化合物も含んだ多様なジアミン化合物のこの塩基
のＣ−４の位置への付加という結果になるだろう。ＤＮ
Ａ断片はその中に含まれるシトシン残基の５〜２５％が
アミノ基転移されるが、最適アミノ基転移は１２〜２４
％である。全ヌクレオチド残基の約１〜７％がアミノ基
転移を起こされ、最適アミノ基転移は全塩基の２〜５％
である。アミノ基転移を起こされたＤＮＡの配列は、そ
のような配列と共有結合を形成できる反応性のある官能
基をもったキサンチンまたは低級アルキル置換キサンチ
ン誘導体の多くの化合物のどんなものとも共有結合で結
合される。アミノ基転移を起こされたＤＮＡの配列をそ
れぞれテオフィリンまたはカフェインで標識するために
使われうる好まれる化合物は、テオフィリン−８−Ｎ−
（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル
−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エス
テルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルである。アミノ基
転移を起こされたＤＮＡの配列はモル比で１００〜３０
０倍過剰の好ましくはモル比で約１５０倍過剰の官能基
を導入されたテオフィリンまたはカフェイン化合物と反
応される。アミノ基転移を起こされた部位の約８０〜１
００％がテオフィリンまたはカフェインで標識される。
【００４９】キサンチンまたは低級アルキル置換キサン
チン誘導で標識されたＤＮＡの配列は、染色体を目標に
するためのインシチュハイブリダイゼーションのために
使われる。本発明の目的に対して「その場」あるいは「
インシチュ」とは染色体の実質的な破壊または相互に関
して各染色体が転移なしで細胞の核から露出され、キサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換体、好まし
くはテオフィリンまたはカフェインで標識されたＤＮＡ
プローブが染色体に接近しうることを意味する。このハ
イブリダイゼーションの標的はこれらに限られるわけで
はないが、正常、病気のまたは悪性腫瘍のヒトまたは他
の動物または植物細胞、減数分裂または有糸分裂の間期
またはあらゆる段階のいずれか、および生きているまた
は死後の組織、器官または体液から抽出されたあるいは
由来した；精子および卵細胞、種子、花粉、または接合
子、胎児、漿膜のまたは羊膜の細胞または他のあらゆる
発芽体からの細胞を含んだ胚細胞；試験管内で生育させ
た、長期間のまたは短期間の培養のいずれかからの、お
よび正常な、不死のまたは形質転換された細胞；細胞の
異なった型のまたはこれらの細胞の異なった分化の状態
の異種間のまたは種間の雑種の染色体または染色体の領
域；クローニングされ、そして原核生物のまたは他のク
ローニングベクター中で増殖させられまたは熟練した人
々によく知られた手段で試験管内で増殖されたそのよう
な染色体のライブラリーを含んだ当該技術分野に熟練し
た人々に知られた多くの方法のいずれかによって単離さ
れた個人の染色体または染色体の部分または転位させら
れた、削られたまたは他の損傷を受けた染色体；または
これらに限られるわけではないが精液、血液、髪または
他の標本を含むあらゆる法医学材料も含む。
チン誘導で標識されたＤＮＡの配列は、染色体を目標に
するためのインシチュハイブリダイゼーションのために
使われる。本発明の目的に対して「その場」あるいは「
インシチュ」とは染色体の実質的な破壊または相互に関
して各染色体が転移なしで細胞の核から露出され、キサ
ンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換体、好まし
くはテオフィリンまたはカフェインで標識されたＤＮＡ
プローブが染色体に接近しうることを意味する。このハ
イブリダイゼーションの標的はこれらに限られるわけで
はないが、正常、病気のまたは悪性腫瘍のヒトまたは他
の動物または植物細胞、減数分裂または有糸分裂の間期
またはあらゆる段階のいずれか、および生きているまた
は死後の組織、器官または体液から抽出されたあるいは
由来した；精子および卵細胞、種子、花粉、または接合
子、胎児、漿膜のまたは羊膜の細胞または他のあらゆる
発芽体からの細胞を含んだ胚細胞；試験管内で生育させ
た、長期間のまたは短期間の培養のいずれかからの、お
よび正常な、不死のまたは形質転換された細胞；細胞の
異なった型のまたはこれらの細胞の異なった分化の状態
の異種間のまたは種間の雑種の染色体または染色体の領
域；クローニングされ、そして原核生物のまたは他のク
ローニングベクター中で増殖させられまたは熟練した人
々によく知られた手段で試験管内で増殖されたそのよう
な染色体のライブラリーを含んだ当該技術分野に熟練し
た人々に知られた多くの方法のいずれかによって単離さ
れた個人の染色体または染色体の部分または転位させら
れた、削られたまたは他の損傷を受けた染色体；または
これらに限られるわけではないが精液、血液、髪または
他の標本を含むあらゆる法医学材料も含む。
【００５０】ハイブリダイゼーションの前に、サンプル
中の非特異的な結合性のＤＮＡを結合させるために、標
識されたＤＮＡの配列は過剰の対応する非標識のＤＮＡ
または非標識のＤＮＡの再び結合したフラクションと反
応させ、それによって非特異的なＤＮＡを遮へいして、
遮へいされた試薬を提供する。この遮へいＤＮＡは全ゲ
ノミックＤＮＡの溶液１０マイクロリットルに対して１
〜１０マイクログラムの濃度で用いられ、好ましい範囲
はハイブリダイズされる染色体に依存するが１０マイク
ロリットルに対して２．２５と６．７５マイクログラム
の間であり、または１０マイクロリットルに対して１と
４マイクログラムの間であり、１０マイクロリットルに
対して好ましくは約１．３マイクログラムである。遮へ
いＤＮＡはヒト胎盤ＤＮＡまたはＣｏｔ１ＤＮＡ（Ｃｏ
ｔ１ＤＮＡはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｃａｔ＃５２７９ＳＡか
ら入手可能である）であって良く、全ヒトゲノミックＤ
ＮＡを平均の長さを４００塩基対より短く機械的に剪断
して調製される。この材料は変性させられ、次に高度繰
り返しＤＮＡ配列の大部分が二本鎖になるのに十分な時
間再びハイブリダイズさせられる。二本鎖と一本鎖のＤ
ＮＡ種の混合物は、一本鎖ＤＮＡを単一またはオリゴヌ
クレオチドへ特異的に分解するヌクレアーゼであるヌク
レアーゼＳ１によって処理される。消化されなかった、
二本鎖のＣｏｔ１ＤＮＡはこの混合物から回収される。
中の非特異的な結合性のＤＮＡを結合させるために、標
識されたＤＮＡの配列は過剰の対応する非標識のＤＮＡ
または非標識のＤＮＡの再び結合したフラクションと反
応させ、それによって非特異的なＤＮＡを遮へいして、
遮へいされた試薬を提供する。この遮へいＤＮＡは全ゲ
ノミックＤＮＡの溶液１０マイクロリットルに対して１
〜１０マイクログラムの濃度で用いられ、好ましい範囲
はハイブリダイズされる染色体に依存するが１０マイク
ロリットルに対して２．２５と６．７５マイクログラム
の間であり、または１０マイクロリットルに対して１と
４マイクログラムの間であり、１０マイクロリットルに
対して好ましくは約１．３マイクログラムである。遮へ
いＤＮＡはヒト胎盤ＤＮＡまたはＣｏｔ１ＤＮＡ（Ｃｏ
ｔ１ＤＮＡはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｃａｔ＃５２７９ＳＡか
ら入手可能である）であって良く、全ヒトゲノミックＤ
ＮＡを平均の長さを４００塩基対より短く機械的に剪断
して調製される。この材料は変性させられ、次に高度繰
り返しＤＮＡ配列の大部分が二本鎖になるのに十分な時
間再びハイブリダイズさせられる。二本鎖と一本鎖のＤ
ＮＡ種の混合物は、一本鎖ＤＮＡを単一またはオリゴヌ
クレオチドへ特異的に分解するヌクレアーゼであるヌク
レアーゼＳ１によって処理される。消化されなかった、
二本鎖のＣｏｔ１ＤＮＡはこの混合物から回収される。
【００５１】好ましくは、染色体は（これらに限定され
るわけではないが）、プロピジウムイオダイド、キナク
リン、またはジスタマイシン／４，６−ジアミノ−２−
フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む多くの対比染色
剤またはギムザのような非蛍光性の色素の任意のものを
用いて染色し、肉眼で見えるようにする。
るわけではないが）、プロピジウムイオダイド、キナク
リン、またはジスタマイシン／４，６−ジアミノ−２−
フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む多くの対比染色
剤またはギムザのような非蛍光性の色素の任意のものを
用いて染色し、肉眼で見えるようにする。
【００５２】したがってこの発明は多くのキサンチンま
たはキサンチンの低級アルキル置換誘導体、で標識され
たＤＮＡの混合物（好ましくは検出すべき染色体の異な
った部分に相補的なテオフィリンまたはカフェインで標
識されている）を提供する。この発明の方法は何万では
ないまでも何千の、検出すべき染色体に相補的であり、
キサンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体
、もっとも好ましくはテオフィリンまたはカフェイン、
で標識された異なったＤＮＡの配列を提供する。この多
くの異なった標識されたＤＮＡの配列の染色体の重要な
部分へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズさ
れた標識ＤＮＡを標識に対する抗体と反応させること、
および次に標識に結合された抗体を、この標識に結合し
抗体に対して特異的な抗体（酵素または蛍光性のマーカ
ーで標識しておく）と結合させることによって染色体の
検出を可能にする。免疫学的技術分野で熟練した人々は
テオフィリンまたはカフェインのようなキサンチンまた
は低級アルキル置換キサンチンの標識が検出されうる多
くの免疫学的な技術を熟知している。例えばテオフィリ
ンまたはカフェインのようなキサンチンまたはキサンチ
ンの低級アルキル置換誘導体は、よく知られた技術によ
って抗体が誘導されるハプテンである。フルオレッセン
、ローダミンおよび類似物のような蛍光性のマーカーで
抗体を標識するための技術はよく知られている。セイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼのような酵素で抗体を標識することもよく知られて
いる。例えば標的の染色体にハイブリダイズされるＤＮ
Ａの断片上のテオフィリン標識のようなキサンチンまた
はキサンチンの低級アルキル置換誘導体の標識は、蛍光
でまたは酵素で標識された抗テオフィリン抗体との直接
的な反応によって検出されうるだろう。複合体は次のよ
うに表現される。染色体ＤＮＡ／テオフィリンで標識さ
れた相補的ＤＮＡ／抗テオフィリン抗体（蛍光または酵
素標識）。
たはキサンチンの低級アルキル置換誘導体、で標識され
たＤＮＡの混合物（好ましくは検出すべき染色体の異な
った部分に相補的なテオフィリンまたはカフェインで標
識されている）を提供する。この発明の方法は何万では
ないまでも何千の、検出すべき染色体に相補的であり、
キサンチンまたはキサンチンの低級アルキル置換誘導体
、もっとも好ましくはテオフィリンまたはカフェイン、
で標識された異なったＤＮＡの配列を提供する。この多
くの異なった標識されたＤＮＡの配列の染色体の重要な
部分へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズさ
れた標識ＤＮＡを標識に対する抗体と反応させること、
および次に標識に結合された抗体を、この標識に結合し
抗体に対して特異的な抗体（酵素または蛍光性のマーカ
ーで標識しておく）と結合させることによって染色体の
検出を可能にする。免疫学的技術分野で熟練した人々は
テオフィリンまたはカフェインのようなキサンチンまた
は低級アルキル置換キサンチンの標識が検出されうる多
くの免疫学的な技術を熟知している。例えばテオフィリ
ンまたはカフェインのようなキサンチンまたはキサンチ
ンの低級アルキル置換誘導体は、よく知られた技術によ
って抗体が誘導されるハプテンである。フルオレッセン
、ローダミンおよび類似物のような蛍光性のマーカーで
抗体を標識するための技術はよく知られている。セイヨ
ウワサビのペルオキシダーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼのような酵素で抗体を標識することもよく知られて
いる。例えば標的の染色体にハイブリダイズされるＤＮ
Ａの断片上のテオフィリン標識のようなキサンチンまた
はキサンチンの低級アルキル置換誘導体の標識は、蛍光
でまたは酵素で標識された抗テオフィリン抗体との直接
的な反応によって検出されうるだろう。複合体は次のよ
うに表現される。染色体ＤＮＡ／テオフィリンで標識さ
れた相補的ＤＮＡ／抗テオフィリン抗体（蛍光または酵
素標識）。
【００５３】別の構成では、テオフィリン標識は抗テオ
フィリン抗体と反応し、次にこの抗テオフィリン抗体は
、蛍光または酵素標識をもつ抗テオフィリン抗体への抗
体に結合される。例えばウサギ抗テオフィリン抗体はま
ずテオフィリン標識に結合され、そして蛍光または酵素
標識をもつヤギ抗ウサギ抗体による結合が続く。この構
成は次のように表現される。染色体ＤＮＡ／テオフィリ
ン標識された相補的ＤＮＡ／ウサギ抗テオフィリン抗体
／蛍光または酵素標識のあるヤギ抗ウサギ抗体。
フィリン抗体と反応し、次にこの抗テオフィリン抗体は
、蛍光または酵素標識をもつ抗テオフィリン抗体への抗
体に結合される。例えばウサギ抗テオフィリン抗体はま
ずテオフィリン標識に結合され、そして蛍光または酵素
標識をもつヤギ抗ウサギ抗体による結合が続く。この構
成は次のように表現される。染色体ＤＮＡ／テオフィリ
ン標識された相補的ＤＮＡ／ウサギ抗テオフィリン抗体
／蛍光または酵素標識のあるヤギ抗ウサギ抗体。
【００５４】蛍光または酵素の標識は標準的な技術によ
って検出される。免疫学的技術分野に熟練した人々はキ
サンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体、特
にテオフィリンまたはカフェインの標識のようなハプテ
ンを検出するための多くの分析方法、蛍光標識、および
酵素標識を良く知っている。キサンチンまたは低級アル
キル置換キサンチン誘導体、特にテオフィリンまたはカ
フェインの標識により形成している本発明の分析に、ア
ビジン／ビオチンのような他の特異的結合物質を利用す
ることもできる。
って検出される。免疫学的技術分野に熟練した人々はキ
サンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘導体、特
にテオフィリンまたはカフェインの標識のようなハプテ
ンを検出するための多くの分析方法、蛍光標識、および
酵素標識を良く知っている。キサンチンまたは低級アル
キル置換キサンチン誘導体、特にテオフィリンまたはカ
フェインの標識により形成している本発明の分析に、ア
ビジン／ビオチンのような他の特異的結合物質を利用す
ることもできる。
【００５５】本発明は次の例でさらに説明される。しか
しここで具体的に記述されていない多くの態様も本発明
の意図と範囲に含まれる。
しここで具体的に記述されていない多くの態様も本発明
の意図と範囲に含まれる。
【００５６】
【実施例】例１
ヒト染色体に特異的なＤＮＡプローブの単離ヒト染色体
に特異的なＤＮＡプローブはＶａｎ Ｄｉｌｌａ，Ｍ
．Ａ．ｅｔａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４；５
３７〜５５２，１９８６）に記載されているように作製
されたローレンスリベルモア国立研究所（Ｌａｗｒｅｎ
ｃｅＬｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＬＬＮＬ）からの組み換えフ
ァージライブラリーとして得られた。これらのライブラ
リーは大腸菌の宿主菌株中での増殖によって増幅された
。増幅されたファージは精製されて、それらのＤＮＡは
抽出され、このＤＮＡは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ によ
って消化された。挿入されていたＤＮＡはラムダベクタ
ーＤＮＡから精製されて分離され、そしてプラスミドベ
クターであるｐＢＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ サイトへクローニングされた。できあがったプラス
ミドは大腸菌菌株、ＤＨ５α（ベテスダリサーチライブ
ラリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ），ガイテルスブルク（Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ），メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）
）へ形質転換された。
に特異的なＤＮＡプローブはＶａｎ Ｄｉｌｌａ，Ｍ
．Ａ．ｅｔａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４；５
３７〜５５２，１９８６）に記載されているように作製
されたローレンスリベルモア国立研究所（Ｌａｗｒｅｎ
ｃｅＬｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＬＬＮＬ）からの組み換えフ
ァージライブラリーとして得られた。これらのライブラ
リーは大腸菌の宿主菌株中での増殖によって増幅された
。増幅されたファージは精製されて、それらのＤＮＡは
抽出され、このＤＮＡは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ によ
って消化された。挿入されていたＤＮＡはラムダベクタ
ーＤＮＡから精製されて分離され、そしてプラスミドベ
クターであるｐＢＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ サイトへクローニングされた。できあがったプラス
ミドは大腸菌菌株、ＤＨ５α（ベテスダリサーチライブ
ラリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ），ガイテルスブルク（Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ），メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）
）へ形質転換された。
【００５７】ここで例示されるプラスミドライブラリー
はＡＴＣＣ番号５７７３８，５７７５３および５７７５
４（第１染色体）；ＡＴＣＣ番号５７７４９，５７７４
８および５７７５１（第３染色体）；ＡＴＣＣ番号５７
７２３および５７７０２（第８染色体）およびＡＴＣＣ
番号５７７２７および５７７３６（第１２染色体）であ
る。ライブラリーは１ｍｌ単位の凍結細胞として保存さ
れている。これらのバイアルは培養のための種培養の生
産の主な源として使われてきた。
はＡＴＣＣ番号５７７３８，５７７５３および５７７５
４（第１染色体）；ＡＴＣＣ番号５７７４９，５７７４
８および５７７５１（第３染色体）；ＡＴＣＣ番号５７
７２３および５７７０２（第８染色体）およびＡＴＣＣ
番号５７７２７および５７７３６（第１２染色体）であ
る。ライブラリーは１ｍｌ単位の凍結細胞として保存さ
れている。これらのバイアルは培養のための種培養の生
産の主な源として使われてきた。
【００５８】バクテリアは発酵によって成育した。ＡＴ
ＣＣから得られた種は３７℃で２４時間アンピシリン（
２００マイクログラム／ｍｌ）およびＹＴ培地を含んだ
１．６％寒天プレート上で培養され、これはバクトトリ
プトン（Ｄｉｆｃｏ）をリットル当り８グラム（ｇ／ｌ
）、５ｇ／ｌのバクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆ
ｃｏ）、１５ｇ／ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、お
よび５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む。培養した細胞は
収穫され、１６ｇ／ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ
）、１０ｇ／ｌのバクトイーストエキストラクト（Ｄｉ
ｆｃｏ）および５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む４ｍｌ
および２０％グリセロール４ｍｌが各収穫へ加えられた
。 大腸菌の細胞培養は液体窒素にバイアルを沈めることに
よって０．５ｍｌづつすばやく凍結され、使用まで−８
０℃で保存された。
ＣＣから得られた種は３７℃で２４時間アンピシリン（
２００マイクログラム／ｍｌ）およびＹＴ培地を含んだ
１．６％寒天プレート上で培養され、これはバクトトリ
プトン（Ｄｉｆｃｏ）をリットル当り８グラム（ｇ／ｌ
）、５ｇ／ｌのバクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆ
ｃｏ）、１５ｇ／ｌのバクトアガー（Ｄｉｆｃｏ）、お
よび５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む。培養した細胞は
収穫され、１６ｇ／ｌのバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ
）、１０ｇ／ｌのバクトイーストエキストラクト（Ｄｉ
ｆｃｏ）および５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む４ｍｌ
および２０％グリセロール４ｍｌが各収穫へ加えられた
。 大腸菌の細胞培養は液体窒素にバイアルを沈めることに
よって０．５ｍｌづつすばやく凍結され、使用まで−８
０℃で保存された。
【００５９】発酵槽への接種源はｐＨ７．３７℃で２リ
ットルの振とう機用のフラスコ中の１３．２ｇ／ｌＮａ
２ ＨＰＯ４ −７Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌＫＨ２ Ｐ
Ｏ４ 、０．０５ｇ／ｌＮａＣｌ、１．０ｇ／ｌＮＨ４
Ｃｌ、１０．０ｇ／ｌカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）；０
．０３ｇ／ｌＭｇＳＯ４ 、０．００４ｇ／ｌＣａＣｌ
２ −２Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌグルコース、０．０２
５ｇ／ｌチアミン塩酸塩、０．００５４ｇ／ｌＦｅＣｌ
３ 、０．０００４ｇ／ｌＺｎＳＯ４ 、０．０００７
ｇ／ｌＣｏＣｌ２ 、０．０００７ｇ／ｌＮａ２ Ｍｏ
Ｏ４ 、０．０００８ｇ／ｌＣｕＳＯ４ 、０．０００
２ｇ／ｌＨ２ ＢＯ３ および０．０００５ｇ／ｌＭｎ
ＳＯ４ を含む緩衝化されたカザミノ酸培地中で種培養
菌を培養することによって３５０ｍｌ中に調製された。 ３５０ｍｌの培養菌は１％グルコース、１３．２ｇ／ｌ
Ｎａ２ ＨＰＯ４ −７Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌＫＨ２
ＰＯ４ 、０．０５ｇ／ｌＮａＣｌ、１．０ｇ／ｌＮ
Ｈ４ Ｃｌ、１０．０ｇ／ｌカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）
、０．０３ｇ／ｌＭｇＳＯ４ 、０．００４ｇ／ｌＣａ
Ｃｌ２ −２Ｈ２ Ｏ、０．０２５ｇ／ｌチアミン塩酸
塩、０．００５４ｇ／ｌＦｅＣｌ３ 、０．０００４ｇ
／ｌＺｎＳＯ４ 、０．０００７ｇ／ｌＣｏＣｌ２ 、
０．０００７ｇ／ｌＮａ２ ＭｏＯ４ 、０．０００８
ｇ／ｌＣｕＳＯ４ 、０．０００２ｇ／ｌＨ２ ＢＯ３
および０．０００５ｇ／ｌＭｎＳＯ４ を含む４．２
リットルの発酵培地に接種するために用いられた。
ットルの振とう機用のフラスコ中の１３．２ｇ／ｌＮａ
２ ＨＰＯ４ −７Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌＫＨ２ Ｐ
Ｏ４ 、０．０５ｇ／ｌＮａＣｌ、１．０ｇ／ｌＮＨ４
Ｃｌ、１０．０ｇ／ｌカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）；０
．０３ｇ／ｌＭｇＳＯ４ 、０．００４ｇ／ｌＣａＣｌ
２ −２Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌグルコース、０．０２
５ｇ／ｌチアミン塩酸塩、０．００５４ｇ／ｌＦｅＣｌ
３ 、０．０００４ｇ／ｌＺｎＳＯ４ 、０．０００７
ｇ／ｌＣｏＣｌ２ 、０．０００７ｇ／ｌＮａ２ Ｍｏ
Ｏ４ 、０．０００８ｇ／ｌＣｕＳＯ４ 、０．０００
２ｇ／ｌＨ２ ＢＯ３ および０．０００５ｇ／ｌＭｎ
ＳＯ４ を含む緩衝化されたカザミノ酸培地中で種培養
菌を培養することによって３５０ｍｌ中に調製された。 ３５０ｍｌの培養菌は１％グルコース、１３．２ｇ／ｌ
Ｎａ２ ＨＰＯ４ −７Ｈ２ Ｏ、３．０ｇ／ｌＫＨ２
ＰＯ４ 、０．０５ｇ／ｌＮａＣｌ、１．０ｇ／ｌＮ
Ｈ４ Ｃｌ、１０．０ｇ／ｌカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）
、０．０３ｇ／ｌＭｇＳＯ４ 、０．００４ｇ／ｌＣａ
Ｃｌ２ −２Ｈ２ Ｏ、０．０２５ｇ／ｌチアミン塩酸
塩、０．００５４ｇ／ｌＦｅＣｌ３ 、０．０００４ｇ
／ｌＺｎＳＯ４ 、０．０００７ｇ／ｌＣｏＣｌ２ 、
０．０００７ｇ／ｌＮａ２ ＭｏＯ４ 、０．０００８
ｇ／ｌＣｕＳＯ４ 、０．０００２ｇ／ｌＨ２ ＢＯ３
および０．０００５ｇ／ｌＭｎＳＯ４ を含む４．２
リットルの発酵培地に接種するために用いられた。
【００６０】バクテリアの細胞は発酵の終了直後に細胞
濃縮膜および高速遠心器を用いて収穫された。発酵に用
いた細胞培地は０．４５ミクロン（μｍ）の膜フィルタ
ー（２００平方フィート）を用いて５リットルから約８
００ｍｌへ濃縮された。細胞の濃縮物は次に冷却遠心機
中で７，０００×ｇで１０分間遠心された。バクテリア
の細胞の塊は上清を除いた後に回収される。
濃縮膜および高速遠心器を用いて収穫された。発酵に用
いた細胞培地は０．４５ミクロン（μｍ）の膜フィルタ
ー（２００平方フィート）を用いて５リットルから約８
００ｍｌへ濃縮された。細胞の濃縮物は次に冷却遠心機
中で７，０００×ｇで１０分間遠心された。バクテリア
の細胞の塊は上清を除いた後に回収される。
【００６１】プラスミドのＤＮＡはバクテリアの細胞の
塊から抽出された。細胞は５０ｍＭグルコース（フィル
ターを通して滅菌されたもの）、１０ｍＭ ＮａＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）、および２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む細胞の塊の質量（Ｍ
）の３倍の（ミリリットルで）溶液中に十分に再懸濁さ
れた。細胞は６×Ｍ（ミリリットルで）の０．２Ｍ
ＮａＯＨ、および１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を加えた後に激しく撹拌することによって
溶菌された。溶液が透明になったとき、最終体積５００
ｍｌ中に５５．５ｍｌの氷酢酸および１４７．５グラム
の酢酸カリウムを含む溶液を４．５×Ｍ（ミリリットル
で）だけ十分に混合して、綿状の沈殿物を生じさせた。 上清は綿状の沈殿物から分離されそしてこの上清は残っ
た沈殿物を除くために１５分間７，０００×ｇで遠心さ
れた。
塊から抽出された。細胞は５０ｍＭグルコース（フィル
ターを通して滅菌されたもの）、１０ｍＭ ＮａＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５〜８．０）、および２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む細胞の塊の質量（Ｍ
）の３倍の（ミリリットルで）溶液中に十分に再懸濁さ
れた。細胞は６×Ｍ（ミリリットルで）の０．２Ｍ
ＮａＯＨ、および１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を加えた後に激しく撹拌することによって
溶菌された。溶液が透明になったとき、最終体積５００
ｍｌ中に５５．５ｍｌの氷酢酸および１４７．５グラム
の酢酸カリウムを含む溶液を４．５×Ｍ（ミリリットル
で）だけ十分に混合して、綿状の沈殿物を生じさせた。 上清は綿状の沈殿物から分離されそしてこの上清は残っ
た沈殿物を除くために１５分間７，０００×ｇで遠心さ
れた。
【００６２】核酸は１体積のエタノールの混合とその後
の１０分間の７，０００ｇの遠心によって上清から沈殿
し、核酸の塊は全部で０．５４×Ｍ（ミリリットルで）
中に再懸濁された。核酸は次に１／２体積の中和したフ
ェノールおよび１／２体積のクロロホルムによって抽出
され、そして２体積のエタノールによって沈殿した。核
酸は０．３×Ｍ（ミリリットルで）の５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ酢酸ナ
トリウムの溶液中に再懸濁された。０．７７×Ｍ（マイ
クロリットルで）の１０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（加熱処
理されたもの）が次に加えられ、そして室温で３０分間
または４℃で一晩消化された。０．６１５×Ｍ（マイク
ロリットルで）のプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）の
溶液が次に加えられて、そして３時間５５℃で保温され
る。ＤＮＡは１／２体積の中和したフェノールおよび１
／２体積のクロロホルムによって抽出され、そして２体
積のエタノールによって沈殿した。
の１０分間の７，０００ｇの遠心によって上清から沈殿
し、核酸の塊は全部で０．５４×Ｍ（ミリリットルで）
中に再懸濁された。核酸は次に１／２体積の中和したフ
ェノールおよび１／２体積のクロロホルムによって抽出
され、そして２体積のエタノールによって沈殿した。核
酸は０．３×Ｍ（ミリリットルで）の５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および１００ｍＭ酢酸ナ
トリウムの溶液中に再懸濁された。０．７７×Ｍ（マイ
クロリットルで）の１０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（加熱処
理されたもの）が次に加えられ、そして室温で３０分間
または４℃で一晩消化された。０．６１５×Ｍ（マイク
ロリットルで）のプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）の
溶液が次に加えられて、そして３時間５５℃で保温され
る。ＤＮＡは１／２体積の中和したフェノールおよび１
／２体積のクロロホルムによって抽出され、そして２体
積のエタノールによって沈殿した。
【００６３】ＤＮＡは０．４１５×Ｍ（ミリリットルで
）の水に再懸濁され、そして０．０５×Ｍミリリットル
の５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１５５×Ｍミリリットル
の５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
（分子量６０００〜８０００）が加えられ、氷水中に１
時間置かれ、そして１５分間の７，０００×ｇの遠心に
よって沈殿した。ＤＮＡは０．０４×Ｍミリリットルの
水および１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁
されて１／２体積の中和したフェノールおよび１／２体
積のクロロホルムで抽出されて、そして２体積のエタノ
ールで沈殿した。精製されたＤＮＡは０．０４７６×Ｍ
ミリリットルの脱イオン水に再懸濁された。
）の水に再懸濁され、そして０．０５×Ｍミリリットル
の５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１５５×Ｍミリリットル
の５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
（分子量６０００〜８０００）が加えられ、氷水中に１
時間置かれ、そして１５分間の７，０００×ｇの遠心に
よって沈殿した。ＤＮＡは０．０４×Ｍミリリットルの
水および１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム中に再懸濁
されて１／２体積の中和したフェノールおよび１／２体
積のクロロホルムで抽出されて、そして２体積のエタノ
ールで沈殿した。精製されたＤＮＡは０．０４７６×Ｍ
ミリリットルの脱イオン水に再懸濁された。
【００６４】最後に精製されたＤＮＡはブランソンソニ
ファー４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ４５
０）（Ｄａｎｂｕｙ，コネクティカット）を用いた超音
波処理によって約３００塩基対の小さな断片へ分断され
た。インシチュハイブリダイゼーションのために使われ
るＤＮＡプローブに対して最適な大きさにするために、
断片の大きさは経験的に決定された。上記のように調製
され、精製された４マイクログラムのプラスミドＤＮＡ
は２ｍｌの水に再懸濁されて、超音波処理中の沸騰を防
ぐためにドライアイス／エタール槽中に沈められた。超
音波装置の微小先端はこの先端がチューブの底から２〜
５ｍｍになるまでこの溶液中に沈められた。超音波は２
５〜３０ワットの出力で８０％の作動サイクル（８０％
の時間オン，２０％の時間オフ）で不連続的に、５分間
実行された。超音波処理に続いてＤＮＡは０．２ｍｌの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および４ｍｌのエタ
ノールの添加によって沈殿した。沈殿は５分間の８，０
００×ｇの遠心によって回収され、減圧乾燥された。
ファー４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｅｒ４５
０）（Ｄａｎｂｕｙ，コネクティカット）を用いた超音
波処理によって約３００塩基対の小さな断片へ分断され
た。インシチュハイブリダイゼーションのために使われ
るＤＮＡプローブに対して最適な大きさにするために、
断片の大きさは経験的に決定された。上記のように調製
され、精製された４マイクログラムのプラスミドＤＮＡ
は２ｍｌの水に再懸濁されて、超音波処理中の沸騰を防
ぐためにドライアイス／エタール槽中に沈められた。超
音波装置の微小先端はこの先端がチューブの底から２〜
５ｍｍになるまでこの溶液中に沈められた。超音波は２
５〜３０ワットの出力で８０％の作動サイクル（８０％
の時間オン，２０％の時間オフ）で不連続的に、５分間
実行された。超音波処理に続いてＤＮＡは０．２ｍｌの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および４ｍｌのエタ
ノールの添加によって沈殿した。沈殿は５分間の８，０
００×ｇの遠心によって回収され、減圧乾燥された。
【００６５】例２
重亜硫酸塩触媒によるＤＮＡのアミノ基転移エチレンジ
アミンの添加によってＤＮＡはシトシン塩基のＣ４炭素
原子へアミノ基転移を起こされた。この反応は重亜硫酸
ナトリウムによって触媒される。存在するデオキシシチ
ジンヌクレオチドの部分の約８〜２４％はキサンチンま
たは低級アルキル置換キサンチン誘導体、特にテオフィ
リンまたはカフェインを用いた標識のためにアミノ化さ
れる。
アミンの添加によってＤＮＡはシトシン塩基のＣ４炭素
原子へアミノ基転移を起こされた。この反応は重亜硫酸
ナトリウムによって触媒される。存在するデオキシシチ
ジンヌクレオチドの部分の約８〜２４％はキサンチンま
たは低級アルキル置換キサンチン誘導体、特にテオフィ
リンまたはカフェインを用いた標識のためにアミノ化さ
れる。
【００６６】重亜硫酸塩緩衝液を調製するために、１．
７ｍｌの発煙塩化水素（ＨＣｌ）が氷上の１ｍｌの脱イ
オン水にゆっくりと加えられた。１ｍｌの新しいエチレ
ンジアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｅ−４
３７９）が次に氷上でゆっくりと加えられた。エチレン
ジアミンの溶解後に、溶液は室温にまで温められて、そ
して０．４７５ｇの無水重亜硫酸ナトリウム（アルドリ
ッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）カタログ番号２５，５５５〜６
）が加えられた。次にｐＨが７．０に達するまで発煙塩
化水素（ＨＣｌ）が重亜硫酸混合液にゆっくりと加えら
れた。最終体積が５．０ｍｌになるように脱イオン水が
加えられた。
７ｍｌの発煙塩化水素（ＨＣｌ）が氷上の１ｍｌの脱イ
オン水にゆっくりと加えられた。１ｍｌの新しいエチレ
ンジアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｅ−４
３７９）が次に氷上でゆっくりと加えられた。エチレン
ジアミンの溶解後に、溶液は室温にまで温められて、そ
して０．４７５ｇの無水重亜硫酸ナトリウム（アルドリ
ッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）カタログ番号２５，５５５〜６
）が加えられた。次にｐＨが７．０に達するまで発煙塩
化水素（ＨＣｌ）が重亜硫酸混合液にゆっくりと加えら
れた。最終体積が５．０ｍｌになるように脱イオン水が
加えられた。
【００６７】ＤＮＡにアミノ基転移を起こすために、１
ミリグラムの超音波処理されたＤＮＡが０．３ｍｌの水
に再懸濁された。ＤＮＡは１００℃で５分間の煮沸によ
って変性されて、その後に氷水浴中ですばやく冷却され
た。アミノ基転移反応は０．３ｍｌのこのＤＮＡ溶液の
２．７ｍｌの重亜硫酸塩緩衝液への添加によって開始さ
れ、そして反応は３７℃で２日間保温された。ＤＮＡ溶
液は５−１０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に対
して通常の透析により脱塩された。透析後に０．３ｍｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）が透析物へ加えら
れた。アミノ化されたＤＮＡは２．５体積のエタノール
によって沈殿し、８，０００×ｇの１０分間の遠心後に
回収された。塊は真空乾燥され、そして３ｍｇ／ｍｌＤ
ＮＡの濃度になるように溶解された。この溶液は使用ま
で−８０℃で保存された。
ミリグラムの超音波処理されたＤＮＡが０．３ｍｌの水
に再懸濁された。ＤＮＡは１００℃で５分間の煮沸によ
って変性されて、その後に氷水浴中ですばやく冷却され
た。アミノ基転移反応は０．３ｍｌのこのＤＮＡ溶液の
２．７ｍｌの重亜硫酸塩緩衝液への添加によって開始さ
れ、そして反応は３７℃で２日間保温された。ＤＮＡ溶
液は５−１０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に対
して通常の透析により脱塩された。透析後に０．３ｍｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）が透析物へ加えら
れた。アミノ化されたＤＮＡは２．５体積のエタノール
によって沈殿し、８，０００×ｇの１０分間の遠心後に
回収された。塊は真空乾燥され、そして３ｍｇ／ｍｌＤ
ＮＡの濃度になるように溶解された。この溶液は使用ま
で−８０℃で保存された。
【００６８】例３
テオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミ
ノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホ
サクシニミジル））エステルの調製 １８ｍｌのパラ−キシレン中の５．１６グラムの８−ブ
ロモテオフィリンおよび５．１５グラムの５−アミノ−
１ペンタノールの溶液は１８時間還流された。反応溶液
は冷却され、室温まで冷却されると固体／液体の混合物
を形成した。キシレンは別の容器に移され、そして固体
はペンタン（３×４０ｍｌ）で洗われた。できあがった
固体は２０ｍｌの水中で３０分間撹拌され、固体の物質
を集めるために濾過された。集められた固体の物質は水
（３×２０ｍｌ）で洗われ、そして乾燥されて３．７３
ｇの８−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）テオフィリ
ンが得られた。１５ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）中の１．１２ｇの８−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）テオフィリンの溶液へ０．５１６ｇ
のコハク酸無水物および０．２ｇの４−ジメチルアミノ
ピリジン（ＤＭＡＰ）が加えられた。混合液は無水条件
下で一晩室温でマグネティックスターラーを用いて撹拌
された。沈殿した無色の固体は減圧濾過によって集めら
れ、ジクロロメタンで洗われ、そして風乾されて、１．
２０ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−コハク酸エステルが得られた。この
固体は沸騰している１：１のプロパノール／水の混合液
から再結晶されて、硫酸カルシウムの上で乾燥されて、
無色の固体が得られた。
ノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホ
サクシニミジル））エステルの調製 １８ｍｌのパラ−キシレン中の５．１６グラムの８−ブ
ロモテオフィリンおよび５．１５グラムの５−アミノ−
１ペンタノールの溶液は１８時間還流された。反応溶液
は冷却され、室温まで冷却されると固体／液体の混合物
を形成した。キシレンは別の容器に移され、そして固体
はペンタン（３×４０ｍｌ）で洗われた。できあがった
固体は２０ｍｌの水中で３０分間撹拌され、固体の物質
を集めるために濾過された。集められた固体の物質は水
（３×２０ｍｌ）で洗われ、そして乾燥されて３．７３
ｇの８−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）テオフィリ
ンが得られた。１５ｍｌの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）中の１．１２ｇの８−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）テオフィリンの溶液へ０．５１６ｇ
のコハク酸無水物および０．２ｇの４−ジメチルアミノ
ピリジン（ＤＭＡＰ）が加えられた。混合液は無水条件
下で一晩室温でマグネティックスターラーを用いて撹拌
された。沈殿した無色の固体は減圧濾過によって集めら
れ、ジクロロメタンで洗われ、そして風乾されて、１．
２０ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−コハク酸エステルが得られた。この
固体は沸騰している１：１のプロパノール／水の混合液
から再結晶されて、硫酸カルシウムの上で乾燥されて、
無色の固体が得られた。
【００６９】１５ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中の
０．７２５ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）−Ｏ−コハク酸エステルの溶液へ０
．４１４ｇの３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）が加えられた。
０．７２５ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）−Ｏ−コハク酸エステルの溶液へ０
．４１４ｇの３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）が加えられた。
【００７０】２ｍｌの無水ＤＭＦ中の０．４８８ｇのジ
シクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）の溶液が上
の溶液に加えられた。得られた混合物はマグネティック
スターラーを用いて室温で１６時間撹拌された。反応混
合物は氷浴中で１時間冷却されて、次にジシクロヘキシ
ルウレアを除くために減圧下で濾過された。濾液は真空
中で（２トル，３０℃）蒸発されて、粘性のある無色の
油になった。この油は４０ｍｌの無水エタノールで処理
されて固体の物質は沈殿した。沈殿した物質は濾過によ
って集められて、無水硫酸カルシウム上で乾燥されて、
０．４５０ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′
−（３−スルホサクシニミジル））エステル、（ＮＨＳ
−テオフィリン）が得られた。この反応の図式が図１に
図解されている。アミノ化されたＤＮＡのＮＨＳ−テオ
フィリンでの標識は図２に示されている。
シクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）の溶液が上
の溶液に加えられた。得られた混合物はマグネティック
スターラーを用いて室温で１６時間撹拌された。反応混
合物は氷浴中で１時間冷却されて、次にジシクロヘキシ
ルウレアを除くために減圧下で濾過された。濾液は真空
中で（２トル，３０℃）蒸発されて、粘性のある無色の
油になった。この油は４０ｍｌの無水エタノールで処理
されて固体の物質は沈殿した。沈殿した物質は濾過によ
って集められて、無水硫酸カルシウム上で乾燥されて、
０．４５０ｇのテオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキ
シペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′
−（３−スルホサクシニミジル））エステル、（ＮＨＳ
−テオフィリン）が得られた。この反応の図式が図１に
図解されている。アミノ化されたＤＮＡのＮＨＳ−テオ
フィリンでの標識は図２に示されている。
【００７１】例４
８−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）カフェイン、カ
フェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）
−Ｏ−コハク酸エステルおよびカフェイン−８−Ｎ−（
５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−
Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステ
ル、（ＮＨＳ−カフェイン）の調製 例３中の８−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）テオフ
ィリンを出発物質とし、１．０ｍｌのジメチル硫酸（Ｄ
ＭＳ）が０．３ｇの水酸化ナトリウムを含む２０ｍｌの
水中の１．４０ｇの８−（５−ヒドロキシペンチルアミ
ノ）テオフィリンへ加えられた。１．０ｍｌのＤＭＳが
０．１ｍｌづつ１時間以上かけて室温で加えられた。無
色の結晶性の固体が分離されて濾過によって集められた
。この固体が乾燥されて、０．８５０ｇの８−（５−ヒ
ドロキシペンチルアミノ）カフェインが得られた。
フェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）
−Ｏ−コハク酸エステルおよびカフェイン−８−Ｎ−（
５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−
Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステ
ル、（ＮＨＳ−カフェイン）の調製 例３中の８−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）テオフ
ィリンを出発物質とし、１．０ｍｌのジメチル硫酸（Ｄ
ＭＳ）が０．３ｇの水酸化ナトリウムを含む２０ｍｌの
水中の１．４０ｇの８−（５−ヒドロキシペンチルアミ
ノ）テオフィリンへ加えられた。１．０ｍｌのＤＭＳが
０．１ｍｌづつ１時間以上かけて室温で加えられた。無
色の結晶性の固体が分離されて濾過によって集められた
。この固体が乾燥されて、０．８５０ｇの８−（５−ヒ
ドロキシペンチルアミノ）カフェインが得られた。
【００７２】例３中の手順に従い、同量を用いて、８−
（５−ヒドロキシペンチルアミノ）カフェインはカフェ
イン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ
−コハク酸エステルおよびカフェイン−８−Ｎ−（５−
ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′
−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステル、
（ＮＨＳ−カフェイン）へ変換される。
（５−ヒドロキシペンチルアミノ）カフェインはカフェ
イン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ
−コハク酸エステルおよびカフェイン−８−Ｎ−（５−
ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′
−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステル、
（ＮＨＳ−カフェイン）へ変換される。
【００７３】例５
テオフィリンでのＤＮＡの標識
例１の手順で得られた平均の長さが約３００ｂｐのヒト
第８染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプローブは
例２に記述されたようにエチレンジアミンを用いた重亜
硫酸塩に触媒されるアミノ基転移によって誘導体化され
た。塩基の約５％がアミノ化された。プラスチックの１
．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ（１００μ
ｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された。この溶液
に０．５ｍｌの０．２Ｍ３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパ
ンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液が加えられ、そして次
に１００マイクロリットルのＮＨＳ−テオフィリン（２
６ｍｇ／ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）が残渣
に加えられてそして混合物は一晩２５℃で保温された。 ５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、続いて
１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて、混合物は少
なくとも２時間−２０℃に保たれた。溶液は１０分間で
１０，０００×ｇで遠心された。塊は０．６ｍｌの氷冷
エタノールで２回洗われて次に１００μｌの滅菌水に溶
解された。 ０．８ｍｌのベッドボリウムの２つのセファデックスＧ
−５０セレクトＤクロマトグラフィーカラム（５−プラ
イム→３プライム（５Ｐｒｉｍｅ→３Ｐｒｉｍｅ），Ｉ
ｎｃ．）が準備された。溶解された塊の５０μｌが各カ
ラムにのせられ、４分間１０，０００×ｇで遠心された
。 精製されたＤＮＡの１０μｌは４９０μｌの２０ｍＭ
ＮａＯＨで希釈されて、ＤＮＡの濃度を評価するため
に光学濃度が２６０ｎｍにおいて測定された。ＤＮＡを
用いるときの濃度であるｍｌ当たり１００マイクログラ
ムにするために精製されたＤＮＡは水で希釈された。
第８染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプローブは
例２に記述されたようにエチレンジアミンを用いた重亜
硫酸塩に触媒されるアミノ基転移によって誘導体化され
た。塩基の約５％がアミノ化された。プラスチックの１
．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ（１００μ
ｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された。この溶液
に０．５ｍｌの０．２Ｍ３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパ
ンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液が加えられ、そして次
に１００マイクロリットルのＮＨＳ−テオフィリン（２
６ｍｇ／ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）が残渣
に加えられてそして混合物は一晩２５℃で保温された。 ５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、続いて
１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて、混合物は少
なくとも２時間−２０℃に保たれた。溶液は１０分間で
１０，０００×ｇで遠心された。塊は０．６ｍｌの氷冷
エタノールで２回洗われて次に１００μｌの滅菌水に溶
解された。 ０．８ｍｌのベッドボリウムの２つのセファデックスＧ
−５０セレクトＤクロマトグラフィーカラム（５−プラ
イム→３プライム（５Ｐｒｉｍｅ→３Ｐｒｉｍｅ），Ｉ
ｎｃ．）が準備された。溶解された塊の５０μｌが各カ
ラムにのせられ、４分間１０，０００×ｇで遠心された
。 精製されたＤＮＡの１０μｌは４９０μｌの２０ｍＭ
ＮａＯＨで希釈されて、ＤＮＡの濃度を評価するため
に光学濃度が２６０ｎｍにおいて測定された。ＤＮＡを
用いるときの濃度であるｍｌ当たり１００マイクログラ
ムにするために精製されたＤＮＡは水で希釈された。
【００７４】インシチュハイブリダイゼーションの手順
テオフィリンで標識されたＤＮＡプローブはインシチュ
ハイブリダイゼーションによってためされた。標的ＤＮ
Ａは中期に得られた培養された正常な白血球から成った
。細胞はこわれて核が露出するように約３フィート上か
ら顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされた。ハイブリ
ダイゼーションの前にスライドガラスは７０％ホルムア
ミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置かれた。スライ
ドガラスは次に７０％，８５％および１００％エタノー
ルに通すことによって（各２分）脱水された。
テオフィリンで標識されたＤＮＡプローブはインシチュ
ハイブリダイゼーションによってためされた。標的ＤＮ
Ａは中期に得られた培養された正常な白血球から成った
。細胞はこわれて核が露出するように約３フィート上か
ら顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされた。ハイブリ
ダイゼーションの前にスライドガラスは７０％ホルムア
ミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置かれた。スライ
ドガラスは次に７０％，８５％および１００％エタノー
ルに通すことによって（各２分）脱水された。
【００７５】各スライドガラス上に置かれたハイブリダ
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）は遮へいＤＮＡとして使われ
た。 テオフィリンで標識されたＤＮＡは１０ｎｇ／μｌの濃
度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼー
ション混合液の１０μｌが７０℃で１０分間加熱するこ
とによって変性された。プローブと遮へいＤＮＡは６０
分間３７℃でプリハイブリダイズされた。混合液は次に
スライドガラスに塗られて、カバーガラスをかぶせられ
てゴムセメントで密封された。ハイブリダイゼーション
は一晩３７℃で加湿された室で行なわれた。
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）は遮へいＤＮＡとして使われ
た。 テオフィリンで標識されたＤＮＡは１０ｎｇ／μｌの濃
度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼー
ション混合液の１０μｌが７０℃で１０分間加熱するこ
とによって変性された。プローブと遮へいＤＮＡは６０
分間３７℃でプリハイブリダイズされた。混合液は次に
スライドガラスに塗られて、カバーガラスをかぶせられ
てゴムセメントで密封された。ハイブリダイゼーション
は一晩３７℃で加湿された室で行なわれた。
【００７６】次の日に過剰のプローブはスライドガラス
を３回１５分間４５℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニ
アによって売られている非イオン性界面活性剤である）
（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うことに
よって除かれた。
を３回１５分間４５℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニ
アによって売られている非イオン性界面活性剤である）
（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うことに
よって除かれた。
【００７７】スライドガラスは２回ＰＮ緩衝液中で２５
℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは１時間０．
１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０界
面活性剤／５％脱脂粉乳（ＰＮＭ緩衝剤）中でふさがれ
た。スライドガラスは１時間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で
１：２５０に希釈されたウサギ抗テオフィリン（シグマ
（Ｓｉｇｍａ））中で保温された。スライドガラスはＰ
Ｎ緩衝液中で３回５分間各々２５℃で洗われた。スライ
ドガラスは次に１時間ＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希
釈されたアルカリホスファターゼ−抗ウサギ免疫グロブ
リンＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で保温された。スラ
イドガラスはＰＮ緩衝液中で３回５分間各々２５℃で洗
われた。スライドガラスは次に１７ｍｌのＢＣＩＰ／Ｎ
ＢＴ〔４μｌ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）および３ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ，ケムプローブ（Ｃ
ｈｅｍｐｒｏｂｅ）から入手できる）〕中で３０分間３
７℃で保温された。スライドガラスは蒸留中ですすがれ
て、風乾されて、そして顕微鏡で観察された。
℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは１時間０．
１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０界
面活性剤／５％脱脂粉乳（ＰＮＭ緩衝剤）中でふさがれ
た。スライドガラスは１時間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で
１：２５０に希釈されたウサギ抗テオフィリン（シグマ
（Ｓｉｇｍａ））中で保温された。スライドガラスはＰ
Ｎ緩衝液中で３回５分間各々２５℃で洗われた。スライ
ドガラスは次に１時間ＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希
釈されたアルカリホスファターゼ−抗ウサギ免疫グロブ
リンＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で保温された。スラ
イドガラスはＰＮ緩衝液中で３回５分間各々２５℃で洗
われた。スライドガラスは次に１７ｍｌのＢＣＩＰ／Ｎ
ＢＴ〔４μｌ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）および３ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ，ケムプローブ（Ｃ
ｈｅｍｐｒｏｂｅ）から入手できる）〕中で３０分間３
７℃で保温された。スライドガラスは蒸留中ですすがれ
て、風乾されて、そして顕微鏡で観察された。
【００７８】インシチュハイブリダイゼーションの結果
アルカリホスファターゼの標識はＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質
の顕微鏡で見たときに黒く見える暗い青い色素への変換
を触媒する。標的ではない染色体は無色に見えるかまた
はギムザ染色の調製物を用いて青く対比染色されうる。
アルカリホスファターゼの標識はＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質
の顕微鏡で見たときに黒く見える暗い青い色素への変換
を触媒する。標的ではない染色体は無色に見えるかまた
はギムザ染色の調製物を用いて青く対比染色されうる。
【００７９】上の手順に実質的に従って、第１，３，お
よび１２染色体の結果も得られた。 略号： 特異性：（−）見えない、 （＋）標的
の染色体中でやや濃い染色、（＋＋）妥当な特異性、
（＋＋＋）良い特異性。
よび１２染色体の結果も得られた。 略号： 特異性：（−）見えない、 （＋）標的
の染色体中でやや濃い染色、（＋＋）妥当な特異性、
（＋＋＋）良い特異性。
【００８０】強 度：（−）見えない、
（＋）位相下でのみ見える、（＋＋）透過の下で濃
い染色、（＋＋＋）とても濃い染色，位相下で光線を屈
折しうる。
（＋）位相下でのみ見える、（＋＋）透過の下で濃
い染色、（＋＋＋）とても濃い染色，位相下で光線を屈
折しうる。
【００８１】例６
カフェインでのＤＮＡの標識
例１の手順によって得られた約３００ｂｐの平均の長さ
のヒト第４染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプロ
ーブは、例２に記述されたようにエチレンジアミンを用
いた重亜硫酸塩触媒によるアミノ基転移によって誘導体
化された。塩基の約４．３％がアミノ化された。プラス
チックの１．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ
（１００μｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された
。 ０．５ｍｌの３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、次に１００μｌのＮＨＳ−カフ
ェイン（３ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド）が残渣に加えられて、そして混合液は一晩２５℃で
保温された。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
５）、続いて１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて
、そして混合液は少なくとも２時間−２０℃に保たれた
。溶液は１０分間１０，０００×ｇで遠心された。塊は
２回０．６ｍｌの氷冷エタノールで洗われ、そして１０
０μｌの滅菌水中に溶解された。０．８ｍｌのベッドボ
リウムの２つのセファデックスＧ−５０セレクトＤクロ
マトグラフィーカラム（５プライム→３プライム（５Ｐ
ｒｉｍｅ→３Ｐｒｉｍｅ），Ｉｎｃ．）が準備された。 溶解された塊の５０μｌが各カラムにのせられて、４分
間１０，０００で遠心された。１０μｌの精製されたＤ
ＮＡは４９０μｌの２０ｍＭ ＮａＯＨで希釈されて
、そしてＤＮＡの濃度を評価するために光学濃度が２６
０ｎｍにおいて測定された。精製されたＤＮＡをｍｌ当
たり１００マイクログラムの使用ＤＮＡ濃度にするため
には、水で希釈した。 インシチュハイブリダイゼー
ションの手順カフェインで標識されたＤＮＡプローブに
よりインシチュハイブリダイゼーションの試験を行なっ
た。標的ＤＮＡは中期に得られた培養された正常な白血
球から成った。細胞はこわれて核が露出するように約３
フィート上から顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされ
た。ハイブリダイゼーションの前にスライドガラスは７
０％ホルムアミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置か
れた。スライドガラスは次に７０％，８５％および１０
０％エタノールに通すことによって（各２分）脱水され
た。
のヒト第４染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプロ
ーブは、例２に記述されたようにエチレンジアミンを用
いた重亜硫酸塩触媒によるアミノ基転移によって誘導体
化された。塩基の約４．３％がアミノ化された。プラス
チックの１．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ
（１００μｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された
。 ０．５ｍｌの３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、次に１００μｌのＮＨＳ−カフ
ェイン（３ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド）が残渣に加えられて、そして混合液は一晩２５℃で
保温された。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
５）、続いて１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて
、そして混合液は少なくとも２時間−２０℃に保たれた
。溶液は１０分間１０，０００×ｇで遠心された。塊は
２回０．６ｍｌの氷冷エタノールで洗われ、そして１０
０μｌの滅菌水中に溶解された。０．８ｍｌのベッドボ
リウムの２つのセファデックスＧ−５０セレクトＤクロ
マトグラフィーカラム（５プライム→３プライム（５Ｐ
ｒｉｍｅ→３Ｐｒｉｍｅ），Ｉｎｃ．）が準備された。 溶解された塊の５０μｌが各カラムにのせられて、４分
間１０，０００で遠心された。１０μｌの精製されたＤ
ＮＡは４９０μｌの２０ｍＭ ＮａＯＨで希釈されて
、そしてＤＮＡの濃度を評価するために光学濃度が２６
０ｎｍにおいて測定された。精製されたＤＮＡをｍｌ当
たり１００マイクログラムの使用ＤＮＡ濃度にするため
には、水で希釈した。 インシチュハイブリダイゼー
ションの手順カフェインで標識されたＤＮＡプローブに
よりインシチュハイブリダイゼーションの試験を行なっ
た。標的ＤＮＡは中期に得られた培養された正常な白血
球から成った。細胞はこわれて核が露出するように約３
フィート上から顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされ
た。ハイブリダイゼーションの前にスライドガラスは７
０％ホルムアミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置か
れた。スライドガラスは次に７０％，８５％および１０
０％エタノールに通すことによって（各２分）脱水され
た。
【００８２】各スライドガラス上に置かれたハイブリダ
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）を遮へいＤＮＡとして使った
。カフェインで標識されたＤＮＡは１０ｎｇ／μｌの濃
度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼー
ション混合液の１０μｌは７０℃で１０分間加熱するこ
とによって変性された。プローブと遮へいＤＮＡは６０
分間３７℃でプリハイブリダイズされた。混合液は次に
スライドガラスに塗られて、カバーガラスをかぶせられ
てゴムセメントで密封された。ハイブリダイゼーション
は一晩３７℃で加湿された室で行なわれた。
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）を遮へいＤＮＡとして使った
。カフェインで標識されたＤＮＡは１０ｎｇ／μｌの濃
度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼー
ション混合液の１０μｌは７０℃で１０分間加熱するこ
とによって変性された。プローブと遮へいＤＮＡは６０
分間３７℃でプリハイブリダイズされた。混合液は次に
スライドガラスに塗られて、カバーガラスをかぶせられ
てゴムセメントで密封された。ハイブリダイゼーション
は一晩３７℃で加湿された室で行なわれた。
【００８３】次の日に過剰のプローブはスライドガラス
を３回１５分間４５℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で、次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナ
トリウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォル
ニアによって売られている非イオン性界面活性剤である
）（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うこと
によって除かれた。スライドガラスは２回ＰＮ緩衝液中
で２５℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは２０
分間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈された
ウサギ抗カフェイン（ウエスタン ケミカル リサ
ーチ コーポレーション，Ｆｔ．コリンズ，Ｃｏ（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ
，Ｃｏ）中で保温された。スライドガラスはＰＮ緩衝液
中で３回２分間各々２５℃で洗われた。スライドガラス
はＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈されたセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−抗−ウサギ免疫グロブリンＧ（
シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で次に２０分間保温された。 スライドガラスはＰＮ緩衝液中で３回２分間各々２５℃
で洗われた。スライドガラスは次にテトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）中で３０分間３７℃で保温された。スラ
イドガラスは蒸留水中ですすがれて、風乾されて、そし
て顕微鏡で観察された。
を３回１５分間４５℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で、次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナ
トリウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォル
ニアによって売られている非イオン性界面活性剤である
）（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うこと
によって除かれた。スライドガラスは２回ＰＮ緩衝液中
で２５℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは２０
分間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈された
ウサギ抗カフェイン（ウエスタン ケミカル リサ
ーチ コーポレーション，Ｆｔ．コリンズ，Ｃｏ（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ
，Ｃｏ）中で保温された。スライドガラスはＰＮ緩衝液
中で３回２分間各々２５℃で洗われた。スライドガラス
はＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈されたセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−抗−ウサギ免疫グロブリンＧ（
シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で次に２０分間保温された。 スライドガラスはＰＮ緩衝液中で３回２分間各々２５℃
で洗われた。スライドガラスは次にテトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢ）中で３０分間３７℃で保温された。スラ
イドガラスは蒸留水中ですすがれて、風乾されて、そし
て顕微鏡で観察された。
【００８４】インシチュハイブリダイゼーションの結果
セイヨウワサビの標識はＴＭＢ基質を顕微鏡で見たとき
青−緑に見える輝いた青い色素へ変換するように触媒す
る。標的ではない染色体は無色に見えるかまたはサフラ
ニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）（シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ），０．５％水性液）の調製物によって赤く対比染色
されうる。
セイヨウワサビの標識はＴＭＢ基質を顕微鏡で見たとき
青−緑に見える輝いた青い色素へ変換するように触媒す
る。標的ではない染色体は無色に見えるかまたはサフラ
ニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）（シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ），０．５％水性液）の調製物によって赤く対比染色
されうる。
【００８５】
略号：
特異性：（−）見えない、 （＋）標的の染
色体中でわずかに強い染色、（＋＋）妥当な特異性、（
＋＋＋）良い特異性。
色体中でわずかに強い染色、（＋＋）妥当な特異性、（
＋＋＋）良い特異性。
【００８６】強 度：（−）見えない、
（＋）位相下でのみ見える、（＋＋）透過の下で濃い染
色、（＋＋＋）とても濃い染色，位相下で光線を屈折し
うる。
（＋）位相下でのみ見える、（＋＋）透過の下で濃い染
色、（＋＋＋）とても濃い染色，位相下で光線を屈折し
うる。
【００８７】例７
ＤＮＡの標識−動原体プローブ上のテオフィリン例１の
手順によって得られた平均の長さ約３００ｂｐのヒト第
８染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプローブは例
２に記述されたようにエチレンジアミンを用いた重亜硫
酸塩に触媒されるアミノ基転移によって誘導体化された
。塩基の約３．５％がアミノ化された。プラスチックの
１．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ（１００
μｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された。０．５
ｍｌの３−〔Ｎ−モリホリノ〕プロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）緩衝液、次に１００μｌのＮＨＳ−テオフィリ
ン（３０ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
）が残渣に加えられて、混合液は一晩２５℃で保温され
た。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、続
いて１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて、混合液
は少なくとも２時間−２０℃に保たれた。溶液は１０分
間１０，０００×ｇで遠心された。塊は２回０．６ｍｌ
の氷冷エタノールで洗われ、そして１００μｌの滅菌水
中に溶解された。０．８ｍｌのベッドボリウムの２つの
セファデックスＧ−５０セレクトＤクロマトグラフィー
カラム（５プライム→３プライム（５Ｐｒｉｍｅ→３Ｐ
ｒｉｍｅ），Ｉｎｃ．）が準備された。溶解された塊の
５０μｌが各カラムにのせられ、４分間１０，０００×
ｇで遠心された。１０μｌの精製されたＤＮＡは４９０
μｌの２０ｍＭ ＮａＯＨで希釈されて、そしてＤＮ
Ａの濃度を評価するために光学濃度が２６０ｎｍにおい
て測定された。ｍｌ当たり１００マイクログラムの使用
ＤＮＡ濃度にするために精製されたＤＮＡは水で希釈さ
れた。
手順によって得られた平均の長さ約３００ｂｐのヒト第
８染色体に対する染色体に特異的なＤＮＡプローブは例
２に記述されたようにエチレンジアミンを用いた重亜硫
酸塩に触媒されるアミノ基転移によって誘導体化された
。塩基の約３．５％がアミノ化された。プラスチックの
１．５ｍｌの遠心管中のアミノ化されたＤＮＡ（１００
μｇの全ＤＮＡ）の溶液は減圧下で蒸発された。０．５
ｍｌの３−〔Ｎ−モリホリノ〕プロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）緩衝液、次に１００μｌのＮＨＳ−テオフィリ
ン（３０ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
）が残渣に加えられて、混合液は一晩２５℃で保温され
た。５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、続
いて１．５ｍｌの氷冷エタノールが加えられて、混合液
は少なくとも２時間−２０℃に保たれた。溶液は１０分
間１０，０００×ｇで遠心された。塊は２回０．６ｍｌ
の氷冷エタノールで洗われ、そして１００μｌの滅菌水
中に溶解された。０．８ｍｌのベッドボリウムの２つの
セファデックスＧ−５０セレクトＤクロマトグラフィー
カラム（５プライム→３プライム（５Ｐｒｉｍｅ→３Ｐ
ｒｉｍｅ），Ｉｎｃ．）が準備された。溶解された塊の
５０μｌが各カラムにのせられ、４分間１０，０００×
ｇで遠心された。１０μｌの精製されたＤＮＡは４９０
μｌの２０ｍＭ ＮａＯＨで希釈されて、そしてＤＮ
Ａの濃度を評価するために光学濃度が２６０ｎｍにおい
て測定された。ｍｌ当たり１００マイクログラムの使用
ＤＮＡ濃度にするために精製されたＤＮＡは水で希釈さ
れた。
【００８８】インシチュハイブリダイゼーションの手順
テオフィリンで標識されたＤＮＡプローブによりインシ
チュハイブリダイゼーションの試験を行なった。標的Ｄ
ＮＡは中期に得られた培養された正常な白血球から成っ
た。細胞はこわれて核が露出するように約３フィート上
から顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされた。ハイブ
リダイゼーションの前にスライドガラスは７０％ホルム
アミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置かれた。スラ
イドガラスは次に７０％，８５％および１００％エタノ
ールに通すことによって（各２分）脱水された。
テオフィリンで標識されたＤＮＡプローブによりインシ
チュハイブリダイゼーションの試験を行なった。標的Ｄ
ＮＡは中期に得られた培養された正常な白血球から成っ
た。細胞はこわれて核が露出するように約３フィート上
から顕微鏡のスライドガラスの上へ落とされた。ハイブ
リダイゼーションの前にスライドガラスは７０％ホルム
アミド／０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）の７０℃の変性液中に置かれた。スラ
イドガラスは次に７０％，８５％および１００％エタノ
ールに通すことによって（各２分）脱水された。
【００８９】各スライドガラス上に置かれたハイブリダ
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）を遮へいＤＮＡとして使った
。テオフィリンで標識されたＤＮＡは３０ｎｇ／μｌの
濃度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼ
ーション混合液の１０μｌは７０℃で１０分間加熱する
ことによって変性された。混合液は次にスライドガラス
に塗られて、カバーガラスをかぶせられてゴムセメント
で密封された。ハイブリダイゼーションは一晩３７℃で
加湿された室で行なわれた。
イゼーションの混合液は５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
から成った。ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム
／１０マイクロリットル）を遮へいＤＮＡとして使った
。テオフィリンで標識されたＤＮＡは３０ｎｇ／μｌの
濃度になるように加えられた。完成したハイブリダイゼ
ーション混合液の１０μｌは７０℃で１０分間加熱する
ことによって変性された。混合液は次にスライドガラス
に塗られて、カバーガラスをかぶせられてゴムセメント
で密封された。ハイブリダイゼーションは一晩３７℃で
加湿された室で行なわれた。
【００９０】次の日に過剰のプローブはスライドガラス
を３回１５分間４０℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニ
アによって売られている非イオン性界面活性剤である）
（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うことに
よって除かれた。スライドガラスは２回ＰＮ緩衝液中で
２５℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは２０分
間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈されたウ
サギ抗テオフィリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で保温
された。スライドガラスはＰＮ緩衝液中で３回２分間各
々２５℃で洗われた。スライドは次に２０分間ＰＮＭ緩
衝液中で１：２５０に希釈されたセイヨウワサビペルオ
キシダーゼ−抗ウサギ免疫グロブリンＧ（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ））中で保温された。スライドガラスはＰＮ緩衝
液中で３回２分間各々２５℃で洗われた。スライドガラ
スは次にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ベクターラ
ボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
））中で５分間製品の説明書に従って保温された。スラ
イドは蒸留水中ですすがれ、風乾され、そして水性サフ
ラニン（０．５％ ｗ／ｖ）中で５分間２５℃で対比染
色された。
を３回１５分間４０℃で５０％ホルムアミド／０．３Ｍ
ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）
中で次に０．３Ｍ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７）中でおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）／０．１％ＮＰ４０洗剤（オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール、これはカルバイオケム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ），ＬａＪｏｌｌａ，カリフォルニ
アによって売られている非イオン性界面活性剤である）
（ＰＮ緩衝液）中の各々で１５分間４５℃で洗うことに
よって除かれた。スライドガラスは２回ＰＮ緩衝液中で
２５℃で２分間づつ洗われた。スライドガラスは２０分
間２５℃でＰＮＭ緩衝液中で１：２５０に希釈されたウ
サギ抗テオフィリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で保温
された。スライドガラスはＰＮ緩衝液中で３回２分間各
々２５℃で洗われた。スライドは次に２０分間ＰＮＭ緩
衝液中で１：２５０に希釈されたセイヨウワサビペルオ
キシダーゼ−抗ウサギ免疫グロブリンＧ（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ））中で保温された。スライドガラスはＰＮ緩衝
液中で３回２分間各々２５℃で洗われた。スライドガラ
スは次にテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，ベクターラ
ボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
））中で５分間製品の説明書に従って保温された。スラ
イドは蒸留水中ですすがれ、風乾され、そして水性サフ
ラニン（０．５％ ｗ／ｖ）中で５分間２５℃で対比染
色された。
【００９１】定量的なインシチュハイブリダイゼーショ
ンの結果 セイヨウワサビペルオキシダーゼの標識はＴＭＢ基質の
輝いた青い色素への変換を触媒する。第８染色体の動原
体プローブで標識された中期染色体は中央が濃く染色さ
れた一対の染色体として現われる。間期の核においては
第８染色体の動原体の染色は赤い背景に対して濃い青い
不連続の斑点として現われた。核当たりの点を数えるこ
とも可能である。この方法の精度と特異性の証明として
１００個の核が数えられて、斑点に対する分布の頻度は
以下のように検出された。
ンの結果 セイヨウワサビペルオキシダーゼの標識はＴＭＢ基質の
輝いた青い色素への変換を触媒する。第８染色体の動原
体プローブで標識された中期染色体は中央が濃く染色さ
れた一対の染色体として現われる。間期の核においては
第８染色体の動原体の染色は赤い背景に対して濃い青い
不連続の斑点として現われた。核当たりの点を数えるこ
とも可能である。この方法の精度と特異性の証明として
１００個の核が数えられて、斑点に対する分布の頻度は
以下のように検出された。
【００９２】
【図１】テオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルの調製法を示す図
である。
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルの調製法を示す図
である。
【図２】テオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルをエチレンジアミ
ンを用いてアミノ基転移を起こされたＤＮＡと反応させ
る過程を示す図である。
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルをエチレンジアミ
ンを用いてアミノ基転移を起こされたＤＮＡと反応させ
る過程を示す図である。
Claims (13)
- 【請求項１】 検出すべき核酸に相補的な１つまたは
それ以上のＤＮＡの配列に多数のキサンチンまたは低級
アルキル置換キサンチン誘導体の標識を共有結合させた
ものからなる、核酸配列をその場で検出するための試薬
。 - 【請求項２】 検出すべき染色体または染色体の領域
の異なった部分に相補的な多数のＤＮＡの配列からなる
、染色体または染色体の領域をその場で検出するための
試薬であり、ここで、標識はキサンチン、１−メチルキ
サンチン、３−メチルキサンチン、７−メチルキサンチ
ン、テオフィリン、１，７−ジメチルキサンチンおよび
カフェインからなる群から選ばれる、請求項１の試薬。 - 【請求項３】 検出すべき染色体または染色体の領域
の異なった部分に相補的な多くのＤＮＡの配列からなる
、染色体または染色体の領域をその場で検出するための
試薬であり、ここで、前記の標識の群はテオフィリン−
８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サク
シノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル
））エステルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロ
キシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ
′−（３−スルホサクシニミジル））エステルを含む群
であり、そして標識の数は、相補的な標的の配列または
検出すべき配列に対する試薬ＤＮＡの特異的な結合性を
保持したまま免疫学的な技術によって検出するのに十分
な数である、請求項１の試薬。 - 【請求項４】 検出すべき染色体または染色体の領域
の異なった部分に対して実質的に相補的な塩基配列をも
っており、アミノ基転移を起こした多くのシトシン塩基
をもっており、そしてこのアミノ基転移を起こしたシト
シンのいくつかには、検出すべき染色体または染色体の
領域に対する試薬の特異的な結合性を実質的に保持しつ
つ免疫学的技術によって十分に検出されうる程度に共有
結合させたキサンチンまたは低級アルキル置換キサンチ
ン誘導体の標識が付与されており、そして前記塩基配列
はハイブリダイズしていないものからなる、染色体また
は染色体の領域をその場で検出するための試薬。 - 【請求項５】 標識前のＤＮＡ配列は検出すべき染色
体または染色体の領域の組み換えファージライブラリー
から得られ、そして前記のＤＮＡ配列の平均の長さは約
３００ｂｐである、請求項１，２，３または４の試薬。 - 【請求項６】 ＤＮＡの配列中のシトシンの部位の約
５〜５０％が重亜硫酸塩の触媒により、それぞれ２から
６または２から９の炭素原子をもつジアミノアルカン類
またはアルキレンジアミン類を用いたアミノ基転移によ
ってアミノ化されており、好ましくはエチレンジアミン
を用いてＤＮＡの配列の中のシトシン部位の約５〜２５
％がアミノ化されており、そして上記の標識はアミノ化
されたシトシンの部位に共有結合している、請求項１，
２，３，４または５の試薬。 - 【請求項７】 １つまたはそれ以上のシトシン塩基が
重亜硫酸塩の触媒により２から９の炭素原子を含むアル
キレンジアミン、好ましくはエチレンジアミンを用いた
アミノ基転移によってアミノ基転移を起こしており、ア
ミノ基転移を起こした後に１つまたはそれ以上のテオフ
ィリンまたはカフェインの基、好ましくはテオフィリン
−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サ
クシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジ
ル））エステルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒド
ロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（
Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルと反応
しているＤＮＡからなる試薬であって、前記のテオフィ
リンまたはカフェインは免疫学的な技術で検出でき、さ
らに前記のＤＮＡはその結合性を保持してなる試薬。 - 【請求項８】 以下の工程からなる染色体をその場で
検出するための試薬を作るための方法： （ａ）検出すべき染色体または染色体の領域に相補的な
ＤＮＡを含むプラスミドのＤＮＡを平均の長さ約３００
ｂｐの断片へ分解する工程、 （ｂ）重亜硫酸塩を触媒にしてエチレンジアミンを用い
てＤＮＡ断片にアミノ基転移を起こさせる工程、および
（ｃ）アミノ基転移されたＤＮＡ断片ヘキサンチンまた
は低級アルキル置換キサンチン誘導体の標識を共有結合
させ、その際該標識はＤＮＡとテオフィリン−８−Ｎ−
（５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル
−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エス
テルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペン
チルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３
−スルホサクシニミジル））エステルとの反応によって
結合させる工程。 - 【請求項９】 次の段階の組み合わせからなる染色体
または染色体の領域をその場で検出するための方法：（
ａ）請求項６または７の試薬を検出すべき染色体または
染色体の領域とハイブリダイゼーションの条件下で接触
させる工程、および （ｂ）検出すべき染色体または染色体の領域とハイブリ
ダイズした試薬によって提供されるキサンチンまたは低
級アルキル置換キサンチン誘導体の標識の存在または不
存在を検出する工程。 - 【請求項１０】 遮へいＤＮＡを過剰にハイブリダイ
ゼーションの条件下で試薬に加えることで試薬が遮へい
される請求項９の方法。 - 【請求項１１】 以下の工程によりなる染色体または
染色体の領域をその場で検出するための試薬を調製する
ための方法： （ａ）検出すべき染色体または染色体の領域に対して実
質的に相補的な塩基配列をもち、ハイブリダイズしてい
ないＤＮＡの配列に含まれるいくつかのシトシン塩基に
エチレンジアミンを用いて重亜硫酸塩を触媒にしたアミ
ノ基転移によってアミノ基転移を起こさせる工程、およ
び （ｂ）キサンチンまたは低級アルキル置換キサンチン誘
導体の標識を、アミノ基転移されたシトシン塩基の少な
くとも一部分に共有結合させ、その際共有結合で結合さ
れた標識をもつシトシン塩基の部分を検出すべき染色体
または染色体の領域に対する試薬の特異的な結合性を実
質的に保持しながら、免疫学的技術で十分に検出される
ようにする工程。 - 【請求項１２】 ＤＮＡ中の１つまたはそれ以上のシ
トシンに２から９の炭素原子を含むアルキレンジアミン
を用いてアミノ基転移を起こすこと、およびこのアミノ
基転移を起こされたＤＮＡをテオフィリン−８−Ｎ−（
５−ヒドロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−
Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステ
ルまたはカフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチ
ルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−
スルホサクシニミジル））エステルと反応させることか
らなるＤＮＡを標識するための方法。 - 【請求項１３】 テオフィリン−８−Ｎ−（５−ヒド
ロキシペンチルアミノ）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（
Ｎ′−（３−スルホサクシニミジル））エステルおよび
カフェイン−８−Ｎ−（５−ヒドロキシペンチルアミノ
）−Ｏ−サクシノイル−Ｏ′−（Ｎ′−（３−スルホサ
クシニミジル））エステルである化合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US611305 | 1984-05-17 | ||
| US07/611,305 US5512433A (en) | 1990-11-08 | 1990-11-08 | Methods and compounds for labeling DNA with xanthine and lower alkyl substituted xanthine derivatives and reagents for the in situ detection of chromosomes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04287699A true JPH04287699A (ja) | 1992-10-13 |
Family
ID=24448502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3293252A Pending JPH04287699A (ja) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | キサンチンおよび低級アルキル置換キサンチン誘導体でｄｎａを標識するための方法および化合物ならびにその場で染色体を検出するための試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5512433A (ja) |
| EP (1) | EP0485156B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04287699A (ja) |
| AT (1) | ATE149512T1 (ja) |
| DE (1) | DE69124921T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994009022A1 (en) * | 1992-10-09 | 1994-04-28 | Oncor, Inc. | Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by in situ hybridization to fixed tissue |
| EP0878552A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Molecular detection of chromosome aberrations |
| WO1999057309A1 (en) | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Dako A/S | Method and probes for the detection of chromosome aberrations |
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|---|---|---|---|---|
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| US4533493A (en) * | 1981-08-27 | 1985-08-06 | Miles Laboratories, Inc. | Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4687737A (en) * | 1982-11-12 | 1987-08-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Mammalian suppressor genes |
| US4769377A (en) * | 1983-02-18 | 1988-09-06 | The Johns Hopkins University | Adenosine receptor antagonists |
| US4626501A (en) * | 1983-09-02 | 1986-12-02 | Integrated Genetics, Inc. | Labeled DNA |
| US4699876A (en) * | 1984-01-27 | 1987-10-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nonradiometric polynucleotide probes |
| US4828979A (en) * | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
| US4833251A (en) * | 1985-06-25 | 1989-05-23 | Siska Diagnostics, Inc. | Compounds for tagging nucleic acid probes |
| EP0310361A3 (en) * | 1987-09-30 | 1989-05-24 | Beckman Instruments, Inc. | Tridentate conjugate and method of use thereof |
| EP0444115B2 (en) * | 1988-11-15 | 2000-12-13 | Yale University | In situ suppression hybridization and uses therefor |
| IL94906A (en) * | 1989-07-19 | 1995-10-31 | Univ California | Methods and preparations for specific chromosome specification |
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-
1990
- 1990-11-08 US US07/611,305 patent/US5512433A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-11-05 AT AT91310203T patent/ATE149512T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-05 DE DE69124921T patent/DE69124921T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-05 EP EP91310203A patent/EP0485156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-08 JP JP3293252A patent/JPH04287699A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0485156B1 (en) | 1997-03-05 |
| DE69124921T2 (de) | 1997-10-16 |
| DE69124921D1 (de) | 1997-04-10 |
| ATE149512T1 (de) | 1997-03-15 |
| US5512433A (en) | 1996-04-30 |
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