JP7446255B2 - 遠心ろ過カートリッジ及び微生物検査方法 - Google Patents

Description

本開示は、遠心ろ過カートリッジ及び微生物検査方法に関する。

製造施設の清浄度を保証するため、又は、製造に用いる水（例えば製薬用水等）若しくは製品自体の無菌性を保証するために、微生物検査や無菌試験が行われる。一般に、微生物検査や無菌検査の方法として、細菌の培養を利用したメンブレンフィルタ法（ＭＦ法）が採用されている。ＭＦ法は、採取した試料をメンブレンフィルタでろ過した後、メンブレンフィルタを寒天培地に載せて、恒温機中にて最大１４日間培養し、生育した細菌のコロニー数を目視で計数する方法である。しかしながら、増殖の速い細菌であってもコロニーの目視検出に至るまでに少なくとも数日の期間を要する。さらに、従来の培地ではコロニー形成能が低いため、培養のみでは検出及び定量が困難な細菌が存在することが、近年の微生物研究の進展により明らかとなってきている。これらの課題を解決する手段として、培養を利用した従来のＭＦ法とは異なる、様々な測定原理を利用した迅速微生物検査技術に期待が寄せられている。

迅速微生物検査法は、直接的検出法と間接的検出法とに大別される。前者には固相サイトメトリー、フローサイトメトリーなどがあり、後者には免疫学的方法、核酸増幅法、生物発光、蛍光（染色）法などがある。例えば、細菌内に含まれるアデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ））を利用したＡＴＰ生物発光法（以下、ＡＴＰ法という）が存在する。この方法は、細菌内に含まれるＡＴＰを抽出し、酵素であるルシフェラーゼと反応させることで生物発光を起こし、その発光量を計測することで菌量を推定する方法である。ＡＴＰ法では、細菌１個あたりに含まれるＡＴＰ分子の存在を数万個相当のフォトンとして検出できるため、細菌１個レベルで高感度に検出することが可能であり、迅速微生物検査法として期待されている。

無菌検査の迅速化に要求される性能において優先させるべき性能は、細菌の検出感度であるが、一方で、検出感度の向上に伴って偽陽性の確率も上昇する。ＡＴＰ法において、検体内に存在する極微量（数個レベル）の細菌を高感度、高精度で検出するためには、発光計測装置の性能が高感度であると同時に、周辺環境中に存在するＡＴＰや細菌のコンタミネーションを抑制しなければならない。

特許文献１には、細菌由来のＡＴＰを高感度に発光検出するために、周辺環境からの試料汚染を軽減するフィルタリング部材及びフィルタリング方法が記載されている。

特開２０１７－２２５４４８号公報

一般に、微生物検査や無菌検査において、検査を行うための計測装置が用いられ、検査試料からターゲット物質（例えば細菌由来のＡＴＰ等）を抽出した後、ターゲット物質を含む水溶液を計測装置専用の計測容器に移し替えることが必要である。しかし、この移し替えの作業の途中で、ターゲット物質を含む水溶液が計測容器の外へ紛失したり、計測の阻害を引き起こす物質（例えば周辺環境に存在する細菌やＡＴＰ等）が混入したりする可能性がある。ターゲット物質の紛失や、計測を阻害する物質の混入は、検査の偽陽性及び偽陰性を発生させる原因となる。

例えば、ＡＴＰ法を用いた微生物検査において、検査試料をフィルタでろ過し、フィルタに捕捉した細菌からＡＴＰを抽出した後、細菌由来のＡＴＰを含む水溶液を計測装置専用の計測チューブへ移し替えなければいけない。この際に、水溶液が計測チューブの外へ漏れ出したり、周辺環境から阻害物質（例えば環境由来のＡＴＰ等）が混入したりすると、偽陽性及び偽陰性の原因となる。

特に、周辺環境からのコンタミネーションを厳密に防止しなければならない無菌検査において、検査試料の密閉性を担保するために、検査試料のろ過及び移動は遠心機を用いることが多い。しかし、遠心力による送液は、その他の送液方法（例えば吸引ポンプによる吸引ろ過等）と比べて、送液方向が正確には定まらず、検査試料が想定外の不要な部分に接触したりすることがある。ＡＴＰ法においても、遠心ろ過によって検体を送液し、計測チューブへ移動させる際に、ろ過フィルタと計測チューブ以外の部分に水溶液が接触し、周辺環境からのＡＴＰがコンタミネーションしてしまうことがある。周辺環境からのＡＴＰの混入は、偽陽性の原因となる。

また、ＡＴＰ法による無菌検査では、極微量の細菌を検出するために、検査試料をフィルタでろ過した後、少量の抽出液（例えば数十μＬ等）でＡＴＰを抽出することがある。これは、細菌から抽出したＡＴＰをできるだけ高濃度に濃縮して、発光計測を行うためである。しかし、抽出液の量が少なくなるほど、検査試料をフィルタから計測チューブへ遠心ろ過で送液する際に、検査試料を損失することなく正確に移し替えることが難しくなる。例えば、フィルタ底面及びろ液の排出部から計測チューブまでの流路の凹凸に検査試料が残存したりする。検査試料の損失は、偽陰性の原因となる。

そこで、本開示は、微生物検査の偽陽性及び偽陰性を低減する技術を提供する。

上記課題を解決するために、本開示の遠心ろ過カートリッジは、微生物を捕捉するフィルタと、前記フィルタを通過した液体を排出するノズルと、を有するフィルタカップと、前記フィルタカップと接続可能に構成され、前記ノズルから排出された前記液体を収容可能な計測容器を内部に格納する汚染防止ボックスと、を備え、前記汚染防止ボックスは、前記フィルタカップと前記計測容器の開口面との間に配置される隔壁を有し、前記隔壁は、前記ノズルが通過可能な開口を有し、前記ノズルは、前記汚染防止ボックスが前記フィルタカップと接続された際に、前記ノズルの先端が前記開口の下端よりも下に位置し、かつ前記計測容器の内部に侵入する長さを有することを特徴とする。

本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。

本開示の技術によれば、微生物検査の偽陽性及び偽陰性を低減することができる。上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。

第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第１の状態の外観を示す六面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第１の状態の外観を示す斜視図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第１の状態の透光性素材からなる部分を示す参考図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第１の状態のＩ－Ｉ断面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの汚染防止ボックスの外観を示す六面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの汚染防止ボックスの外観を示す斜視図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの汚染防止ボックスの透光性素材からなる部分を示す参考図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの汚染防止ボックスのＶ－Ｖ断面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第２の状態の外観を示す六面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第２の状態の外観を示す斜視図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第２の状態の透光性素材からなる部分を示す参考図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの第２の状態のＩＸ－ＩＸ断面図である。 第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジを用いた無菌検査方法のフローチャートである。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０１における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０２における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０３における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０４における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０５における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０６における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０７における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０８における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第１の実施形態に係る無菌検査方法のステップＳ１０９における遠心ろ過カートリッジの状態を示す概略断面図である。 第２の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジを示す概略断面図である。 第３の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジを示す概略断面図である。

［第１の実施形態］
＜遠心ろ過カートリッジの第１の状態の構成例＞
図１は、第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ１００の第１の状態の外観を示す六面図である。図１（ａ）は正面図であり、図１（ｂ）は背面図であり、図１（ｃ）は右側面図であり、図１（ｄ）は左側面図であり、図１（ｅ）は上面図であり、図１（ｆ）は底面図である。図１に示すように、第１の状態の遠心ろ過カートリッジ１００は、蓋付きホルダ２及び廃液容器１２を備える。蓋付きホルダ２には開閉可能な蓋１が設けられている。詳細は後述するが、蓋付きホルダ２と廃液容器１２とは着脱可能に構成されている。

図２は、第１の状態における遠心ろ過カートリッジ１００の斜視図である。図２に示すように、蓋付きホルダ２及び廃液容器１２は、略円筒形である。廃液容器１２の外径は、蓋付きホルダ２の外径よりも小さい。

図３は、第１の状態における遠心ろ過カートリッジ１００の透光性素材からなる部分を示す参考図である。図３のハッチングで示す部分、すなわち、蓋１、蓋付きホルダ２及び廃液容器１２は、光を透過する材料（樹脂やガラス）で構成することができる。

図４は、第１の状態における遠心ろ過カートリッジ１００のＩ－Ｉ断面図である。図４に示すように、蓋付きホルダ２は、内部にフィルタカップ３を有する。フィルタカップ３は略筒状である。フィルタカップ３には、検査試料（溶液）が導入される。フィルタカップ３の上端は、蓋付きホルダ２の上端と同じ高さである。フィルタカップ３は、内底部に配置されたフィルタ４を有する。フィルタカップ３の下端部には、ノズル５が設けられており、フィルタ４を通過した液体は、ノズル５から排出される。ノズル５を設ける代わりに、単にフィルタカップ３に開口を設けることによっても、フィルタ４により検査試料をろ過したろ液をフィルタカップ３から排出することができる。

フィルタ４は、フィルタカップ３に導入された検査試料をろ過し、検査対象の微生物（細菌、真菌、古細菌などの菌）を捕捉可能なものであればよく、例えばメンブレンフィルタを用いることができる。フィルタ４の材質としては、例えばセルロース混合エステル、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ポリカーボネートなどが挙げられる。

フィルタ４の孔径は、検査対象の微生物のサイズや、微生物検査の諸条件に応じて適宜選択することができ、例えば０．２０μｍ以上とすることができる。具体的には、フィルタ４として、孔径が０．２２μｍや０．４５μｍ等のメンブレンフィルタが挙げられる。

フィルタカップ３に検査試料を導入し、蓋１を密閉し、蓋付きホルダ２と廃液容器１２とを接続した状態で遠心ろ過カートリッジ１００を遠心機にセットし、遠心分離を行うことで、フィルタカップ３に添加された検査試料は、フィルタ４を通過してろ過され、ろ液（廃液）が廃液容器１２に回収される。

蓋付きホルダ２は、外径が異なる二つの部分を有し、蓋付きホルダ２の上部の外径が下部の外径より小さく、蓋１の外径と蓋付きホルダ２の上部の外径とが略等しくなる。蓋付きホルダ２の下部の内径は、廃液容器１２の外径に略等しい。蓋付きホルダ２及び廃液容器１２にはねじ溝が設けられており、廃液容器１２が蓋付きホルダ２に螺嵌（接続）されている。なお、蓋付きホルダ２及び廃液容器１２の接続方式は、スクリュー方式に限定されず、遠心機による遠心分離に耐えうる固定強度が得られればよい。例えば、蓋付きホルダ２及び廃液容器１２は、単に嵌合により接続可能に構成されていてもよい。

図４に示す例では、蓋１は、スクリュー方式で蓋付きホルダ２の上部に対し着脱可能に構成されている。ただし、蓋１は、ヒンジ機構であってもよい。

＜汚染防止ボックスの構成例＞
図５は、遠心ろ過カートリッジ１００の汚染防止ボックス９の外観を示す六面図である。図５（ａ）は正面図であり、図５（ｂ）は背面図であり、図５（ｃ）は右側面図であり、図５（ｄ）は左側面図であり、図５（ｅ）は上面図であり、図５（ｆ）は底面図である。図５に示すように、汚染防止ボックス９は、上枠７及び下枠８を備える。上枠７の上部にはねじ溝が設けられており、当該ねじ溝により、上枠７は蓋付きホルダ２と螺嵌（接続）可能である。なお、蓋付きホルダ２及び汚染防止ボックス９の接続方式は、スクリュー方式に限定されず、遠心機による遠心分離に耐えうる固定強度が得られればよい。例えば、蓋付きホルダ２及び汚染防止ボックス９は、単に嵌合により接続可能に構成されていてもよい。

図６は、汚染防止ボックス９の斜視図である。図６に示すように、汚染防止ボックス９は、略円筒形である。

図７は、汚染防止ボックス９の透光性素材からなる部分を示す参考図である。図７のハッチングで示す部分、すなわち、汚染防止ボックス９の上枠７及び下枠８は、光を透過する材料（樹脂やガラス）で構成することができる。

図８は、汚染防止ボックス９のＶ－Ｖ断面図である。図８に示すように、上枠７及び下枠８は螺合されており、分離可能に構成されている。上枠７の内部空間の上部には、後述するように、蓋付きホルダ２のフィルタカップ３を格納可能な空間が設けられている。汚染防止ボックス９の内部には、計測チューブ１０（計測容器）が設けられている。計測チューブ１０の長さは、下枠８の長さよりも長く、下枠８から上枠７を取り外すと、下枠８の開口面から計測チューブ１０が突出する。

上枠７の内部には、開口を有する隔壁６が設けられている。隔壁６は、フィルタカップ３を格納可能な空間と、計測チューブ１０が格納される空間とを隔てる。隔壁６の開口の断面積は、計測チューブ１０の開口の断面積よりも小さい。隔壁６の開口の断面積はノズル５の断面積よりも大きく、隔壁６の開口にノズル５が通過可能である。

＜遠心ろ過カートリッジの第２の状態の構成例＞
図９は、第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ１００の第２の状態の外観を示す六面図である。図９（ａ）は正面図であり、図９（ｂ）は背面図であり、図９（ｃ）は右側面図であり、図９（ｄ）は左側面図であり、図９（ｅ）は上面図であり、図９（ｆ）は底面図である。図９に示すように、第２の状態の遠心ろ過カートリッジ１００は、蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９が接続された状態である。

図１０は、第２の状態における遠心ろ過カートリッジ１００の斜視図である。図１０に示すように、蓋付きホルダ２及び汚染防止ボックス９は、略円筒形である。汚染防止ボックス９の外径は、蓋付きホルダ２の外径よりも小さい。

図１１は、第２の状態における遠心ろ過カートリッジ１００の透光性素材からなる部分を示す参考図である。図１１のハッチングで示す部分、すなわち、蓋１、蓋付きホルダ２及び汚染防止ボックス９は、光を透過する材料（樹脂やガラス）で構成することができる。

図１２は、第２の状態における遠心ろ過カートリッジ１００のＩＸ－ＩＸ断面図である。図１２に示すように、蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９を接続すると、ノズル５が隔壁６の開口を通り、計測チューブ１０の内部へ侵入する。これにより、遠心ろ過の際にフィルタ４及びノズル５を通過した溶液は、遠心ろ過カートリッジ１００の計測チューブ１０の内部以外に接触しない。したがって、計測チューブ１０に導入される液体の汚染を防止することができる。また、計測チューブ１０が汚染防止ボックス９により覆われていることにより、計測チューブ１０が周辺環境に曝露されず、空気中に浮遊している細菌や作業者の飛沫等の付着を防止することができる。ノズル５及び隔壁６は、蓋付きホルダ２と汚染防止ボックス９とを接続した際に、ノズル５と隔壁６とが接触しないように設計されており、これにより、フィルタ４を通過した溶液が隔壁６に接触することを防止することができる。

ノズル５は、略円筒状とすることができるが、略角筒状であってもよい。ノズル５の先端の太さ（断面が円形である場合は直径、断面が多角形である場合は対角線の最大の長さ）は、例えば５ｍｍ以下とすることができ、場合に応じて３ｍｍ以下とすることができる。これにより、遠心ろ過カートリッジ１００を用いて遠心ろ過する際に、溶液がノズル５に残存することを防止することができる。

ノズル５の先端面を含む面が隔壁６の下面よりも例えば１ｍｍ以上、場合に応じて３ｍｍ以上離れるように、ノズル５を設計することができる。これにより、遠心ろ過の際に、溶液が汚染防止ボックス９及び隔壁６に接触することを防止することができる。また、ノズル５の先端面を含む面が計測チューブ１０の開口面よりも例えば１ｍｍ以上、場合に応じて５ｍｍ以上離れるように、ノズル５を設計することができる。これにより、遠心ろ過の際に、溶液が計測チューブ１０の外に漏れ出すことを防止することができる。

＜遠心ろ過カートリッジの包装＞
遠心ろ過カートリッジ１００は、蓋付きホルダ２、汚染防止ボックス９及び廃液容器１２を含む検査キットとして、流通させることができる。検査キットにおいて、蓋付きホルダ２と廃液容器１２とが接続された第１の状態の遠心ろ過カートリッジ１００と、汚染防止ボックス９単体とが、それぞれ密封包装された状態とすることができる。検査キットをこのように構成することにより、後述する使用時に、廃液容器１２と汚染防止ボックス９との付け替えが一度で済むため、操作が簡単となり、外部からの汚染を防止することもできる。蓋付きホルダ２、汚染防止ボックス９及び廃液容器１２は、ガンマ線滅菌、ＥＯＧ滅菌、オートクレーブなどの滅菌工程を経て包装することができる。遠心ろ過カートリッジ１００は、使い捨てとすることができる。

＜遠心ろ過カートリッジ１００を用いた無菌検査方法＞
遠心ろ過カートリッジ１００の使用形態の一例として、ＡＴＰ法を用いた製薬用水（検査試料）の無菌検査方法について説明する。本方法において、高感度ＡＴＰ検査キット（Ｌｕｍｉｏｎｅ（登録商標）微生物迅速検査用試薬キット（日立ハイテクソリューションズ社製））と、高感度のＡＴＰ計測装置（Ｌｕｍｉｏｎｅ ＢＬ－２０００（日立ハイテクソリューションズ社製））とを用いることとする。高感度ＡＴＰ検査キットは、ＡＴＰ活性消去液、洗浄液、発光液、抽出液、ポジティブコントロール（ＡＴＰ １００ａｍｏｌ／５０μＬ抽出液）、測定チューブとその専用ラックを含む。

以下説明する作業は、１ＣＦＵ／ｍ^３未満で管理されているグレードＡ、又は、１０ＣＦＵ／ｍ^３以下で管理されているグレードＢのクリーンルームで行われる。

図１３は、遠心ろ過カートリッジ１００を用いた製薬用水の無菌検査方法を示すフローチャートである。図１４Ａ～図１４Ｉは、各ステップにおける遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。なお、図１４Ａ～図１４Ｉは、図示の簡略化のため、各部材が図４、図８及び図１２とは異なる縮尺、形状、大きさで示されている。

（ステップＳ１０１：初期状態）
作業者は、遠心ろ過カートリッジ１００、高感度ＡＴＰ検査キット及びＡＴＰ計測装置を準備し、遠心ろ過カートリッジ１００及びピペット等の全ての備品を事前に滅菌処理（例えば放射線滅菌、ガス滅菌、高圧蒸気滅菌等）しておく。作業者は、準備が完了したら、無菌検査の作業を開始する。

図１４Ａは、ステップＳ１０１における初期状態（第１の状態）の遠心ろ過カートリッジ１００を示す概略断面図である。フィルタ４及びフィルタカップ３は蓋付きホルダ２に格納されており、蓋付きホルダ２の下部には廃液容器１２が接続されている。蓋付きホルダ２の蓋１は密閉されている。

（ステップＳ１０２：製薬用水の分注）
作業者は、蓋付きホルダ２の蓋１を開けて、製薬用水（検査試料）を含む容器から、ピペット操作により、製薬用水をフィルタカップ３に分注する。その後、作業者は、蓋１を閉じる。遠心ろ過をスムーズに行うために、製薬用水の容量は、例えば１００ミリリットル以下、場合に応じて１０ミリリットル以下に設定することができる。

図１４Ｂは、ステップＳ１０２における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。製薬用水１３が汚染されている場合は、製薬用水１３の中には細菌１４がいる。本実施形態では説明を明確にするため、細菌１４が存在する場合を図示している。

（ステップＳ１０３：製薬用水の遠心ろ過）
作業者は、遠心ろ過カートリッジ１００を遠心機にセットし、遠心機を駆動して製薬用水１３を遠心ろ過する。

図１４Ｃは、ステップＳ１０３における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。製薬用水１３に含まれている細菌１４はフィルタ４上に捕捉され、製薬用水１３のろ液は廃液容器１２に廃液１５として排出される。

（ステップＳ１０４：ＡＴＰ活性消去液の分注）
作業者は、蓋１を開け、高感度ＡＴＰ検査キットに含まれるＡＴＰ活性消去液をフィルタカップ３のフィルタ４上に分注し、蓋１を閉じる。ＡＴＰ活性消去液をフィルタ４上に分注することにより、フィルタカップ３及びフィルタ４に残存する、検査試料中に含まれていた不要なＡＴＰを消去することができる。ＡＴＰ活性消去液の容量は、ステップＳ１０２で分注した製薬用水１３の容量よりも多くすることができる。ＡＴＰ活性消去液の分注後、例えば３７℃で４０分以上インキュベートすることにより、消去反応を亢進することができる。

図１４Ｄは、ステップＳ１０４における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。ＡＴＰ活性消去液１６を分注しても、フィルタ４上に捕捉されている細菌１４の内部のＡＴＰは、細胞膜や細胞壁に覆われているため、ＡＴＰ活性消去液１６では消去されない。このように、ＡＴＰ活性消去液１６は、細菌由来以外のＡＴＰを消去することが可能である。

（ステップＳ１０５：ＡＴＰ活性消去液の遠心ろ過）
作業者は、遠心ろ過カートリッジ１００を遠心機にセットし、遠心機を駆動してＡＴＰ活性消去液１６を遠心ろ過する。

図１４Ｅは、ステップＳ１０５における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。ＡＴＰ活性消去液１６は、廃液１５としてフィルタ下部の廃液容器１２に排出される。

（ステップＳ１０６：容器の入れ替え）
作業者は、廃液容器１２を蓋付きホルダ２から外し、計測チューブ１０が格納された状態の汚染防止ボックス９を蓋付きホルダ２に取り付ける。

図１４Ｆは、ステップＳ１０６における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。蓋付きホルダ２から廃液容器１２を取り外し、計測チューブ１０が格納された状態の汚染防止ボックス９を、蓋付きホルダ２にセットする。フィルタ４の下方に設けられているノズル５の先端は、隔壁６の開口を貫通し、計測チューブ１０の内部に侵入する。

（ステップＳ１０７：抽出液の分注）
作業者は、蓋１を開け、高感度ＡＴＰ検査キットに含まれる抽出液をフィルタカップ３のフィルタ４上に分注し、蓋１を閉じる。抽出液の容量は、例えば５００μＬ以下、場合に応じて５０μＬ以下に設定することができる。抽出液は、フィルタ４上に捕捉されている細菌１４の細胞膜及び細胞壁を溶解し、細菌１４内部のＡＴＰを抽出液中に放出させる。抽出液の分注後、例えば１分間以上静置することにより、ＡＴＰ抽出を十分に行うことができる。

図１４Ｇは、ステップＳ１０７における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。抽出液１７を分注すると、細菌１４の細胞膜及び細胞壁が破壊され、細菌１４内部のＡＴＰが抽出液１７に溶解する。

（ステップＳ１０８：抽出液の遠心ろ過）
作業者は、遠心ろ過カートリッジ１００を遠心機にセットし、遠心機を駆動して、細菌１４由来のＡＴＰが溶解した抽出液１７を遠心ろ過する。

図１４Ｈは、ステップＳ１０８における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。細菌１４由来のＡＴＰを含む抽出液１７は、フィルタ４及びノズル５を通過し、計測チューブ１０へ送液される。計測チューブ１０に回収されるろ液は、検体１１として後述の発光計測に用いられる。ノズル５の先端は計測チューブ１０の内部に侵入しているため、検体１１となるろ液が計測チューブ１０の外部に漏れ出すことはない。また、計測チューブ１０は最低限の開口部を除いて、周囲を汚染防止ボックス９に覆われていることで、計測チューブ１０が暴露している従来よりも、作業中の汚染リスクを軽減することができる。

（ステップＳ１０９：計測チューブの取り出し・発光計測）
作業者は、汚染防止ボックス９の下枠８を上枠７から取り外し、計測チューブ１０を下枠８から取り出す。計測チューブ１０の取り出しは、安全キャビネット内部等のクリーンな環境で行うことができる。作業者は、計測チューブ１０を取り出した後、計測チューブ１０をＡＴＰ計測装置にセットして、ＡＴＰ計測装置により細菌由来のＡＴＰ生物発光量を計測する。発光量が事前に採用している閾値を超えた場合、規定以上の細菌が検査試料（製薬用水）の中に存在したことを表す。

図１４Ｉは、ステップＳ１０９における遠心ろ過カートリッジ１００の状態を示す概略断面図である。図１４Ｉは、汚染防止ボックス９の下枠８を上枠７から取り外した状態を示しており、計測チューブ１０の上部が下枠８から突出していることにより、作業者が計測チューブ１０を把持しやすくなっている。計測チューブ１０の下枠８からの突出量は、例えば、作業者が計測チューブ１０を把持した際に指が計測チューブ１０の開口に接触しないような長さとすることができる。具体的には、計測チューブ１０の下枠８からの突出量は、例えば２ｃｍ以上とすることができる。

＜検査試料の種類について＞
以上、検査試料が製薬用水である場合の無菌検査方法を説明したが、本開示の遠心ろ過カートリッジ１００は、製薬用水の遠心ろ過以外にも適用することができる。例えば、飲料製品又は医薬品（例えば内服薬、外用薬、注射剤、細胞治療薬、遺伝子治療薬等）を検査試料とすることができる。したがって、遠心ろ過カートリッジ１００は、飲料製品の工程内検査や出荷前検査、医薬品の工程内検査若しくは出荷前検査などに用いることができる。

＜第１の実施形態のまとめ＞
以上のように、第１の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ１００は、微生物を捕捉するフィルタ４と、フィルタ４を通過した液体を排出するノズル５と、を有するフィルタカップ３と、フィルタカップ３と接続可能に構成され、ノズル５から排出された液体を収容可能な計測チューブ１０を内部に格納する汚染防止ボックス９と、を備える。汚染防止ボックス９は、フィルタカップ３と計測チューブ１０の開口面との間に配置される隔壁６を有し、隔壁６は、ノズル５が通過可能な開口を有し、ノズル５は、汚染防止ボックス９がフィルタカップと接続された際に、ノズル５の先端が開口の下端よりも下に位置し、かつ計測チューブ１０の内部に侵入する長さを有する。

このように、計測チューブ１０が汚染防止ボックス９に格納されており、計測チューブ１０の開口面とフィルタカップ３との間に隔壁６が存在するため、周辺環境からの計測チューブ１０の汚染を軽減することができる。また、ノズル５の先端が計測チューブ１０の内部に侵入している（開口面よりも下に位置する）ため、フィルタ４を通過する液体（ターゲット物質を含みうる検体）を、フィルタ４、ノズル５及び計測チューブ１０以外に接触することなく、遠心ろ過によって正確に全量を計測チューブ１０に移動させることが可能になる。結果として、微生物検査の偽陽性及び偽陰性を低減することができる。

［第２の実施形態］
上述の第１の実施形態においては、一度に１つの検査試料を検査可能な遠心ろ過カートリッジについて説明した。しかしながら、検査によっては、同一の検査試料を複数に分割し、複数回検査することが望まれる。例えば、一度の検査では偽陽性・偽陰性を判断することは難しいため、複数回測定を行い、所定の回数以上陽性となった場合に、検査結果として陽性と判断することが考えられる。そこで、第２の実施形態では、１つの検査試料から複数個の計測チューブに検体を取得可能な遠心ろ過カートリッジを提案する。

＜遠心ろ過カートリッジの構成例＞
図１５は、第２の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ２００を示す概略断面図である。図１５においては、蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９が接続された状態が示されている。遠心ろ過カートリッジ２００は、主に、フィルタカップ３が２つのノズル５を有し、汚染防止ボックス９が２つの計測チューブ１０を格納している点で、第１の実施形態の遠心ろ過カートリッジ１００と異なっている。２つの計測チューブ１０を格納する空間は互いに分離されている。隔壁６には、２つのノズル５と対応する位置のそれぞれに開口が設けられている。隔壁６の開口のそれぞれは、ノズル５の断面積よりも大きく、計測チューブ１０の開口部の面積よりも小さい。ノズル５の数、隔壁６の開口の数及び計測チューブ１０の数は２つに限定されず、３つ以上であってもよい。

本実施形態においては、蓋１はヒンジ機構で開閉可能に構成されているが、第１の実施形態と同様にスクリュー方式であってもよい。

図示は省略しているが、蓋付きホルダ２に接続される廃液容器１２は、２つの空間に分離されている必要はないが、２つの空間に分離されていてもよい。

＜遠心ろ過カートリッジを用いた無菌検査方法＞
本実施形態の無菌検査方法は、第１の実施形態と同様とすることができるため、説明を省略する。ただし、本実施形態によれば、上述のステップＳ１０８において、２つの計測チューブ１０に検体が回収されるため、２つの検体について同時にＡＴＰ発光計測を実施することができる。

＜第２の実施形態のまとめ＞
以上のように、第２の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジの汚染防止ボックスは、異なる空間に格納された複数の計測チューブを備える。これにより、１つの検査試料から複数の検体を取得することができるため、検査結果の正確性を向上できる。

［第３の実施形態］
第１の実施形態では、計測チューブ１０が周辺環境から汚染されるのを軽減するため、計測チューブ１０を汚染防止ボックス９に格納する遠心ろ過カートリッジ１００について説明した。第１の実施形態の構造でも阻害物質の混入を十分に軽減できるが、第３の実施形態では、さらに徹底した密閉性を実現可能な遠心ろ過カートリッジを提案する。

＜遠心ろ過カートリッジの構成例＞
図１６は、第３の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ３００を示す概略断面図である。図１６においては、蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９を接続する直前の状態が示されている。遠心ろ過カートリッジ３００は、汚染防止ボックス９の隔壁６の開口に密閉シール１９が設けられ、密閉シール１９を貫通するためにノズル１８の先端が針状に加工されている点で、第１の実施形態の遠心ろ過カートリッジ１００と異なっている。

密閉シール１９としては、例えばゴム状のセプタム又はアルミ箔のフィルム等を用いることができる。作業者は、蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９を接続する際に、ノズル１８を密閉シール１９に突き刺して、計測チューブ１０に侵入させる。

蓋付きホルダ２に汚染防止ボックス９を接続した状態において、ノズル１８の先端を含む面が隔壁６の下面よりも例えば１ｍｍ以上、場合に応じて３ｍｍ以上離れるように、ノズル１８を設計することができる。これにより、遠心ろ過の際に、溶液が汚染防止ボックス９及び隔壁６に接触することを防止することができる。また、ノズル１８の先端を含む面が計測チューブ１０の開口面よりも例えば１ｍｍ以上、場合に応じて５ｍｍ以上離れるように、ノズル１８を設計することができる。これにより、遠心ろ過の際に、溶液が計測チューブ１０の外に漏れ出すことを防止することができる。

＜遠心ろ過カートリッジを用いた無菌検査方法＞
本実施形態の無菌検査方法は、第１の実施形態と同様とすることができるため、説明を省略する。

＜第３の実施形態のまとめ＞
以上のように、第３の実施形態に係る遠心ろ過カートリッジ３００の汚染防止ボックス９は、隔壁６の開口に密閉シール１９が設けられている。これにより、汚染防止ボックス９を蓋付きホルダ２に接続されるまでは、計測チューブ１０の密閉性及び無菌性が維持されるため、計測チューブ１０の汚染をより確実に防止することが可能になる。

［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。

１…蓋、２…蓋付きホルダ、３…フィルタカップ、４…フィルタ、５…ノズル、６…隔壁、７…上枠（第１のボックス）、８…下枠（第２のボックス）、９…汚染防止ボックス、１０…計測チューブ（計測容器）、１１…検体、１２…廃液容器、１３…製薬用水、１４…細菌（微生物）、１５…廃液、１６…ＡＴＰ活性消去液、１７…抽出液、１８…ノズル、１９…密閉シール、１００～３００…遠心ろ過カートリッジ

Claims (13)

1. 微生物を捕捉するフィルタと、前記フィルタを通過した液体を排出するノズルと、を有するフィルタカップと、
   前記フィルタカップと接続可能に構成され、前記ノズルから排出された前記液体を収容可能な計測容器を内部に格納する汚染防止ボックスと、を備え、
   前記汚染防止ボックスは、前記フィルタカップと前記計測容器の開口面との間に配置される隔壁を有し、
   前記隔壁は、前記ノズルが通過可能な開口を有し、
   前記ノズルは、前記汚染防止ボックスが前記フィルタカップと接続された際に、前記ノズルの先端が前記開口の下端よりも下に位置し、かつ前記計測容器の内部に侵入する長さを有することを特徴とする遠心ろ過カートリッジ。
2. 前記開口の断面積は、前記ノズルの断面積よりも大きく、前記計測容器の開口面の断面積よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
3. 前記汚染防止ボックスは、前記計測容器の開口面側の第１のボックスと、前記計測容器の底側の第２のボックスとを備え、
   前記第１のボックスと前記第２のボックスとが、分離可能なように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
4. 前記汚染防止ボックスは、複数の前記計測容器を格納し、
   前記隔壁は、前記複数の前記計測容器のそれぞれの上部に設けられた複数の前記開口を有し、
   前記フィルタカップは、前記複数の前記計測容器と同数の複数の前記ノズルを有することを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
5. 前記開口には、前記開口を密閉するシールが設けられており、
   前記ノズルの先端が針状であることを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
6. 前記ノズルの太さは５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
7. 前記汚染防止ボックスが前記フィルタカップと接続された状態において、前記ノズルの先端を含む面が、前記隔壁の下面から１ｍｍ以上下方に位置することを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
8. 前記汚染防止ボックスが前記フィルタカップと接続された状態において、前記ノズルの先端を含む面が、前記計測容器の開口面から１ｍｍ以上下方に位置することを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
9. 前記汚染防止ボックスが前記フィルタカップと接続された状態において、前記ノズルの側面と前記開口との間に隙間があることを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
10. 前記フィルタカップを保持し、前記フィルタカップの上方を覆う蓋を有し、前記汚染防止ボックスと接続可能に構成されたホルダをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
11. 前記第１のボックスと前記第２のボックスとを分離した際に、前記計測容器が前記第２のボックスから突出することを特徴とする請求項３に記載の遠心ろ過カートリッジ。
12. 前記汚染防止ボックスを取り外した状態の前記フィルタカップと接続可能な廃液容器をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジ。
13. 請求項１に記載の遠心ろ過カートリッジを準備することと、
    前記フィルタカップに検査試料を分注することと、
    前記フィルタカップと前記計測容器とを接続することと、
    前記フィルタカップと前記計測容器とが接続された状態の前記遠心ろ過カートリッジを遠心機に設置して、前記フィルタにより遠心ろ過を行うことと、を含む微生物検査方法。

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