JPH04269644A - 光エコー顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、物質の物理化学的な性
質の差を光学的に観察できる顕微鏡に関する。 【０００２】 【従来技術】一般の光学顕微鏡に対して、レーザ光源を
用いたレーザ走査顕微鏡が知られており種々の顕鏡に利
用されている。このうち共焦点型レーザー走査顕微鏡は
、照明系の焦点位置に被検物体を配置してここに光スポ
ットを形成し、被検物体からの光をピンホール上に集光
して光検出するものである。共焦点型レーザー走査顕微
鏡によって得られる画像は、非常に浅い焦点深度を有し
ていることから、光軸方向の走査を行うことによって、
所謂セクショニング効果による無限に深い焦点深度が得
られるという利点を有している。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、共焦点
型レーザー走査顕微鏡によって得られる被検物体の情報
は、通常の光学顕微鏡の画像から得られる情報と比較す
ると質的に大差ないものであった。本発明の目的は、試
料をただ観察するという従来の顕微鏡の機能の他に、試
料の物理化学的な性質の差異に関する情報を得ることの
できる光エコー顕微鏡を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明による光エコー顕
微鏡は、像面上で点光源とみなせる空間コヒーレンスと
所定の時間コヒーレンスとを有する光を供給するレーザ
光源と、該光源からの光を２光束に分割する光分割器と
、該光分割器により分岐された２光束の一方の光路中に
配置された光遅延器と、該２光束のうちの一方の光を所
定の周波数で位相変調するための位相変調器と、該２光
束を合波する光合成器と、該合波された光束を被検物体
上に導いて光スポットを形成するための照射光学系と、
該照射光学系により形成される被検物体上の光スポット
を前記被検物体に対して相対的に走査するための走査手
段と、前記被検物体からの光を光検出器上に導く集光光
学系と、該光検出器の出力信号から前記位相変調器の変
調周波数の偶数倍の変調成分を抽出する信号処理手段と
を有する。ここで、レーザ光源は、被検物体に対して注
目する光吸収帯の光学的位相緩和時間よりも短い時間コ
ヒーレンスを有することが望ましい。 【０００５】 【作　　用】従来のレーザー走査顕微鏡においては、光
源として時間コヒーレンスの長い、すなわち、極めて狭
い発振スペクトル幅を有するレーザー光源（例えばヘリ
ウムネオンレーザーやＣＷアルゴンレーザー等）が用い
られてきた。本発明の光エコー顕微鏡では、試料の光位
相緩和時間を測定するという手法の為に、光源として広
い発振スペクトル幅を有するレーザー光源を用いている
。 【０００６】固体試料の位相緩和時間を測定するために
は、広い発振スペクトル幅を有するレーザー光源の他に
光変調光学系とそれと対応した光検出系が必要である。 固体の位相緩和時間は、蓄積フォトンエコーのヘテロダ
イン検出により容易に測定することができ、特に共焦点
型レーザー走査顕微鏡において、その照明系の焦点にお
ける光エコーを簡便に測定する方法として、光位相変調
によるヘテロダイン検出法を採用することが適切である
。光エコーの光位相変調によるヘテロダイン検出法につ
いては、本願と同一出願人による特願平２−２５３０１
１号に解説したとおりである。 【０００７】被検物体において光エコーを生じ得る物理
化学的特性を有している場合には、光エコーは位相変調
光周波数成分の２倍乃至偶数倍の周波数成分の信号とし
て検出されるため、試料上のレーザー焦点位置の光エコ
ーの大きさは、受光部焦点位置における位相変調周波数
の２倍乃至は偶数倍の光強度変調成分の大きさを抽出す
ることによって、光エコーを検出することが可能である
。従って、試料の位相緩和時間は、上記光遅延器により
２つの光ビームの光路長差を順次変化させることにより
生じる光エコーの変化を記録することにより得られる。 通常のレーザー走査顕微鏡像においては、このような変
調操作は必要なく、受光部の光強度のみを検出すれば良
い。 【０００８】以上述べたように、本発明による光エコー
顕微鏡は、光学的位相緩和時間（一般にＴ２緩和時間、
或いは横緩和時間と呼んでいる）を、走査手段との組合
せにより、２次元的に、さらには３次元的にマッピング
することにより、明らかにするという新たな機能を有し
ている。すなわち、通常のレーザ顕微鏡としての走査像
の他に、そのレーザー光と共鳴しうる光吸収体が試料中
にある場合は、光エコーによる光位相緩和時間を測定す
ることにより、試料の物理化学的な性質をも明らかにで
きる。例えばレーザー光と共鳴しうる色素を、結晶質と
非晶質とが混在するポリマー中に分散した場合、結晶質
中と非晶質中では光位相緩和時間が異なる事を利用すれ
ば、非晶質相と結晶質相とがどのような形で混在するの
かを観察することができる。 【０００９】 【実施例】本発明の実施例として、まず光源については
、像面上で点光源と見なせる空間コヒーレンスを有し、
かつ被測定物の注目する光吸収帯の光学的位相緩和時間
よりも短い時間コヒーレンスを有することが適当である
。そして、光源からの光を２光束に分割する光分割器と
、２光束を合波する光合成器とを有する光学系は、マイ
ケルソン干渉計やマッハツェンダー干渉計等に類する２
光路干渉光学系（２ｐａｔｈ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅ
ｔｅｒ　）が好適である。光遅延器は該干渉光学系の一
方の光経路の長さを変える機能を有し、光変調器は干渉
光学系の一方の経路を通る光を固定周波数ｆで位相変調
する機能を有する。そして、干渉光学系から出射する光
が光照射光学系によって被測定物上あるいは内部に集光
されて光スポットが形成される。被測定物から散乱、透
過あるいは放射される光が集光光学系によって光検出器
上に導かれ、信号処理手段は光検出器の出力信号から位
相変調器の変調周波数の２倍乃至は任意の偶数倍の周波
数の交流成分のみ選択的に検出、増幅する機能を有して
いる。　　【００１０】以下、図示した具体的実施例の
構成について説明する。第１図は本発明による第１実施
例の概略を示す構成図である。この実施例の光学系の構
成は、大別すると図中点線で囲まれた３つの部分、すな
わち光源手段（Ａ）、光変調光学系（Ｂ）、及び共焦点
型レーザー走査顕微鏡（Ｃ）からなっている。本実施例
においては、光源手段（Ａ）は８０ＭＨｚのモード同期
アルゴンレーザー励起色素レーザーからなる光源１を有
している。光源１としてはその他に、マルチモード半導
体レーザー、モード同期半導体レーザー、ＬＥＤや固体
レーザーを用いることができる。 【００１１】レーザ光源からの光束を２光束に分岐する
ための光分割器２及び分岐された２つの光束を合波する
合波器３は、共に偏光ビームスプリッターであるが、代
わりに偏光特性の殆ど無いか或いは全く無い半透鏡など
も用いることができる。光分割器２の透過光路中には、
図示なき可動ステージに固定されたコーナーキューブ４
ａが配置されており、可動ステージを変位させる変位器
４ｂとによって光遅延手段４を構成している。この変位
器４ｂによってコーナーキューブ４ａを移動させて所定
量だけ光遅延を生ずるように構成されている。また、光
分割器２の反射光路上には位相変調手段５が配置されて
いる。位相変調手段５としては、一般に電気光学結晶を
用いたものが良く知られているが、本実施例においては
、一端が固定され他端にコーナーキューブ５ａが固定さ
れた圧電素子５ｂを用いている。そして、交流駆動源５
ｃにより圧電素子５ｂに所定の周波数ｆの交流電圧を印
加することによって、周波数ｆの位相変調手段５を構成
している。これら光分割器２、合波器３、光遅延手段４
及び位相変調手段５により光変調光学系（Ｂ）が構成さ
れている。分岐された光束中に配置された直交反射面６
ａ，６ｂ　及び７ａ，７ｂ　は、それぞれ光遅延手段４
及び位相変調手段５へ光を導き、合波器３での光合波を
容易にするための光路屈曲用反射面である。本実施例で
は、光分割器２の透過光路上に光遅延手段４を、反射光
路上に位相変調手段５を配置したが、これに限らず、逆
の配置でも可能であり、また光遅延手段と位相変調手段
とを共に一方の光路上に配置することも可能である。 【００１２】共焦点型レーザ走査顕微鏡（Ｃ）は、半透
過鏡１０、対物レンズ１１及び１２からなる照射光学系
と、集光レンズ１３、ピンホール開口を有する遮光板１
４からなる集光光学系、及び光検出器としての光電子増
倍管１５と信号処理のためのロックインアンプを有して
いる。半透過鏡１０を透過する光変調光学系（Ｂ）から
の光束は、対物レンズ１１，１２により被検物体２０上
に集光され、ここに光スポットを形成する。被検物体２
０から発する光は、再び対物レンズ１１，１２をとおり
、半透過鏡１０で反射されて集光レンズ１３により、遮
光板１２のピンホール開口１２ａ　上に集光される。ピ
ンホール開口１２ａ　を通過した光は検出器としての光
電子増倍管１５に入射し、光電子増倍管１５は光電変換
により入射光量に応じた信号を出力し、この出力信号の
なかから位相変調周波数の２倍の変調成分のみがロック
インアンプ１６により増幅される。ピンホール開口を有
する遮光板１４は、照射光学系の焦点位置からの散乱光
、あるいは発光のみを検出するための空間フィルターと
して機能している。尚、光変調光学系からの光のうち半
透過鏡１０を反射する光が、集光光学系に入射して迷光
を生ずるのを防止するために、光トラップ１７が配置さ
れている。 【００１３】そして、照射光学系中の半透過鏡１０と対
物レンズ１１，１２　との間には、集光光学系による光
スポットを被検物体２０上で走査するための走査手段３
０が配置されている。この走査手段３０は光学的な反射
或いは屈折による光走査手段として周知のものを用いる
ことができ、走査駆動手段３１からの信号により所定の
速度にて被検物体２０上を光スポットが走査する。走査
手段３０はいわば空間変調器であり、他に、被測定物を
保持したステージを集光光学系に対して相対的に移動す
る装置を採用することもできる。また、試料としての被
検物体２０は、必要に応じて試料を冷却保持するための
試料室２１に収納されている。 【００１４】さらに、本実施例の光エコー顕微鏡には、
電気信号処理装置４０として、ロックインアンプ１６か
らの出力信号を、走査手段３０のモニターにより得られ
る照射光学系の光スポットの位置と、光変調光学系の光
遅延器４による遅延時間とに対応して記録し、必要に応
じて再生できる記録再生手段を有している。また、照射
光学系による光スポットの形成される被検物体内の所望
の点に対して、照射光学系の遅延時間の変化による、電
気信号処理装置４０の出力信号の変化量の分析が行える
データ解析装置５０を備えている。 【００１５】走査手段３０によるレーザービーム走査と
光遅延器４による光路長の走査は、必要に応じ任意の組
合せで行うことが可能であるが、被検物体上での光スポ
ットの相対的走査速度は、前記位相変調器による位相変
調に対して十分に遅いことが必要であり、位相変調器５
及び光遅延器４の制御が制御手段３２によって行われ、
電気信号処理装置４０を介してデータ解析装置５０へ信
号が送られる。データ解析装置５０にて出力信号の分析
を行うと共に、所望の画像表示がなされる。 【００１６】以上の如き本発明の第１実施例の光エコー
顕微鏡により、例えば、生体染色色素の一種であるギム
ザという染料を用いて生体組織を染色して観察する場合
、レーザー波長を６４０ｎｍ付近に選択し、位相変調器
５の位相変調周波数を２０ＫＨｚとした。走査手段３０
により試料２０上の一点にレーザービームを固定し、光
遅延器４のステージ位置を走査しながら４０ＫＨｚの電
気信号のみをロックインアンプ１６により増幅記録する
と、レーザー焦点位置の光位相緩和時間が得られた。同
様に試料２０上の各空間点における光位相緩和時間が得
られ、生体組織についての詳しい情報が得られた。 【００１７】図２は、本発明による第２実施例の構成を
示す概略構成図である。この実施例は図１に示した構成
の光エコー顕微鏡とは、共焦点型の集光光学系を持たな
いレーザー走査顕微鏡（Ｃ）を有する点、また透過型で
ある点で構成を異にしている。そして、照射光学系によ
る光スポットの走査は、被検物体２０を収納する試料室
２１を図示なきステージを走査駆動手段３３より移動さ
せることによって行う。その他の構成は同様であるため
、前記第１実施例の構成と同等の機能を有する部材には
、同一の符号を付した。被検物体２０からの透過光、散
乱光、及び発光は、集光レンズ１７により光検出器１５
上に集光され、光検出器１５の出力信号のなかから位相
変調周波数の２倍の変調成分のみがロックインアンプ１
６により増幅されて電気信号処理装置４０及びデータ解
析装置５０により所望の処理がなされる。 【００１８】このような第２実施例の構成によっても、
被検物体の光エコーを検出することができ、被検物体の
物理化学的情報を得ることができる。尚、上記の実施例
においては、いずれも検出器１５において、照射光と同
一波長の光エコーを検出することとしたが、被検物体か
ら発する蛍光の光エコーを検出することも可能である。 この場合、検出器に至る光路上に蛍光の波長域のみを透
過するフィルタを設けることにより蛍光の光エコーのみ
を検出することができることは言うまでもない。 【００１９】 【発明の効果】本発明の光エコー顕微鏡により、被検物
体の微細な形状のみならず、微細部分の光位相緩和時間
を測定することにより、その物性の差をも明らかにする
ことができる。本発明の顕微鏡が有するこの新しい機能
は、従来の光学顕微鏡あるいは、レーザー走査型顕微鏡
が持ち得なかった機能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による第１実施例の光エコー顕微鏡の概
略構成図。

【図２】本発明による第２実施例の光エコー顕微鏡の概
略構成図。

【主要部分の符号の説明】

１・・・光源　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２・・・光分割器３・・・光合波器　　　　　　　　
　　　　　　　　４・・・光遅延手段５・・・光変調手
段　　　　　　　　　　　　　　１１，１２　・対物レ
ンズ１３・・・集光レンズ　　　　　　　　　　　　　
　１５・・・光検出器２０・・・被検物体　　　　　　
　　　　　　　　　　３０・・・走査手段４０・・・電
気信号処理装置　　　　　　　　５０・・・データ解析
装置

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】像面上で点光源とみなせる空間コヒーレン
   スと所定の時間コヒーレンスとを有する光を供給するレ
   ーザ光源と、該光源からの光を２光束に分割する光分割
   器と、該光分割器により分岐された２光束の一方の光路
   中に配置された光遅延器と、該２光束のうちの一方の光
   を所定の周波数で位相変調するための位相変調器と、該
   ２光束を合波する光合成器と、該合波された光束を被検
   物体上に導いて光スポットを形成するための照射光学系
   と、該照射光学系により形成される被検物体上の光スポ
   ットを前記被検物体に対して相対的に走査するための走
   査手段と、前記被検物体からの光を光検出器上に導く集
   光光学系と、該光検出器の出力信号から前記位相変調器
   の変調周波数の偶数倍の変調成分を抽出する信号処理手
   段とを有することを特徴とする光エコー顕微鏡。
2. 【請求項２】前記レーザ光源は、被検物体に対して注目
   する光吸収帯の光学的位相緩和時間よりも短い時間コヒ
   ーレンスを有することを特徴とする請求項１記載の光エ
   コー顕微鏡。
3. 【請求項３】走査手段による被検物体上での光スポット
   の相対的走査速度は、前記位相変調器による位相変調に
   対して十分に遅いことを特徴とする請求項１乃至２記載
   の光エコー顕微鏡。
4. 【請求項４】前記集光光学系は前記光検出器の近傍に配
   置されたピンホール開口を有する遮光部材を有し、前記
   被検物体と該遮光部材のピンホール開口とを共役に形成
   することを特徴とする請求項２乃至３記載の光エコー顕
   微鏡。
5. 【請求項５】前記信号処理手段からの出力信号を、前記
   走査手段による照射光学系の光スポット位置と、前記光
   遅延器による遅延時間とに対応して記録し、必要に応じ
   て再生できる記録再生装置を備えたことを特徴とする請
   求項３乃至４記載の光エコー顕微鏡。
6. 【請求項６】前記照射光学系による光スポット照射位置
   に対して、前記光遅延器の遅延時間の変化による前記電
   気信号処理装置の出力信号の変化量の分析が行えるデー
   タ解析装置を備えたことを特徴とする請求項１乃至５記
   載の光エコー顕微鏡。
7. 【請求項７】像面上で点光源とみなせる空間コヒーレン
   スと所定の時間コヒーレンスとを有する光を供給する光
   源手段、該光源手段からの光を２光束に分割して一方の
   光を他方の光に対して相対的に光遅延すると共に位相変
   調を行った後合波する光変調光学手段と、該光変調光学
   手段からの光束を被検物体上に導いて該被検物体からの
   光を検出する走査型顕微鏡手段、及び該被検物体からの
   光を検出して前記位相変調周波数の偶数倍の変調成分を
   抽出する信号処理手段とを有することを特徴とする光エ
   コー顕微鏡。