JPH0418028A - 肝硬変治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有して
なる肝硬変治療剤に関する。

〔従来の技術］ 肝臓は糖新生、アミノ酸代謝、脂質代謝、さらには血漿
タンパクの合成、分泌、朋汁の生成分泌、解毒、エネル
ギー源としての糖の貯蔵、ビタミン類の貯蔵など多くの
生理機能を有する生体にとって必須の臓器である。この
肝臓はウィルス感染や長期にわたるアルコール摂取や薬
物の摂取などが原因で肝炎を発症する。この肝炎が慢性
化すると肝硬変へと移行し、高い確率で患者は死亡する
。

現在、我国での肝硬変患者数は約４０万人と推定され、
年間約２万人の患者が死亡している。肝硬変轡者の８０
％はＢ型および非Δ非Ｂ型ウィルス感染による肝炎が原
因で、また残りの２０％の大半はアルコール性肝炎が原
因で肝硬変に移行したと推定されている。

しかしながら現在、この肝硬変を治療する治療剤は全く
無いのが実情である。現在、肝硬変の治療法としては、
肝硬変の進行に伴って起こる低栄養、低タンパク症状を
改善するため、対症療法的にビタミンやアミノ酸輸液の
点滴や経Ｉｌ！輸液が行われているにすぎない。また、
肝庇護剤としてグリチルリチン、グルタオチン、チオプ
ロコン、ＡＴＰ製剤あるいは動物肝抽出物などの投与が
行われているが、その効果のほどは疑わしい。

一方、肝機能を担っている成軌実質細胞を」Ｌ道」仔−
で培養することは長らく不可能であったが、本発明者ら
は、再生肝ラット血清に含まれる特定のタンパク質成分
を培地に添加することにより、成熱肝実質細胞が、極め
て良好に増殖することを見出し、そのタンパク質成分の
部分精製に成功しくＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１２２　（Ｎｏ、３
）。

１４５０〜１４５９．１９８４）　、これを肝実質細胞
増殖因子（以下、ｒＨＧＦＪともいう）と命名した。更
に、本発明者らは本肝実質細胞増殖因子をラット血小板
より単離することに成功しくＦＦＢ５　ＬＥＴＴＥＲ，
２２Ｌ。

（Ｎｏ、　２）、　３１）．１９８７）　、加えてその
アミノ酸配列を一部決定した（Ｎａｔｕｒｅ、−３４２
，４４０〜４４３．１９８９）　、。

本発明者らは更に得られたＨ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列を
もとに、ヒトおよびラット由来のＨＧ　ＦのＣＤＮＡの
クローニングを行い、得られた３８’　ＣＤ　ＮΔを動
物細胞に組換えて肝実質細胞増殖因子を得ることに成功
した（Ｎａｔｕｒｅ、　　３４ｇ、　４４０〜４４３゜
１９８９）。

（発明が解決しようとする課題〕 肝硬変は肝臓の慢性炎症と線維化の窮極の病態と理解さ
れている。すなわち、線維隔壁が肝全体に進展し無数の
偶小葉を形成する病態を示している。つまり肝実質細胞
の増殖が抑えられ、間質結合織が異常に増生じた病態で
あると考えられている。線維隔壁が進展して、偶小葉が
形成されると肝実質細胞が隔則され、円滑な血流の維持
あるいは物質の輸送に支障が生しる。さらに本来の血管
系は線維隔壁を通るシャントとなり、有効な血流の減少
が起こる。この様な肝硬変の進行に伴う血流の異常は肝
実質の変性を一層おしすすめる一因にもなり、肝硬変に
おける。Ｗｉ循環が続くことにな肝硬変の成立の主因は
持続する慢性炎症であり、結合織の増生はあくまでも二
次的なものと考えられている。それ故、慢性炎症の成立
を防ぐことが肝硬変成立を防ぐために第一に必要なこと
であろう。一方、線維芽細胞の増殖抑制により、線維形
成を抑え、同時に肝実質細胞の増殖を促進することが出
来れば、慢性肝炎からの肝硬変への移行や肝硬変の進行
を止めることが出来ると考えられ、更に高度に成立した
肝硬変をも治療出来ると考えられる。

すなわち、特異的に肝実質細胞の増殖を促進すると同時
に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制するという
２つの生理活性を持つ物質が肝硬変治療剤として応用で
きると期待されており、本発明の目的はかかる肝硬変治
療剤を提供することにある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた
結果、肝実質細胞を増殖させる因子として同定したＨ　
Ｇ　Ｆが、初代培養ラット肛非実質線維芽細胞群を抑制
する活性をもあわせ持つことを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。

すなわち、本発明はＨＧ　Ｆを有効成分として含有する
肝硬変治療剤に関するものである。

本発明に用いられるＨ　Ｇ　Ｆは、肝実質細胞を増殖す
る活性と肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制させる活性を
合わせ持つ生理活性ポリペプチドであり、分子量は、非
還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると７万〜９
万である。還元下では分子量６万〜７．５万のα−鎖と
分子量３万〜４万のβ−鎖に分かれるヘテロダイマー構
造をとる。またヒトＨＧ　Ｆやラット１）　ＣＦのアミ
ノ酸配列からみると、そのα−鎖にはプラスミノーゲン
やプラスミンなどに見られるクリングル構造と呼ばれる
特殊な配列を有し、またβ−鎖においてもその配列は、
カリクレイン、凝固因子Ｘｌ＋　などのセリン・プロテ
アーゼ領域にＲｍする特徴をもつ。またＩＩ　ＣＦはコ
ンカナバリンＡに対し、親和性を示すことから、その構
造の中に糖鎖をもつ糖蛋白質である。

ＨＧＦは種々の方法により得ることができる。

例えば、ウシなどの哺乳類動物の肝臓、肺臓、肺臓、骨
髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器および血小板や白血球な
どの血液細胞や血漿（血清を含む）などから抽出・精製
して得ることが出来る。また、ＨＣＦを産生ずる初代培
養細胞や株化細胞を培養し、培養物から分離精製して、
ＨＧＦを得ることもできる。勿論、ＨＧ　Ｆの遺伝子を
単離し、いわゆる遺伝子工学的手法を応用し、適切な宿
主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、そ
の培養物から、目的とする組換え肝実質細胞増殖因子を
分離精製して、得ることもできる（Ｎａｔｕｒｅ。

３４２、４４０〜４４３．　ｘ９ｓｊ参照）。

例えば、組換えヒＬＨＣＦを調製するには、（１）ラッ
ト肝細胞やラット巨核球などの動物組織よりｍＲＮＡま
たは染色体ＤＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡライ
ブラリーまたは染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。

（２）合成オリゴヌクレオチドプローブ、あるいは抗体
を用いて動物、例えばラントのＩｔ　ＣＦのｃＤＮＡま
たは染色体ＤＮＡを単離するため、上記動物、例えばラ
ット由来のｃ　ＤＮＡライブラリーまたは染色体ライブ
ラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンよ
り目的とするｃ　ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを抽出し、
この動物、例えばラット由来のＨＧ　ＦのｃＤＮＡまた
は染色体ＤＮＡをプローブとして、ヒトの臓器あるいは
血液細胞などのｍＲＮＡより調製したｃ　ＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンよ
り目的とするヒト由来＋（Ｇ　ＦのｃＤＮＡを抽出する
。ｒＥだ、本発明者らが明らかにしたＤＮＡ配列あるい
はヒトや動物のＩ（ＣＦのアミノ酸配列に基づいて合成
されたオリゴヌクレオチドやヒトトＩＧＦｃＤＮＡやヒ
トＨＧＦ染色体ＤＮＡなどをプローブに用い、またヒト
または動物のＨＧ　Ｆに対する抗体を用い、直接ヒトの
臓器あるいは血液細胞などから抽出したｍＲＮＡより調
製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、
単離されたクローンより目的とするヒト由来のＨＧＦの
ＣＤＮＡを抽出することもできる。

（３）このヒト由来ＨＧ　Ｆのｃ　ＤＮＡよりヒトＨＧ
ＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素を用いて切り出
し発現用ベクターに組み込む。

（４）得られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質
転換して形質転換体を得る。

（５）この形質転換細胞を培養して、その培養上清から
ヒトＨＧＦを採取・製造する。

さらに形質転換細胞中の組換発現ベクターから、制限酵
素処理によって、ヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含
有するＤＮＡを得ることも出来る。

以下に、上記の各工程を詳細に説明する。

（０ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの調製：動
物、例えばラットまたはヒトの１）　Ｇ　Ｆをコードす
るｍＲＮＡはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓
、ひ臓、肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血
球、巨核球やリンパ球などの血液細胞などから各々得る
ことが出来る。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
１８．５２９４　（１９７９）に記載されているＪ、　
Ｍ、　Ｃｈｉｒｇｖｉｎらの方法によって、ラットなど
の動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグアニジン
チオシアン酸溶液から得たＲＮＡを、さらにオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフィー
に付すことによって該ｍＲＮＡ８調製することが可能で
ある。

また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球などのｍＲＮＡのよう
な動物細胞や動物組織などの各種ｍＲＮＡは、市販品と
してクロンチック社などから購入して利用することも出
来る。

これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やポリメラー
ゼ・チェーン・リアクシボン法（ＰＣＲ）を用いて、例
えばＨ，Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ
。

Ｂｉｏｌ、、２．１６１．１９Ｂ２、およびＭｏ１．　
Ｃｅ１）．　Ｂｉｏｌ、。

、３．’２８０．１９８３）あるいはＵ、　Ｇｕｂｌｅ
ｒらの方法（Ｇｅｎｅ。

２５、２６３．１９８３）あるいは門、＾、　Ｐｒｏｈ
ｍａｎ　らの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８−５．８９９８．１９８８）
に従ってｃ　ＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをプラスミ
ドやファージなどに組み込むことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを調製することが出来る。ｃＤＮＡを紐み込むプ
ラスミドベクターとしては、大腸閉由来のｐＢＲ３２２
（東洋紡製）、ｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９（東洋紡製
）、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ（シグマ社製）などがあ
る。またＣＤＮＡを組み込むファージヘクターとしては
、１■↓１０およびＬＥｉｌ　１．（東洋紡製）などが
ある。これらのヘクターは、宿主細胞内に保持されて複
製、増幅されるものであれば、ここに例示したものに限
定されるものではない。

ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミド
またはファージに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを調
製する方法として、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒａｎｇ　）ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１
９８２．　ｐ、　２３９）またはＴ、ν、Ｈｙｕｎｈら
の方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ＋１、４９．１９８５）を各
々例示することが出来る。また、ｍＲＮＡと同様に各種
のｃＤＮＡライブラリーを市販品としてクロンチック社
などから購入することが出来るのでそれらを利用するこ
とも出来る。

（２）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーのクローニング：
ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファ
ージなどの＆！Ｉ換発現ヘクターは、大腸菌のような通
切な宿主細胞器こ保持される。宿主となり得る大腸菌と
しては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＮＭ
５１４．Ｃ６００（ストラフジーン社製）、ＮＭ５２２
．ＪＭＩＯＩ　　（ファルマシア社製）などを例示する
ことが出来る。ｃＤＮＡのヘクターがプラスミドの場合
、塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム
法などを用いて、またｃＤＮＡのヘクターがファージの
場合、インビトロパンケージング法などを用いてあらか
じめ増殖させた宿主細胞に保持させることが出来る（Ｍ
ｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋
１９８２、　ｐ、　２４９）　。

このようにして得られた形質転換体から、ラットなどの
動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ酸
配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、このオ
リゴヌクレオチドをｘｔｐ標識して、プローブとして用
いてコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｅｎｅ、　
１３．６３．１９８０）　、プラークハイブリダイゼー
ション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１３ｊｇ。

１８０、１９７７）などによってｃＤＮ八クワクローン
り上げることが出来る。また、目的とするポリペプチド
に対する抗体を用いて、標識抗体法（ＤＮＡＣｌｏｎｉ
ｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、
ＬＬ４９＋　１９８５）によって、ｃ、　Ｄ　Ｎ　Ａク
ローンをクローニングすることも可能である。このよう
にしてクローン化された形質転換体は、ラットなどの動
物またはヒト由来のＨＧ　Ｆの全アミノ酸配列あるいは
その部分のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ｃＤＮＡを含有している。

次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ、　１９８２）に従って
プラスミドやファージなどの組換ＤＮＡを単翻し、その
まま、あるいは制限酵素で消化してからｃＤＮＡ塩基配
列が決定される。最初に得られた該ラットなどの動物ま
たはヒト由来のｃＤＮＡを１０−ブとして、同様の方法
によってヒトのＩＩ器あるいは血液細胞由来のｍＲＮＡ
から調製されたｃＤＮＡライブラリーのクローニングを
行うことが出来る。得られたラットなどの動物あるいは
ヒト由来の）Ｉ　Ｇ　ＦのｃＤＮＡの塩基配列は、マク
サムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　７４．５６０．１
９７７）やサンガーのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、＋　７４＋
５４６３、１９７７）などによって決定される。さらに
、必要があれば、前述のｍＲＮＡと塩基配列の決定され
たｃＤＮＡの１部あるいはそのｃＤＮＡの１部の配列を
合成したＤＮＡをプライマーにしてプライマーエクステ
ンション法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１）．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６、７３１．１９７９）によっ
て新たにｃＤＮＡライブラリーを構築し、上記と同様に
してそのｃＤＮＡライブラリーから、すでに得られた第
１のｃＤＮＡに連結しうる第２のｃＤＮＡを含有するプ
ラスミドやファージなどの組換ＤＮＡをクローニングす
ることが可能である。このプライマーエクステンション
とクローニングの工程は、必要により蝮数回繰り返され
る。

（３）ヒトＨＣＳＦ＆ｌ１ｍ発現ベクターの構築：クロ
ーン化されたヒトＨＧＦのアミノ酸配列の全部あるいは
その１部をコードするｃ　ＤＮＡを含有する数種のプラ
スミドやファージなどの組、換ヘクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、ヒトＨＧＦの発現に適した
プロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用い
て再結合して組換発現ヘクターを作製することが出来る
。

より詳しくは、ヒ）ＨＧＦを効率良く発現させるために
組換発現ヘクターは、転写方向の順番に必要により■プ
ロモーター、■リポソーム結合部位、■開始コドン、■
ヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、■
終止コドン、■ターミネーターを含むように構築される
。

採用することが出来るＤＮＡのヘクターとして、大腸菌
由来のプラスミドｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１８（東洋紡製
）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１）０（シグマ社製
）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５　（ＡＴＣＣ３７
０６２）、バクテリオファージＬＪＬＬ１）．Ｊ工±１
）　（ストラタジーン社製）、ウィルスＳＶ４０　（Ｂ
ＲＬ社製）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣＶＲ−７０３）、レトロ
ウィルスの遺伝子由来のヘクターなどが列挙出来るが、
宿王内で複製・増幅可能なヘクターであれば特に限定は
ない。特に、ヒトＩＩ　ＣＦを簡便に発現させるには、
ＳＶ４０のようなウィルスの遺伝子由来のヘクターを用
いるのが好ましい。

例えば、前述のクローン化されたヒトＨＧ　Ｆをコード
するＤＮＡをＳＶ４０ヘクターの後期領域に結合した組
換発現ヘクターは、ＣＯ８細胞（Ｃｅｌｌ。

υ、　１７５．１９８１）と呼ばれるサル細胞株に導入
して発現させることが可能である。

プ「Ｉモーターおよびターミネータ−に関しても、目的
とするヒトＨＧＦをコードする塩基配列の発現に用いら
れる宿主に対応したものであれば特に限定はない。例え
ば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、−
ＬＬＬプロモーター、土足−んプロモーターなどを、宿
主が枯草菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、５ＰＯ
２プロモーターなどを、宿主が酵母である場合、ＧＡＰ
プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどを、宿主がマウ
ス線維芽細胞やチャイニーズハムスター卵巣細胞のよう
な動物細胞の場合、ウィルス由来のＳＶ４０プロモータ
ーやＨ３ＶＩ　　ＴＫプロモーターあるいはメタロチオ
ネインプロモーターなどを例示することが出来る。また
ターミネータ−としては、宿主が大腸菌の場合、土工１
ターミネータ−１ＩＪｌ上ターミネータ−などを、宿主
が枯草菌の場合、ｌ旦Ｌ１ターミネータ−などを、宿主
が酵母の場合、ＣＹＣ１ターミネータ−などを、宿主が
動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネータ−１ＨＳ　Ｖ　
ＩＴＫターミネータ−などを例示することが出来る。

これらのプロモーターとターミネータ−は用いる宿主に
応じて適切に組み合わされる。

ヒトＨＧ　Ｆをコードする塩基配列を含有するＤＮＡは
、そのＤＮＡから転写、翻訳されて作られるポリペプチ
ドが、肝実質細胞増“殖活性を有するならば特に制限は
なく、さらには上記塩基配列の一部が置換、欠損、挿入
、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を有するＤ
ＮＡであってもよい。ヒ）ＨＧＦをコードする塩基配列
を含有する該ＤＮＡの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻
訳終止コドンとしてＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを
有してもよい。また必要に応して開始コドン、あるいは
終止コ（ンを１つ以上組み合わせたり、他のコドンと組
み合わせて配列してもよく、これらに特に限定されない
。さらに、この組換発現ヘクターで形質転換した宿主の
選択マーカーとなり得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオ
マイシン耐性遺伝子、Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子など１種また
は２種以上が註ヘクターの適切な位置に含有されている
ことが好ましい。

（４）宿主細胞の形質転換とその培養：このようにして
構築されたヒトＨＧ　Ｆ組換発現ヘクターは、コンピテ
ント細胞法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

５３、　１５４．　１９７０）、プロトプラスト法（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．１９２９．１
９７８）　　リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　
２２１．Ｊ−５５１，１９８３）　　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅデ
キストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　ｇ１５．１６６、１
９８２）　、電気パルス法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｌ’ｌｊ。

７１６１、１９８４）、インビトロパンケージング法（
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．５
８１．１９７５）、ウイルスヘツタ−法（Ｃｅｌｌ、　
３７．１０５３．１９８４）　、またはマイクロインジ
ェクション法（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１）．　Ｒｅｓ、。

１５３　３４７．１９８４）などによって宿主に導入さ
れ、形質転換体が作製される。このとき、宿主として既
述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動物細胞などが用い
られる。特にマウス線維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ、ν１ｒｏ
１．．２６．２９Ｌ　１９７Ｂ）やチャイニーズハムス
ター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７７、４２１６．１９８０）などの哺乳動物
由来の宿主細胞を用いるのが好適である。

得られた形質転換体は、目的とする＆ｌ換ヒ）　ＨＧＦ
を産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培
養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが
含有される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が
大腸菌の場合、ＬＢ培地（日永製薬製）、Ｍ９培地（Ｊ
、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎｅｔ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＷｏｒｋ、　１９
７２．　ｐ、４３１）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥ
ＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋
土＋　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　
１９７９．　ｐ、１）７）などを、宿主が動物細胞の場
合、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、
ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭｒ１６４０１Δ地（日永製薬製）
などを挙げることが出来る。

形質転換体の培養は、通常２０°Ｃ〜４５”Ｃ，ｐＨは
５〜８の範囲で行われ、必要に応して通気、撹拌が行わ
れる。また、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガ
ラスピーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセル
ロースフォローファイバーなどの担体が用いられる。こ
れら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体
が生育すれば実施でき、これらに限定されるものではな
い。

（５）ヒトＨＧ　Ｆの精製： このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換
体中に生成した＆ＩＩ換ヒトＨＧＦは、公知の塩析法、
溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あ
るいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマト
グラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマ
トグラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来
る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファ
ロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファ０−ス
アフイニテイクロマトグラフイ、およびフェニルセファ
ロース逆相クロマトグラフィの組み合わセ、あるいは硫
酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオン
クロマトグラフィ、およびｌｉ　１）　Ｃ；　Ｆ抗体セ
ファロースアフィニティクロマトグラフィの絹み合わせ
などが好ましく有効な精製法である。

以上述べた方法によって得られた組換ヒトＨＧＦは、ラ
ット肝およびラット血小板由来ＨＧ　Ｆと同様に肝実質
細胞の増殖を顕著に促進する。

ＨＧＦを、ヒトをはじめとする動物の生体組繊や動物細
胞培養物から抽出、分離、精製することもでき、その方
法としては、通常のタンパクの抽出、分離、精製法を利
用することが出来る。例えば、エタノールやアセトンな
どの有ｉ溶媒沈澱法、硫安等による塩析法、透析法、限
外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを組合わせて用いることができる。特に、Ｓ−セフ
ァロースクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースク
ロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラ
フィー、抗体アフィニティークロマトグラフィー、Ｃ４
逆相クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマト
グラフィーなどの組み合わせが好ましく、有効な分離、
精製法である。

１（Ｇ　Ｆは、そのアミノ酸配列の１部が欠失もしくは
置換していたり、他のアミノ酸配列が１部挿入されてい
たり、さらにはｅｌｌが同様に欠失あるいは［ｔＭされ
ていても、肝硬変治療に有効であるような十分の肝実質
細胞増殖活性と線維芽細胞増Ｍ　１０１制活性とを有す
るかぎり全て本発明に使用され得る。

本発明の有効成分であるＨＧＦは、ヒトを含むウシ、ウ
マ、ラット、ヒツジなどの哺乳動物に対して優れた肝実
質細胞増殖活性と線維芽細胞増殖抑制活性を示すもので
あり、いずれの哺乳動物に対しても有効な肝硬変治療剤
である。

当該製剤は、通常ＨＧＦの単独または自体既知の担体等
と共に注射剤などの態様とされることが一般的である０
例えば、注射剤は、ＨＧＦを適切な緩衝液に溶解した後
、フィルターなどで無菌濾過すること等によって調製す
ることができる。

本発明の肝硬変治療剤には安定化物質、賦形物質、溶解
補助物質、吸着防止物質、酸化防止物質などの添加物質
を含んでもよく、該添加物質として、例えばマンニトー
ルやグルコースなどの糖類、グリシン、アラニン、リジ
ン、アルギニンなどのアミノ酸、アルブミンなどのタン
パク賞、エチレングリコールやグリセロールなどのアル
コール類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマ
ー、ＮａＣｌなどの無機塩類、クエン酸ナトリウムなど
の存機塩類、ポリソルベー）８０など界面活性剤および
含硫還元剤が挙げられ、これら１つまたは２つ以上を含
有してもよい。

液状製剤は凍結保存するとか、また凍結乾燥、真空乾燥
等の方法により水分を除去して保存することが好ましい
。さらに、ＨＧＦを含有する水溶液を塩析法や１８媒沈
澱法により、該因子を析出させ、得られた沈澱物を乾燥
して保存することもできる。

本発明の肝硬変治療剤は、通常、静脈、動脈、皮下等の
投与経路によって投与される。その投与量は、ＩＩ　Ｃ
Ｆとして、０゜０１ｍｇ〜１００■であり、これを１日
１〜数回に分けて投与することが好適である。

〔発明の効果〕

本発明の肝硬変治療剤は、ＨＧＦを有効成分として含有
してなり、ＨＧＦは線維芽細胞の増殖抑制により、維形
成を抑え、同時に肝実質細胞の増殖を促進することが出
来、すなわち、特異的に肝実質細胞の増殖を促進すると
同時に特異的に肝非実質線維芽細胞の増殖を抑制すると
いう２つの生理活性を持つ物質であるから、慢性肝炎か
らの肝硬変への移行や肝硬変の進行を止めることが出来
ると考えられ、更に高度に成立した肝硬変をも治療出来
るという効果を奏し、これまで有効な治療方法のなかっ
た肝硬変に対する治療剤として極めて有用である。また
、肝炎等の肝疾患治療剤としても有用である。

〔実施例・参考例・実験例］ 以下、実施例・参考例・実験例にて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらによって限定されるもので
はない。

参考例１ （ＨＧＦ活性の測定） ＨＧ　、Ｆ活性は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ。

８０、７２２９　（１９８３）に記載の方法に準じて次
のように測定した。ウィスター系ラットからコラゲナー
ゼ還流法によって肝実質細胞を分Ｎ情製した。得られた
ラット肝実質細胞を５％ウシ血清、２Ｘ１０−”Ｍイン
スリンおよび２Ｘ１０−’Ｍデキサメサゾンを添加した
ウィリアムスＥ培地（フローラボラトリー社）に懸濁し
、２４ウエルマルチプレートに１．２５×１０５個／ウ
ェルの濃度で播いた。５％Ｃ０２および３０％０．およ
び６５％Ｎ２の存在下、３７°Ｃで２０時間培養後、０
．１μｇ／ｄのアプロチニンを添加したウィリアムスＥ
培地に交換すると同時に所定量の被験試料を添加した。

１５時間後、■５μＣｉ／１ｒｒｌｌの１２Ｓ１デオキ
シウリジン１０μ！！／ウエルを添加した。コントロー
ル群には、　「２５Ｉデオキソウリジン添加の１５分前
に５μｇ／ｍρのアフィディコリンを添加した。さらに
６時間培養して１２５Ｉでラヘルした。細胞をｐｌ＋７
．４のＰＢＳ　（リン酸塩緩衝食塩水）で２回洗浄後、
冷１０％トリクロＤ酢酸水？８液（ＴＣＡ）で固定した
。細胞をｌウェル当たり０．５　＃１’のＩＮ水酸化ナ
トリウム水＞’Ｅ１ｍで可溶化し、その放射能をガンマ
カウンターにより測定した。また放射能測定後の試料の
１部をとってローリ−法（Ｊ、　Ｒｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、、　１９３．２６５．１９５１）に従い蛋白質を測定
した。被験試料を添加したとき肝実質細胞に取り込まれ
た１２５Ｉの量をコントロールとのカウントの差として
求め、これをラット肝実質細胞蛋白質１）ｇ当たりに換
算して、ＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／ｌＩｇ蛋白″ａ）と
した。被験試料のＩＩ　ＣＦ活性は、同一試験において
上皮細胞成長因子（ＥＣ，Ｆ）］Ｏｎε／ｌｄを用いた
時の肝実質細胞のＤＮＡ合成活性の５０％に相当する活
性を１単位と定義して表示した。

参考例２ ［肝非実質線維芽細胞増殖抑制活性の測定］若い成熟ラ
ット（体重１８０ｇ前後）の肝臓をコラゲナーゼにて潅
流することにより粗細脂分散液を調製後、５０×ｇ、１
分間の低速遠心により肝実質細胞を沈澱させた上清を分
離する。

この上清を次に１）００Ｘ、３分間の遠心を行い、完全
に肝実質細胞を沈澱させた後、肝非実質細胞を３５０Ｘ
ｇ、３分間の遠心により沈澱に集める。

このようにして肝実質細胞をほぼ完全に除去した肝非実
質細胞を、１０％ウシ血清を含むＲＰＭｌ１６４０培地
に約２６万細胞／Ｉ１）の細胞濃度に懸濁し、１２−ウ
ェル−マルチプレートの各ウェル毎に１　ｍｌずつ培養
した。３日間培養後、培地を１０％ｆｅｔａｌｃａｌｆ
　５ｅｒｕ＋１）（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭ１）０
４０培地に交換し、培養を続けた。培養開始から７日日
に組換えヒトおよびラット肝臓由来のＨＧＦを１　ｎｇ
〜５　ｎｇ／　ｔｄの濃度範囲で添加した。ＨＧＦ添加
添加２問 チミジンを加え、さらに１２時間培養を続けた。培地を
除きＰＢＳで細胞をよく洗浄後、各ウェルにｌＩｄのジ
ェングー液を加え、細胞を固定した．２０分後にジエン
グー液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、暗室下でＸ！！感光
乳剤［エマルジョン　タイプＮＲ−Ｍ２　（小西六社）
］を塗布した。４°Ｃで、６日間露光した後、細胞を現
像定着しオートラジオグラムを作成した。現像、定着後
エオシンで細胞質を染色し、写真撮影を行った。ラヘリ
ングインデソクスは、写真上で核がラベルされている肝
非’［１細胞をカウントすることにより算出した。

参考例３ 〔肝臓からの肝実質細胞増殖因子の製造〕ラット体重の
０．２％四塩化炭素を腹腔投与し、投与後約３０時間目
で肝臓を摘出した．肝臓はワーリングプレンダーで破砕
後、日立２０ＰＲ−５２型冷却遠心器を用いて１０．０
０Ｏ　ｒ　ｐ　ｍ　２　０分間遠心し、上清を得た。上
清を５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８、５）　十ｏ．　ｌ　
５Ｍ　　Ｎａ　Ｃ　ｌ　＋　１　０ｍＭヘペス＋２ｍＭ
　　ＣａＣ１ｇ＋０．０１％ツイン８０溶液で４°Ｃ−
昼夜透析した。透析内液を透析液で平衡化したＳ−セフ
ァロース（ＦＦ）（ファルマソア社製）カラムに注入し
、洗浄後、ＮａＣｌの濃度勾配により溶出した。肝実質
細胞増殖因子はＮａＣｌ濃度０．７Ｍ付近に溶出した。

次にこの肝実質細胞増殖因子をブルートリスアクリルＭ
　（ＩＢＦ社製）クロマトグラフィーにて精製した。２
容出はアルギニンの濃度勾配により行い、肝実質細胞増
殖因子はアルギニン濃度０．　２　５　Ｍ付近で溶出し
た。得られた画分を次にヘパリン−セファロース（ファ
ルマシア社製）クロマトグラフィーにより精製した。

溶出はＮａＣ１の濃度勾配により行い、肝実質細胞増殖
因子は１Ｍ前後のＮａＣ１ｆｉ度付近で溶出した。次に
フェニル５ＰＷ（東ソー社製）クロマトグラフィーによ
り精製した。溶出はＮａＣ１濃度減少およびエチレング
リコール濃度上昇勾配により行った。ラット１００匹の
肝臓当たり１０ｔｔｇの肝実質細胞増殖因子が得られた
．精製された肝実質細胞増殖因子は５ＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動において、非還元下で分子量７万から９万のバン
ドを与え、還元後は分子量約７万と約３万のαとβ鎖の
２本のバンドを与えた。得られた肝実質細胞増殖因子に
０．２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加え、ＰＢ
Ｓにて透析した後、実験に供した。

参考例４ 〔遺伝子組換え法によるＣ１２７細胞を宿主とするヒト
肝実質細胞増殖因子の製造］ ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードする遺
伝子により形質転換されたマウスＣｌ２７細胞を培養し
、その培養液上清より、ヒト肝実質細胞増殖因子を得た
。以下にその要約を示す。

ヒト肝臓のｍＲＮＡから作られたｃ　ＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、ヒト肝実質細胞増殖因子のアミ
ノ酸配列をコードするクローンＨＡＣ１９とＨＢＣ２　
５を得た。

１（ＡＣ１９からのＤＮＡをＢａｍＨＩとＳ＜：、ａ。

土で、ＷＢＣ２５からのＤＮＡをＳｃａ　ｌとＰｓ工↓
で消化し、それぞれ得られた２つのＤＮＡフラグメント
をブルースクリプトＫＳ■のＢ　ａ　ｍ　Ｈ上とＰｓＬ
１部位に連結し挿入し、ｐＢＳ　（ｈＨＣＦＩＩ）を得
た（微工研菌寄第１）０５０号）。

ｐＢＳ　　［ｈＨＧＦＩｌ）をχ」ＬＬ上と５ａｌｌと
Ｎエエ±で消化し、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端とした後、ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする約
３ＫｂのＤＮＡフラグメントを、ウシパピローマウィル
スＤＮＡをベクターとする発現ベクターＰＢＰＭＴのＥ
ｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＢＰＭＴ　［ｈＨＣ；Ｆｌｌ
）を得た。得られた肝実質細胞増殖因子発現ベクターｐ
ＢＰＭＴ　（ｈＨＧＦｉｌ）を、リン酸カルシウム法に
よりマウスＣ１２７細胞を形質転換した。形質転換体の
選択は、６４１８を含む培地で増殖させることにより行
った。得られた形質転換体の中から、高い肝実質細胞増
殖因子産生能を示す細胞株ＢＰＩ（８９を選び出した。

ＢＰＨ８９１）１胞を牛胎児血清を加えた培地で増殖さ
せた後、培地を２日おきに変換して、肝実質細胞増殖因
子を生産させた。培ｉ液から目的とする肝実質細胞増殖
因子を参考例３の精製法に準じた方法により精製した。

精製した肝実質細胞増殖因子がＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果、非還元下で分子量約８万ダルト
ンの単一バンドを与え、還元下では分子量約７万ダルト
ンのα鎖と約３万ダルトンβ鎖の２本のバンドを与える
ことをｉｔ　Ｌ’２した。得られた肝実質細胞増殖因子
に０．２５％ＢＳＡを加え、ＰＢＳで透析した後実験に
供した。

実験例 〔初代培養肝実質細胞と初代培養肝非実質線維芽細胞に
対するＨＧＦの効果〕 参考例４に基づき調製した精製ヒト組換え肝実質細胞増
殖因子を、参考例１において示した方法に従って、成熟
ラット初代培養肝実質細胞に１〜５ｎｇ／ｄとなるよう
に添加し、そのＤＮＡ合成活性を測定した。さらに、同
因子を参考例２に示したごとくラント肝非実質細胞系に
１〜５ｎｇ／ｊＩ！添加し、ラベリングインデックスを
算出した。

以上の結果を第１図としてグラフにまとめた。組換えヒ
ト肝実質細胞増殖因子は、肝実質細胞に対しては用量依
存的に増殖を促進させたが、一方の非実質細胞に対して
は増殖を顕著に抑制した。即ち本因子は肝臓を構成する
実質細胞と非実質細胞に対し、全く逆の作用を有するこ
とが明らかになった。

実施例１ ０．１５Ｍ　　ＮａＣｌと０．Ｏ１％ポリソルヘート８
０を含むｐｌ＋７．４の０．０２　Ｍリン酸緩衝液１０
０ｄに肝実質細胞増殖因子１■とヒト血清アルブミンｌ
ｏ０ｍ１ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、Ｉ　ｍｌず
つバイアルに分注し、凍結乾燥し密封する。別に注射用
蒸留水を無菌的に１　ｍｌずつアンプルに分注し、溶解
溶液とする。

実施例２ ０．１５Ｍ　　ＮａＣｌと０．Ｏ１％ポリソルヘート８
０　ヲ含ムｐＨ７、４（Ｄｏ、　０２　Ｍ　’）　７＃
ｉ緩衝液１００ｄに肝実質細胞増殖因子１■とヒト血清
アルブミン１００Ｋを含む水溶液を無菌的に調製し、１
ａｆｆずつアンプルに無菌的に分注溶閉する。

実施例３ 生理的食塩水１００社中に肝実質細胞増殖因子１■とマ
ンニトール１ｇとポリソルベート１０１ｇを含む？容液
を無菌的に調製し、ｌｄずつバイアルに分注し、凍結乾
燥し密封する。

実り面倒４ 肝実質細胞増殖因子　１重量部、ヒト血清アルブミン５
０重量部、注射用蒸留水１００．０００重を部の組成比
の水溶液を無菌的に調製し、バイアル瓶に分注し、凍結
乾燥し密封する。

実施例５ 注射用蒸留水１００献に肝実質細胞増殖因子１■、ポリ
ソルベート８０　１０ｍｇ、グリシン２ｇ、ソルビトー
ル２ｇを含む溶液を無菌的に調製し、Ｉ　ｍｌずつバイ
アルに分注し、凍結乾燥し密封する。

【図面の簡単な説明】

第１図は初代培養肝実質細胞と初代培養肝葬実質線維芽
細胞に対するＨ　Ｇ　Ｆの効果を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有してな
   る肝硬変治療剤。
2. （２）肝実質細胞増殖因子が、肝実質細胞を増殖させる
   活性と肝間葉系細胞および線維芽細胞の増殖を抑制する
   活性とを有するポリペプチドであることを特徴とする請
   求項（１）記載の肝硬変治療剤。
3. （３）肝実質細胞増殖因子がヒトを含む動物組織由来の
   ものであることを特徴とする請求項（１）記載の肝硬変
   治療剤。
4. （４）肝実質細胞増殖因子が肝実質細胞増殖因子をコー
   ドする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させて得たもので
   あることを特徴とする請求項（１）記載の肝硬変治療剤
   。
5. （５）宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物
   または動物細胞のいずれかであることを特徴とする請求
   項（４）記載の肝硬変治療剤。