JP7352275B2 - 更年期症状改善用組成物 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 平成３１年３月３１日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／１４２０－３０４９／２４／７／１２５９／ｐｄｆ

特許法第３０条第２項適用 平成３１年４月１日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／１４２０－３０４９／２４／７／１２７２／ｐｄｆ

本発明は、更年期症状を改善するための更年期症状改善用組成物に関する。

カシスは、クロスグリ、クロフサスグリ、ブラックカラントなどとも呼ばれ、ニュージーランドなどの冷涼な地域に繁殖し、日本においては青森県での生産量が最大の果樹植物である。

２０１５年には農林水産省により「あおもりカシス」が地理的表示保護制度の第１号として認定されている。カシスにはビタミン、ミネラル類、アントシアニンが豊富に含まれており、目のクマ予防、眼精疲労軽減などに効果があることが知られている（非特許文献１を参照）。

植物中にはエストロゲン活性を持つ分子が存在し、フィトエストロゲン（植物性エストロゲン）と総称される。フィトエストロゲンは、いわゆる植物性女性ホルモンであり、大豆に含まれるイソフラボン、ブドウに含まれるレスベラトロールなどが、フィトエストロゲンの一種として知られている（非特許文献２及び非特許文献３を参照）。

本発明者らによって、カシスに含まれるアントシアニンは、エストロゲン受容体（ＥＲ）α及びＥＲβを介したエストロゲン活性を有し、フィトエストロゲンの一種であることが明らかになっている（非特許文献４及び非特許文献５を参照）。また、本発明者らは、カシス抽出物を卵巣除去ラットに摂取させることにより、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸の量が増えたことを報告している（非特許文献６を参照）。

Gopalan, A. et al., Food Funct 2012, 3, 795-809. Limer, J. L., et al, Breast Cancer Research, 2004, 6(3), 119-127. Mahmoud, A. M., et al., Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 140, 116-132. Nanashima, N. et al., Mol Nutr Food Res 2015, 59, 2419-2431. Nanashima, N. et al., Molecules 2018, 23, 74 Nanashima, N. et al., Nutrients, 2018, 10, 495

非特許文献４～６によれば、カシスに含まれるアントシアニンはフィトエストロゲンとして機能することがわかる。

しかし、本発明者らが調べたところによれば、カシス抽出物を摂取した卵巣除去ラットにおける皮膚のコラーゲン量は、偽手術ラットにおける量よりも多く増加した。これは、カシス抽出物が有するコラーゲン増加作用は、エストロゲンの分泌が低下した雌性個体だけではなく、健常な雌性個体においても生じ得ることを示唆する。したがって、カシス抽出物が有するコラーゲン増加作用は、カシス抽出物に含まれるフィトエストロゲン（アントシアニン）以外の成分によってもたらされる可能性があることが否定できない。

また、カシス抽出物が、更年期にある雌性個体に特有の症状を、最大でも更年期ではない雌性個体と同程度になるまでに改善することについて、今まで知られていない。

そこで、本発明は、更年期にある雌性個体に特有の症状を、最大でも更年期ではない雌性個体と同程度になるまでに改善する作用を有する物質を有効成分として含有する組成物を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を積み重ねたところ、驚くべきことに、カシス抽出物を摂取することにより、更年期にある雌性個体においてみられる薄毛、体重増加、腹腔内脂肪増加などの症状を、更年期ではない雌性個体と同程度になるまでに改善する作用を有することを見出した。

また、カシス抽出物は、血管内皮細胞の一酸化窒素（ＮＯ）生産量を１７β－エストラジオールと同程度になるまで改善し、さらに卵巣除去ラットの血管組織における内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現量を偽手術ラットと同程度になるまでに改善した。このように、本発明者らは、カシス抽出物は、ＮＯやｅＮＯＳを介した血管拡張作用及び血管硬化改善作用を有することを見出した。

さらに、本発明者らは、メタボローム解析によって、カシス抽出物はアントシアニンだけではなく、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールを含むことを見出した。また、驚くべきことに、ブルーベリー果実粉末にも、カシス抽出物と同程度のβ－エストラジオール及び１７α－エストラジオールが含まれていることがわかった。このことはブルーベリー果実粉末が、カシス抽出物と同様の更年期症状改善作用を有することを示す。そして、これらの知見は全て、本発明者らによって初めて見出されたことである。

このような知見を基にして、本発明者らは、有効成分として、カシス、ブルーベリー及び／又はこれらの抽出物を含有する、更年期症状を改善するための組成物を創作することに成功した。本発明は、かかる知見や成功例に基づいて完成された発明である。

したがって、本発明の一態様によれば、以下［１］～［９］の組成物及び方法が提供される。
［１］カシス及びブルーベリー並びにそれらの抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸の減少による皮膚劣化以外の更年期症状を改善する作用を有する、更年期症状改善用組成物。
［２］前記更年期症状は、薄毛、血管硬化、体重増加及び脂肪増加からなる群から選ばれる少なくとも１種の更年期症状である、［１］に記載の組成物。
［３］前記有効成分は、カシス及びカシス抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分である、［１］～［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［４］前記組成物は、経口用の組成物である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組成物。
［５］カシス及びブルーベリー並びにそれらの抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有する、増毛用組成物、血管拡張用組成物、血管硬化改善用組成物、体重増加抑制用組成物、脂肪増加抑制用組成物又は抗肝炎用組成物。
［６］前記組成物は、成人女性に摂取されるための組成物である、［５］に記載の組成物。
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の組成物を、更年期症状の雌性個体に投与することにより、該雌性個体の更年期症状を改善する工程を含む、更年期症状の改善方法。
［８］［１］～［６］のいずれか１項に記載の組成物を、成人女性に投与することにより、該成人女性に対して増毛する方法、血管を拡張する方法、血管を柔軟化する方法、体重を減少する方法、脂肪を減少する方法又は肝炎を減少する方法。
［９］［１］～［６］のいずれか１項に記載の組成物を製造するための、カシス及びブルーベリー並びにそれらの抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分の使用。

本発明の一態様の組成物によれば、カシス、ブルーベリー及びこれらの抽出物などを有効成分として摂取することにより、薄毛、血管硬化、体重増加及び脂肪増加といった更年期症状を、更年期ではない雌性個体と同程度に改善することが期待できる。

図１は、実施例に記載されているとおりの、ＢＣＥ及びブルーベリー果実粉末のメタボローム解析の結果を示す図である。 図２は、実施例に記載されているとおりの、リアルタイムＰＣＲによりＫＲＴ１９遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。 図３は、実施例に記載されているとおりの、ラットの皮膚組織中の毛包をＨ－Ｅ染色した結果（Ａ～Ｃ；スケールバーは２０μｍ）及び毛包１個あたりの毛の本数を計測して得られた結果（Ｄ）を示す図である。 図４は、実施例に記載されているとおりの、抗Ｋｉ６７抗体を用いた免疫染色の結果（Ａ～Ｄ；スケールバーは１００μｍ）及びＫｉ６７陽性細胞率の測定結果（Ｅ）を示す図である。 図５は、実施例に記載されているとおりの、抗ＫＲＴ１９抗体を用いた蛍光免疫染色の結果（スケールバーは１００μｍ）を示す図である。 図６は、実施例に記載されているとおりの、ＫＲＴ１５及びＣＤ３４のそれぞれの抗体を用いた蛍光免疫染色の結果（スケールバーは１００μｍ）を示す図である。 図７は、実施例に記載されているとおりの、各群のラットの３ヵ月間の飼育前後の体重の変化を示す図である。 図８は、実施例に記載されているとおりの、各群のラットの３ヵ月間の飼育前後の腹腔内脂肪の重量の変化を示す図である。 図９は、実施例に記載されているとおりの、各群のラットの３ヵ月間の飼育前後の肝臓の重量の変化を示す図である。 図１０は、実施例に記載されているとおりの、３ヵ月間の飼育後の腹腔内脂肪組織をＨ－Ｅ染色して得られた写真図を示す図である。 図１１は、実施例に記載されているとおりの、腹腔内脂肪組織における脂肪細胞の直径の測定結果を示す図である。 図１２は、実施例に記載されているとおりの、肝臓細胞におけるＴＮＦαの発現量をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す図である。 図１３は、実施例に記載されているとおりの、肝臓細胞におけるＩＬ－６の発現量をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す図である。 図１４は、実施例に記載されているとおりの、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析の結果を示す図である。ＡはＨＵＶＥＣにおける、及びＢはＥＡ．ｈｙ９２６細胞におけるｅＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを示す。Ｃは、１００ｎＭ フルベストラントの存在下でのＥＡ．ｈｙ９２６細胞における結果を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示されている。未処理コントロール細胞に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｃ３Ｇはシアニジン－３－グルコシドを示し、Ｃ３Ｒはシアニジン－３－ルチノシドを示し、Ｄ３Ｇはデルフィニジン－３－グルコシドを示し、Ｄ３Ｒはデルフィニジン－３－ルチノシドを示す。 図１５は、実施例に記載されているとおりの、１００ｎＭのフルベストラントの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）における、ＮＯの測定結果を示す図である。データは少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示す。未処理のコントロール細胞に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 図１６は、実施例に記載されているとおりの、更年期モデルラットの血管内皮細胞を免疫組織化学的染色した結果を示す図である。Ａは低倍率（×２００）でのｅＮＯＳタンパク質発現の画像を示す。Ｂは、Ａに示される四角で囲った部分の画像の４００倍の画像を示す。Ｃは、一次抗体で処理していない組織を陰性コントロールとして使用した画像を示す。Ｄは、ｅＮＯＳの染色強度のスコア付けをした結果を平均スコア±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５。

以下、本発明の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている憶測や推論は、本発明者らのこれまでの知見や経験によってなされたものであることから、本発明の技術的範囲はこのような憶測や推論のみによって拘泥されるものではない。

「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形担体又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。

整数値の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、１の有効数字は１桁であり、１０の有効数字は２桁である。また、小数値は小数点以降の桁数と有効数字の桁数とは一致する。例えば、０．１の有効数字は１桁であり、０．１０の有効数字は２桁である。

「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。

「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。

数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。

「更年期」は、女性の加齢に伴う生殖期から非生殖期への移行期をいい、具体的には閉経の前後５年の合計１０年間をいう。更年期にある女性は、卵巣機能の低下若しくは老化によって、女性ホルモンであるエストロゲンが減少し、生理的機能及び性機能が減少又は消失する。

「更年期症状」は、更年期にある女性にみられる症状である。更年期症状として、顔面紅潮、のぼせ（ホットフラッシュ）、頻脈、発汗、頭痛、肩こりなどの血管性の症状；易疲労感、動悸、筋肉痛、関節痛、腰痛、足腰の冷え、頻尿、尿失禁、目眩、視力減退、皮膚劣化、薄毛、体重増加、脂肪増加、中性脂肪増加、肝炎などの身体性の症状；視力減退；記憶力減退、うつ症状、集中力減退などの精神性の症状などが挙げられる。

「症状改善作用」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、症状が出ている状態を症状が出ていない状態へ向かう作用に加えて、症状が出ている状態を悪化させない作用、症状が出ていない状態を維持する作用、症状が出ていない状態から症状が出ている状態へ向かうことを妨げる作用などが含まれる。具体的には、「症状改善作用」には、症状の発生の防止及び遅延並びに発生の危険性の低下；症状の好転；症状の悪化の防止及び遅延；症状をもたらす機能の維持並びに悪化の防止及び遅延などが包含される。症状の「改善」は、症状の緩和、抑制、阻害、回復、治療及び予防を包含する。

本発明の一態様の組成物は、カシス、カシス抽出物、ブルーベリー、ブルーベリー抽出物又はこれらの２種、３種若しくは４種である有効成分を少なくとも含有する。本発明の一態様の組成物は、これらの有効成分を含有することにより、更年期症状改善作用を有する。

カシスは、学名がＲｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ又はＲｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ Ｌ．であり、クロスグリ、クロフサスグリ、ブラックカラント（Ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ）などとも呼ばれる、温帯性の落葉低木果樹の果実である。カシスの果実は、ゼリー、ジャム、アイスクリーム、コーディアル、リキュールなどに利用されている。カシスは、果実を含めば、カシスの葉、茎、根、花などの他の部位が混入したものであってもよい。

カシスは、採取したままの状態のもの（生実）でもよいが、カシスの搾汁残渣にはアントシアニンに加えて、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールが多く含まれていることから、採取した後に搾汁処理や乾燥処理などの加工処理に供した加工処理物であることが好ましい。また、カシスを採取した後、加工処理までに時間を要する場合、カシスの変質を防ぐために低温貯蔵などの当業者が通常用いる貯蔵手段により貯蔵することが好ましい。

搾汁処理の方法は、通常用いられている植物果実を用いて搾汁液と搾汁残渣とを分けるための方法であれば特に限定されないが、例えば、カシスを搾汁機、ジューサーなどの機械的搾汁手段を用いて搾汁し、必要に応じて、篩別、ろ過などの手段によって粗固形分を回収することにより搾汁残渣を得る方法などが挙げられる。搾汁残渣は、乾燥処理に供することが好ましい。

乾燥処理の方法は、通常用いられている植物果実を乾燥するための方法であれば特に限定されず、例えば、カシスの乾燥後の質量（乾燥質量）が、乾燥前の質量（湿質量）に対して８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下になるように乾燥する処理などが挙げられる。乾燥処理は、例えば、熱風乾燥、高圧蒸気乾燥、電磁波乾燥、凍結乾燥、風乾などの当業者に公知の任意の方法により行われ得るが、カシスに含まれる成分が変質又は分解しないようにするためには、凍結乾燥が好ましい。

カシス抽出物は、通常用いられているカシス又はカシス加工処理物（以下、カシス等とよぶ。）を抽出処理に供することにより得られる。抽出処理の方法は、通常用いられている植物果実に含まれる所望の成分を抽出するための方法であれば特に限定されず、例えば、カシス等と、カシスに含まれるβ－エストラジオール及び１７α－エストラジオールに対して可溶性である溶媒とを接触させることにより抽出液を得ることを含む方法などが挙げられる。

抽出溶媒として、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールに対して可溶性である溶媒は、例えば、水、有機溶媒及び水と有機溶媒との混合溶媒などが挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどの低級アルコール；酢酸エチル、酢酸メチルなどの低級エステル；ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、グリセリン、プロピレングリコールなどが挙げられるが、好ましくは水と有機溶媒との混合溶媒であり、より好ましくは水とエタノールとの混合溶媒である。抽出条件は、カシス等におけるβ－エストラジオール及び１７α－エストラジオールが抽出溶媒に溶解するのに適した条件であれば特に限定されず、カシス等の状態や使用量に応じて、抽出溶媒の種類や使用量は適宜設定できる。

抽出処理の後に固液分離処理を行うことで、抽出液と原料のカシス等の残渣とを分離することができる。固液分離手段は特に限定されないが、例えば、ろ過、遠心分離などの公知の固液分離手段を利用することができる。

抽出液は、必要に応じて濃縮処理及び／又は乾燥処理に供してもよい。濃縮処理の方法は、液体を減容化する通常知られている方法であれば特に限定されず、例えば、抽出液を、常温又は加温下で、必要に応じて減圧して、濃縮液を得ることを含む方法などが挙げられる。濃縮の程度は特に限定されないが、例えば、１／２～１／１０以下になるまで減容化すればよい。濃縮液は、凍結乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥などの乾燥処理、好ましくは凍結乾燥処理に供することが好ましい。さらに、濃縮液の乾燥物は、粉砕処理に供することが好ましい。粉砕処理の方法は特に限定されないが、例えば、クラッシャー、ブレンダー、ミキサー、ミルなどを用いる方法などを挙げることができる。

以下に、カシスを原料として、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールを含有するカシス抽出物を製造する具体的方法を説明するが、カシス抽出物の製造方法としては以下のものに限定されない。

カシスの果実の搾汁残渣を凍結乾燥して搾汁残渣乾燥物を得て、次いで得られた搾汁残渣乾燥物を含水エタノールを用いた抽出処理に供して抽出液を得て、次いで得られた抽出液をフィルターを用いたろ過処理、濃縮処理、凍結乾燥処理、粉砕処理及び混合処理に順次供して、カシス抽出物を得る。カシス抽出物を篩過することにより、特定の粒子サイズを有する、例えば、８０メッシュのカシス抽出物が得られる。

ブルーベリーは、通常ブルーベリーとして知られている、ツツジ科スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）の落葉低木果樹の果実であれば特に限定されない。ブルーベリーは、果実を含めば、ブルーベリーの葉、茎、根、花などの他の部位が混入したものであってもよい。

ブルーベリーは、採取したままの状態のもの（生実）でも、採取した後に搾汁処理や乾燥処理などの加工処理に供した加工処理物でもどちらでもよい。ブルーベリーを乾燥処理に供する場合は、乾燥処理の方法は凍結乾燥であることが好ましい。ブルーベリーを採取した後、加工処理までに時間を要する場合、ブルーベリーの変質を防ぐために低温貯蔵などの当業者が通常用いる貯蔵手段により貯蔵することが好ましい。

ブルーベリー抽出物は、上記したカシス抽出物の記載を適宜参照できる。

カシス抽出物及びブルーベリー抽出物は、上記した製造方法によって得られたものでも、市販されたものでも、どちらでもよい。例えば、カシス抽出物は、「ＣａＮＺａＣ－３５」（光洋商会社）として市販されている。

本発明の一態様の組成物が有する更年期症状改善作用は、更年期症状の少なくともいずれか１種の症状を改善する作用であれば特に限定されない。ただし、本発明の一態様の組成物が有する更年期症状改善作用は、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸の減少による皮膚劣化を改善する作用を除外するが、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸の減少とは異なる原因による皮膚劣化を改善する作用を包含する。

本発明の一態様の組成物が有する更年期症状改善作用は、薄毛、血管硬化、体重増加及び脂肪増加又はこれらの２種、３種若しくは４種の症状を改善する作用であることが好ましい。本発明の一態様の組成物が有する更年期症状改善作用の程度は、更年期である雌性個体に対して、本発明の一態様の組成物を使用しない場合と比べて改善する程度であればよいが、好ましくは更年期ではない雌性個体と同程度になるまでに改善する程度である。

更年期症状改善作用は、後述する実施例に記載のある更年期モデル動物と偽手術動物とを用いて比較する方法によって、確認及び評価することができる。例えば、更年期モデル動物は、偽手術動物と比べると、毛包あたりの毛の数が減少し、皮膚組織におけるｅＮＯＳ発現レベル及びＮＯ合成量が減少し、体重が増加し、腹腔内脂肪が増加し、及び／又は脂肪細胞の直径が大きくなる。

本発明の一態様の組成物を摂取することにより、更年期モデル動物における毛包あたりの毛の数の減少が改善すれば、好ましくは偽手術動物における毛包あたりの毛の数と同程度になるまで改善すれば、本発明の一態様の組成物は、薄毛である更年期症状を改善する作用があるといえる。

本発明の一態様の組成物を摂取することにより、更年期モデル動物における血管組織におけるｅＮＯＳ発現レベル及び／又はＮＯ合成量の減少が改善すれば、好ましくは偽手術動物における血管組織におけるｅＮＯＳ発現レベル及び／又はＮＯ合成量と同程度になるまで改善すれば、本発明の一態様の組成物は、血管硬化である更年期症状を改善する作用があるといえる。

本発明の一態様の組成物を摂取することにより、更年期モデル動物における体重増加が改善すれば、好ましくは偽手術動物における体重増加と同程度になるまで改善すれば、本発明の一態様の組成物は、体重増加である更年期症状を改善する作用があるといえる。

本発明の一態様の組成物を摂取することにより、更年期モデル動物における腹腔内脂肪が増加し、及び／又は脂肪細胞の直径が大きくなることが改善すれば、好ましくは偽手術動物における腹腔内脂肪増加及び／又は脂肪細胞の直径と同程度になるまで改善すれば、本発明の一態様の組成物は、脂肪増加である更年期症状を改善する作用があるといえる。

本発明の一態様の組成物を摂取することにより、更年期モデル動物における肝炎関連遺伝子の発現レベルの増加が改善すれば、好ましくは偽手術動物における肝炎関連遺伝子の発現レベルと同程度になるまで改善すれば、本発明の一態様の組成物は、肝臓への脂肪の蓄積の結果として生じ得る肝炎を改善する作用があるといえる。

本発明の一態様の組成物は、更年期症状改善作用を有することによって、育毛効果、抗血管疾患効果、抗肥満効果などの様々な効果を奏することが期待されるものであることから、育毛用組成物、抗血管疾患用組成物、抗高血圧用組成物、血管抵抗低下用組成物、抗肥満用組成物、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）改善用組成物、好ましくは成人女性用の上記組成物といった態様をとり得る。例えば、本発明の一態様の組成物は、肥満気味の成人女性の体重、腹部の脂肪（内臓脂肪及び／又は皮下脂肪）、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）及び／又はウエスト周囲径を減らすことを助けるための組成物であり得る。

有効成分であるカシス及びブルーベリーは、長期にわたりヒトに摂取されてきた実績があり安全性が高いことから、本発明の一態様の組成物は、実用性が高く、そのままで、又は加工することにより、種々の用途に適用可能である。

本発明の一態様の組成物は、その摂取方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様の組成物は、簡便かつ長期的に摂取するためには経口用の組成物であることが好ましい。

本発明の一態様の組成物の摂取個体は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。摂取個体は、更年期にある雌性個体であれば健常な雌性個体であってもよいが、更年期症状を有する雌性個体であることが好ましい。

本発明の一態様の組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。

本発明の一態様の組成物は、更年期症状改善作用を有する限り、有効成分と他の成分とを組み合わせて含有し得る。すなわち、本発明の一態様の組成物は、本発明の目的を達成し得る限り、有効成分に加えて、他の成分として種々のものを含有し得る。

他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油、保存剤、緩衝剤、光沢剤などの通常の食品加工や医薬品加工に使用される添加物などを挙げることができる。他の成分の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。

賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、デキストリン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などを挙げることができる。結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどを挙げることができる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどを挙げることができる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどを挙げることができる。着色剤としては、飲食品や経口用医薬品に添加することが許容されているものなどを使用することができ、特に限定されない。

錠剤や顆粒剤とする場合には、所望により、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などを用いてコーティングしてもよく、複数層でコーティングすることもできる。さらに顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。

本発明の一態様の組成物における有効成分の含有量は、更年期症状改善作用が認められる量であれば特に限定されないが、経口用組成物としては、例えば、１回の摂取量として、０．１ｍｇ～１０，０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～１，０００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ～５００ｍｇ、さらに好ましくは２０ｍｇ～１００ｍｇになるような量であり；組成物の全体量に対して、０．１質量％～９９．９質量％、好ましくは０．５質量％～９９質量％、より好ましくは１質量％～９０質量％、さらに好ましくは５質量％～９０質量％、なおさらに好ましくは１０質量％～９０質量％である。

本発明の一態様の組成物の摂取量は特に限定されず、摂取個体の年齢、体格、症状などの摂取個体の特性；摂取方法；適用部位などに合わせて適宜設定することができる。本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、ヒト等価用量から換算すると、一般成人女性（体重：５０ｋｇ）に対して、約０．１ｇ～約１０ｇ／日であり、好ましくは１ｇ～５ｇ／日である。

本発明の一態様の組成物の摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１回～３回であり、摂取個体の更年期症状の程度、１回当たりの摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。本発明の一態様の組成物の摂取期間は、一定期間、すなわち３日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは１ヵ月以上、さらに好ましくは３ヵ月以上、なおさらに好ましくは６ヶ月以上にわたって継続的に投与する。本発明の一態様の組成物の摂取は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に摂取する限り、毎日摂取しなくてもよい。

本発明の一態様の組成物は、該組成物を単独で、又は該組成物を配合する飲食品用組成物や医薬品用組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、有効成分を含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品用組成物、医薬品用組成物、医薬部外品用組成物、化粧品用組成物、動物飼料用組成物などである。本発明の一態様の組成物は、経口摂取が可能な内外美容（インナーコスメ）用組成物としても有用である。

本発明の一態様の組成物が飲食品用組成物である場合は、あらゆる飲食品の形態をとり得るが、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、ゼリー、ペーストなどの剤状食品；果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料、コーヒー飲料、スポーツドリンク、清涼飲料、健康飲料などの飲料；ヨーグルトやチーズなどの乳製品；スープ、麺、プリン、ジャムなどの加工飲食品；チューインガム、キャンディー、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、スナックなどの菓子；アイスクリーム、シャーベット、氷菓などの冷菓；せんべいなどの米菓；羊羹その他の大豆を原料とする菓子などに添加して一般的な飲食品の形態とすることができる。

飲食品用組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。

飲食品用組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、コーティング紙、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、アルミなどの金属、ガラスなどを素材とするパック、瓶、缶、パウチ、１層又は積層（ラミネート）のフィルム袋などが挙げられる。

本発明の一態様の組成物が医薬品用組成物である場合は、あらゆる医薬品の形態をとり得るが、例えば、経口製剤、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、点鼻製剤などが例示される。医薬品用組成物は、本発明の目的を達成し得る限り、有効成分に加えて、更年期症状改善作用を有する他の生理活性物質を配合してもよい。また、本発明の一態様の医薬品用組成物は、他の生理活性物質を有効成分として含有する他の医薬品と併用してもよい。

本発明の一態様の組成物の製造方法は特に限定されず、例えば、有効成分と、任意に他の成分とを混合して、所望の剤形に成形する方法などが挙げられる。

本発明の一態様の組成物の使用方法は特に限定されないが、例えば、本発明の一態様の組成物が経口用組成物である場合は、経口用組成物をそのまま、若しくは水などとともに、又は水などで希釈するなどして、飲食することにより経口摂取することができる。使用個体の好みなどに応じて、本発明の一態様の組成物と他の固体物や液状物とを混ぜて経口摂取してもよい。本発明の一態様の組成物を口腔崩壊剤形とした場合は、水なしで経口摂取することができる。

本発明の別の一態様は、本発明の一態様の組成物又は該組成物における有効成分を利用する方法である。本発明の一態様の方法は、本発明の一態様の組成物を、更年期症状の雌性個体に投与することにより、該雌性個体の更年期症状を改善する工程を含む、更年期症状の改善方法である。投与方法や雌性個体の更年期症状の改善効果の確認方法などは、上記項目を適宜参照できる。

本発明の別の一態様の方法は、本発明の一態様の組成物を、成人女性に投与することにより、該成人女性に対して増毛する方法、血管を拡張する方法、血管を柔軟化する方法、体重増加を抑制する方法、脂肪増加を抑制する方法又は肝炎のリスクを低減する方法である。本発明の別の一態様の方法は、本発明の一態様の組成物を製造するための、カシス及びブルーベリー並びにそれらの抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分の使用である。

本発明の一態様の方法は、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

［例１ カシス抽出物及びブルーベリー果実粉末が有する更年期モデルに対する薄毛改善作用の評価］
（１－１）カシス抽出物及びブルーベリー果実粉末
カシス抽出物（ＢＣＥ）として、市販のＢＣＥ粉末である「ＣａＮＺａｃ－３５」（光洋商会社）を用いた。ＢＣＥには、ポリフェノールが３７．６ｇ／１００ｇ－ＢＣＥ、アントシアニンが３８．０ｇ／１００ｇ－ＢＣＥで含まれていた。また、ＢＣＥには、アントシアニンＣ３Ｇ（５．６質量％）、Ｃ３Ｒ（３２．０質量％）、Ｄ３Ｇ（１６．８質量％）及びＤ３Ｒ（４５．３質量％）が含まれていた。

ブルーベリー果実粉末として、ブルーベリーの果実を凍結乾燥処理に供し、次いで粉砕処理に供して得られたものを用いた。

ＢＣＥ及びブルーベリー果実粉末のメタボローム解析の結果を図１に示す。図１に示すとおり、ＢＣＥ及びブルーベリー果実粉末にはβ－エストラジオール及び１７α－エストラジオールが含まれていることがわかった。

（１－２）ヒト毛乳頭細胞
ヒト毛乳頭細胞（Ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ；ＨＦＤＰＣ）はプロモセル社から購入した。ＨＦＤＰＣは、毛乳頭細胞増殖用培地（プロモセル社）を用いて維持した。細胞培養は、５％ＣＯ_２を含む加湿インキュベーター内で３７℃にて実施した。

（１－３）マイクロアレイ及びＩＰＡによる遺伝子解析
培地には毛乳頭細胞基本培地（フェノールレッド不含；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を使用した。１μｇ／ｍｌ ＢＣＥを含有する被験培地及び毛乳頭細胞基本培地のみであるコントロール培地を用いて、ＨＦＤＰＣを２４時間培養した後に細胞を回収し、次いで回収した細胞をＰＢＳで２度洗浄した。洗浄後の細胞から「ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」（キアゲン社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。

ＲＮＡの標識化及びハイブリダイゼーションは、アジレント・ワンカラー・マイクロアレイに基づく遺伝子発現解析の手順に従って実施した。具体的には、１００ｎｇの全ＲＮＡを直線的に増幅し、次いでＣｙ３－ｄＣＴＰを用いて標識した。得られた標識化ｃＲＮＡを、「ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」を使用して精製した。標識化及び断片化したｃＲＮＡを、「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ マイクロアレイ」（８×６０Ｋ Ｖｅｒ．３．０；アジレントテクノロジー社）にハイブリダイズした。マイクロアレイデータセットは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏのアクセッション番号 ＧＳＥ１２１７３０で利用可能である。

また、ＢＣＥを含有する被験培地を用いることにより、２．０倍より大きい発現上昇を示した遺伝子については、ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェア（Ｖｅｒ．３６６０１８４５）を用いてパスウェイ解析を行った。ｚスコアアルゴリズムを偽陽性結果の可能性を減じるために利用した。２．０以上のｚスコアは、転写産物の発現が有意に増加したことを示し、－２．０以下のｚスコアは発現が有意に低下したことを示した。

以上のようにして、ＢＣＥによるヒト毛乳頭細胞における遺伝子発現の変動を網羅的に探索した。

（１－４）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子解析
マイクロアレイで変動が大きかった毛乳頭幹細胞マーカーであるｋｅｒａｔｉｎ １９（ＫＲＴ１９）の発現量を調べるために、ヒト毛乳頭細胞から抽出したＲＮＡを用いて、「ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（登録商標） Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ」（ＴａＫａＲａ社）によりリアルタイムＰＣＲを行った。

（１－５）卵巣除去ラットを用いた薄毛改善作用の評価
更年期モデル動物として１２週齢の卵巣除去ラット（「ＯＶＸ ｆｅｍａｌｅ Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ」；クレアジャパン社）を用い、偽手術動物として１２週齢のＳｈａｍラット（「Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ」；クレアジャパン社）を用いた。卵巣除去ラット６匹を２群に分け、一方の３匹には「ＡＩＮ－９３Ｍ」（クレアジャパン社）のみからなる普通餌を摂取させ（「ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ」群）、他方の３匹には３質量％ ＢＣＥを含有する「ＡＩＮ－９３Ｍ」である被験餌を摂取させた（「ＯＶＸ ＢＣＥ」群）。また、手術行為による影響を排除するために、麻酔及び皮膚切開のみを行い、卵巣を除去していない偽手術ラットの３匹に、普通餌を摂取させた（「Ｓｈａｍ」群）。各群のラットは餌及び水を自由に摂取できるようにした。

上記した各群のラットを３ヵ月間飼育した後、常法に従って皮膚組織を採取し、１０％ホルマリン中性緩衝液中で固定し、パラフィン包埋による組織ブロックの作成を行ったパラフィン包埋組織を、連続した厚さ３μｍの切片に切り出し、スライドガラス上に置いて組織切片を作製して、各種評価を行った。組織切片はヘマトキシリン－エオシン染色（Ｈ－Ｅ染色）を行い、毛包１個あたりの毛の本数をカウントし、各群の計測値の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を算出し、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法による検定を実施した（ｐ＜０．０５）。

また、毛包の細胞増殖効果の検証として、細胞増殖マーカーであるＫｉ６７の発現量を調べるために、皮膚組織切片を抗Ｋｉ６７抗体を用いて免疫染色を行った。また、毛包の全細胞数及びｋｉ６７陽性細胞を顕微鏡下で計測し、全細胞数あたりの陽性細胞の割合を算出し、上記と同様にして検定を行った。また、抗ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１９（ＫＲＴ１９）抗体、抗ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１５（ＫＲＴ１５）抗体及び抗ＣＤ３４抗体を用いた蛍光免疫染色法によって各タンパク質の発現を調べた。

（１－６）評価結果
マイクロアレイ及びＩＰＡによって解析して予測した、ＢＣＥを通じて発現が変動した遺伝子の上流因子を表１に示す。

表１に示す因子は、ＢＣＥによってヒト毛乳頭細胞の遺伝子発現の変化をもたらし得る因子である。ｚスコアが２．０以上又は－２．０以下であることにより有意差があることを示している。表１に示すとおり、β－エストラジオールのｚスコアが最も大きいことから、β－エストラジオールの下流遺伝子に着目することとした。

β－エストラジオールの下流遺伝子のうち、コントロール培地を用いた場合に対して、ＢＣＥを含有する被験培地を用いることにより、発現量が上昇した遺伝子を表２に示す。表２に示すとおり、ＢＣＥを含有する被験培地を用いることにより、１７種類の遺伝子の発現量が上昇した。

マイクロアレイ解析の結果から、最も発現量が上昇した遺伝子であるＫＲＴ１９について、リアルタイムＰＣＲにより発現量を測定した結果を図２に示す。図２はコントロール培地を用いた場合のＫＲＴ１９の発現量を１としたときのＢＣＥを含有する被験培地を用いた場合の相対発現量を表している。図２に示すとおり、ＫＲＴ１９の発現量は、ＢＣＥを含有する被験培地を用いた場合には、コントロール培地を用いた場合と比較して１５倍程度上昇した。

ラットの皮膚組織中の毛包をＨ－Ｅ染色した結果（Ａ～Ｃ；スケールバーは２０μｍ）及び毛包１個あたりの毛の本数を計測して得られた結果（Ｄ）を図３に示す。ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較すると、ＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群で有意差が認められ、毛の本数が平均して約０．５本増加した。また、ＯＶＸ ＢＣＥ群の毛の本数は、Ｓｈａｍ群と同程度であり、両者の間で有意差は認められなかった。

抗Ｋｉ６７抗体を用いた免疫染色の結果（Ａ～Ｄ；スケールバーは１００μｍ）及び毛包の全細胞数あたりのＫｉ６７陽性細胞率の測定結果（Ｅ）を図４に示す。図４が示すとおり、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群において発色の強度が増しており、さらにＫｉ６７陽性細胞率が有意に増加したことから、Ｋｉ６７の発現量の上昇が確認できた。

抗ＫＲＴ１９抗体を用いた蛍光免疫染色の結果（スケールバーは１００μｍ）を図５に示す。さらに、ＫＲＴ１９と同じように幹細胞マーカーであるＫＲＴ１５及びＣＤ３４のそれぞれの抗体を用いた蛍光免疫染色の結果（スケールバーは１００μｍ）を図６に示す。ＫＲＴ１９だけではなく、ＫＲＴ１５及びＣＤ３４についても、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群において蛍光強度の上昇が確認された。

ＫＲＴ１９、ＫＲＴ１５、ＣＤ３４及びＫｉ６７の発現量の上昇から、ＢＣＥは毛乳頭幹細胞の維持及び毛乳頭細胞の増殖などに関係していることにより、更年期モデルに対して薄毛改善作用を有することがわかった。また、ＢＣＥと同じように、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールを含有するブルーベリー果実粉末についても、更年期モデルに対して薄毛改善作用を有することがわかった。

［例２ カシス抽出物及びブルーベリー果実粉末が有する更年期モデルに対する体重増加抑制作用及び脂肪増加抑制作用の評価］
（２－１）卵巣除去ラットを用いた体重増加抑制作用及び血中中性脂肪上昇抑制作用の評価
１１週齢の卵巣除去ラット及びＳｈａｍラットを用いた以外は、上記（１－５）と同様に各ラットを群分けし、それぞれの餌を用いて３ヵ月間飼育した。各群のラットについて、飼育前後の体重を測定した。

飼育後のラットについて、採血した後に解剖して、腹腔内脂肪組織及び肝臓の重量をそれぞれ測定した。

腹腔内脂肪組織を用いて、上記（１－５）と同様にして３μｍの厚さの組織切片を作製して、各種評価を行った。組織切片をＨ－Ｅ染色して、各群のラットの腹腔内脂肪組織のＨ－Ｅ染色標本の画像上の５つの脂肪細胞の直径を測定した。各群の測定値の平均を算出し、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法による検定を実施した（ｐ＜０．０５）。

（２－２）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子解析
肝炎関連遺伝子の発現解析を行うために、肝臓から抽出したｍＲＮＡを用いて上記（１－４）と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。肝炎関連遺伝子としてはＴＮＦα及びＩＬ－６を対象とした。

（２－３）評価結果
３ヵ月間の飼育前後の体重の変化を図７に示す。餌の摂取前では体重に個体差は無かった。しかし、３ヵ月間の餌の摂取後では、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、ＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群の体重は統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）。また、ＯＶＸ ＢＣＥ群の体重は、Ｓｈａｍ群と大差がなかった。

３ヵ月間の飼育後の腹腔内脂肪及び肝臓の重量の結果をそれぞれ図８及び図９に示す。ＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群は、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して統計的有意に腹腔内脂肪の減少がみられた。しかし、これらの群間において、肝臓の重量には有意な変動は認められなかった。また、ＯＶＸ ＢＣＥ群の腹腔内脂肪の重量は、Ｓｈａｍ群よりも若干大きかった。

３ヵ月間の飼育後の腹腔内脂肪組織をＨ－Ｅ染色して得られた写真図を図１０に示す。また、腹腔内脂肪組織における脂肪細胞の直径の測定結果を図１１に示す。これらの図が示すとおり、ＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群は、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して統計的有意に脂肪細胞の直径を減少させた。また、ＯＶＸ ＢＣＥ群の脂肪細胞の直径は、Ｓｈａｍ群よりも若干大きかった。

肝炎関連遺伝子であるＴＮＦα及びＩＬ－６について、肝臓細胞における発現量をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を、それぞれ図１２及び図１３に示す。ＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群は、ＯＶＸ ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して統計的有意に肝炎関連遺伝子の発現量の上昇を抑制した。しかし、ＯＶＸ ＢＣＥ群の肝炎関連遺伝子の発現量上昇抑制効果は、Ｓｈａｍ群よりも若干小さかった。

以上の結果から、ＢＣＥは更年期モデルに対して体重増加抑制作用、脂肪増加抑制作用、脂肪細胞拡大抑制作用及び肝炎抑制作用を有することがわかった。また、ＢＣＥと同じように、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールを含有するブルーベリー果実粉末についても、更年期モデルに対してこれらの作用を有することがわかった。

［例３ カシス抽出物及びブルーベリー果実粉末が有する更年期モデルに対する血管硬化作用の評価］
（３－１）マイクロアレイ及びＩＰＡによる遺伝子解析
細胞として、ヒト血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（プロモセル社）を使用した以外は、上記（１－３）と同様にしてマイクロアレイ分析を実施した。また、１．５倍以上の発現上昇を示した遺伝子を対象とした以外は、上記（１－３）と同様にしてＩＰＡソフトウェアを用いて分析した。

（３－２）ＲＴ－ｑＰＣＲ
内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ） ｍＲＮＡ発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析により評価した。ＨＵＶＥＣと同じくヒト血管内皮細胞であるＥＡ．ｈｙ９２６細胞（ＡＴＣＣ）を用いた。ＨＵＶＥＣ及びＥＡ．ｈｙ９２６細胞を１２ウェル培養プレートに播種し、コンフルエントになるまで培養した。培地を交換し、次いで細胞をアントシアニン（１０μＭ）、ＢＣＥ（０．５又は１．０μｇ／ｍＬ）又は１７β－エストラジオール（Ｅ２）（１０ｎＭ）の存在下又は非存在下で２４時間処理した。フルベストラントの実験系では、１００ｎＭ フルベストラントの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後、処理した後の細胞をさらにアントシアニン及びＢＣＥで２４時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後「ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」を用いて全ＲＮＡを抽出した。

「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（タカラ社）を用いてｃＤＮＡを全ＲＮＡ（２００ｎｇ）から逆転写した。特異的ｍＲＮＡのレベルは、「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ（商標）ＩＩ」（タカラバイオ社）を用いてｑＰＣＲにより定量した。転写物レベルをグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルを用いた標準化を行った。ＰＣＲ条件及びプライマーは、本発明者らの文献（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１９，２４（７），１２５９）に記載のものを用いた。ＰＣＲ特異性は融解曲線分析により確認した。全ての試料は３サンプルで分析し、相対遺伝子発現を２^{－ΔΔＣｔ}法により計算した。

（３－３）一酸化窒素（ＮＯ）測定
ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を１２ウェル培養プレートに播種し、コンフルエントになるまで培養した。培地を交換し、次いで細胞を１００ｎＭ フルベストラントの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした後アントシアニン（１０μＭ）、ＢＣＥ（０．５又は１．０μｇ／ｍＬ）若しくはＥ２（１０ｎＭ）の存在下又は非存在下で細胞をさらに５日間インキュベートした後、培地を回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（「ＳＰＤ１０１０」；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で濃縮した。

「ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）一酸化窒素アッセイキット」（フナコシ社）を用いてＮＯの放出量を定量した。具体的には、培養培地をＺｎＳＯ_４及びＮａＯＨで脱タンパク質処理し、続いてキットからワーキング試薬を添加し、次いで６０℃で１０分間インキュベートした。試料を９６ウェルプレートに移し、次いで吸光度（ＯＤ）をマイクロプレートリーダー（「Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ」；バイオ－ラッド社）を用いて５７０ｎｍの波長で測定した。データは標準試料を用いて作成した標準曲線に基づいて濃度に変換した。

（３－４）卵巣除去ラットを用いたｅＮＯＳタンパク質の免疫組織化学染色
上記（１－５）と同様に各ラットを群分けし、それぞれの餌を用いて３ヵ月間飼育し、次いで腹腔動脈組織を摘出し、組織切片を作製した。

組織切片について、検体中の内在性ペルオキシダーゼを、ペルオキシダーゼ除去溶液（ダコ・サイトメーションＡ／Ｓ社）を用いて室温で５分間反応させ、次いで血清フリータンパク質ブロック試薬（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ」；ダコ・サイトメーションＡ／Ｓ社）を用いてインキュベートした後に、抗ｅＮＯＳ抗体（予め希釈したもの；アブカム社）を一次抗体として適用した。

室温で９０分間インキュベートし、次いで洗浄した後、組織切片を「ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）／ＨＲＰウサギ／マウス二次抗体」（ダコ・サイトメーションＡ／Ｓ社）を用いて室温で３０分間、次いで色素原３，３’－ジアミノベンジジンと一緒にインキュベートした。マイヤーズ・ヘマトキシリン（和光純薬社）を用いて核を対比染色した。一次抗体で処理しなかった組織切片を陰性コントロールとして使用した。組織試料の染色強度を半定量的に測定した（０：なし、１：弱い、２：中程度、３：強い）。

（３－５）統計分析
測定結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計分析は、「ベルカーブ（ＢｅｌｌＣｕｒｖｅ）エクセル バージョン２．１３ ソフトウェア」（社会情報サービス社）を使用して実施し、スチールポストホックテスト；ｐ＜０．０５を有するクラスカル－ウォリス分析は統計的有意性を示すとした。

（３－６）評価結果
マイクロアレイ及びＩＰＡにより、ＢＣＥを通じて発現が変動した、血管系に関連する遺伝子の上流因子を表３に示す。

ＥＲαのｚ－スコアは２．７であり、ＨＵＶＥＣにおけるＢＣＥのフィトエストロゲン作用にはＥＲαが関係していることがわかった。

ラロキシフェンは２．３のｚ－スコアを示し、ラロキシフェンの遺伝子の下流はＢＣＥによって上方制御された。ラロキシフェンは、閉経後骨粗鬆症の予防に臨床的に有効な組織選択的ＥＲモジュレーター（ＳＥＲＭ）である。ラロキシフェンはエストロゲンと同様の挙動をすることが知られており、ヒト内皮細胞においてｅＮＯＳ酵素活性のＥＲ依存性の増強によってＮＯ産生を誘導することが示されている。

ＮＯのｚ－スコアは２．１であったので、エストラジオール及びＮＯによって調節される遺伝子セットに関連する発現変化を別途評価したところ、ＢＣＥがＮＯ合成に関連する経路に関与する遺伝子の発現レベルを有意に変化させた。

ｅＮＯＳの発現におけるアントシアニン及びＢＣＥの作用を評価するために、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析を実施した。結果を図１４に示す。

図１４Ａ及び図１４Ｂが示すとおり、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡレベルはＢＣＥ処理又はアントシアニン処理したＨＵＶＥＣ及びＥＡ．ｈｙ９２６細胞において有意な増加を認めた。ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現は、０．５及び１．０μｇ／ｍＬ ＢＣＥの両方で、用量非依存的に増加した。ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現レベルはＢＣＥの濃度の間で有意差はなく、さらにＢＣＥの最適濃度は細胞腫で異なることが示された。ＢＣＥに含まれるアントシアニンは、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現レベルを有意に増加させたが、４種のアントシアニンの間に有意差はなかった。

図１４Ｃが示すとおり、フルベストラント処理細胞では、ｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現レベルは減少したが、コントロールレベルと比較して有意差はなかった。フルベストラントは合成ＥＲアンタゴニストである。したがって、ＢＣＥがＥＲを介して媒介されるフィトエストロゲン活性を発揮し、ｅＮＯＳ発現に影響を与えると推測される。

次に、ＢＣＥ又はアントシアニンがＥＡ．ｈｙ９２６細胞においてＮＯ合成を惹起することについて、ＮＯを測定することにより評価した。結果を図１５に示す。図１５Ａが示すとおり、ＮＯレベルは、コントロール細胞よりもＢＣＥ又はアントシアニンで処理した細胞で有意に高かった。しかし、ＢＣＥ濃度の間及び４種類のアントシアニンの間に有意差はなかった。

図１５Ｂが示すとおり、フルベストラント処理細胞では、ＮＯ合成レベルは減少したが、コントロールレベルとは有意差がなかった。これらの結果はｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現と一致しており、これはＢＣＥ及びアントシアニンがｅＮＯＳ発現を介してＮＯ合成を制御し得ることを示す。

表４に示すとおり、ＢＣＥ（２．０μｇ／ｍＬ）と接触したＨＵＶＥＣの全転写マイクロアレイ分析の結果より、ＮＯ関連遺伝子であるＶＥＧＦＡ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ及びＡＫＴ１の発現が亢進した。ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現は１．７倍増加したが、他のＶＥＧＦ遺伝子の発現は実質的に変化しなかった。ただし、ＶＥＧＦＣ発現は１．２倍増加したが、ＶＥＧＦＢ発現はコントロールレベルと大差なかった。

ＢＣＥは、チロシン及びＰＩ３Ｋキナーゼが関与する機構を介して、ＶＥＧＦ発現を調節し、それによってＮＯ放出を促進し得る。マイクロアレイに基づくＰＩＫ３ＣＡ（１．４倍）及びＡＫＴ１（１．１倍）の遺伝子発現のレベルは有意に増加しなかった（表４を参照）。

さらに、ＢＣＥ処理したＯＶＸラットから血管内皮細胞の免疫組織化学的染色によって、ＰＩ３Ｋ及びホスホＡｋｔタンパク質の発現を調べた。しかし、どちらのタンパク質も明確には検出されなかった。これらの結果から、ＢＣＥがフィトエストロゲン活性を介するだけではなく、他の経路を介しても内皮細胞におけるＮＯ合成を誘発し得ることがわかった。

ｉｎ ｖｉｖｏでのｅＮＯＳタンパク質発現に対するＢＣＥの作用を検証するために、更年期モデルラットの血管内皮細胞を免疫組織化学的染色に供することにより、食餌性ＢＣＥがｅＮＯＳタンパク質の発現を増加させるかどうかを評価した。結果を図１６に示す。

図１６に示すとおり、ｅＮＯＳタンパク質発現は、質重量３％ ＢＣＥを投与したＯＶＸ ＢＣＥ群及びＳｈａｍ群において、ＯＶＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ群よりも統計的に有意に高かった。しかし、ＯＶＸ ＢＣＥ群の発現量は、Ｓｈａｍ群よりも小さかった。したがって、ＢＣＥの食餌摂取がＯＶＸラットの血管内のｅＮＯＳタンパク質レベルを改善することを示した。

以上の結果より、ＢＣＥは、フィトエストロゲン活性により、ヒト内皮細胞におけるｅＮＯＳ ｍＲＮＡ発現及びＮＯ産生を強く増加させることがわかった。さらに、食餌性ＢＣＥは、更年期モデルにおけるｅＮＯＳタンパク質発現を増加させた。これらの結果より、ＢＣＥは、閉経後の雌性個体にみられる、血管硬化といった血管症状に対して、有益な健康的効果を有し得ることがわかった。また、ＢＣＥと同じように、β－エストラジオール及び１７α－エストラジオールを含有するブルーベリー果実粉末についても、更年期モデルに対してこれらの作用を有することが示唆された。

本発明の一態様の組成物は、薄毛、血管硬化、体重増加及び脂肪増加といった更年期症状を罹患した雌性個体に対して利用可能である。

Claims (2)

1. カシス抽出物である有効成分を含有し、かつ、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸の減少による皮膚劣化以外の閉経後の雌性個体に対する更年期症状を改善する作用を有する、閉経後の雌性個体に対する更年期症状改善用組成物であって、
   前記更年期症状は、薄毛である、前記組成物。
2. 前記組成物は、経口用の組成物である、請求項１に記載の組成物。