JP7369417B2

JP7369417B2 - 細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置

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Publication number: JP7369417B2
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Inventors: 展神崎
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Publication date: 2023-10-26
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Description

本発明は、細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置に関する。

細胞に電気刺激を加える電気刺激負荷培養装置として、例えば特許文献１及び２に記載されているような培養装置が知られている。しかしながら、このような従来の電気刺激用培養装置は、細胞を収容する容器の上部と下部に電極が設けられており、二つの電極が細胞を収容する容器に対して垂直に対向する構成である。このため、各容器内の細胞に電流を与えるための培養基板上における回路の配置が複雑となり、電気刺激用培養装置の製造単価が増大する問題がある。

特開２００３－２２５特開２００６－２９６２８２

本発明が解決すべき課題は、電気刺激に使用される細胞培養用インサートと、かかる細胞培養用インサートを備え、より単純な回路の配置を有する電気刺激用培養装置とを提供することにある。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、細胞培養用インサートの側壁の少なくとも一部に通電部を設けることにより、かかる細胞培養用インサートが挿入されたウェルを挟んで該ウェルの軸に対して略平行に互いに対向する一対の電極で細胞に効率的に電気刺激を与えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の項に記載の主題を包含する。

項１．培養容器のウェルに挿入可能な細胞培養用インサートであって、略環状の側壁（ハイドロゲルからなるものを除く）と、前記側壁に取り付けられて前記細胞培養用インサートの底部を形成する多孔質膜とを備え、前記側壁の少なくとも一部が通電部を備え、前記通電部が、前記側壁の高さ方向における半分の高さよりも前記細胞培養用インサートの底部に近い部分に設けられている細胞培養用インサート。

項２．前記通電部が、前記側壁に互いに離間して設けられた少なくとも二つの貫通孔を有する項１に記載の細胞培養用インサート。

項３．前記少なくとも二つの貫通孔が、細胞培養用インサートの軸に対して１５０°～１８０°の角度をなして互いに対向する二つの貫通孔である項２に記載の細胞培養用インサート。

項４．前記少なくとも二つの貫通孔が同じ高さに設けられている項２又は３に記載の細胞培養用インサート。

項５．前記少なくとも二つの貫通孔が異なる高さに設けられている項２又は３に記載の細胞培養用インサート。

前記多孔質膜に、少なくとも一つの貫通孔が設けられている請求項１に記載の細胞培養用インサート。

前記通電部が、前記側壁に設けられた少なくとも一つの貫通孔を有する請求項６に記載の細胞培養用インサート。

項８．前記通電部が、前記側壁の一部を構成する導電性材料から形成された部分を有する項１に記載の細胞培養用インサート。

項９．前記通電部が、前記側壁の周方向に沿って帯状に形成された１又は複数の部分を有する項８に記載の細胞培養用インサート。

項１０．電気刺激用培養装置であって、基板プレートを備えた培養容器と、前記培養容器内に挿入された項１～９のいずれか一項に記載の細胞培養用インサートと、前記培養容器内に挿入され、前記細胞培養用インサートの側壁と対面し、前記細胞培養用インサートを間に挟んで配置された少なくとも一対の電極と、を備えた電気刺激用培養装置。

本発明によれば、細胞培養用インサートを電気刺激に適した構成とすることができる。また、細胞への電気刺激の効果を奏しつつ、電気刺激用培養装置の回路の構成を簡素化すると共に製造コストを抑えることができる。

本発明の実施形態の細胞培養用インサートと、該細胞培養用インサートが挿入された複数のウェルを備えた培養容器と、電極とを備えた電気刺激用培養装置の略斜視図。本発明の第１実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第２実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第３実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第４実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第５実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第６実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第７実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第８実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。本発明の第９実施形態の細胞培養用インサートの（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図。別の培養容器の例の略斜視図。図１１の培養容器の平面図。図１２の１３－１３線で沿った断面図。図１１の培養容器と、培養容器の基板プレートの対向する側壁に取り付けられた一対の電極とを備えた電気刺激用培養装置の略斜視図。別の培養容器の例の略斜視図。種々の細胞培養用インサートに収容したヒト筋細胞を電気刺激した場合のマイオカイン（CXCL1）の発現量を示すグラフ。インサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激中の筋管細胞を倒立顕微鏡に設置したCCDカメラを用いて動画を撮影し、その収縮能力をImage Jソフトウエアを用いてイメージング解析を行った画像データ。（Ａ）側面にスリット無しのインサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激中の筋管細胞の画像データ（Ｂ）多孔膜を有する底面と側面に１つスリットを有するインサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激中の筋管細胞の画像データ（収縮活動部位が赤く表示される）。（Ｃ）スリット無し（Ａ）および１スリット（Ｂ）で培養したC2C12筋芽細胞におけるMovement Indexを示すグラフ。多孔膜を有する底面と側面に１つスリットを有するインサートで培養したヒト骨格筋芽細胞における電気刺激後の（Ａ）CXCL1遺伝子、（Ｂ）IL6遺伝子、及び（Ｃ）IL8遺伝子の発現量を示すグラフ。（－）EPS無し群、（＋）EPS群。

以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。

本発明の実施形態の細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置を図面に従って説明する。

図１に示すように、電気刺激用培養装置５０は、培養容器１０と、培養容器１０内に挿入された細胞培養用インサート２０と、培養容器１０内に挿入され、細胞培養用インサート２０を間に挟んで配置された少なくとも一対の電極３０とを備えている。電極３０は電極３０に取り付けられた導線３２を介して電圧パルス発生装置３４に接続される。

培養容器１０は、基板プレート１１と、基板プレート１１内に一体的に形成された複数のウェル１４とを備えている。ウェル１４の数は図では４個のウェルが示されているが、使用される特定の目的に応じて、１、４、８、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６個又はその他の数のウェルとすることができる。培養容器１０は、任意の材料から形成することができ、例えば合成樹脂、金属又はガラスから形成され、好ましくは透明な合成樹脂から形成される。透明な合成樹脂としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。

図２（Ａ）に示すように、細胞培養用インサート２０は、略環状（より具体的には略円筒状）の側壁２１と、側壁２１の一端に側壁２１と接続する底壁２２と、底壁２２に取り付けられた多孔質膜２３とを備えている。底壁２２及び多孔質膜２３は細胞培養用インサート２０の底部を形成し、側壁２１の一端は多孔質膜２３により塞がれているが、側壁２１の頂端２４は開放されている。多孔質膜２３は細胞培養面として作用し、細胞は、細胞培養用インサート２０の側壁２１及び多孔質膜２３に区画形成された収容部２５に収容される。側壁２１及び底壁２２は、合成樹脂、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等から形成することができるが、これらに限定されない。多孔質膜２３は、多孔性の不活性フィルム、水化ゲルを含む適当な材料で形成することが出来るが、これらに限定されない。多孔質膜２３の孔径は例えば０．０５～５０μｍであり、好ましくは０．１～１５μｍである。多孔質膜２３の膜厚は例えば１～２００μｍであり、好ましくは１０～１００μｍである。孔密度は例えば１×１０⁴～１×１０⁸、好ましくは１×１０⁵～１×１０⁷である。

本実施形態では、側壁２１は細胞培養用インサート２０の底部に向かうにつれて直線状に先細りする形状となっているが、側壁２１の一端から他端まで側壁２１の直径が変化しない構成としてもよい。側壁２１の頂端２４には、細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して略垂直方向に側壁２１に対し径方向外側に延びるフランジ２６が接続され、フランジ２６は細胞培養用インサート２０をウェル１４に対して支持する把持面を提供する。このため、フランジ２６の最大長さはウェル１４の内径よりも大きい。

また、細胞培養用インサート２０は、側壁２１を貫通して延びる２つの貫通孔２７を備えている。貫通孔２７は通電部として機能する。貫通孔２７は本実施形態ではスリットの形状をしており、互いに離間して設けられており、細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して約１８０°の角度をなして互いに対向している。貫通孔２７の長さは特に限定されないが、例えば０．１μｍ～１ｃｍであり、より好ましくは１μｍ～１ｍｍである。

本実施形態では、２つの貫通孔２７が異なる高さに設けられており、一方の貫通孔２７は側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に設けられているが、別の貫通孔２７は側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の頂部に近い部分に設けられている。これは細胞培養用インサート２０の底部の方が電気刺激が強く高効率であるためである。２つの貫通孔２７が異なる高さに設けられているため、細胞培養用インサート２０内から培養液を漏れないか又は漏れにくい構造とすることができる。

本実施形態において、貫通孔２７の形状は帯状である。より具体的には側壁２１を広げたときに貫通孔２７は直線状である。貫通孔２７の形状は同じであっても異なっていてもよい。側壁２１の周方向に沿って貫通孔２７が帯状に延びるようにすることにより、後述するように細胞培養用インサート２０を間に挟んで配置した一対の電極３０（図４及び５）から電流を流したときに、細胞培養用インサート２０の内部をより多くの電流がより効率的に流れる。また、２つの貫通孔２７を設けることで、電極３０の正極と負極に対応させることができるため、電流がより効率的に流れる。

細胞培養用インサート２０内の細胞を培養する際には、培養容器１０のウェル１４により区画形成された空間１５に培養液が入れられる。培養液は細胞培養用インサート２０の多孔質膜２３を浸透し、ウェル１４内に配置された細胞培養用インサート２０内の細胞は、培養液に浸される。

各ウェル１４内の細胞培養用インサート２０の外側には、一対の電極３０が配置されている。電極３０としては例えば炭素電極が挙げられるが、これに限定されない。通常、電極３０は、通電時に培養液（図１３の符号１６参照）中に存在するようウェル１４の底部１７の上に底部１７に接して配置される。一対の電極３０は互いに略水平方向に並んで配置されている。本明細書では、水平方向とは重力の方向に垂直な方向を指す。また、一対の電極３０は、１又は複数の細胞培養用インサート２０の側壁２１の対向する側に（より具体的には細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して中心角１８０°をなして）、細胞培養用インサート２０を間に挟んで配置される。本実施形態では、一対の電極３０は、各ウェル１４の幅方向に延びる対向する壁１４ａのそれぞれに近接して配置されている。図１では電極３０を平板状の平面電極で示しているが、電極３０は細胞培養用インサート２０の側壁２１の形状に適合すべく湾曲させた電極であってもよいし、他の任意の形状でもよい。

一つのウェル１４内には１又は複数の細胞培養用インサート２０を収容することができ、特には１又は複数行かつ１又は複数列の細胞培養用インサート２０を収容することができる。一つのウェル１４内に複数個の細胞培養用インサート２０を収容することにより、一対の電極３０で複数の細胞培養物インサート２０内の各細胞に効率よく電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。

電圧パルス発生装置３４により電極３０に印加して、ウェル１４に挿入された細胞培養用インサート２０内の細胞に選択的電気刺激を与えることができる。細胞培養用インサート２０には通電部としての貫通孔２７が設けられているため、細胞培養用インサート２０の収容部２５に収容された細胞はより効果的に電気刺激される。電気刺激の大きさ及び持続時間は目的に応じて適宜選択することができる。電気刺激は、好ましくは10～50V、0.001～4Hz、1～24msパルス幅にて0.5～120時間、更に好ましくは、20～40V、0.1～1Hz、1～24msパルス幅にて2～24時間与えられる。この電気刺激により、細胞の膜電位依存性チャンネルを活性化し、筋細胞のサルコメア構造を発達させる。さらに、同時に収縮活動を促進させてエネルギー消費量を高める電極３０に対する複数の細胞培養用インサート２０の各々の貫通孔２７の向きを、電極３０に向き合うように合わせれば、電流を複数の細胞培養用インサート２０を通ってより均一に流すことができる。

本発明の実施形態の細胞培養用インサート２０及びこれを備えた培養装置１並びに電気刺激用培養装置５０を用いて培養される細胞は限定されず、電気刺激の対象となる任意の細胞が含まれる。細胞の例としては、例えば、平滑筋細胞、心筋細胞、C2C12筋芽細胞等の培養細胞株、若しくはこれら細胞株から培養して分化した筋管細胞等の筋細胞、膵β細胞等の内分泌細胞、及び神経細胞などが挙げられる。

本発明の実施形態の電気刺激用培養装置５０を用いて、細胞の各種性質、特性及び/又は機能（例えば、運動、増殖、及び、分化）を調査、研究及び／又は評価することができる。例えば、本発明の実施形態の細胞培養用インサート２０を備えた電気刺激用培養装置５０を用いて、動物由来の繊維芽細胞をウェル１４内で培養し、微弱電位刺激を加えることによって心筋細胞へ分化誘導し、さらに分化誘導した心筋細胞に電気刺激を与え、拍動の再現を可能とし、培養心筋細胞の細胞電位及び／又形態を計測することできる。或いは、動物由来の筋芽細胞をウェル１４内で培養し、筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導し、分化誘導した筋管細胞に電気刺激を与え、高い糖取り込み代謝能を有する培養筋管細胞を製造作製することができる。高アミノ酸含有培地を用いた筋芽細胞からの筋管細胞の作製方法については特開2006-296282及び特開2008-99616を参照されたい。或いは、筋細胞の電気生理学的機能の解明及び／又は筋細胞に対する薬剤効果の評価を目的とする各種の細胞検査方法を実施することが出来る。

さらには、本発明の実施形態の電気刺激用培養装置５０を用いて、動物より採取した筋細胞又は培養筋細胞系を用いて、運動強度と関連して発現量が変動する酵素タンパク質、分泌タンパク質、若しくはそれらの受容体、又は、それらをコードする遺伝子を利用した、正常あるいは病態時における運動が、運動強度の評価ならびに筋エネルギー消費をはじめとする総合的な代謝状態に及ぼす影響を低侵襲的かつ簡便に測定することもできる。本発明者らは、筋管細胞の粗精製方法の開発と網羅的遺伝子発現解析などの方法を駆使して、特定の分泌タンパク質及び／又はその受容体をコードする遺伝子が運動依存的に発現変動することを見出し、更に、それらの中で筋の健康状態や代謝を調節するあるいは連関する遺伝子／タンパク質を同定したが（特許第5246740号）、当該特許に開示されている下記の遺伝子群から選択される少なくとも一種類の遺伝子の発現量を測定し、その変動に基づき、筋肉に負荷された運動刺激の強度を検出することができる：(1) C-X-C ligand 1 、(2) C-X-C receptor 7 (CXCR7) 、(3) C-X-C ligand 5 、(4) Oncostatin R 、(5) Wnt inhibitory factor-1 (WIF-1)、 (6) GPR43、 (7)VEGF-D 、(8)SCF/kit-ligand 、(9) COX2、 (10) prrx1、 (11) HDAC9 、(12) Interleukin-6 (IL-6)、 (13) FKBP11、 (14) oxysterol binding protein-like 1 (OSBPL1)、(15) SERPING、(16)Ubiquitin-conjugating enzyme E2B、(17)TBC domain family member1、(18)Ubiquitin-conjugating enzyme E2N、(19)Fibroblast growth factor 21、(20)Adaptor-related protein complex 2、(21)Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2、(22)IGFBP5、(23)Ubiquitin specific peptidase 15、(24)CD28 antigen、(25)Epsin 2、(26)Toll interacting protein、(27)von Hippel-Lindau syndrome homolog、(28)Ubiquitin specific peptidase 12、(29)SUMO/sentrin specific peptidase 2、(30)Heme oxygenase (decycling)1、(31)Dual specificity phosphatases 18、(32)Ubiquitin specific peptidase 22、(33)Ubiquitin protein ligase E3A、(34)Protein phosphatase 1、(35)Hect domain and RCC1-like domain、(36)Calpastatin、(37)RAB GTPase activating protein 1、(38)Ubiquitin-conjugating enzyme E2L3、(39)interleukin 13 receptor alpha1、(40)RAD23a homolog (S. cerevisiae)、(41)Ubiquitin specific peptidase 9、 (42) Ubiquitin fusion degradation 1 like、(43)protein phosphatases 4 catalytic subunit、(44)ubiquitin-conjugating enzyme E2D3、(45)IGFBP6、(46)Sphingosine phosphate lyase 1、(47)adaptor protein complex AP-2 alpha2 subunit、(48)RAB10、(49)HECT domain containing 1、(50)Ubiquitin specific peptidase 14、(51)Ubiquitin specific peptidase 32、(52)interleukin-1 receptor associated kinase 2、(53)ubiquitin-conjugating enzyme E2M、(52)adaptor-related protein complex 3、 (53)Ubiquitin specific peptidase 4、及び(54)Dual specificity phosphatases 4。

図３は本発明の第２実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１に１つの貫通孔２７が設けられると共に、多孔質膜２３の中心に、多孔質膜２３に設けられている複数の孔よりも孔径が大きい、多孔質膜２３を貫通して延びる貫通孔２９が設けられている。貫通孔２９は通電部として機能する。貫通孔２７は第１実施形態に関連して説明した通りであり、スリットの形状をしており、側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に設けられている。貫通孔２９の形状は略円形に示されているが、特に限定されず、略矩形、略矩形以外の多角形、楕円形等、他の形状であることができる。貫通孔２９の最大長さ又は孔径は特に限定されないが、例えば０．１μｍ～１ｃｍ、より好ましくは１００μｍ～５ｍｍである。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図４は本発明の第３実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１の同じ高さに２つの貫通孔２７が設けられている。

図４（Ｂ）に示すように、２つの貫通孔２７は、側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に設けられていると共に、同じ高さに設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図５は本発明の第４実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、側壁２１の貫通孔２７が、側壁２１の周方向に沿って整列した複数の貫通孔２７からなる第１の組と、側壁２１の周方向に沿って整列した複数の貫通孔２７からなる第２の組とからなる。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図６は本発明の第５実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１に、４つの貫通孔２７が設けられている。そのうち、２つの貫通孔２７は側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に設けられている。２つの貫通孔２７は側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の頂部に近い部分に設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図７は本発明の第６実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１に、貫通孔２７，２９の代わりに、導電性材料から形成された部分３６が設けられている。導電性材料から形成された部分３６は通電部として機能する。導電性材料としては、導電性プラスチック、金属、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。導電性材料は導電性充填剤を樹脂に配合した公知の複合材料である。導電性充填剤としては、炭素系物質 (カーボンブラック、グラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン等)、金属 (銀、銅、ニッケル、スズ、アルミニウム、ステンレス鋼等を繊維状、フレーク状、樹枝状、円筒状、楕円体状等の形状にして利用)、及びこれらの組み合わせ(ニッケル被覆炭素繊維、銀めっきアルミニウム粉末等)が挙げられるがこれらに限定されない。

導電性材料から形成された部分３６は、側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に、側壁２１の一部として側壁２１の全周に渡って設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図８は本発明の第７実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１に、２箇所の導電性材料から形成された部分３６が設けられている。導電性材料から形成された部分３６は、各々が側壁２１の一端から他端まで延び、細胞培養用インサートの軸Ａｘに対して１８０°の角度をなして互いに対向している。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図９は本発明の第８実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この例では、細胞培養用インサート２０の側壁２１の全部が、導電性材料から形成された部分３６により形成されている。このような構成によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

図１０は本発明の第９実施形態の細胞培養用インサート２０の（Ａ）略斜視図及び（Ｂ）正面図である。この実施形態では、第１実施形態の細胞培養用インサート２０と比較して、側壁２１の断面形状が略矩形である。側壁２１は細胞培養用インサート２０の底部に向かうにつれて直線状に先細りしている。本実施形態によっても、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。

ここまで、本発明を第１～９実施形態を例にとって説明してきたが、本発明はこれに限られず、以下のような種々の変形が可能である。
・貫通孔２７，２９の形状及び数は限定されない。例えば、貫通孔２７は合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上であってよい。側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の底部に近い部分に設けられた貫通孔２７は、少なくとも一つであればよく、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上であってもよい。側壁２１の高さ方向における半分の高さ（Ｈ／２）よりも細胞培養用インサート２０の頂部に近い部分に設けられた貫通孔２７は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上であってもよい。多孔質膜２３に設けられる貫通孔２９は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上であってもよい。
・第１実施形態の細胞培養用インサート２０の２つの貫通孔２７が細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して互いになす角度、第３実施形態の細胞培養用インサート２０の２つの貫通孔２７が細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して互いになす角度、及び第６実施形態の細胞培養用インサート２０の２つの導電性材料から形成された部分３６が細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して互いになす角度は、それぞれ約１８０°に限定されず、０°よりも大きく１８０°よりも小さい任意の角度であってよい。ただし、約９０°～１８０°が好ましく、約１５０°～約１８０°がより好ましい。
・図５に示した第４実施形態において、複数の貫通孔２７からなる第１の組と、複数の貫通孔２７からなる第２の組は、側壁２１の周方向に沿って整列していたが、整列する方向は限定されず、例えば細胞培養物インサート２０の軸Ａｘに対して平行に整列していてもよい。

図１０に示した第９実施形態の細胞培養用インサート２０において、細胞培養用インサート２０の側壁２１の断面形状は先細りせず、断面形状が側壁２１の上端から下端まで一定面積の略矩形であってもよい。この場合、平板電極３０と側壁２１との形状がよく適合し、平板電極３０と側壁２１とが良好に接触できるため、細胞培養用インサート２０の内部に電流をより効率的に流すことができる。
・フランジ２６を省略してもよい。その場合、細胞培養物インサート２０の底部の多孔質膜２３と培養容器１０のウェル１４の底部１７との間にスペースを維持することが望ましい。このため、細胞培養物インサート２０が、底面から突出する複数の脚部を備えるか、ウェル１４の底部１７から突出する突出部を備えることが好ましい。
・側壁２１は、断面形状が三角形、矩形、正方形、六角形、八角形等のように幾何学的形状を形成し得るように相互に関して配置することが望ましい。
・一対の電極３０の代わりに、一対よりも多くの電極を用いてもよい。
・蓋部材４０は省略してもよい。
・培養容器１０及び電気刺激用培養装置５０は図１に示す実施形態に限定されない。図１１は別の培養容器１０及び電気刺激用培養装置５０の例である。図１１において、細胞を培養させるための装置は、培養容器１０と、細胞培養用インサート２０と、培養容器１０に装着される蓋部材４０とを備えている。

培養容器１０は、基板プレート１１と、基板プレート１１の側壁１３により区画された空間に収容された複数（図では６個）のウェル１４とを備えている。培養容器１０の材料は第１実施形態に関して説明した通りである。

図１２は図１１の培養容器１０の平面図であり、一つの細胞培養用インサート２０がウェル１４に挿入された状態が示されている。

図１３は図１２の１３－１３線で沿った断面図である。細胞培養物インサート２０は培養容器１０のウェル１４の上端でフランジ２６により支持された状態でウェル１４に挿入されている。細胞培養用インサート２０の側壁２１の外径は、ウェル１４により区画形成された空間１５内の溶液又は培養液１６が毛管作用によって側壁１４とウェル１４の間を上昇してウェル１４からあふれて流出するのを防ぐために、ウェル１４の内径よりも十分に小さいことが好ましい。また、多孔質膜２３は、培養容器１０のウェル１４の底部から離間させて上方に配置するのが一般的である。

ウェル１４内であって細胞培養用インサート２０の外側に一対の電極３０が配置されている。通常、電極３０は、通電時に培養液１６中に存在するようウェル１４の底部１７の上に配置される。一対の電極３０は、細胞培養用インサート２０の側壁２１の対向する側に（より具体的には細胞培養用インサート２０の軸Ａｘに対して中心角１８０°をなして）、細胞培養用インサート２０を間に挟んで配置される。図１３では電極３０を平板状の平面電極で示しているが、電極３０は細胞培養用インサート２０の側壁２１の形状に適合すべく湾曲させた電極であってもよいし、他の任意の形状でもよい。

図１４は、培養容器１０の一つのウェル１４内に一つの細胞用インサートチャンバー２０を挿入するとともに一対の電極３０を配置した電気刺激用培養装置５０の略斜視図である。一対の電極３０は互いに水平方向に並ぶと共に、互いに略平行に配置されている。本実施形態では、一対の電極３０は細胞培養用インサート２０の側壁と対面し、細胞培養用インサート２０を間に挟んでウェル１４の軸Ａｘに対して略平行に配置されている。このような構成により、電極３０間の複数列のウエル１４の各細胞に電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。
図１５は、培養容器１０の基板プレート１１内に複数の細胞用インサートチャンバー２０が配置されており、基板プレート１１の対向する面の付近に一対の電極３０を配置した電気刺激用培養装置の略斜視図である。一対の電極３０は互いに水平方向に並ぶと共に、互いに略平行に配置されている。本実施形態では、一対の電極３０は細胞培養用インサート２０の側壁と対面し、細胞培養用インサート２０を間に挟んで配置されている。このような構成により、電極３０間の複数列のウエル１４の各細胞に電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

実施例１マウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激
マウスC2C12筋芽細胞をインサートチェンバー（スリット無し、１スリット、および２スリット）に播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、その後筋管細胞へと分化させた。なお、「スリット無し」は市販のインサート、「１スリット」は該市販のインサートに対し側面に１つのスリットを設けたインサートに対応し、「２スリット」は該市販のインサートに対し側面に２つのスリットを設けたインサートに対応する。

分化したC2C12筋管細胞を含むインサートチェンバーを電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激（周波数：1 Hz, 電圧：20 V/4 cm,パルス幅：2, 4, 8, 16 ms）を16時間にわたり付与した。電気パルス刺激と培養液条件等は特開2006-296282を参照されたい。インサートチェンバー内のC2C12筋管細胞からトータルRNAを抽出し、定法に従ってcDNAを合成後に定量PCR解析を行い、CXCL1遺伝子の発現量を計測した（図１６）。

分化したC2C12筋管細胞を含むインサートチェンバー（スリット無し、1スリット）を電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激（周波数：1 Hz, 電圧：20V/2.5 cm,パルス幅：8ms）を16時間にわたり付与した後、EPS応答性の収縮能力（Movement Index）を計測した(図１７（Ａ）－（Ｃ）)。Movement Indexの計測については特開2006-296282およびFujita H. et al., Exp.Cell Res.313(9):1853-1865, 2007を参照されたい。

実施例２ヒト骨格筋芽細胞の電気パルス刺激
ヒト骨格筋芽細胞（LONZA社、HSMM）をインサートチェンバー（１スリット）に播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、その後筋管細胞へと分化させた。分化したヒトHSMM筋管細胞を含むインサートチャンバーを電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激（周波数：1 Hz, 電圧：20 V/2.5 cm,パルス幅：4ms）を24時間（8h EPSｘ3回、各EPSの間に１時間の休憩）にわたり付与した。EPS無し群を対照とした。電気パルス刺激と培養液条件等は特開2006-296282を参照されたい。インサートチェンバー内のヒトHSMM筋管細胞からトータルRNAを抽出し、定法に従ってcDNAを合成後に定量PCR解析を行い、CXCL1遺伝子、IL6遺伝子及びIL8遺伝子の発現量を計測した（図１８（Ａ）－（Ｃ））。

１０・・・培養容器
１１・・・基板プレート
１４・・・ウェル
２０・・・細胞培養用インサート
２１・・・インサート側壁
２３・・・多孔質膜
２７・・・側壁に設けられた通電部としての貫通孔
２９・・・多孔質膜に設けられた通電部としての貫通孔
３０・・・電極
３６・・・導電性材料から形成された部分
５０・・・電気刺激用培養装置

Claims

培養容器のウェルに挿入可能な細胞培養用インサートであって、
略環状の側壁（ハイドロゲルからなるものを除く）と、前記側壁に取り付けられて前記細胞培養用インサートの底部を形成する多孔質膜とを備え、
前記側壁の少なくとも一部が通電部を備え、前記通電部が、前記側壁の高さ方向における半分の高さよりも前記細胞培養用インサートの底部に近い部分に設けられており、
通電部が、前記側壁の一部を構成する導電性材料から形成された部分を有する、細胞培養用インサート。
前記通電部が、前記側壁の周方向に沿って帯状に形成された１又は複数の部分を有する請求項１に記載の細胞培養用インサート。
電気刺激用培養装置であって、
基板プレートを備えた培養容器と、
前記培養容器内に挿入された請求項１又は２に記載の細胞培養用インサートと、
前記培養容器内に挿入され、前記細胞培養用インサートの側壁と対面し、前記細胞培養用インサートを間に挟んで配置された少なくとも一対の電極と、を備えた電気刺激用培養装置。