JP3200609B2 - 上皮細胞増殖促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は肝実質細胞増殖因子を有
効成分として含有してなる上皮細胞増殖促進剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】皮膚は、表皮、真皮、皮下組織の３層か
らなり、表皮はいわゆる上皮であり外胚葉に由来するの
に対し、真皮、皮下組織は中胚葉（間葉）に由来する結
合組織である。表皮は胚芽層（基底層）、有きよく層、
顆粒層などからなる層状をなしている。表皮を形成する
細胞はマルピギー系細胞またはケラチノサイトとよばれ
る一般表皮細胞と木の枝のような突起を持つメラノサイ
トに大別される。ケラチノサイトは角化能力をもち、メ
ラノサイトはメラニン色素の産生能力を持つことで特徴
づけられる。ケラチノサイトは表皮全体を形成する主要
な細胞であるが、メラノサイトは表皮の胚芽層に主に存
在する。表皮の最外部は角質層と呼ばれ、ケラチンを大
量に含んだ、鱗片状の細胞の死骸の堆積物である。上皮
細胞の更新は、最深部の胚芽層において新生したケラチ
ノサイトが角質層の上端に達して説落するという過程を
経て約１５〜３０日間で行われる。メラノサイトはメラ
ニン色素を産生するが、色素量はメラノサイトの数に依
存するのではなく、メラノサイトの色素産生能力と色素
分配能力により決定される。例えば、黒人と白人などの
人種間で、メラノサイトの分布密度に差異がなく、産生
されたメラニン顆粒が１ヵ所に集まると皮膚の色は白く
見え、小さい顆粒が広く分散すると黒く見える。表皮は
形態的にも機能的にも２つの独立した細胞要素−ケラチ
ノサイトとメラノサイトの共生組織とみなすことができ
る。

【０００３】上皮細胞の増殖因子としてはすでにＥＧＦ
（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；
上皮細胞成長因子）と呼ばれる物質が実用化に向けて臨
沫効果（Ｎａｎｎｅｙ，Ｌ．Ｂ；Ｊ ＩｎｖｅｓｔＤｅ
ｒｍａｔｏｌ，９５，６２４−６２９，１９９０）と大
量生産（アース製薬、特開平２−１０４２９３号など）
の両面について検討されつつある。ＥＧＦはアミノ酸５
３個からなる約６ｋＤａの分子量を持つポリペプチドで
あり、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞の細胞増殖
促進効果を有することが知られている。ＥＧＦは医療品
として種々の効果が期待されており、例えば、創傷治療
剤、消化性潰瘍治療剤、抗ガン剤、人工皮膚などへの応
用が考えられているが、実用化には至っていない。ＥＧ
Ｆの作用効果の特徴は上皮細胞と共に線維芽細胞をも増
殖させる点であり、このため、結合組織にまでおよぶ外
傷の治療には適しているが、表皮のみが損傷を受けてい
る外傷や皮膚潰瘍には最適とは言い難い。ＥＧＦはま
た、ガン化誘導作用を持つので、実用化には慎重になら
ざるを得ない。

【０００４】また、ＥＧＦ同様創傷治療剤として開発さ
れつつあるＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）も主に線維芽
細胞の増殖を促進するものであって、このため上皮細胞
のみを選択的に増殖することは不可能であった。ＥＧＦ
と構造的に近縁であるＴＧＦ−_αもまた上皮細胞の増殖
を促進させる活性を有するが、その名前の由来（トラン
スフォーミング成長因子、すなわちガン化促進因子）の
とおり細胞をガン化させる活性を併せ持つという重大な
欠陥があるので、ヒトや動物への投与は難しいと考えら
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来見出され
ていなかった、正常上皮細胞のみを特異的に増殖促進
し、線維芽細胞増殖促進作用やガン化作用を持たない薬
剤を提供することを目的とするものである。

【０００６】正常上皮細胞のみを選択的に増殖させるこ
とができると、結合組織にまで至らない表層の外傷や皮
膚潰瘍に非常に有用である。例えば、寝たきり老人の増
加で大きな問題となってきた「床ずれ」は、受診患者６
万５０００人を数え、潜在患者はその１０倍にものぼる
と推定されている。これは上皮細胞の更新速度が老齢化
により基礎的に低下しているために起こる症状であり、
症状が悪化して皮下組織にまで損傷が広がる以前に、上
皮細胞を新生させ更新能力を高めることができれば、有
効な治療及び予防が可能となる。結合組織に至る外傷を
治癒する場合であっても、患部表面をいち早く上皮組織
で覆うことができれば、患部は保護され自律的な皮膚組
織更新が速やかに行われると期待できる。むしろ外傷の
修復の際、線維芽細胞の増殖が進展しすぎると上皮細胞
の再生が不完全な状態、いわゆる班痕、が残ると考えら
れる。同様に、あらゆる外科的手術において、術後の皮
膚縫合は感染防御などの意味から重要であるが、上皮組
織が速やかに癒着し、かつ治癒後の表皮に痕跡が少なく
なれば、非常に有用であることは確実である。従って、
上皮細胞のみを選択的に増殖させる薬剤は、単独使用し
ても、あるいはＥＧＦのように線維芽細胞増殖を促進す
る物質とともに使用しても創傷治癒に対して有効であ
る。

【０００７】正常上皮細胞のみを選択的に増殖させる薬
剤は、ＥＧＦについて従来から考えられている各種の適
用範囲、例えば角膜手術、抗消化性潰瘍、人工皮膚など
について、ＥＧＦよりむしろ特異性が高く効果を発揮す
ると期待される。さらにまた、上皮の更新を促すことか
ら皮膚の新陳代謝を高め、肌を若々しく保つために有用
であり化粧品としても広い用途が期待される。新しい用
途として、育毛、術後の皮膚回復、角質化した皮膚の代
謝促進、日焼け後やアトピー性皮膚炎などにおける表皮
の回復などが期待される。とりわけ育毛については、血
行促進などにより毛根細胞を活性化する薬剤が製品化さ
れているが、正常上皮細胞のみを選択的に増殖させる薬
剤によって毛根細胞を増殖促進すれば、より直接的に効
果的である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、肝実質細胞増
殖因子ＨＧＦを有効成分とする上皮細胞増殖促進剤の発
明である。本発明において、ＨＧＦはヒトまたは動物の
組織ないし血液成分由来であってよく、またＨＧＦは遺
伝子組換えにより製造したものであってよい。この場
合、遺伝子組換えの宿主細胞は大腸菌、枯草菌、酵母、
糸状菌、植物又は動物細胞のいずれかであってもよい。

【０００９】本発明の有効成分である肝実質細胞増殖因
子（ＨＧＦ）は本発明者等が再生肝ラット血清中から成
熟肝実質細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる因子とし
て見いだした蛋白質である（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１２２，１４５０，１
９８４）。本発明者等は更に、ＨＧＦをラット血小板よ
り単離することに成功し（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，２
２，３１１，１９８７）、そのアミノ酸配列を決定し
た。さらに、本発明者等は、解明されたＨＧＦアミノ酸
配列をもとにヒトおよびラット由来のＨＧＦｃＤＮＡク
ローニングを行い、このｃＤＮＡを動物組織に組換えて
肝実質細胞増殖因子を蛋白質として得ることに成功した
（ヒトＨＧＦ：Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８
９；ラットＨＧＦ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ，８７，３２００，１９９０）。

【００１０】本発明者等は多年にわたり肝実質細胞の増
殖因子を研究し、その結果上記のように、ＨＧＦを単離
精製することに成功した。さらにその構造と活性を詳細
に検討する中でＨＧＦに上皮細胞、すなわちメラノサイ
トとケラチノサイトの増殖を特異的に促進する活性を見
出し、本発明を完成するに至った。すなわち、ＨＧＦは
以下の実施例に述べるごとく、ヒト正常表皮ケラチノサ
イトおよびメラノサイトの増殖を５〜１０ｎｇ／ｍｌと
いう低濃度で著しく促進するのみならず、両細胞の運動
性を高める活性を有することが確認された。すなわち、
創傷治癒など組織が再生されるときに重要なことは、組
織を構成する細胞が増殖すると共に、増殖する細胞自身
が損傷部位へ移動してゆくことであり、本発明の薬剤は
完全に条件を満たしている。またＨＧＦは元来、肝実質
細胞増殖を促進する因子として発見されたポリペプチド
であるが、上皮系細胞のみの増殖を促進し、間葉系細胞
の増殖を促進せず、さらに細胞をガン化させる活性も持
たないため、ＥＧＦと比べて非常に特異性が高く、より
実用に適している。

【００１１】本発明に用いられるＨＧＦは、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで成熟ラット肝細胞を増殖させる因子として発見
された生理活性ポリペプチドであり、分子量はＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動より８２〜８５ｋＤで
ある。ラットＨＧＦ分子は４４０アミノ酸残基からなる
α鎖と２３３アミノ酸残基からなるβ鎖が１個のジスル
フィド結合により架橋したヘテロダイマー構造を持ち、
α、β両鎖とも２個のグルコサミン型糖鎖結合部位が存
在する。ヒトＨＧＦもまた同じ生理活性を有し、４４０
アミノ酸残基からなるα鎖と２３４アミノ酸残基からな
るβ鎖とからなる。α鎖中には線溶酵素プラスミンと同
様のクリングル構造が４個存在し、β鎖のアミノ酸配列
においてもセリンプロテアーゼ活性を有するプラスミン
のβ鎖と約３７％のホモロジーを有する。ヒトＨＧＦ前
駆体のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩
基配列を配列番号１及び２に示した。ラットＨＧＦとヒ
トＨＧＦのアミノ酸配列のホモロジーはα鎖において９
１．６％、β鎖において８８．９％と非常に高い相同性
を持ち、その活性はまったく互換性がある。

【００１２】本発明のＨＧＦは種々の方法により得るこ
とができる。例えば、ラット、ウシなどの哺乳動物の肝
臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器及び
血小板、白血球などの血液細胞や血漿、血清などから抽
出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦを産生す
る初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物から分離精
製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは公知の遺伝
子工学的手法（Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０，１９８
９）によりＨＧＦをコードする遺伝子を大腸菌、枯草
菌、酵母、糸状菌、植物または動物細胞と適切な宿主細
胞に組み込み、この形質転換体の培養物から目的とする
組換えＨＧＦを得ることができる。

【００１３】こうして得られたＨＧＦは、そのアミノ酸
配列の一部が欠失、もしくは置換したり、他のアミノ酸
配列が一部挿入されていたり、あるいは糖類が同様に欠
失あるいは置換されていても、上皮細胞増殖の促進活性
を有するかぎり本発明の範囲に含まれる。本発明の有効
成分であるＨＧＦは、ヒトを含むウシ、ウマ、ラット、
ヒツジなどいずれの哺乳動物に由来するものであっても
優れた上皮細胞増殖の促進効果を持ち、いずれの哺乳動
物に対しても有効な上皮細胞増殖効果を有する。すなわ
ち、本発明の上皮細胞増殖促進剤はヒトのみならず動物
用医薬品とすることができる。

【００１４】本発明の上皮細胞増殖促進剤ならびに皮膚
疾患治療剤は有効成分であるＨＧＦ単独で、あるいは他
の上皮細胞増殖促進因子や既知の担体と共に外用薬また
は化粧品として製剤化するのが望ましい。また、本発明
の治療剤および予防剤はＨＧＦ以外に製剤化に必要な添
加物、例えば安定化剤、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止
剤等を含んでもよい。製剤化する場合はその用途に応じ
て軟膏状、ゲル状、液状など種々の剤形にして用いるこ
とができる。また、凍結乾燥により担体と共に固形化し
て保存し、必要に応じて液状とすることも可能である。

【００１５】

【発明の効果】本発明の上皮細胞増殖促進剤は、正常上
皮細胞のみを特異的に増殖促進し、また、細胞運動性促
進活性作用を有する。このため、創傷治療、皮膚潰瘍治
療をはじめ、消化性漬瘍治療、抗ガン、手術後の皮膚縫
合、角膜手術などにおける医薬品的用途や、毛根細胞の
増殖剤、さらに皮膚の新陳代謝を高める化粧品として用
いることができる。また、ＨＧＦは、ＥＧＦ、ＴＧＦ−
α、ＦＧＦとは異なり、線維芽細胞の増殖や細胞のガン
化促進活性を有しない。このため、従来にない特異性の
高い、また副作用の少ない薬剤として活用することがで
きる。

【００１６】

【実施例】以下に本発明の実施態様及び効果を明らかに
するための実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する
が、もとより本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００１７】実施例１ ラット肝臓から本発明の肝実質細胞増殖因子ＨＧＦは次
のようにして製造した。ウィスター（Ｗｉｓｔｅｒ）系
のラットに体重の０．２％に相当する四塩化炭素を腹腔
投与し、投与後約３０時間目で肝臓を摘出した。肝臓を
ワークリングブレンダーで粉砕した後、日立２０ＰＲ−
５２型冷却遠心機を用いて１０，０００ｒｐｍ２０分間
遠心し、上清を得た。上清を０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋１
０ｍＭヘペス＋２ｍＭ ＣａＣｌ_２＋０．０１％ツイン
８０溶液を加えた５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で４℃一昼夜透析した。透析内液を透析液で平衡化
したＳ−セフアロース（ＦＦ）（ファルマシア社製）カ
ラムに注入し、洗浄後、ＮａＣｌの濃度勾配により溶出
した。肝実質細胞増殖因子はＮａＣｌ濃度０．７Ｍ付近
に溶出した。次ぎにこのＨＧＦをブルートリスアクリル
Ｍ（ＩＢＦ社製）クロマトグラフィーで精製した。溶出
はアルギニンの濃度勾配により行い、ＨＧＦはアルギニ
ン濃度０．２５Ｍ付近で溶出した。得られた画分を次に
ヘパリン−セファロース（ファルマシア社製）クロマト
グラフィーにより精製した。溶出はＮａＣｌの濃度勾配
により行い、ＨＧＦは１Ｍ前後のＮａＣｌ濃度付近で溶
出した。次にフェニル５ＰＷ（東ソー社製）クロマトグ
ラフィーにより精製した。溶出はＮａＣｌ濃度減少およ
びエチレングリコール濃度上昇勾配により行った。ラッ
ト１００匹の肝臓あたり１０μｇのＨＧＦが得られた。
ＨＧＦの比活性は約５０万単位／ｍｇであった。得られ
たＨＧＦに０．２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を
加え、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）にて透析した。

【００１８】実施例２ 遺伝子組換え法によりヒト細胞由来の肝実質細胞増殖因
子ＨＧＦを製造した。Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅｌ
ｌ，１１，２２３，１９７７）に記載された方法に従っ
て、ヒト肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子により形質転換されたマウスＣ１２７細胞を培
養し、その培養液上清より、ヒト肝実質細胞増殖因子を
得た。すなわち、ヒト肝臓のｍＲＮＡから作られたｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、ヒト肝実質細胞
増殖因子のアミノ酸配列をコードするクローンＨＡＣ１
９とＨＢＣ２５を得た。ＨＡＣ１９からのＤＮＡをＢａ
ｍＨＩとＳｃａＩで、ＨＢＣ２５からのＤＮＡをＳｃａ
ＩとＰｓｔＩで消化し、それぞれ得られた２つのＤＮＡ
フラグメントをブルースクリプトＫＳＩＩのＢａｍＨＩ
とＰｓｔＩ部位に連結し挿入し、ｐＢＳ［ｈＨＧＦＩ
Ｉ］を得た。ｐＢＳ［ｈＨＧＦＩＩ］をＸｂａＩとＳａ
ｌＩとＮａｅＩで消化し、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端とした後、ヒト肝実質細胞増殖因子をコード
する約３ＫｂのＤＮＡフラグメントを、ウシパピローマ
ウイルスＤＮＡをベクターとする発現ベクターｐＢＰＭ
ＴのＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩ
Ｉ］を得た。得られた肝実質細胞増殖因子発現ベクター
ｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩＩ］を用いて、リン酸カルシウ
ム法によりマウスＣ１２７細胞を形質転換した。形質転
換体の選択は、Ｇ４１８を含む培地で増殖させることに
より行った。得られた形質転換体の中から、高い肝実質
細胞増殖因子産生能を示す細胞株ＢＰＨ８９を選びだし
た。ＢＰＨ８９細胞を牛胎児血清を加えた培地で増殖さ
せた後、培地を２日おきに交換して、肝実質細胞増殖因
子ＨＧＦを実施例１の精製法に準じた方法により精製し
た。

【００１９】ヒト白血球のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライ
ブラリーを用いて、上記と同様の方法でＨＧＦを得た。

【００２０】実施例３ヒト正常表皮メラノサイトの増殖に対する効果 本発明の上皮細胞増殖促進剤の有効成分であるＨＧＦ
の、メラノサイトに対する増殖促進作用を以下の方法に
より確認した。ＭＣＤＢ１５３（高アミノ酸タイプ）培
地にインスリン５μｇ／ｍｌ、ヒドロコーチゾン０．５
μｇ／ｍｌ、フォルボール１２−ミリステート１３−ア
セテート（ＰＭＡ）１０ｎｇ／ｍｌを加えた無血清基礎
培地を用いてヒト正常表皮メラノサイト（クラボウ株式
会社）を懸濁し、１２穴プラスチックプレートに１０^４
個／ウェルになるように蒔いた。１０％ＣＯ_２、２５％
Ｏ_２、６５％Ｎ_２の条件下３７℃で培養した。２４時間
培養後、無血清基礎培地にＨＧＦを０から２０ｎｇ／ｍ
ｌの範囲で段階的に加えた試験培地に交換し、培養を続
けた。培養開始９日後に再びＨＧＦを加えた試験培地を
用いて培地交換をした後、１５日後培養を終了し、最終
細胞数をヘモサイトメーターにてカウントした。その結
果、図１に示す如く正常メラノサイトはＨＧＦにより０
〜１０ｎｇ／ｍ１の範囲で容量依存的に増殖を促進さ
れ、最適濃度において約５倍にまで高められることが確
認された。

【００２１】実施例４ヒト正常表皮メラノサイトの複製ＤＮＡ合成に対する効
果 実施例３に記載された無血清基礎培地にヒト正常表皮メ
ラノサイトを懸濁し、２４穴プラスチックプレートに４
×１０^４個／ウェルになるように蒔いた。１０％Ｃ
Ｏ_２、２５％Ｏ_２、６５％Ｎ_２の条件下３７℃で培養し
た。２４時間培養後、無血清基礎培地にＨＧＦを０から
２０ｎｇ／ｍｌの範囲で段階的に加えた試験培地に交換
し、培養を続けた。２４時間培養後、０．５μＣｉの［
^１２５Ｉ］デオキシウリジンを各ウェルに添加した。さ
らに４時間培養して細胞に［^１２５Ｉ］を取り込ませた
後、細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸食塩緩衝液）に
て洗浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で固定した。
細胞を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その放
射能をガンマーカウンターにより測定した。また放射能
測定後の試料の一部をとってＭｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（ピアース社）に
より蛋白質量を測定した。細胞内に取り込まれた標識デ
オキシウリジンの量をコントロールとのカウント差とし
て求め、これをヒト正常表皮メラノサイト蛋白質１ｍｇ
あたりに換算してＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／ｍｇ蛋白
質）とした。その結果、図２に示す如く正常メラノサイ
トＨＧＦにより０〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲で用量依存的
に複製ＤＮＡ合成を促進され、最適濃度において約４倍
にまで高められることが確認された。

【００２２】実施例５ヒト正常表皮ケラチノサイトの増殖に対する効果 本発明の上皮細胞増殖促進剤の有効成分であるＨＧＦ
の、ケラチノサイトに対する増殖促進作用を以下の方法
により確認した。実施例１に記載された無血清基礎培地
にウシ視床下部抽出物１５０μｇ蛋白質／ｍｌを加えた
培地にヒト正常表皮ケラチノサイトを懸濁し、１２穴プ
ラスチックプレートに１０^４個／ウェルになるように蒔
いた。１０％ＣＯ_２、２５％Ｏ_２、６５％Ｎ_２の条件下
３７℃で培養した。２４時間培養後、カルシウムイオン
濃度を１．８ｍＭに調整した無血清基礎培地に交換し、
更に２４時間培養後、ＨＧＦを０から２０ｎｇ／ｍｌの
範囲で段階的に添加し、培養を続けた。培養開始６日
後、培地をＨＧＦを加えた新しい培地に交換して培養を
続け、４日後（培養開始から１０日後）培養を終了し、
最終細胞数をヘモサイトメーターにてカウントした。そ
の結果、図３に示す如く正常ケラチノサイトはＨＧＦに
より０〜２．５ｎｇ／ｍｌの範囲で用量依存的に増殖を
促進され、最適濃度において約３倍にまで高められるこ
とが確認された。

【００２３】実施例６ヒト正常表皮ケラチノサイトの複製ＤＮＡ合成に対する
効果 実施例３に記載された無血清基礎培地にウシ視床下部抽
出物１５０μｇ蛋白質／ｍｌを加えた培地にヒト正常表
皮ケラチノサイトを懸濁し、２４穴プラスチックプレー
トに４×１０^４個／ウェルになるように蒔いた。１０％
ＣＯ_２、２５％Ｏ_２、６５％Ｎ_２の条件下３７℃で培養
した。２４時間培養後、カルシウムイオン濃度を１．８
ｍＭに調整した無血清基礎培地に交換し、さらに２４時
間培養後ＨＧＦを０から２０ｎｇ／ｍｌの範囲で段階的
に添加し、培養を続けた。２４時間培養後、０．５μＣ
ｉの［^１２５Ｉ］デオキシウリジンを各ウエルに添加し
た。さらに４時間培養して細胞に［^１２５Ｉ］を取り込
ませた後、細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸食塩緩衝
液）にて２回洗浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で
固定した。細胞を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化
し、その放射能をガンマーカウンターにより測定した。
また放射能測定後の試料の一部をとってＭｉｃｒｏ Ｂ
ＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ピ
アース社）により蛋白質量を測定した。細胞内に取り込
まれた標識デオキシウリジンの量をコントロールとのカ
ウント差として求め、これをヒト正常表皮メラノサイト
蛋白質１ｍｇあたりに換算してＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ
／ｍｇ蛋白質）とした。その結果、図４に示す如く正常
メラノサイトＨＧＦにより０〜５ｎｇ／ｍｌの範囲で用
量依存的に複製ＤＮＡ合成を促進され、最適濃度におい
て約２倍にまで高められることが確認された。

【００２４】実施例７ヒト正常表皮ケラチノサイトの増殖に対する効果 実施例３に記載された無血清基礎培地にウシ視床下部抽
出物１５０μｇ蛋白質／ｍｌを加えた培地にヒト正常表
皮ケラチノサイトを懸濁し、１２穴プラスチックプレー
トに２×１０^４個／ウェルになるように蒔いた。１０％
ＣＯ_２、２５％Ｏ_２、６５％Ｎ_２の条件下３７℃で培養
した。２日間培養後、カルシウムイオン濃度を１．８ｍ
Ｍに調整した無血清基礎培地に交換し、さらに２日間培
養後ＨＧＦを２．５ｎｇ／ｍｌ添加し、培養を続けた。
２４時間培養後（培養開始から５日後）、細胞の増殖程
度を顕微鏡下で観察した。その結果、図５に示す如く、
ＨＧＦ添加培養液で培養した正常ケラチノサイトは無添
加の場合に比して明らかに増殖が促進されていた。

【００２５】実施例８ヒト正常表皮ケラチノサイトの細胞運動性に対する効果 本発明の上皮細胞増殖促進剤の有効成分であるＨＧＦ
の、ケラチノサイトの細胞運動性に対する促進作用を以
下の方法により確認した。実施例３に記載された無血清
基礎培地にウシ視床下部抽出物１５０ｎｇ蛋白質／ｍｌ
を加えた培地にヒト正常表皮ケラチノサイトを懸濁し、
１２穴プラスチックプレートに２×１０^４個／ウェルに
なるように蒔いた。１０％ＣＯ_２、２５％Ｏ_２、６５％
Ｎ_２の条件下３７℃で培養した。２日間培養後、ウシ視
床下部抽出物を添加しない無血清基礎培地に交換し、さ
らに２４時間培養後ＨＧＦを０から１０ｎｇ／ｍｌの範
囲で段階的に添加し、培養を続けた。２４時間後（培養
開始から４日後）培養を終了し、細胞の状態を顕微鏡下
で観察した。その結果、図６に示す如く、ＨＧＦ添加培
養液で培養したヒト正常表皮ケラチノサイトは無添加の
ものに比べて細胞同士の接着が弱まり、細胞の運動性が
高まっていることが確認された。

【００２６】実験例ヒト正常表皮ケラチノサイトの細胞運動性に対するＥＧ
Ｆ、ＴＧＦ−αの効果 本発明の上皮細胞増殖促進剤の有効成分であるＨＧＦと
同様に上皮の細胞を増殖するＥＧＦ、ＴＧＦ−αのケラ
チノサイトの細胞運動性に対する促進作用を、実施例８
と同様の方法により確認した。実施例３に記載された無
血清基礎培地にウシ視沫下部抽出物１５０μｇ蛋白質／
ｍｌを加えた培地にヒト正常表皮ケラチノサイトを懸濁
し、１２穴プラスチックプレートに２×１０^４個／ウェ
ルになるように蒔いた。１０％ＣＯ_２、２５％Ｏ_２、６
５％Ｎ_２の条件下３７℃で培養した。２日間培養後、ウ
シ視床下部抽出物を添加しない無血清基礎培地に交換
し、さらに２４時間培養後ＥＧＦまたはＴＧＦ−αを１
０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、培養を続けた。２４時間
後（培養開始から４日後）培養を終了し、細胞の状態を
顕微鏡下で観察した。その結果、図７に示す如く、ＥＧ
Ｆ、ＴＧＦ−α添加培養液で培養したヒト正常表皮ケラ
チノサイトは図６のＨＧＦ添加培養の場合に比べて細胞
同士の接着に変化がなく、細胞の運動性を促進する効果
がないことが確認された。

【００２７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２１８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：７２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト正常表皮メラノサイトの増殖に対するＨＧ
Ｆの促進効果を示す図。●は各ＨＧＦ濃度における培養
終了時の細胞数（実施例３）。

【図２】ヒト正常表皮メラノサイトの増殖に対するＨＧ
Ｆの促進効果を示す図。●は各ＨＧＦ濃度における培養
終了時の蛋白質量あたりのＤＮＡ合成量（実施例４）。

【図３】ヒト正常表皮ケラチノサイトの増殖に対するＨ
ＧＦの促進効果を示す図。●は各ＨＧＦ濃度における培
養終了時の細胞数（実施例５）。

【図４】ヒト正常表皮ケラチノサイトの増殖に対するＨ
ＧＦの促進効果を示す図。●は各ＨＧＦ濃度における培
養終了時の蛋白質量当たりのＤＮＡ合成量（実施例
６）。

【図５】ヒト正常表皮ケラチノサイトの増殖に対するＨ
ＧＦの促進効果を示す顕微鏡観察写真。（ａ）はＨＧＦ
無添加培養、（ｂ）はＨＧＦ２．５ｎｇ／ｍｌ添加培養
（実施例７）。

【図６】ヒト正常表皮ケラチノサイトの運動性に対する
ＨＧＦの促進効果を示す顕微鏡観察写真。（ａ）はＨＧ
Ｆ無添加培養、（ｂ）はＨＧＦ１ｎｇ／ｍｌ添加培養、
（ｃ）はＨＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ添加培養（実施例８）。

【図７】ヒト正常表皮ケラチノサイトの運動性に対する
ＥＧＦ、ＴＧＦ−αの促進効果を示す顕微鏡観察写真。
（ａ）はＥＧＦ、（ｂ）はＴＧＦ−αをそれぞれ１０ｎ
ｇ／ｍｌ添加培養したもの（実験例）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(1)又は(2)に記載の組換え肝実質
   細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成分とする、ヒト又は哺
   乳動物用上皮細胞増殖促進剤； (1)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＨＧ
   Ｆ、 (2)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、その
   一部が欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列が挿入さ
   れたアミノ酸配列からなり、かつ肝実質細胞増殖活性を
   有するＨＧＦ 。
2. 【請求項２】 上皮細胞が皮膚表皮細胞である、請求項
   １記載の上皮細胞増殖促進剤。
3. 【請求項３】 以下の(1)又は(2)に記載の組換えＨＧＦ
   を有効成分とする、創傷治療又は皮膚潰瘍治療剤； (1)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＨＧ
   Ｆ、 (2)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、その
   一部が欠失、置換及び／又は他のアミノ酸配列が挿入さ
   れたアミノ酸配列からなり、かつ肝実質細胞増殖活性を
   有するＨＧＦ 。