JP7245840B2 - 電気泳動分離用分解剤としてのトリ－およびテトラ－ヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の使用 - Google Patents
電気泳動分離用分解剤としてのトリ－およびテトラ－ヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の使用 Download PDFInfo
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Description
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６１７１１０号明細書の利益および優先権を主張し、その内容は引用することによって本明細書の一部を成すものとする。
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６１７１１０号明細書の利益および優先権を主張し、その内容は引用することによって本明細書の一部を成すものとする。
［連邦政府資金援助の記述］
該当なし。
該当なし。
本発明は、分析物を含有するゲルを電気泳動による分離に供することによる、分析物の分析分野に関する。
電気泳動では、分析物は、ゲルを通して分析物を移動させる電気力に供される。典型的には、目的(interest)の１種または複数の分析物は、試料中に存在する他の成分からこれらを分離した後、これらの検出および定量化を促進するために標識されている。
試料に存在している様々な分析物を分析するための技法の１つは、電気泳動である。典型的には目的の１種または複数の分析物を含む試料は、ゲルに装填され、試料中の分析物をゲルの長さにわたって電位に供し、ゲルを通してこれらを移動させる。電気泳動による分離(electrophoretic separations)についてのいくつかの形態は、当技術分野において公知である。これらは、限定されるものではないものの、スラブゲル、キャピラリ電気泳動（「ＣＥ」）、エレクトロフィルトレーション(electrofiltration)、示差イン－ゲル電気泳動(Differential In-gel Electrophoresis)（「ＤＩＧＥ」）、ゾーン電気泳動、等電点電気泳動（「ＩＥＦ」）、ネイティブ電気泳動(native electrophoresis)、２次元電気泳動、免疫化学／免疫固定電気泳動、固定化ｐＨ勾配電気泳動(immobilized pH gradient electrophoresis)、マイクロチップ、移動境界(moving boundary)、等速電気泳動、パルスフィールド電気泳動、およびこれらの組合せを含む。キャピラリ電気泳動では、このような技法は、分子の大きさに基づいて分子を分離するキャピラリゲル電気泳動(capillary gel electrophoresis)、または「ＣＧＥ」、および電荷：質量比に基づいて分子を分離するキャピラリゾーン電気泳動(capillary zone electrophoresis)、または「ＣＺＥ」を含む。
ＣＥ、ＣＧＥおよびＣＺＥＥは、当技術分野で周知であり、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ ｂｏｏｋｌｅｔ“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”（ｕｎｄａｔｅｄ， ｂｕｔ ｆｒｏｍ１９９１－２）、Ｗｈａｔｌｅｙ，Ｈ．，Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｉｎ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｍｏｈａｍｍａｄ，ｅｄｓ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００１）、およびＬａｕｅｒ ａｎｄ Ｒｏｚｉｎｇ，ｅｄｓ．，Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ（２０１４）を含む文献にて広範囲に教示されている。ＣＧＥは、タンパク質と核酸を分離するために、数十年にわたって使用されてきている。例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２０１２ Ｊａｎ ４；７０９：２１－３１を参照されたい。
様々なタイプの化合物を分離するために、異なる電気泳動の技法を使用することができる。グリカンの相互からの分離、特に電気泳動の技法によるＮ－グリカンの分離は、これらの複数タイプの化合物の各々の特性に起因して、タンパク質または核酸を相互から分離するよりも挑戦的なものである。例えば、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＣＧＥ－ＬＩＦ：Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００８，２９，４２０３－４２１４，ａｔ ４２０４を参照されたい。典型的には、ＣＧＥによって分析されるグリカンは、例えば、レーザー誘起蛍光（「ＬＩＦ」）またはＵＶ光による検出を可能とするために、荷電したフルオロフォアまたはＵＶ可視染料で標識されている。例えば、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，ｓｕｐｒａ，Ｒｅｕｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ，”２０１４，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２６７１２を参照されたい。
電気泳動分離用の検出システムは、吸収、蛍光、質量分析、伝導性、電位差測定、または電流測定を含んでもよい。しかし、目的の１種または複数の分析物の正確な検出および定量化は、電気泳動による分離が実施される条件下で目的の分析物と共移動する(co-migrate)、試料中に存在する他の化合物の存在に起因して困難となる。このような共移動(co-migration)を低減することによって、分析される試料中に存在する目的の分析物の分解能は改善されるであろう。今日まで、電気泳動による分離を受ける試料の成分の共移動を低減する、このような試料中の他の成分からの目的の分析物の分解能を改善するための組成物および方法は、未だ報告されていない。
したがって、分析物および成分、特に電気泳動による分離、例えば、ＣＥまたはＣＧＥ中に一緒に共移動するグリカンの分解能を改善する、組成物および方法への需要が依然として存在している。しかし、驚くべきことに、本発明はこれらの及び他の需要を満たすものである。
本発明は、標識された分析物の電気泳動による分離を改善するための組成物、方法、システム、およびキットを提供する。実施形態に係る第１のグループでは、本発明は、分析物の電気泳動による分離のためのゲルを提供する。ゲルは、構造１の１種もしくは複数の化合物(one or more compounds)、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１は、
であり、前記構造２は、
である。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の２種以上の化合物(two or more compounds)を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造２の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の１種または複数の化合物および構造２の１種または複数の化合物を含む。いくつかの実施形態では、構造１の１種の化合物は、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、ＴＨＭＨは、安定化剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、電気泳動による分離は、キャピラリ電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゲル電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゾーン電気泳動である。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で存在する。
実施形態に係る別のグループでは、本発明は、目的の分析物のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）による分離のためのカートリッジまたはキャピラリであって、カートリッジまたはキャピラリにゲルが装填されており、ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１は、
であり、前記構造２は、
である、カートリッジまたはキャピラリを提供する。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造２の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の１種もしくは複数の化合物および構造２の１種もしくは複数の化合物を含む。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物は、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、ＴＨＭＨは安定化剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、ゲルはポリエチレンオキシドをさらに含む。いくつかの実施形態では、目的の分析物は、標識されたグリカンである。いくつかの実施形態では、カートリッジまたはキャピラリは、カートリッジである。いくつかの実施形態では、カートリッジまたはキャピラリは、キャピラリである。いくつかの実施形態では、キャピラリは、未被覆である壁を備えた内部ルーメン(interior lumen)を有する。いくつかの実施形態では、キャピラリは、（ａ）目的の前記分析物のＣＥを妨げず、（ｂ）各運転間で前記キャピラリを調整することなく、目的の分析物の分解能が少なくとも５回の運転で劣化することを防ぐ、コーティングで被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する。いくつかの実施形態では、コーティングは目的の分析物のＣＥを妨げず、各運転間で前記キャピラリを調整することなく、分析物の分解能が少なくとも１０回の運転で劣化することを防ぐ。いくつかの実施形態では、壁のコーティングは、ポリビニルアルコールである。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する。
実施形態に係る更なるグループでは、本発明は、分析物の電気泳動による分離のためのシステムであって、（ａ）電気泳動による分離を実施するための装置と、（ｂ）電気泳動による分離を実施するためのゲルであり、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、構造１は、
であり、前記構造２は、
である、ゲルとを含む、システムを提供する。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造２の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の１種もしくは複数の化合物、および構造２の１種もしくは複数の化合物を含む。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物は、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、ＴＨＭＨは、安定化剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、電気泳動による分離は、キャピラリ電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゲル電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゾーン電気泳動である。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．２％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する。
実施形態に係るなお更なるグループでは、本発明は、標識された分析物の電気泳動による分離を実施する方法であって、（ａ）ゲルに前記分析物を装填するステップであり、そのゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１は、
であり、前記構造２は、
であるステップと、ゲル中の標識された分析物を電位に供し、それによって標識された分析物の電気泳動による分離を実施するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造２の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の１種もしくは複数の化合物および構造２の１種もしくは複数の化合物を含む。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物は、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、ＴＨＭＨは、安定化剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、電気泳動による分離は、キャピラリ電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゲル電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゾーン電気泳動である。いくつかの実施形態では、標識された分析物は、標識されたグリカンである。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物は、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する。いくつかの実施形態では、標識されたグリカンは、複数のスルホン酸部分を有する染料で標識される。いくつかの実施形態では、標識されたグリカンは、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識される。
実施形態のまた更なるグループでは、本発明は、電気泳動による分離を実施するためのキットであって、（ａ）ゲルを保持する容器であり、ゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、構造１は、
であり、構造２は、
である容器と、（ｂ）緩衝剤とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造２の２種以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、構造１の１種もしくは複数の化合物および構造２の１種もしくは複数の化合物を含む。いくつかの実施形態では、構造１の１種もしくは複数の化合物は、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、ＴＨＭＨは、安定化剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、前記ゲルを保持する容器は、カートリッジまたはキャピラリである。いくつかの実施形態では、カートリッジまたはキャピラリは、カートリッジである。いくつかの実施形態では、前記カートリッジまたはキャピラリは、キャピラリである。いくつかの実施形態では、キャピラリは、未被覆である壁を備えた内部ルーメンを有する。いくつかの実施形態では、キャピラリは、被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する。いくつかの実施形態では、キャピラリの壁のコーティングは、ポリビニルアルコールである。
試料中にどの分析物が存在するかを決定することは、いくつかの状況で重要である。例えば、どの炭水化物（または「グリカン(glycans)」）が複合糖質、例えば、糖タンパク質に結合しているかを決定することは、薬物動態学、免疫原性、および糖タンパク質の潜在的な治療有効性を理解するために重要である。その結果、目的の分析物、例えば、所与の試料に存在するグリカンの検出を改善することは望ましいであろう。
しばしば、試料中に存在する分析物は、電気泳動によって分析物を分離し、次に分離された分析物を検出することによって検出される。背景技術で述べたように、いくつかの電気泳動による分離技法は、当技術分野で公知である。これらは、限定されるものではないが、スラブゲル、キャピラリ電気泳動（「ＣＥ」）、エレクトロフィルトレーション、示差イン－ゲル電気泳動（「ＤＩＧＥ」）、ゾーン電気泳動、等電点電気泳動（「ＩＥＦ」）、ネイティブ電気泳動、２次元電気泳動、免疫化学／免疫固定電気泳動、固定化ｐＨ勾配電気泳動、マイクロチップ、移動境界、等速電気泳動、パルスフィールド電気泳動、およびこれらの組合せを含む。キャピラリ電気泳動の範囲内で、技法は、分子の大きさに基づいて分子を分離するキャピラリゲル電気泳動、または「ＣＧＥ」、および電荷：質量比に基づいて分子を分離するキャピラリゾーン電気泳動、または「ＣＺＥ」を含む。
電気泳動の技法が多くの分析物の良好な分離をしばしば与える一方で、いくつかの分析物、特にグリカンは互いに共移動し、どれがどんな量で存在するのかについて決定することを困難にする。所与の試料中に存在する分析物、例えば、標識されたグリカンの共移動を低減することによって、試料中に存在する分析物の分解能が改善されるであろう。残念ながら、分析物、例えば、標識されたグリカンの共移動を低減し、したがって分析物の分解能を改善する組成物および方法があったとしても、今日までほとんど存在していない。
驚くべきことに、以前に主として半導体の洗浄に使用された化合物である、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（ＣＡＳ Ｎｏ．３３６６７－４８－０；この化合物は、本明細書にて「ＴＨＭＨ」または「ＴＥＭＡＨ」と時に呼称する。）が低濃度でゲル中に存在することにより、標識された分析物がゲル中で電気泳動による分離に供された場合、ある特定の標識で標識された分析物の分解能が著しく改善されることを我々は見出した。例えば分析物、例えば、ＣＡＳ名称／番号が１，３，６－ピレントリスルホン酸８－アミノ－三ナトリウム塩／１９６５０４－５７－１であるＡＰＴＳ（８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム塩）で標識されたグリカン、米国特許第８１２４７９２号および同第８４４５２９２号によって教示されるＡＰＴＳの活性化された形態で標識されたグリカン、または複数のスルホン酸部分を備える他の標識で標識されたグリカンは、電気泳動中に少量のＴＨＭＨがゲル中に存在すると、ＣＧＥによってより良好に分解され得る。本発明の基礎となる研究では、ゲル中のＴＨＭＨの存在によって、ＣＧＥ分離での分離が広がり、分析物の分解能が改善された。本発明の基礎となるいくつかの研究は、ＣＧＥ分離で分解することが特に困難であり得るグリカンである、Ｍａｎ５（本明細書では、時に「Ｍａｎ－５」または「Ｍａｎ－５グリカン」とも呼称する。）の分離へのＴＨＭＨの影響を、ゲル中において単独でＭａｎ５の十分な分離を与えないＡＰＴＳを使用して試験した。ＴＨＭＨはゲル分離中にＭａｎ５のピーク形状を維持するのを助け、さらに、いくつかの運転にわたってそうであることを、研究は示した。実務者が認識するように、手順中にピークが広がると起こり得る、接近して共移動する分析物のピークがオーバーラップすることを避けるのを助けるので、分析物の分離でピーク形状を維持することは望ましい。
すべての電気泳動の技法が、電場の影響下でゲルを通る分析物の動きに依存するものと考えれば、ＣＧＥシステムを使用した研究で得られる結果は、ゲルを使用する電気泳動の他の形態、特にマイクロ流体の環境で電気泳動による分離が行われる実施形態でも得られると考えることができる。さらに、電場の影響下でゲルを通る目的の化合物の動きは、分析される化合物のタイプに関係なく電気泳動の技法の特徴であるので、グリカンの分解能を増加させることが好ましい実施形態であるが、本明細書で議論するＴＨＭＨおよび他の化合物の使用も、他の標識された炭水化物およびそれらを含有する化合物の分解能を増加させると考えられる。
ＴＨＭＨは、いくつかの実施形態で使用するための、第四級アンモニウム化合物の好ましい実施形態である。しかしながら、メチル基および３つの末端ヒドロキシル基を含有し、メチル基はＴＨＭＨのように直接ではないが、炭素数１～５のアルキルリンカーを通して窒素に結合している他の第四級アンモニウム化合物を使用して、電気泳動による分離で分析物の分解能を改善する類似の結果が得られると考えられる。その結果、これらの実施形態では、トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物は、構造１で示される構造を有する。構造１：
構造１の化合物は、本明細書にて、時に「トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物(trihydrocyl quaternary ammonium compounds)」と呼称する。
ＴＨＭＨのメチルが、代わりに、直接または炭素数１～５のアルキルリンカーを通して窒素に結合し得る第４のヒドロキシル基である、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物を使用して、電気泳動による分離で分析物の分解能を改善する類似の結果が得られるとさらに考えられる。そのため、これらの実施形態では、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物は、構造２で示される構造を有する。構造２：
構造２の化合物は、本明細書にて、時に「テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物(tetrahydroxyl quaternary ammonium compounds)」と呼称する。好ましい実施形態では、構造２の化合物のヒドロキシル基は、窒素に直接結合する。いくつかの実施形態では、構造２の化合物は、ヒドロキシル基と窒素の間に１つの炭素を有する。いくつかの実施形態では、構造２の化合物は、ヒドロキシル基と窒素の間に２つの炭素を有する。いくつかの好ましい実施形態では、構造２の化合物は、ヒドロキシル基と窒素の間に３つの炭素を有する。いくつかの好ましい実施形態では、構造２の化合物は、ヒドロキシル基と窒素の間に４つの炭素を有する。いくつかの好ましい実施形態では、構造２の化合物は、ヒドロキシル基と窒素の間に５つの炭素を有する。
本発明に係る組成物および方法は、ハイブリッド技法を含む、分析物の大きさ分離用のゲルを使用する電気泳動による分離に特に適している。いくつかの実施形態では、ゲルを使用する電気泳動による分離は、キャピラリ電気泳動である。いくつかの実施形態では、キャピラリ電気泳動は、キャピラリゲル電気泳動である。
上述したトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物は、個々に使用できる、またはトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物もしくはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の両方の混合物、または２つのトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の混合物、または２つのテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の混合物として使用できる。１種または複数の分析物の試料を、試験する化合物または化合物の混合物で作られた第１のゲルであるゲル１での分離に導入し、複製試料を、１種または複数の試験化合物を有さない第２のゲルであるゲル２の中へ導入し、試験試料がゲル１で分離された場合に、試験試料がゲル２で分離された場合と比較して、選択した分析物の分解能が（ａ）改善された、（ｂ）同じ、または（ｃ）より悪い、を決定することによって、任意の特定のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物を容易に試験して、目的の１種または複数の分析物の分解能を改善するかどうかを決定できる。例えば、目的の分析物が、例えば、ＡＮＴＳ、ＡＰＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）（ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で標識されたグリカンのＭａｎ５、Ａ１ＦおよびＧ０Ｆ－Ｎである場合、それらを試験量の試験化合物または混合物を含有している第１のゲル中でＣＧＥに供し、第１のゲルとの唯一の違いが試験化合物または混合物の不在である第２のゲル中でＣＧＥによって分離された場合より、異なる標識された目的のグリカンが相互から良好に分離されるか否かを見ることができる。
典型的には、化合物または混合物は、ゲル組成物へ溶液として簡便に導入され得るが、ゲルマトリックスを形成するために使用される緩衝剤中へ粉末として混合できる、または当技術分野で公知の他の簡便な方法で導入できる。トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の溶液は、少量の抗菌剤をさらに含んでもよい。ＴＨＭＨは、例えば、薬剤ＭＥＨＱ（４－メトキシフェノール、ＣＡＳ Ｎｏ．１５０－７６－５）で安定化され、水中にて４０～５０％の濃度で、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ ＯＲ）から市販されている。ＴＨＭＨを用いて行われた本開示の基礎となる研究で達成された良好な結果は、ＴＨＭＨの存在に起因し、研究で使用するＴＨＭＨ中に存在する少量のＭＥＨＱに起因しないと考えられる。
異なる電気泳動の適用で使用するゲルを作るためのレシピは、当技術分野で周知である。目的の１種または複数の分析物の分析に使用される、特定の電気泳動の技法に好適なレシピに、当業者は精通していると予想される。いくつかの好ましい実施形態では、ゲルのレシピは、キャピラリ電気泳動で使用するゲル用である。いくつかの好ましい実施形態では、ゲルのレシピは、キャピラリゲル電気泳動で使用するゲル用である。トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物もしくはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の両方の混合物、または２種もしくはそれ以上(two or more)のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の混合物、または２種もしくはそれ以上のテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物の混合物は、好ましくは０．００５％～５％、０．００７５％～４％、０．０１％～３％、０．０２５％～２％、０．０２５％～１％、０．０５％～０．７５％、０．０５％～０．６０％、０．０７５％～０．５０％、０．０７５％～０．４％、０．０７５％～０．３％、０．０７５％～０．２％、０．０７５％～０．１５％、０．０８％～０．１２５％、０．８５％～０．１２５％、０．０９％～０．１２０％、０．０９％～０．１１５％、０．０９％～０．１１％、および０．１％の量で、選択したゲルのレシピに添加され得る。他の接近して共移動するグリカンからＭａｎ５を分離するには、百分率０．１％が最善であることが見出された。目的の異なるグリカンの分離で最良に機能する１種または複数の第四級アンモニウム化合物の百分率は、他のグリカンからＭａｎ５を分離するために見出されるものとは異なる可能性があるが、上述の百分率の範囲内であり、任意の特定のグリカンまたは他の標識された炭水化物に最良に機能する百分率または濃度は、本開示で教示される試験法を使用して容易に決定できると予想される。百分率は、ｗｔ／ｗｔ基準、またはｖ／ｖ基準で計算できる。２つの計算は非常に類似するものであるが、どの計算を使用するかによって、化合物の最適な濃度に僅かな差があり得る。本研究の過程での研究で、両方の計算を使用して混合物を作り、機能的な差は見られなかった。
電気泳動ゲルを作るためにレシピに添加する、少量のＴＨＭＨまたは他のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはこれらの混合物は、ゲルのレシピの中へ導入するためにピペットで計るまたは他の方法で操作することは困難であり得る。ＴＨＭＨまたは他のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物を含む溶液は、したがって時には最初に２倍～１０倍希釈して、導入する化合物を含有する溶液の量を提供する。例えば、ＴＨＭＨ原液（４５～５０％ｗ／ｗ）は、約５％の作業濃度(working concentration)のために、ＭＥＨＱを含有する水で１０倍希釈できる。次に、ＴＨＭＨのこの作業濃度をゲル混合物に添加して、ゲル中に０．０５～０．５％のＴＨＭＨの最終濃度を有するゲルを形成する。いくつかの実施形態では、中間溶液の必要性を回避することによって、最終溶液の正確性を増加させることが望ましい。これらの実施形態では、レシピに添加される、ＴＨＭＨまたは他のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはテトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物またはこれらの混合物（「添加物」）は、添加物を計算された所望の濃度へ希釈するのに必要なゲル溶液の重量、添加物を希釈するのに使用する量でゲルを保持するのに好適な容器中に設置される添加物の重量、および容器中の添加物に直接的に添加されるゲル溶液の重量を量り分けることができる。次に、好ましくは、粘性の溶液を混合するために実験室で使用される技法、例えば、回転台に容器を設置すること、または磁気撹拌機を使用することにより、ゲル溶液と添加物は混合される。
結果として得られるゲル中に存在する、トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の任意の特定の濃度を容易に試験して、それが電気泳動装置中で使用に推奨される電流の量を超える電流を生じるかどうかを確かめることができ、超える場合、その特定のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物のその特定の濃度は好ましくないものである。トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物を、好ましくは選択したゲルのレシピの他の成分に添加し、撹拌して、トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の均一な分布をゲル中に得る。
同様に、任意の特定のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の任意の特定の濃度は、分析物の試験試料を、１種または複数の化合物の試験濃度で作られた第１のゲルであるゲル１での分離、および１種または複数の試験化合物を有さない第２のゲルであるゲル２での分離に供し、試験試料をゲル１で分離した場合に、試験試料をゲル２で分離した場合と比較して、選択した分析物の分解能が改善された、同等、またはより悪いかを決定することにより、目的の１種または複数の分析物の分解能を改善する際のその効果に関して容易に試験することができる。例えば、目的の分析物が、例えば、ＡＮＴＳ、ＡＰＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）（ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で標識された、Ｍａｎ５、Ａ１ＦおよびＧ０として当技術分野で公知のグリカンである場合、これらを試験化合物または混合物の試験量でＣＧＥに供して、目的の異なる標識されたグリカンを相互から分離することに、ゲルが成功するかどうかを見ることができる。特定量の特定のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物が、トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の非存在下で実施した同様の分離と比較して、特定の分析物の分解能を改善するのに成功するかどうかを決定するために、ＡＮＴＳ、ＡＰＴＳまたはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）以外の標識によって標識された分析物を同様に使用することができる。所与のゲルのレシピで、選択した分析物の分解能を改善するが、電気泳動による分離を行うために使用する装置の過熱をもたらさない、特定のトリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の量が、トリヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、テトラヒドロキシル第四級アンモニウム化合物、またはこれらの混合物の有効な量であると考えられる。
［定義］
本明細書にて、「ゲル」、「ゲルマトリックス」および「ふるい分けマトリックス(sieving matrix)」というフレーズは、同意語である。
本明細書にて、「ゲル」、「ゲルマトリックス」および「ふるい分けマトリックス(sieving matrix)」というフレーズは、同意語である。
例えば、ＣＧＥまたはゲルを使用するハイブリッドＣＥ手順(hybrid CE procedures)によって、電気泳動による分離を実施する文脈において、「分解能(resolution)」という用語は、分離するために使用される分析システムにおいて、他の場合には一緒に移動する２つの分析物を識別する能力を指す。参照の便宜上、本明細書にて「ＣＧＥ」という用語は、文脈により他に必要とされない限り、ゲルを使用するハイブリッドＣＥ手順を含む。
目的の分析物の標識に関する「標識(label)」という用語は、目的のその分析物に、蛍光性の部分またはＵＶ可視染料を化学的に結合することを意味している。
指定された化合物「と反応することによって分析物は標識された(analyte has been labeled by being reacted with)」というフレーズは、標識された分析物に結合した標識が、蛍光性部分またはＵＶ可視染料で分析物を標識させる条件下で、分析物が指定された化合物と接触した後に残存する標識であることを意味している。
［Ｍａｎ５］
哺乳類の抗体および融合タンパク質は重要であり、非常に高価な治療薬のグループであり、典型的には商業的な醗酵システムで製造されている。抗体または融合タンパク質の製造中に、「Ｍａｎ５」（マンノペンタオース－ジ－（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）、または「オリゴマンノース－５グリカン」、ＣＡＳ Ｎｏ．６６０９１－４７－２、「Ｍａｎ－５」もしくは「Ｍａｎ－５グリカン」としても公知である。）として公知のグリカンのレベルをモニタリングすることは、醗酵システムがストレス下にあることのマーカーとして機能することができ、望ましくは生産ロットを節約するのに間に合う介在を可能とする。Ｍａｎ－５グリカンに関する以下の構造
は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈウェブサイト（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られる。
哺乳類の抗体および融合タンパク質は重要であり、非常に高価な治療薬のグループであり、典型的には商業的な醗酵システムで製造されている。抗体または融合タンパク質の製造中に、「Ｍａｎ５」（マンノペンタオース－ジ－（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）、または「オリゴマンノース－５グリカン」、ＣＡＳ Ｎｏ．６６０９１－４７－２、「Ｍａｎ－５」もしくは「Ｍａｎ－５グリカン」としても公知である。）として公知のグリカンのレベルをモニタリングすることは、醗酵システムがストレス下にあることのマーカーとして機能することができ、望ましくは生産ロットを節約するのに間に合う介在を可能とする。Ｍａｎ－５グリカンに関する以下の構造
［ＣＥおよびＣＧＥ］
様々な分析物を分離するために、キャピラリ電気泳動およびＣＧＥは２０年にわたって使用されてきている。したがって、実務者はＣＧＥおよびゲルを使用するハイブリッドＣＥ法を実施するための当技術分野で使用される様々な手順および試薬に精通しており、これらの手順および試薬についてここで長々と議論する必要はないと予想される。例えば、一般にＣＥおよび特にＣＧＥは、テキスト、例えば“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｖｏｌｕｍｅ９，Ａｈｕｊａ ａｎｄ Ｊｉｍｉｄａｒ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００８）、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ａｌｔｒｉａ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２０１０）、および“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，”Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｒｉｅｄｒ，Ｖｉｅｗｅｇ＆Ｓｏｈｎ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ（１９９６）にて詳細に議論されている。特に炭水化物のＣＥについても、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１３），Ｔｈｉｂａｕｌｔ ａｎｄ Ｈｏｎｄａ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３）、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｏ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”Ｖｏｌｐｉ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２０１１）および“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｅｌ Ｒａｓｓｉ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ（１９９５）を含む、いくつかのテキストにて教示されている。最後の引用文献の第８章では、炭水化物および複合糖質の分析のための、ＣＺＥとＣＧＥの両方を含む様々なＣＥ技法の使用について議論されている。
様々な分析物を分離するために、キャピラリ電気泳動およびＣＧＥは２０年にわたって使用されてきている。したがって、実務者はＣＧＥおよびゲルを使用するハイブリッドＣＥ法を実施するための当技術分野で使用される様々な手順および試薬に精通しており、これらの手順および試薬についてここで長々と議論する必要はないと予想される。例えば、一般にＣＥおよび特にＣＧＥは、テキスト、例えば“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｖｏｌｕｍｅ９，Ａｈｕｊａ ａｎｄ Ｊｉｍｉｄａｒ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００８）、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ａｌｔｒｉａ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２０１０）、および“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，”Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｒｉｅｄｒ，Ｖｉｅｗｅｇ＆Ｓｏｈｎ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ（１９９６）にて詳細に議論されている。特に炭水化物のＣＥについても、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１３），Ｔｈｉｂａｕｌｔ ａｎｄ Ｈｏｎｄａ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３）、“Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｏ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”Ｖｏｌｐｉ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２０１１）および“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｅｌ Ｒａｓｓｉ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ（１９９５）を含む、いくつかのテキストにて教示されている。最後の引用文献の第８章では、炭水化物および複合糖質の分析のための、ＣＺＥとＣＧＥの両方を含む様々なＣＥ技法の使用について議論されている。
［ゲル、カートリッジ、キャピラリおよび標識］
様々な分析物の電気泳動による分離のためのゲルは、当技術分野で周知であり、実務者によって選択される特定の電気泳動の技法で、目的の分析物の特性用に調整された、異なる組成物を含有する。ゲルを含む選択された電気泳動による分離技法、ならびにグリカンおよび炭水化物を含有する他の化合物のための技法によって、目的の特定の分析物を電気泳動による分離に供するために、当業者は当技術分野で使用される様々なゲルに精通していると予想される。
様々な分析物の電気泳動による分離のためのゲルは、当技術分野で周知であり、実務者によって選択される特定の電気泳動の技法で、目的の分析物の特性用に調整された、異なる組成物を含有する。ゲルを含む選択された電気泳動による分離技法、ならびにグリカンおよび炭水化物を含有する他の化合物のための技法によって、目的の特定の分析物を電気泳動による分離に供するために、当業者は当技術分野で使用される様々なゲルに精通していると予想される。
グリカン分離のいくつかの実施形態では、本発明に係る方法および組成物で使用される特にＣＧＥ分離用のゲルは、米国特許第８１６３１５２号（「’１５２特許」）における第１２列第１５～２３行に教示される通りである。いくつかの好ましい実施形態では、ゲルは、以下の変更とともに、’１５２特許における第１２列第２５～３５行に明記されたレシピに従って作られる。（１）レシピに明記された７００００００ｍｗｔ ｇ／ｍｏｌのポリエチレンオキシド（「ＰＥＯ」）は、分子量７００００００のＰＥＯが現在市販されていないので、８００００００のｍｗｔ ｇ／ｍｏｌのＰＥＯと置き換え、（２）ＥｔＢｒは省く（この変更されたレシピを、本明細書では時に「変更ＰＥＯゲル」と呼ぶ。）。いくつかの実施形態では、レシピに明記された、より大きなおよびより小さなＰＥＯのｍｗｔ ｇ／ｍｏｌは、独立して、述べられているｍｗｔ ｇ／ｍｏｌ値の±２０％であり得る。また、使用されるＰＥＯの大きさに関係なく、好ましくはＥｔＢｒをゲルから省く。’１５２特許は、引用することによってその全体が本明細書の一部を成し、上に引用した部分は特に本明細書に組み込まれるものである。当業者にとって既知であるように、「ＰＥＯ」および「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、化学的に同意語であるが、「ＰＥＧ」は、２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満のポリマーを指すために典型的には使用される一方で、「ＰＥＯ」は、そのポイントを超えるポリマーを指すために典型的には使用される。
目的の分析物がグリカンであるいくつかの実施形態では、ゲルは、グリカンのキャピラリゲル電気泳動用に使用されるＰＥＯ以外の化合物、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から構成され得る。特に好ましいゲルはＰＥＯであるが、他の中性親水性ポリマー、例えば、アルキルセルロース、ポリビニルアルコール、デキストラン、またはポリアクリルアミドを使用することができる。
電気泳動による分離のために使用するゲルは、当技術分野にて公知である任意の手段によって調製できる。構造１、構造２、またはこれらの混合物の化合物を、ゲルが形成される前に簡便に試薬に添加し、構造１、構造２、またはこれらの混合物の化合物のゲル内での均一な分布を可能にする。多くの機器では、ゲルを１つもしくは複数の容器に配置し、キャピラリの端をゲル内へ導入して、典型的には空気圧によってゲルをキャピラリ内に送る。
いくつかの実施形態では、ゲルをカートリッジに配置し、カートリッジに流動的に接続されたキャピラリに送り、試料の分析の間にキャピラリ内のゲルの変更を促進できる。カートリッジは、例えば、ＧＬ１０００グリカン分析計（ＢｉＯｐｔｉｃ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ（Ｒ．Ｏ．Ｃ））で使用するように構成されたゲルカートリッジのように、典型的にはカートリッジを受け入れるように構成された分析機器で使用するように設計されており、好ましくはゲルの速やかな変更を可能にし、一連の分析を促進する。典型的には、ゲルは大量に製造され、カートリッジ内へ分配され、次に、カートリッジを受け取るように構成された機器でＣＧＥ分離を実施するために、カートリッジを使用することを意図する実務者が、選択したゲルですでに満たされたカートリッジを購入する。
グリカンの分析では、好適な標識としては、ＡＰＴＳおよびＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）（ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）が挙げられる。ＡＮＴＳ（典型的には、８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸二ジナトリウム塩、ナトリウム塩水和物、ＣＡＳ Ｎｏ．５３９８－３４－５として購入される。）、およびグリカン用の他のポリスルホネート標識も使用できる。構造１、構造２、またはこれらの混合物の化合物は、目的の分析物を標識するために使用される標識が複数のスルホン酸部分を含む電気泳動による分離に、特に有用であると考えられる。
［他のグリカンからのＭａｎ－５グリカンの分離］
前述したように、発酵槽におけるＭａｎ５のレベルの変更は、価値ある治療薬、例えば、抗癌性治療薬としてＦＤＡによって承認された抗体の１つの全製造運転の喪失をもたらすおそれがある、発酵反応でのストレスを示す可能性がある。その結果、システムに存在するＭａｎ５の量を決定することが重要となった。残念ながら、Ｍａｎ５と共移動する他のグリカンが存在する可能性があるので、従来のＣＧＥゲルを使用してＣＧＥによりＭａｎ５の量をモニタリングすることは、困難であった。グリカンがＡＰＴＳで標識される場合、Ｍａｎ５と共移動するグリカンは、Ａ１Ｆ、Ｇ０およびＧ０Ｆ－Ｎである。グリカンがＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識される場合、ＭＡＮ－５グリカンと共移動するグリカンは、Ｇ０Ｆ－ＮおよびＡ１Ｆである。前述したように、本開示の基礎となる研究では、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨは、Ｍａｎ－５グリカンがＡＰＴＳで標識された場合に、他の接近して共移動するグリカンからのＭａｎ－５グリカンの分解能を改善することを示した。特に、ＡＰＴＳで標識されたＭａｎ－５グリカンのピーク形状は、分離中に維持され、Ｍａｎ－５グリカンをＧ０Ｆ－Ｎ、Ｇ０、およびＡ１Ｆから識別することをより容易にした。
前述したように、発酵槽におけるＭａｎ５のレベルの変更は、価値ある治療薬、例えば、抗癌性治療薬としてＦＤＡによって承認された抗体の１つの全製造運転の喪失をもたらすおそれがある、発酵反応でのストレスを示す可能性がある。その結果、システムに存在するＭａｎ５の量を決定することが重要となった。残念ながら、Ｍａｎ５と共移動する他のグリカンが存在する可能性があるので、従来のＣＧＥゲルを使用してＣＧＥによりＭａｎ５の量をモニタリングすることは、困難であった。グリカンがＡＰＴＳで標識される場合、Ｍａｎ５と共移動するグリカンは、Ａ１Ｆ、Ｇ０およびＧ０Ｆ－Ｎである。グリカンがＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識される場合、ＭＡＮ－５グリカンと共移動するグリカンは、Ｇ０Ｆ－ＮおよびＡ１Ｆである。前述したように、本開示の基礎となる研究では、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨは、Ｍａｎ－５グリカンがＡＰＴＳで標識された場合に、他の接近して共移動するグリカンからのＭａｎ－５グリカンの分解能を改善することを示した。特に、ＡＰＴＳで標識されたＭａｎ－５グリカンのピーク形状は、分離中に維持され、Ｍａｎ－５グリカンをＧ０Ｆ－Ｎ、Ｇ０、およびＡ１Ｆから識別することをより容易にした。
［未被覆および被覆キャピラリ］
前述のように、本開示の基礎となる研究は、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨがキャピラリ電気泳動中に存在することにより、いくつかの分解困難なグリカンの分解能に著しい改善をもたらすことを見出した。したがって、分析物のＣＥ分離での第四級アンモニウム化合物の存在は有利であり、他の場合には目的の１種または複数の分析物と共移動する他の分析物から識別することが困難な、目的の分析物の存在に対して、試料を分析する能力を改善するために使用できる。いくつかの好ましい実施形態では、第四級アンモニウム化合物は、ＴＨＭＨである。いくつかの好ましい実施形態では、分析物は、グリカンであり、使用するゲルは、グリカンを分析する際に使用するのに好適である。
前述のように、本開示の基礎となる研究は、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨがキャピラリ電気泳動中に存在することにより、いくつかの分解困難なグリカンの分解能に著しい改善をもたらすことを見出した。したがって、分析物のＣＥ分離での第四級アンモニウム化合物の存在は有利であり、他の場合には目的の１種または複数の分析物と共移動する他の分析物から識別することが困難な、目的の分析物の存在に対して、試料を分析する能力を改善するために使用できる。いくつかの好ましい実施形態では、第四級アンモニウム化合物は、ＴＨＭＨである。いくつかの好ましい実施形態では、分析物は、グリカンであり、使用するゲルは、グリカンを分析する際に使用するのに好適である。
現行のほとんどのＣＥ機器は、試料の各運転間にキャピラリを洗浄し、新しいゲルをキャピラリ内へ導入するように設計されている。このような洗浄は、キャピラリを「再生する(regenerating)」または「調整する(conditioning)」と呼ばれ、再現性を改善するために多くのＣＥ手順で使用されている。例えば、Ｄ．Ｈｅｉｇｅｒ，ＨＩＧＨ ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ，ＡＮ ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ５９６８－９９６３Ｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００）（“Ｈｅｉｇｅｒ”），ｐ．９２には、キャピラリを強塩基、強酸、有機化合物、例えば、メタノールもしくはＤＭＳＯ、または洗浄剤で洗浄し、すすぎによる洗浄を伴うことによって、キャピラリを調整できると記載されている。
各運転の間にキャピラリを洗浄してそれらを調整することによって、キャピラリの分解能は確かに維持されるが、複数の分析を実施しなければならない場合、それは相当な時間も追加する。キャピラリを洗浄し、すすぎ、新しいゲルを再充填するステップには時間がかかり、分析が完了するのに要する時間を２倍またはそれ以上にするおそれがある。各運転間にキャピラリを調整する必要性を低減することによって、複数の運転を実施するのに必要な時間を除去または低減することは望ましいものであろう。
ＰｒｏＺｙｍｅのＧｌｙ－Ｑ（商標）Ｇｌｙｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍは、各運転間でキャピラリを調整する必要を伴わずに、再現可能な結果を提供する。典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨをシステムで使用するゲルに添加すると、他の場合にはＭａｎ５と共移動するのであろう試料中の他の標識されたグリカンから、標識されたＭａｎ５を分解する能力を著しく改善することが見出された。しかしながら、何回か運転をした後、その能力は劣化した。標識されたグリカンを表すピークが広がって重なるおそれがあり、Ｍａｎ５と接近して共移動する試料中の他の標識されたグリカンから、標識されたＭａｎ５を分解する能力を低下させるまでに、典型的には２０～５０回運転できる可能性がある。
本開示の基礎となる研究では、酸を備える溶液（研究では、酢酸）または低ｐＨを備える溶液（研究では、０．１ＭのＭＥＳ、（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、３．５ｐＨ）でのキャピラリの洗浄、続いて水でのすすぎ、および典型的な第四級アンモニウム化合物を含有する新しいゲルによって、キャピラリの能力が維持され、典型的な分析物として使用されるグリカンの優れた分解能が提供された。理論によって拘束されることを望むものではないが、調整せずに同じキャピラリで複数分離した後、第四級アンモニウム化合物のアミンとキャピラリの壁との相互作用により、分解能の低下がもたらされるおそれがあり、キャピラリを調整すると、この相互作用が除かれるものと考えられる。キャピラリの調整に他の従来の試薬を使用した場合、同様の結果が得られるものと予想される。したがって、本発明に係る組成物および方法は、キャピラリ調整用の標準的な手順を使用して各運転間でキャピラリを洗浄する機器と、使用の適合性がある。
キャピラリの洗浄は、ＴＨＭＨを使用して、他の接近して移動するグリカンからのＭａｎ５の分解能を改善することを可能にしたが、それは、Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇｌｙｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、分析に使用するキャピラリを調整するのに必要な時間を除去することによって、グリカン分析の全体の時間を低減する能力を減少させた。ゲル中にＴＨＭＨが存在する場合に、キャピラリを調整する必要性を低減するために、別の手法を用いた。
先の段落で報告した研究は、内部が被覆されていないキャピラリを使用して実施した。（実務者が認識するように、すべてでなくとも殆どのキャピラリは、これらの脆性を低減するために、これらの外部は被覆されている。）キャピラリの内部がいくつかのコーティングのいずれかで被覆されたキャピラリは、市販されており、典型的には分析物と壁の相互作用を防ぐために存在している。本発明者らは、ゲル添加剤、例えば、第四級アンモニウム化合物の性能を改善するために使用されているコーティングの存在を知らない。
本開示の基礎となる研究では、恒久的に取り付けられたコーティングで被覆された市販のキャピラリをシステムに合うように変更し、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨがゲル中に存在する場合に、コーティングの存在が分析物の分解能に影響を与えるか否かを見るために、グリカンを典型的な分析物として使用し、分解が困難なグリカンであるＭａｎ５を、他の接近して移動するグリカンからの分解能が所望されるグリカンとして使用し試験した。試験したすべてのキャピラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手した。以下に述べるコーティングの名前は、Ａｇｉｌｅｎｔによってそのウェブサイトで言及されているコーティングである。
５つの異なるタイプの被覆キャピラリ、すなわち、ポリビニルアルコールもしくは「ＰＶＡ」、μＳＩＬ－ＷＡＸ、ＤＢ－１、μＳＩＬ－ＤＮＡ、またはＣＥＰで被覆されたキャピラリを試験した。Ａｇｉｌｅｎｔのウェブサイトは、μＳＩＬ－ＷＡＸコーティングを、「変性された、ポリエチレンオキシド、親水性コーティング」と記述している。ＤＢ－１は、ジメチルポリシロキサンであると記述されている。Ａｇｉｌｅｎｔのウェブサイトには、μＳＩＬ－ＤＮＡを専売のフルオロカーボンポリマーと記述され、ＣＥＰを、キャピラリ表面のシラノール官能性を遮蔽し、試料吸着防止を助ける、恒久的に結合したポリマーコーティングと記述されている。
以下の実施例３で示すように、ポリビニルアルコールまたは「ＰＶＡ」で被覆されたキャピラリは、ＴＨＭＨが存在した場合にグリカン分解能の妨害を示さず、運転の間に調整することなく試料および標準物質を複数回運転した場合に、Ｍａｎ５を他のグリカンから分解する能力の劣化を示さなかった。試験した被覆キャピラリの他のタイプのうちの２つである、μＳＩＬ－ＷＡＸまたはＤＢ－１で被覆されたキャピラリは、他の接近して移動するグリカンからＭａｎ５を分解するＴＨＭＨゲルの能力を劣化させないことが見出された。本開示の時点で、これらを複数の運転にわたって試験していないものの、（例えば、上述したような各運転間で、キャピラリを洗浄しゲルを置換するＣＥ機器を用いた）少なくとも１回の運転適用で、これらのコーティングのいずれかを使用でき、複数の使用適用でも好適であり得る。
試験した２つの最終タイプの被覆キャピラリである、μＳＩＬ－ＤＮＡおよび「ＣＥＰ」は、典型的な分析物としてのグリカンの分解能を破壊することが見出された。その結果、目的の分析物がグリカンである場合、μＳＩＬ－ＤＮＡまたはＣＥＰで被覆されたキャピラリは、使用することが好ましくないものである。
ＰＶＡ被覆キャピラリ、または劣化を保護し、それら自身が分析物のＣＥを妨げない他のコーティングで内部が被覆されたキャピラリにおいて、同じキャピラリ内で分析物の複数の運転を分解能の劣化を伴わないで実施する能力により、いくつかの運転にわたって調整するステップを回避することが可能となる。これによって、分析物の分析を行う時間を少なくとも半分だけ低減することが可能となり、再現性を改善するために各運転間でのキャピラリの再調整に依存する、現行の機器および手順に著しい利点が提供される。
本開示の基礎となる研究で試験されたコーティング以外の任意の特定のコーティングで内部が被覆されたキャピラリを容易に試験して、任意の特定の第四級アンモニウム化合物またはこうした化合物の混合物の分解能の劣化をコーティングが保護し、目的の分析物のＣＥをコーティング自体が妨げないかどうかを決定できる。例えば、一方は目的のコーティングで被覆され、他方は未被覆である２つのキャピラリに、問題となっている特定の第四級アンモニウム化合物またはこれらの混合物を含む同一のゲルを満たし、検知できる標識で標識された目的の分析物（例えば、ＡＰＴＳで標識されたＭａｎ５）を、同じく検知できる標識で標識され、目的の分析物と接近して共移動すると予想される他の分析物（例えば、Ｇ０Ｆ－ＮおよびＡ１Ｆ）と組み合わせて注入し、電気泳動に供し、これによって運転を実施でき、（ａ）目的の分析物の存在をそれと共移動すると予想される存在する他の分析物から分解する能力に、未被覆のキャピラリでの分析物の分解能と比較して、コーティングの存在が有害な影響を有するかどうかを、１回目の運転で、影響がなければ２回目の運転で、決定し、（ｂ）少ない運転回数でしか劣化を防がないコーティングより好ましい、多くの運転で分解能の劣化を防ぐコーティングを用いて、このような運転を各運転間でキャピラリの調整を伴わなずに複数回実施し、所望の運転回数、例えば、５回の運転、１０回の運転、１５回の運転、２０回の運転、５０回の運転、７５回の運転、１００回の運転、１５０回の運転、または２００回の運転にわたって、コーティングが分解能の劣化を防ぐかどうかを分析する。上述したように、ＰＶＡ被覆キャピラリは、運転間で調整されないキャピラリで試験した場合、２００回を超える運転で分解能の劣化を示さず、特に好ましい。
［キット］
いくつかの実施形態では、本発明に係るゲルは、キャピラリ電気泳動を実施するためのキットで提供することができる。キットは、構造１の化合物、構造２の化合物、または構造１および構造２の１種もしくは複数の化合物の混合物を含む、ＣＥを実施するのに好適なゲルを保持する容器、ならびにＣＥの実施に使用するのに好適な緩衝剤を保持する容器を含むことができる。好ましい実施形態では、構造１、構造２または両方の１種または複数の化合物は、０．０５％ｗｔ／ｗｔ～０．５％ｗｔ／ｗｔ、より好ましくは０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５０％ｗｔ／ｗｔの濃度（または、２つ以上のこうした化合物が存在する場合、組み合わせた濃度）で存在する。好適な緩衝剤、例えばＭＥＳは、当技術分野で周知なものである。いくつかの実施形態では、ゲルを保持する容器は、ゲルを１つもしくは複数のキャピラリへ導入するように構成されたカートリッジ、またはキャピラリもしくは複数のキャピラリであり得る。１つもしくは複数のキャピラリは、目的の分析物のＣＥを妨げないコーティングでこれらの内部を被覆でき、これは好ましくは、分析物の分解能の改善を、いくつか、例えば５０、１００、２００回の運転により劣化することから防ぐコーティングである。いくつかの好ましい実施形態では、コーティングはポリビニルアルコールであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明に係るゲルは、キャピラリ電気泳動を実施するためのキットで提供することができる。キットは、構造１の化合物、構造２の化合物、または構造１および構造２の１種もしくは複数の化合物の混合物を含む、ＣＥを実施するのに好適なゲルを保持する容器、ならびにＣＥの実施に使用するのに好適な緩衝剤を保持する容器を含むことができる。好ましい実施形態では、構造１、構造２または両方の１種または複数の化合物は、０．０５％ｗｔ／ｗｔ～０．５％ｗｔ／ｗｔ、より好ましくは０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５０％ｗｔ／ｗｔの濃度（または、２つ以上のこうした化合物が存在する場合、組み合わせた濃度）で存在する。好適な緩衝剤、例えばＭＥＳは、当技術分野で周知なものである。いくつかの実施形態では、ゲルを保持する容器は、ゲルを１つもしくは複数のキャピラリへ導入するように構成されたカートリッジ、またはキャピラリもしくは複数のキャピラリであり得る。１つもしくは複数のキャピラリは、目的の分析物のＣＥを妨げないコーティングでこれらの内部を被覆でき、これは好ましくは、分析物の分解能の改善を、いくつか、例えば５０、１００、２００回の運転により劣化することから防ぐコーティングである。いくつかの好ましい実施形態では、コーティングはポリビニルアルコールであり得る。
［実施例１］
本実施例では、図に記載の研究において、グリカン試料のＣＥ分離に使用した手順を説明する。本手順で列挙する商標登録された試薬および機器は、ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の製品である。
本実施例では、図に記載の研究において、グリカン試料のＣＥ分離に使用した手順を説明する。本手順で列挙する商標登録された試薬および機器は、ＰｒｏＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の製品である。
すべての試料は、市販のキットを使用してＡＰＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識した。実験は、Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇｌｙｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで以下を使用して実施した。
ａ．分離キャピラリ各実験で、これら３つのうちの１つを使用した。
ｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（標準ゲル、未被覆のキャピラリを使用）
ｉｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（（ｉ）と同じゲルだがＴＨＭＨを０．１％ｗｔ／ｗｔ添加、未被覆のキャピラリを使用）、または
ｉｉｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（（ｉ）と同じゲルだがＴＨＭＨを添加、ＰＶＡ被覆キャピラリを使用）
ｂ．分離緩衝剤：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）分離緩衝剤
ｃ．校正標準：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）ＧＵ Ｌａｄｄｅｒ
ｄ．校正標準注入：２ｋＶで２秒
ｅ．移動標準：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）移動標準（上および下）
ｆ．移動標準注入：２ｋＶで２秒
ｇ．試料注入：２ｋＶで２秒
ｈ．分離：１０ｋＶで１２０秒
ａ．分離キャピラリ各実験で、これら３つのうちの１つを使用した。
ｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（標準ゲル、未被覆のキャピラリを使用）
ｉｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（（ｉ）と同じゲルだがＴＨＭＨを０．１％ｗｔ／ｗｔ添加、未被覆のキャピラリを使用）、または
ｉｉｉ．Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジ（（ｉ）と同じゲルだがＴＨＭＨを添加、ＰＶＡ被覆キャピラリを使用）
ｂ．分離緩衝剤：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）分離緩衝剤
ｃ．校正標準：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）ＧＵ Ｌａｄｄｅｒ
ｄ．校正標準注入：２ｋＶで２秒
ｅ．移動標準：Ｇｌｙ－Ｑ（商標）移動標準（上および下）
ｆ．移動標準注入：２ｋＶで２秒
ｇ．試料注入：２ｋＶで２秒
ｈ．分離：１０ｋＶで１２０秒
データ分析は、Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して実施した。結果は、グルコース単位（ＧＵ）値を使用して示した。
校正目的のために、すべての分析は、校正標準の注入（「注入１」）とともに開始した。したがって、すべての研究にて、「注入２」が目的の試料の最初の注入および分析であった。
［実施例２］
本実施例では、通常はＧｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジとともに販売されているゲルを使用して、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨを０．１％ゲルに添加した場合の、接近して共移動するグリカンＡ１ＦおよびＧ０Ｆ－ＮからのＭａｎ５の分解能を比較する研究の結果を示す。
本実施例では、通常はＧｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジとともに販売されているゲルを使用して、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨを０．１％ゲルに添加した場合の、接近して共移動するグリカンＡ１ＦおよびＧ０Ｆ－ＮからのＭａｎ５の分解能を比較する研究の結果を示す。
Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、またはエタネルセプトは、関節炎のいくつかの形態に対して米国で使用を承認された、腫瘍壊死因子を阻害する、融合タンパク質の生物学的治療薬(fusion protein biologic)である。グリカンは酵素消化によってエタネルセプトから放出され、ＡＰＴＳで標識されて、ＣＥに供された。図１ａは、Ｇｌｙ－Ｑ（商標）Ｇ１カートリッジとともに販売されているゲルでの、放出され標識されたグリカンの分離を示す電気泳動図である。矢印はＭａｎ５、Ａ１ＦおよびＧ０Ｆ－Ｎを含むピークを指し、２つの他のグリカンは、接近してＭａｎ５と共移動する。このように、このゲルでのＣＥは、他の接近して共移動するグリカンからのＭａｎ５の分離をもたらさなかった。図１ｂは、同様のプラットフォームで、同様の試薬を用いているものの、ゲルは０．１％の典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨをさらに含む、同じＡＰＴＳ標識グリカンの分解能を示す電気泳動図である。図１Ｂで矢印によって示されるように、ＡＰＴＳ標識Ｍａｎ５のピークは、Ａ１ＦおよびＧ０Ｆ－Ｎのピークから分離された。
［実施例３］
本実施例では、酵素消化によりヒトＩｇＧから放出され、染料ＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識され、その内部がポリビニルアルコールで被覆されたキャピラリ内でＣＥに供された、グリカンの分解能を比較する２つの電気泳動図について説明する。
本実施例では、酵素消化によりヒトＩｇＧから放出され、染料ＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識され、その内部がポリビニルアルコールで被覆されたキャピラリ内でＣＥに供された、グリカンの分解能を比較する２つの電気泳動図について説明する。
図２ａは、典型的な第四級アンモニウム化合物であるＴＨＭＨが０．１％ｗｔ／ｗｔ添加された標準ゲルが装填されているＰＶＡ被覆キャピラリ内へ、試料が最初に注入された際の（最初の注入が標準物質のラダーであったため、この注入は「注入２」と標識される。）、ヒトＩｇＧから放出されたＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）標識グリカンの分離を示す電気泳動図である。
図２ｂは、異なる標識で標識されたグリカンの分離および標準物質の追加ラダーの分離を含めて、同じＰＶＡ被覆キャピラリ内で４日にわたって２３４回さらに分離した後の（上述のように、最初の注入が標準物質のラダーであったため、この注入は「注入２３５」と標識される。）、ヒトＩｇＧから放出されたＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）標識グリカンの同様の試料の分離を示す電気泳動図である。キャピラリには、各注入および電気泳動の後に新しいゲルを装填したが、図２ａに示す運転と図２ｂに示す運転の間の２３４回のいずれの運転の間にも、調整はされなかった。図２ａと図２ｂとを比較すると、いくつかのピークの高さは変化しているものの、各成分のピークは両方の電気泳動図で依然として明確に識別可能であることを示した。その結果、キャピラリでＰＶＡコーティングを使用することによって、各分離間でキャピラリを調整する必要がなく、２つの分離の間でキャピラリを２００回超調整するために要する時間を伴うことなく、典型的な第四級アンモニウム化合物を含むゲルにより、グリカン分離の優れた再現性が提供された。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、説明を目的としたのみのものであって、これらを考慮して様々な変更または変化が当業者に提案され、本出願の趣旨および領域ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにそれらの全体は、引用することによって本明細書の一部を成すものとする。
なお、本願の出願当初の特許請求の範囲の請求項は以下の通りである。
［請求項１］
分析物の電気泳動による分離のためのゲルであって、前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
であり、前記構造２が、
である、ゲル。
［請求項２］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項３］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項４］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項５］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項１に記載のゲル。
［請求項６］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項５に記載のゲル。
［請求項７］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項１に記載のゲル。
［請求項８］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項７に記載のゲル。
［請求項９］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項７に記載のゲル。
［請求項１０］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で存在する、請求項１に記載のゲル。
［請求項１１］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔ濃度で存在する、請求項１０に記載のゲル。
［請求項１２］
目的の分析物のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）による分離のためのカートリッジまたはキャピラリであって、前記カートリッジまたはキャピラリにゲルが装填され、前記ゲルが構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
であり、前記構造２が、
である、カートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１３］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１４］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１５］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１６］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１７］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項１３に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１８］
前記ゲルが、ポリエチレンオキシドをさらに含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１９］
前記目的の分析物が、標識されたグリカンである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２０］
前記カートリッジまたはキャピラリが、カートリッジである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２１］
前記カートリッジまたはキャピラリが、キャピラリである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２２］
前記キャピラリが、未被覆である壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項２１に記載のキャピラリ。
［請求項２３］
前記キャピラリが、（ａ）前記目的の分析物のＣＥを妨げず、（ｂ）前記キャピラリが各運転間で調整されない場合に、前記分析物の分解能が少なくとも５回の運転で劣化することを防ぐものであり、コーティングで被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項２１に記載のキャピラリ。
［請求項２４］
前記コーティングが、前記目的の分析物のＣＥを妨げず、前記キャピラリが各運転間で調整されない場合に、前記分析物の分解能が少なくとも１０回の運転で劣化することを防ぐものである、請求項２３に記載のキャピラリ。
［請求項２５］
前記壁の前記コーティングが、ポリビニルアルコールである、請求項２３に記載のキャピラリ。
［請求項２６］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項２６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２８］
分析物の電気泳動による分離のためのシステムであって、（ａ）前記電気泳動による分離を実施するための装置と、（ｂ）前記電気泳動による分離を実施するためのゲルであって、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
であり、前記構造２が、
である、ゲルとを含む、システム
［請求項２９］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３０］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３１］
前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物と、構造２の１種もしくは複数の化合物とを含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３２］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３３］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項３２に記載のシステム。
［請求項３４］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３５］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項３４に記載のシステム。
［請求項３６］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項３４に記載のシステム。
［請求項３７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３８］
構造１の前記１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．２％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項３７に記載のシステム。
［請求項３９］
標識された分析物の電気泳動による分離を実施する方法であって、前記方法が、（ａ）前記分析物をゲルに装填するステップであって、前記ゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
であり、前記構造２が、
である、ステップと、前記ゲル中の前記標識された分析物を電位に供し、これによって前記標識された分析物の電気泳動による分離を実施するステップとを含む、方法。
［請求項４０］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４１］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４２］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４３］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４４］
前記ＴＨＭＨが、さらに安定化剤で安定化されている、請求項３９に記載の方法。
［請求項４５］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４６］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４７］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４８］
前記標識された分析物が、標識されたグリカンである、請求項３９に記載の方法。
［請求項４９］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項３９に記載の方法。
［請求項５０］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項４９に記載の方法。
［請求項５１］
前記標識されたグリカンが、複数のスルホン酸部分を有する染料で標識されている、請求項３９に記載の方法。
［請求項５２］
前記標識されたグリカンが、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識されている、請求項５１に記載の方法。
［請求項５３］
電気泳動による分離を実施するためのキットであって、前記キットが、（ａ）ゲルを保持する容器であり、前記ゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
であり、前記構造２が、
である、容器と、（ｂ）緩衝剤とを含む、キット。
［請求項５４］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５５］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５６］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項５３に記載のキット。
［請求項５８］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項５７に記載のキット。
［請求項５９］
前記ゲルを保持する前記容器が、カートリッジまたはキャピラリである、請求項５３に記載のキット。
［請求項６０］
前記カートリッジまたはキャピラリが、カートリッジである、請求項５９に記載のキット。
［請求項６１］
前記カートリッジまたはキャピラリが、キャピラリである、請求項５９に記載のキット。
［請求項６２］
前記キャピラリが、未被覆である壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項６１に記載のキット。
［請求項６３］
前記キャピラリが、被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項６１に記載のキット。
［請求項６４］
前記キャピラリの前記壁の前記コーティングが、ポリビニルアルコールである、請求項６３に記載のキット。
なお、本願の出願当初の特許請求の範囲の請求項は以下の通りである。
［請求項１］
分析物の電気泳動による分離のためのゲルであって、前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
［請求項２］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項３］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項４］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１に記載のゲル。
［請求項５］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項１に記載のゲル。
［請求項６］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項５に記載のゲル。
［請求項７］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項１に記載のゲル。
［請求項８］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項７に記載のゲル。
［請求項９］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項７に記載のゲル。
［請求項１０］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で存在する、請求項１に記載のゲル。
［請求項１１］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔ濃度で存在する、請求項１０に記載のゲル。
［請求項１２］
目的の分析物のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）による分離のためのカートリッジまたはキャピラリであって、前記カートリッジまたはキャピラリにゲルが装填され、前記ゲルが構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
［請求項１３］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１４］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１５］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１６］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１７］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項１３に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１８］
前記ゲルが、ポリエチレンオキシドをさらに含む、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項１９］
前記目的の分析物が、標識されたグリカンである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２０］
前記カートリッジまたはキャピラリが、カートリッジである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２１］
前記カートリッジまたはキャピラリが、キャピラリである、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２２］
前記キャピラリが、未被覆である壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項２１に記載のキャピラリ。
［請求項２３］
前記キャピラリが、（ａ）前記目的の分析物のＣＥを妨げず、（ｂ）前記キャピラリが各運転間で調整されない場合に、前記分析物の分解能が少なくとも５回の運転で劣化することを防ぐものであり、コーティングで被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項２１に記載のキャピラリ。
［請求項２４］
前記コーティングが、前記目的の分析物のＣＥを妨げず、前記キャピラリが各運転間で調整されない場合に、前記分析物の分解能が少なくとも１０回の運転で劣化することを防ぐものである、請求項２３に記載のキャピラリ。
［請求項２５］
前記壁の前記コーティングが、ポリビニルアルコールである、請求項２３に記載のキャピラリ。
［請求項２６］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項１２に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項２６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
［請求項２８］
分析物の電気泳動による分離のためのシステムであって、（ａ）前記電気泳動による分離を実施するための装置と、（ｂ）前記電気泳動による分離を実施するためのゲルであって、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
［請求項２９］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３０］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３１］
前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物と、構造２の１種もしくは複数の化合物とを含む、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３２］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３３］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項３２に記載のシステム。
［請求項３４］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３５］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項３４に記載のシステム。
［請求項３６］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項３４に記載のシステム。
［請求項３７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度でゲル中に存在する、請求項２８に記載のシステム。
［請求項３８］
構造１の前記１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．２％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項３７に記載のシステム。
［請求項３９］
標識された分析物の電気泳動による分離を実施する方法であって、前記方法が、（ａ）前記分析物をゲルに装填するステップであって、前記ゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
［請求項４０］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４１］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４２］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項３９に記載の方法。
［請求項４３］
前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４４］
前記ＴＨＭＨが、さらに安定化剤で安定化されている、請求項３９に記載の方法。
［請求項４５］
前記電気泳動による分離が、キャピラリ電気泳動による分離である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４６］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゲル電気泳動である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４７］
前記キャピラリ電気泳動が、キャピラリゾーン電気泳動である、請求項３９に記載の方法。
［請求項４８］
前記標識された分析物が、標識されたグリカンである、請求項３９に記載の方法。
［請求項４９］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．００１％ｗｔ／ｗｔ～５．０％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項３９に記載の方法。
［請求項５０］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項４９に記載の方法。
［請求項５１］
前記標識されたグリカンが、複数のスルホン酸部分を有する染料で標識されている、請求項３９に記載の方法。
［請求項５２］
前記標識されたグリカンが、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）で標識されている、請求項５１に記載の方法。
［請求項５３］
電気泳動による分離を実施するためのキットであって、前記キットが、（ａ）ゲルを保持する容器であり、前記ゲルが、有効な量の、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
［請求項５４］
前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５５］
前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５６］
前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項５３に記載のキット。
［請求項５７］
前記構造１の１種もしくは複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）である、請求項５３に記載のキット。
［請求項５８］
前記ＴＨＭＨが、安定化剤で安定化されている、請求項５７に記載のキット。
［請求項５９］
前記ゲルを保持する前記容器が、カートリッジまたはキャピラリである、請求項５３に記載のキット。
［請求項６０］
前記カートリッジまたはキャピラリが、カートリッジである、請求項５９に記載のキット。
［請求項６１］
前記カートリッジまたはキャピラリが、キャピラリである、請求項５９に記載のキット。
［請求項６２］
前記キャピラリが、未被覆である壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項６１に記載のキット。
［請求項６３］
前記キャピラリが、被覆された壁を備えた内部ルーメンを有する、請求項６１に記載のキット。
［請求項６４］
前記キャピラリの前記壁の前記コーティングが、ポリビニルアルコールである、請求項６３に記載のキット。
Claims (20)
- 分析物としてグリカンの電気泳動による分離のためのゲルであって、前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
- 前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
- 前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１に記載のゲル。
- 前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１に記載のゲル。
- 前記構造１の１種もしくは複数の化合物のが、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）であり、前記ＴＨＭＨが安定化剤で安定化されている、請求項１に記載のゲル。
- 目的の分析物としてグリカンのキャピラリ電気泳動（ＣＥ）による分離のためのカートリッジまたはキャピラリであって、前記カートリッジまたはキャピラリにゲルが装填され、前記ゲルが構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
- 前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
- 前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
- 前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
- 前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）であり、前記ＴＨＭＨが安定化剤で安定化されている、請求項６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
- 前記カートリッジまたはキャピラリが、カートリッジである、請求項６に記載のカートリッジ。
- 前記キャピラリが、（ｉ）未被覆である壁を備えた、または（ｉｉ）（ａ）前記目的の分析物のＣＥを妨げず、かつ（ｂ）前記キャピラリが各運転間で調整されない場合に、前記分析物の分解能が少なくとも５回の運転で劣化することを防ぐものであるコーティングで被覆された壁を備えた、内部ルーメンを有する、請求項６に記載のキャピラリ。
- 前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０８％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項６に記載のカートリッジまたはキャピラリ。
- 標識された分析物としてグリカンの電気泳動による分離を実施する方法であって、前記方法が、（ａ）前記分析物をゲルに装填するステップであって、前記ゲルが、構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の１種もしくは複数の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物を含み、前記構造１が、
- 前記ゲルが、構造１の２種以上の化合物を含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記ゲルが、構造２の２種以上の化合物を含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記ゲルが、構造１の１種または複数の化合物と、構造２の１種または複数の化合物とを含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記構造１の１種または複数の化合物が、トリス（２－ヒドロキシエチル）メチルアンモニウムヒドロキシド（「ＴＨＭＨ」）であり、前記ＴＨＭＨが安定化剤で安定化されている、請求項１４に記載の方法。
- 前記標識されたグリカンの標識が、ＡＰＴＳ、ＡＮＴＳ、またはＩｎｓｔａｎｔＱ（商標）である、請求項１４に記載の方法。
- 前記構造１の１種もしくは複数の化合物、または構造２の化合物、または構造１の１種もしくは複数の化合物と構造２の１種もしくは複数の化合物との混合物が、ゲルの０．０７５％ｗｔ／ｗｔ～０．１５％ｗｔ／ｗｔの濃度で前記ゲル中に存在する、請求項１４に記載の方法。
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