JP7138411B2 - 変異した骨格を有する結合ポリペプチド - Google Patents
変異した骨格を有する結合ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP7138411B2 JP7138411B2 JP2016537294A JP2016537294A JP7138411B2 JP 7138411 B2 JP7138411 B2 JP 7138411B2 JP 2016537294 A JP2016537294 A JP 2016537294A JP 2016537294 A JP2016537294 A JP 2016537294A JP 7138411 B2 JP7138411 B2 JP 7138411B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- polypeptides
- population
- amino acid
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 413
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 413
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 413
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 53
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 52
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 52
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 52
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 40
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 24
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 24
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 21
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102100031506 Complement C5 Human genes 0.000 claims 2
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 claims 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 15
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 15
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 13
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 13
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 13
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 13
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 11
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 101100440311 Homo sapiens C5 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 5
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 5
- -1 PDGFRβ Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000001498 protein fragment complementation assay Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 5
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 4
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102220470986 Histone deacetylase 8_S39E_mutation Human genes 0.000 description 3
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220597878 Ketimine reductase mu-crystallin_D36R_mutation Human genes 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 102220097833 rs876660426 Human genes 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 102100040439 Adenylate kinase 4, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108050004095 Adenylate kinase 4, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 2
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 102200016465 rs104894275 Human genes 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000013097 stability assessment Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規なポリペプチド、その産生方法および共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の新規な集団に関する。この集団は、例えば新規な結合タンパク質およびポリペプチドを提供するために用いることができる。
新規な結合タンパク質を作製するための種々の方法が記載されている（非特許文献１）。１つの戦略は、ライブラリー生成およびスクリーニングを所望の性質の選択と組み合わせることである。
共通の第一世代の骨格に基づく第一世代のＺ変異体ポリペプチド、このような分子の集団およびそれらを含む方法は、特許文献１に記載されている。さらに、第二世代の骨格に基づくＺ変異体ポリペプチド、このような分子の集団およびそれらを含む方法は、特許文献２に記載されている。これらの２つの開示の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの適用に関して、改善された性質、例えばより高いアルカリ安定性、低い抗原性、構造安定性、化学合成の容易さおよび親水性を有するＺ変異体ポリペプチドまたはその集団が望まれている。特許文献２は、改善された性質を有する共通の骨格を有するＺ変異体を開示しているが、しかし、その中に記載されたＺ変異体ポリペプチドによってすべての所望の性質を得ることができるわけではない。
ポリペプチド医薬の成功の鍵となる因子の１つは、それらの安定性である。高い構造安定性を示すポリペプチドは、おそらく産生中および人体内の両方で、化学的修飾、物理的条件の変化およびタンパク質分解に機能的に耐えるであろう。さらに、安定性は、ポリペプチド医薬の活性有効期間だけでなく人体内のポリペプチド医薬の活性期間に影響を及ぼすであろう。
したがって、Ｚ変異体ポリペプチドの安定性の改善が継続的に必要とされている。
Nygren PA and Uhlen M (1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469
新規な骨格を有するポリペプチドを提供することが本発明の目的であり、このポリペプチドは、現在入手可能なＺ変異体ポリペプチドの上記および他の欠点を軽減する。
本発明の別の目的は、新規な骨格に基づくポリペプチドの産生方法を提供することである。また、本発明の目的は、このような改善されたポリペプチド変異体の集団を提供することであり、すべて新規な骨格に基づいている。
本発明の別の目的は、ポリヌクレオチドの集団を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ポリペプチド集団とポリヌクレオチド集団との組合せを提供することである。
本発明のさらなる目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを、ポリペプチドの集団から選択する方法を提供することである。
別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法を提供することである。
別の目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法を提供することである。
さらなる目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法を提供することである。
関連した目的は、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法を提供することである。
これらのおよび他の目的は、本明細書に開示された種々の態様によって達成してもよい。
本開示の第１の態様において、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
上のポリペプチド配列ｉ）の中で、「独立して任意のアミノ酸に相当する」として定義された各アミノ酸Ｘは、それぞれ、すべての可能なアミノ酸から選択されるアミノ酸残基に相当する。明確にするため、これは、上の配列ｉ）中の位置Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８に相当するアミノ酸位置に当てはまる。これは、それぞれのこのようなＸが、配列中のＸと表された他の任意の残基の同一性と独立した任意のアミノ酸残基であってもよいことを意味する。アミノ酸配列中、これらのアミノ酸Ｘは、全２０個の天然のアミノ酸残基のいずれかが、任意の所定の変異体中の対応するＸ位置に存在しうるようなやり方で、これらの２０個の天然のアミノ酸残基から選択してもよい。各位置におけるアミノ酸残基の選択は、多少ランダム化してもよい。また、種々の多様なアミノ酸残基が選択される群を、２０個の天然のアミノ酸残基のうち１９、１８、１７、１６またはそれ未満に限定することも可能である。種々の位置における変動性は、ランダム化を意味しない１個から最大で全２０個のアミノ酸までの間で個々に調整してもよい。アミノ酸のより小さなサブセットのランダム導入は、導入されたデオキシリボヌクレオチド塩基の注意深い選択によって行ってもよく、例えば、コドンＴ（Ａ／Ｃ）Ｃは、ポリペプチド鎖中の所定の位置でセリンまたはチロシンのランダム導入を行うことによって導入してもよい。同様に、コドン（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＣＣを導入してポリペプチド鎖の所定の位置でフェニルアラニン、ロイシン、アラニンおよびバリンのランダム導入を行ってもよい。当業者は、ポリペプチド鎖中の所定の位置でアミノ酸の種々の組合せを得るために用いてもよいデオキシリボヌクレオチド塩基の組合せの多くの選択肢を知っている。また、ポリペプチド鎖中の所定の位置に現れてもよいアミノ酸のセットは、一度に１つのデオキシリボヌクレオチド塩基の代わりに、オリゴヌクレオチド合成中のトリヌクレオチドの導入によって決定してもよい。アミノ酸の確定セットは、合成において望ましい位置で確定コドンの組込みを可能にするスプリット－プール（split-pool）合成を用いて得てもよい。ランダム化二本鎖リンカーを得るためのさらに別の選択肢は、その後に構築された二本鎖ＤＮＡの連結および制限を用いるトリヌクレオチド構成単位のランダム化セットの組込みによるものである。
本開示の一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供される。このような一実施態様において、標的結合特異性をもたらすアミノ酸残基は、上の配列ｉ）中の位置２、３、４、６、７、１０、１１、１７、１８、２０、２１、２５および２８に相当する位置のものである。同様に、このようなポリペプチドにおいて、標的結合特異性もたらすアミノ酸残基は、「骨格アミノ酸」または単に「骨格」と呼ばれる。したがって、一実施態様において、本明細書に定義された骨格アミノ酸残基は、上の配列ｉ）中の位置１、５、８、９、１２～１５、１９、２２～２４、２７、３１、３３～３４、３７～３８、４０～４４および４８に相当する位置のものである。本明細書に定義されたポリペプチドの骨格アミノ酸によってもたらされる好都合な性質が、上記ポリペプチドの標的結合特異性と無関係であることは当業者に明らかであろう。
当業者に知られているように、任意のポリペプチド、例えば本開示のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存する。したがって、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのアミノ酸の配列に小さな変化を加えることが可能である。したがって、本開示は、ポリペプチドの機能的性質、例えばその改善された安定性および／または所定の標的に対するその結合親和性を変えることのない、上記ポリペプチドの修飾された変異体を包含する。
このように、また、ｉ）に定義された配列に対して９１％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが本開示によって包含される。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％同一である配列を含んでもよい。
いくつかの実施態様において、配列定義ｉ）とｉｉ）との間のこのような違いは、本明細書に開示されたポリペプチドの配列の任意の位置において見いだされることがある。別の実施態様において、このような変化は、骨格アミノ酸残基にのみ見いだされてもよい。別の実施態様において、上記の変化は、標的結合特異性をもたらすアミノ酸残基中にのみ見いだされてもよい。例えば、アミノ酸残基の特定の機能的分類（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を同じ機能的分類からの別のアミノ酸残基と交換することができる可能性がある。
「％同一性」という用語は、本明細書中で用いる場合、例えば、以下のように算出してもよい。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を用いてクエリー配列を標的配列に対して整列させる。整列させた配列の１つ、例えば最も短いものに相当するウィンドウ上で比較を行う。ウィンドウは、いくつかの場合、標的配列によって定義してもよい。他の場合、クエリー配列によってウィンドウを定義してもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中で同一の対応関係を有するクエリー配列の位置のパーセンテージを％同一性として報告する。
ポリペプチドを結合するための骨格として用いるとき、本明細書に開示された配列は、知られている類似の骨格と比較して利点を提供し、そして高い構造安定性を示し、かつそれによって改善された貯蔵有効期間を示すように設計されている。これらの利点は、本開示の第３の態様（さらに下を参照）にもあてはまり、それらはこの第１の態様のポリペプチド変異体の集団に関連がある。
本開示の一実施態様において、Ｘ１６はＴである。
一実施態様において、Ｘ２６はＫである。
一実施態様において、Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２はＤＤＰＳである。
一実施態様において、Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２はＲＱＰＥである。
一実施態様において、Ｘ３５はＳである。
一実施態様において、Ｘ３６はＥである。
一実施態様において、Ｘ３９はＳである。
一実施態様において、Ｘ４５はＥおよびＳから選択される。
一実施態様において、Ｘ４５はＥである。
一実施態様において、Ｘ４５はＳである。
一実施態様において、Ｘ４６はＥおよびＳから選択される。
一実施態様において、Ｘ４６はＥである。
一実施態様において、Ｘ４６はＳである。
一実施態様において、Ｘ４６はＤである。
一実施態様において、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤまたはＥではない。
一実施態様において、Ｘ４５Ｘ４６は、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから、例えばＥＳおよびＳＥから選択される。
一実施態様において、Ｘ４５Ｘ４６はＥＳである。
一実施態様において、Ｘ４５Ｘ４６はＳＥである。
一実施態様において、Ｘ４５Ｘ４６はＳＤである。
一実施態様において、Ｘ４７はＳである。
本明細書に用いる「所定の標的に対する結合親和性」という用語は、例えば表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて試験されうるポリペプチドの性質のことをいう。例えば、上記結合親和性は、所定の標的またはそのフラグメントを機器のセンサチップ上に固定し、被検ポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通過させる実験において試験してもよい。別法として、被検ポリペプチドを機器のセンサチップ上に固定し、所定の標的を含有するサンプルまたはそのフラグメントをチップ上に通過させる。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して所定の標的に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的尺度（qualitative measure）を確立してもよい。定量的尺度（quantitative measure）が望ましい場合、例えば相互作用のＫＤ値を決定するため、表面プラスモン共鳴法を用いてもよい。結合値は、例えば、ビアコア（Biacore）（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））またはプロテオンＸＰＲ３６（ProteOn XPR 36）（バイオ・ラッド）Bio-Rad）機器において確定してもよい。所定の標的を機器のセンサチップ上に適切に固定し、親和性を決定すべきポリペプチドのサンプルを系列希釈によって調製し、そして順不同で注射する。次いで、例えばBIAevaluation 4.1ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、または機器の製造元によって提供される、他の適したソフトウェアを用いて、結果からＫＤ値を算出してもよい。
また、本明細書に用いる「所定の標的に対する結合親和性」という用語は、例えばＥＬＩＳＡによって試験されうるポリペプチドの性質のことであってもよい。例えば、結合親和性は、抗体コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でポリペプチドのサンプルを捕捉し、ビオチン化された所定の標的またはそのフラグメント、続いてストレプトアビジンコンジュゲート化ＨＲＰを加える実験において試験してもよい。ＴＭＢ基質を加え、そしてマルチウェルプレートリーダー、例えばビクター３（Victor3）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して所定の標的に関して少なくとも複合体の結合親和性の定性的尺度を確立してもよい。また、定量的尺度が望ましい場合、例えば相互作用に関するＥＣ５０値（最大半減有効濃度）を決定するため、ＥＬＩＳＡを用いてもよい。上記のようにＥＬＩＳＡを用いて、所定の標的またはそのフラグメントの希釈系列に対するポリペプチドの反応を測定する。次いで、当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈してもよく、例えばグラフパッドプリズム５（GraphPad Prism 5）および非線形回帰を用いて結果からＥＣ５０値を算出してもよい。
前述のとおり、Ｚ変異体ポリペプチドは、３－ヘリックスバンドルタンパク質ドメインを構成するか、またはその一部を形成すると考えられ、そのモチーフは、上記３－ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループと共に２本のアルファヘリックスの部分を本質的に形成する所定の標的に対する親和性を有する。
本発明の範囲を逸脱することなく、意図する特定の使用に合わせてポリペプチドを作るために、上に定義されたようなポリペプチドの種々の修飾、および／またはそれへの付加を実施してもよい。このような修飾および付加は、以下により詳細に記載されており、同じポリペプチド鎖に含まれるさらなるアミノ酸、または化学的にコンジュゲートされた、もしくは別の方法でポリペプチドに結合された標識および／もしくは治療剤を含んでもよい。
したがって、一実施態様において、さらなるアミノ酸残基を含む上記のようなポリペプチドが提供される。
いくつかの実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＣ末端にあってもよい。
いくつかの実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮ末端にあってもよい。
一実施態様において、Ｃ末端の上記さらなるアミノ酸残基は、ＡＰを含む。
一実施態様において、Ｎ末端の上記さらなるアミノ酸残基は、ＡＥＡＫＹＡＫを含む。
さらに別の実施態様において、上記のようなポリペプチドを提供し、それは、Ｎ末端で０から７個までのさらなるアミノ酸残基Ｃ末端でおよび０から３個までのさらなるアミノ酸残基を有する配列ｉ）またはｉｉ）からなる。
さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの結合において役割を果たしうるが、しかし、例えばポリペプチドの産生、精製、安定化、カップリングまたは検出の１つまたはそれ以上に関連した他の目的に同様に十分役立つこともありうる。
いくつかの実施態様において、上記さらなるアミノ酸残基は、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成する。
このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングのために付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この一例は、ポリペプチド鎖中のいちばん最初のまたはいちばん最後の位置での、すなわちＮ末端またはＣ末端でのシステイン残基の付加である。また、化学的カップリングに用いるシステイン残基は、タンパク質ドメインの表面における、好ましくは標的結合に関与しない表面の一部における別のアミノ酸の置換によって導入してもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ６）タグ、またはそのタグに特異的な抗体と相互作用するための「ｍｙｃ」タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを含んでもよい。他の代替物は当業者に知られている。
また、上で議論した「さらなるアミノ酸残基」は、任意の所望の機能、例えば別の結合機能、または半減期延長機能、または酵素的機能、または金属イオンキレート化機能、または蛍光機能、またはそれらの任意の組合せを有する１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成してもよい。
実施態様の一例において、所定の標的に対する親和性を有する化合物が提供され、上記化合物は、
Ａ．上に定義された少なくとも１つのポリペプチド；
Ｂ．連鎖球菌Ｇタンパク質の少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；および
Ｃ．場合により、上記少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を、上記少なくとも１つのポリペプチドのＣまたはＮ末端に連結するための少なくとも１つの連結部分
を含む。
Ａ．上に定義された少なくとも１つのポリペプチド；
Ｂ．連鎖球菌Ｇタンパク質の少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；および
Ｃ．場合により、上記少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を、上記少なくとも１つのポリペプチドのＣまたはＮ末端に連結するための少なくとも１つの連結部分
を含む。
連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインの誘導体の非限定的な例は、ＷＯ２００９／０１６０４３およびＷＯ２０１２／００４３８４に開示される。
また、さらなる実施態様において、上に定義されたポリペプチドが提供され、それは、
ＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ；および
ＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ
［配列中、各Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そしてｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ；および
ＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ
［配列中、各Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そしてｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ポリペプチドが提供され、それは、
ＡＤＮＮＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
［配列中、Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そして、ｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＡＤＮＮＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
［配列中、Ｘｙは、上に定義されたとおりである（そして、ｙは、上のｉ）によって定義されたポリペプチド配列内の残基Ｘのアミノ酸位置を表す）］
から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示されたポリペプチド変異体は、例えば知られている骨格に基づき、かつ所定の標的に対する親和性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、そして選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施して、本開示による骨格を有し、標的親和性を保持しているポリペプチドを得ることによって生成してもよい。別法として、本開示によるポリペプチドは、分子全体の化学合成によって、またはＺ変異体ポリペプチドの結合モチーフを本明細書に開示された骨格上へ移植するための、当業者に知られている、他の分子生物学的方法を用いることによって作製してもよい。
一般的な実例として、以下の共通の骨格配列を含み、かつ結合モチーフ［ＢＭ］：
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱ ＡＰＫ
内のアミノ酸配列によって定義された結合特異性を有する元の（original）Ｚ変異体ポリペプチドを修飾して本明細書に開示されたポリペプチドを提供してもよい。
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱ ＡＰＫ
内のアミノ酸配列によって定義された結合特異性を有する元の（original）Ｚ変異体ポリペプチドを修飾して本明細書に開示されたポリペプチドを提供してもよい。
本開示のこの態様のさまざまな具体的実施態様において、以下のポリペプチド：
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＳＳＱ ＡＰＫ
が提供される。
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱ ＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ－［ＢＭ］－ＲＱＰＥＱＳＳＥＬＬ ＳＥＡＫＫＬＮＳＳＱ ＡＰＫ
が提供される。
本明細書に開示されたポリペプチドは、多くの用途、例えば疾患に関する治療上の、診断上のまたは予後の有意性の用途を有する。上記ポリペプチドについて、治療上の、診断上のまたは予後の使用を見いだしうる疾患の非限定的なリストには、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、神経系疾患、神経変性疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、消化管の疾患、心血管疾患、血液疾患、皮膚疾患、アレルギーおよびその他が含まれる。
したがって、一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供される。より具体的な実施態様において、上記標的は、ＨＥＲ２、ＴＮＦα、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ、ＨＥＲ３、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ、アミロイドβ、ＣＤ４、ＩＬ８、ＩＬ６およびインスリンからなる群から選択される。別の実施態様において、上記ポリペプチドは、バイオテクノロジー、産業および医薬用途において、例えば分離技術、精製用途における親和性リガンドとして、または検出剤として有用でありうる。より具体的なこのような実施態様において、所定の標的は、連鎖球菌Ｇタンパク質からのアルブミン結合ドメイン（「ＡＢＤ」または「ＧＡモジュール」）またはその誘導体であってもよい。
所定の標的のリストが非限定的なものとみなされ、かつ他の所定の標的に対する親和性を有する本明細書に定義されたポリペプチドが本開示の範囲内にあることは、当業者にとって明らかであろう。
知られている骨格に基づき、かつ異なる標的に対する親和性を有する知られているＺ変異体ポリペプチドの非限定的な例は、ＥＧＦ受容体（ＷＯ２００７／０６５６３５に開示された）に対する、ＨＥＲ２受容体（ＷＯ２００９／０８０８１０に開示された）に対する、ＨＥＲ３受容体（ＷＯ２０１０／０５６１２４に開示された）に対する、ＩＧＦ１受容体（ＷＯ２００９／０１９１１７に開示された）に対する、ＰＤＧＦ受容体β（ＷＯ２００９／０７７１７５に開示された）に対する、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）（ＷＯ２０１４／０６４２３７に開示された）に対する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９に開示された）に対する、そして炭酸脱水酵素ＩＸ（ＷＯ２０１４／０９６１６３に開示された）に対する親和性を有するＺ変異体である。明確にするため、本開示において、Ｚ変異体の結合モチーフ［ＢＭ］は上に記載された文献に開示されたそれらの結合モチーフの最初の２８個のアミノ酸残基に相当し、その際、結合モチーフの定義は２９個のアミノ酸残基であり、そして上の配列ｉ）の位置１～２９に相当する位置のアミノ酸残基に相当することに留意すること。
一実施態様において、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供され、それは、標識、例えば、蛍光色素および金属、発色団色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される標識をさらに含む。このような標識は、例えばポリペプチドの検出に用いてもよい。
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、所望の生物活性を有する第２の部分も含んでいる融合ポリペプチドまたはコンジュゲートの一部として存在する。このような所望の生物活性の非限定的な例としては、治療活性、結合活性および酵素活性が含まれる。
いくつかの実施態様において、上記部分は、標識をさらに含む。標識は、場合によっては、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドにのみ結合していてもよく、場合によっては、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドと、コンジュゲートまたは融合ポリペプチドの第２の部分との両方に結合していてもよい。さらにまた、標識が第２の部分のみ結合しており、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドに結合していなくてもよいことも可能である。したがって、さらに別の実施態様において、第２の部分を含む所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドが提供され、ここで、上記標識は、第２の部分のみに結合されている。
本明細書に開示されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、検出試薬、捕捉試薬として、分離試薬として、インビボもしくはインビトロでの診断用の診断剤として、または治療剤として用いることができる。本開示によるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをインビトロで用いる方法は、種々のフォーマット、例えばマイクロタイタープレート、タンパク質アレイ、バイオセンサー表面、組織切片などにおいて実施してもよい。
また、本開示によるポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、例えば上記標的において直接的または間接的な効果を有する、治療剤、診断剤もしくは予後剤としてそれ自体で、または他の治療剤、診断剤もしくは予後剤を標的化するための手段として有用でありうることを理解すべきである。直接的な治療効果は、例えば上記標的によってシグナル伝達を阻害することによって実施してもよい。上記標的は、特定の疾患（例えば上記の疾患）の予後を予測するための有益なマーカーとして役立つこともありうる。
したがって、一実施態様において、治療に使用するための、または診断剤として使用するための、本明細書に記載されたようなポリペプチドまたは融合ポリペプチドが提供される。別の実施態様において、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、治療剤をさらに含む。このような治療剤の非限定的な例としては、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの効果を増強する治療剤、上記ポリペプチドまたは融合ポリペプチドとの相乗効果で作用する治療剤および処置すべき疾患の種々の態様に作用する治療剤である。また、本明細書に開示されたポリペプチドを含む医薬組成物は、単独でまたはさらなる治療剤と一緒に想定されている。
本開示の第２の態様において、本明細書に記載されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。また、このようなポリヌクレオチドを発現することを含む、上記のようなポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生する方法；ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および上記発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。
本開示の第３の態様において、共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団が提供され、その集団中のそれぞれのポリペプチドは、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ、
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立していずれかのアミノ酸残基に相当し；そして配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤではなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤではない、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ、
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立していずれかのアミノ酸残基に相当し；そして配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤではなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤではない、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
上の配列ｉ）において、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、集団中で変更されたアミノ酸残基に個々に相当する。したがって、それぞれのこのようなアミノ酸残基は、本開示の第１の（ポリペプチド）態様に関連して、上で説明したように、配列中にＸｙと表された他のいずれの残基の同一性とも無関係の任意のアミノ酸残基であってもよい。ポリペプチドの集団中の特定のアミノ酸残基Ｘｙに関する、および配列ｉ）またはｉｉ）のいずれかの末端での任意のさらなるアミノ酸残基に関する非限定的な選択肢は、本開示の第１の態様の実施態様として上に記載されたものと同じである。
上に議論したように、ほとんど三次構造およびその機能に影響を及ぼすことなく、上のアミノ酸配列と比較してより少ない変化を含むポリペプチドも、本開示の範囲内にある。したがって、また、共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドがｉ）に定義されたような配列に対して９１％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む集団が本開示よって包含される。いくつかの実施態様において、それぞれのポリペプチドは、ｉ）に定義されたような配列に対して少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％同一である配列を含んでもよい。
本明細書に定義された集団は、定義されたポリペプチド分子の多数の独特な（unique）および種々の変異体からなる。この文脈において、多数とは、例えば、その集団が少なくとも１×１０４個の独特なポリペプチド分子、または少なくとも１×１０６、少なくとも１×１０８、少なくとも１×１０１０、少なくとも１×１０１２、もしくは少なくとも１×１０１４個の独特なポリペプチド分子を含むことを意味しうる。当業者に認められるように、それは、集団の望ましいサイズを提供するのに十分大きな群を用いることが必要である。また、本明細書に記載された「集団」は、「ライブラリー」と表してもよい。
本明細書に開示された集団が、ｉ）に定義されたポリペプチドに基づく新たな結合分子の選択のためのライブラリーとして有用でありうることは、当業者に明らかであろう。ランダム化されたポリペプチドの集団（またはライブラリー）から結合分子を単離しうることは、当分野でよく知られている。この技術は、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／１９３７４、Nord
et al (1997) Nature Biotechnology 15:772-777、およびＷＯ２００９／０８０８１１に一般的な用語で記載されており、そして１３箇所の異なる標的結合位置をランダムに変え、その後、ファージディスプレイまたは遺伝子型－表現型カップリングに基づく他の選択システムにおいて興味の結合剤を選択することにより、さまざまな標的分子に対して共通のＺドメイン骨格に基づく結合分子を選択するために適用することに成功している。本明細書に開示された集団は、先行技術の集団と比較して、特に安定性に関して改善された性質を示すポリペプチド変異体の集団である。ランダム化されたポリペプチドの集団（または、ライブラリー）から単離されたＺ変異体の例としては、ＥＧＦレセプター（ＷＯ２００７／０６５６３５に開示された）に対する、ＨＥＲ２受容体（ＷＯ２００９／０８０８１０に開示された）に対する、ＨＥＲ３受容体（ＷＯ２０１０／０５６１２４に開示された）に対する、ＩＧＦ１受容体（ＷＯ２００９／０１９１１７に開示された）に対する、ＰＤＧＦ受容体β（ＷＯ２００９／０７７１７５に開示された）に対する、ＡＢＤ（ＷＯ２０１４／０６４２３７に開示された）に対する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９に開示された）に対する、そして炭酸脱水酵素ＩＸ（ＷＯ２０１４／０９６１６３に開示された）に対する親和性を有するＺ変異体が含まれる。
et al (1997) Nature Biotechnology 15:772-777、およびＷＯ２００９／０８０８１１に一般的な用語で記載されており、そして１３箇所の異なる標的結合位置をランダムに変え、その後、ファージディスプレイまたは遺伝子型－表現型カップリングに基づく他の選択システムにおいて興味の結合剤を選択することにより、さまざまな標的分子に対して共通のＺドメイン骨格に基づく結合分子を選択するために適用することに成功している。本明細書に開示された集団は、先行技術の集団と比較して、特に安定性に関して改善された性質を示すポリペプチド変異体の集団である。ランダム化されたポリペプチドの集団（または、ライブラリー）から単離されたＺ変異体の例としては、ＥＧＦレセプター（ＷＯ２００７／０６５６３５に開示された）に対する、ＨＥＲ２受容体（ＷＯ２００９／０８０８１０に開示された）に対する、ＨＥＲ３受容体（ＷＯ２０１０／０５６１２４に開示された）に対する、ＩＧＦ１受容体（ＷＯ２００９／０１９１１７に開示された）に対する、ＰＤＧＦ受容体β（ＷＯ２００９／０７７１７５に開示された）に対する、ＡＢＤ（ＷＯ２０１４／０６４２３７に開示された）に対する、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９に開示された）に対する、そして炭酸脱水酵素ＩＸ（ＷＯ２０１４／０９６１６３に開示された）に対する親和性を有するＺ変異体が含まれる。
本開示の第４の態様において、ポリヌクレオチドの集団が提供される。この集団中のそれぞれのポリヌクレオチドは、第３の態様に関連して上に定義されたようなポリペプチドの集団のメンバーをコードしている。
本開示の第５の態様において、第３の態様によるポリペプチド集団と、第４によるポリヌクレオチド集団との組合せが提供され、この組合せにおいて、ポリペプチド集団のそれぞれのメンバーは、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしている対応するポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している。この物理的または空間的関連は、使用するシステムに応じて、多かれ少なかれ厳密になるであろう。遺伝子型－表現型カップリング（genotype-phenotype coupling）手段は、ファージディスプレイシステムを含んでもよい。ファージディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Smith GP (1985) Science 228:1315-1317およびBarbas CF et al (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982に記載されている。
さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、細胞表面ディスプレイシステムを含んでもよい。細胞表面ディスプレイシステムは、原核細胞、例えばグラム陽性細胞または真核細胞、例えば酵母細胞を含んでもよい。細胞表面ディスプレイシステムは、当業者によく知られている。原核細胞システムは、例えば、Francisco JA et al (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448およびLee SY et al (2003) Trends Biotechnol 21:45-52に記載されている。真核細胞システムは、例えば、Boder ET et al (1997) Nat Biotechnol 15:553-557およびGai SA et al (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473に記載されている。一実施態様において、上記遺伝子型－表現型カップリングは、ファージディスプレイシステムを含んでもよい。
さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、無細胞ディスプレイシステムを含んでもよい。無細胞ディスプレイシステムは、リボソームディスプレイシステム、またはインビトロ区画化ディスプレイシステム（in vitro compartmentalization display system）、またはシスディスプレイ用のシステム（system for cis display）、またはミクロビーズディスプレイシステムを含んでもよい。リボソームディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Mattheakis LC et al (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91:9022-9026およびZahnd C et al (2007) Nat Methods 4:269-279に記載されている。インビトロ区画化システムは、当業者によく知られており、例えば、Sepp A et al (2002) FEBS Lett 532:455-458に記載されている。シスディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Odegrip R et al (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101:2806-2810に記載されている。ミクロビーズディスプレイシステムは、当業者によく知られており、例えば、Nord O et al (2003) J Biotechnol 106:1-13に記載されている。
さらにまた、遺伝子型－表現型カップリング手段は、非ディスプレイシステム、例えばタンパク質－フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）を含んでもよい。ＰＣＡシステムは、当業者によく知られており、例えば、Koch H et al (2006) J Mol Biol 357:427-441に記載されている。
本開示の第６の態様において、ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法が提供される。
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法が提供される。
以下において、この方法は、本開示による「選択方法」と称する。
ステップ（ａ）は、ポリヌクレオチドの集団を準備し、そしてポリヌクレオチドの上記集団を発現させてポリペプチドの上記集団を得る準備ステップを含んでもよい。ポリペプチドの集団を得るための手段は、使用するディスプレイシステムに応じて変わり、このような手段の例は、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。選択方法で用いるポリペプチドの上記集団のそれぞれのメンバーを、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的に関連付けてもよい。遺伝子型－表現型カップリング手段は、上に議論されたものの１つであってもよい。
ステップ（ｂ）は、標的と、標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップを含む。適用できる条件の範囲は、標的のロバストネス（robustness）、ディスプレイシステムのロバストネス、および標的との相互作用の所望の性質によって決定される。例えば、所定のｐＨへの酸性化といったような相互作用を分離する具体的方法が望ましいこともありうる。当業者は、適した条件を決定するにはどんな実験が必要か知っている。
ステップ（ｃ）は、少なくとも１つのポリペプチドの選択を含む。所定の標的と、標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用に基づいて残りの集団から所望のポリペプチドを選択する手段は、使用するディスプレイシステムに応じて変わり、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。例えば、インビトロディスプレイ選択システムは、ファージディスプレイおよびタンパク質フラグメント区画化アッセイのようなシステムと対照的に無細胞である。
本開示の第７の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・第６の態様による選択方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法が提供される。
・第６の態様による選択方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法が提供される。
以下において、この方法は、本開示による「単離方法」と称する。
ポリペプチドからのポリヌクレオチドの分離は、選択に用いるディスプレイシステムに応じて異なるやり方で行ってもよい。例えば、シスディスプレイおよびリボソームディスプレイのような無細胞ディスプレイシステムでは、ポリヌクレオチドまたは対応するｍＲＮＡは、上の遺伝子型－表現型の文献で記載された手段を用いてポリペプチドからの効率的溶離により回収される。ポリヌクレオチドの単離は、選択に用いるディスプレイシステムに応じて異なる方法によって行ってもよい。上記の選択システムのほとんど、例えば、タンパク質フラグメント相補性アッセイにおいて、ポリヌクレオチドは、適当なオリゴヌクレオチドを用いる特異的ＰＣＲ増幅によって直接単離することができる。また、リボソームディスプレイにおけるように、ポリヌクレオチドは、逆転写を用いて対応するｍＲＮＡから単離することができる。ポリヌクレオチドを単離するためのさまざまな手段は、上の遺伝子型－表現型の文献に見いだすことができる。
本開示の第８の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法が提供される。ポリヌクレオチドの配列決定は、当業者によく知られた標準的な方法に従って行ってもよい。
・第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法が提供される。ポリヌクレオチドの配列決定は、当業者によく知られた標準的な方法に従って行ってもよい。
本開示の第９の態様において、ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法が提供される。
（ａ）第３の態様によるポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法が提供される。
ステップ（ｃ）では、例えば質量分光分析を用いることが可能である。
以下において、この方法は、本開示による「選択および同定方法」と称する。
本開示の第１０の態様おいて、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
・第６の態様による選択方法または第９の態様による選択および特定方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法が提供される。
・第６の態様による選択方法または第９の態様による選択および特定方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法が提供される。
以下において、この方法は、本開示による「産生方法」と称する。
産生方法において、産生は、所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの組換え発現を用いて実施してもよい。産生は、新たに所望のポリペプチドの化学合成を用いて実施してもよい。
本開示の第１１の態様において、所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ１）第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含み、その際、ステップ（ｂ）をステップ（ａ１）またはステップ（ａ２）の後に実施する方法が提供される。
（ａ１）第７の態様による単離方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含み、その際、ステップ（ｂ）をステップ（ａ１）またはステップ（ａ２）の後に実施する方法が提供される。
本開示によるポリペプチド、集団および方法は、所定の標的に対する特異的結合を特徴とするポリペプチドの供給により、所定の標的に対する親和性を有する物質の供給を可能にする。
非特異的結合を少ししかまたは全く示さない所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。
融合ポリペプチドの一部として容易に用いることができる所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。
さらにまた、既存の抗体試薬で遭遇する知られている問題の１つまたはそれ以上を解決する、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。
さらに、治療および／または診断用途における使用に適した、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。
化学的ペプチド合成によって容易に作られた、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。
さらにまた、本発明は、同じ標的に結合する知られている物質と比べて改善された安定性を示す、所定の標的と結合するポリペプチドの特定を可能にする。
哺乳動物中にインビボで用いたときに低い抗原性を示す、かつ／または哺乳動物に投与すると改善された体内分布を示す、所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。
本開示による集団を構成しているポリペプチドに関する上で議論された修飾は、上記の方法のいずれかによって得られたポリペプチドにもあてはまる。
本開示によるポリペプチドは、化学合成、または細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、全植物およびトランスジェニック動物を含む、種々の原核細胞もしくは真核細胞宿主中での発現を含む、任意の知られている手段で産生してもよい。
ポリペプチド、ポリペプチドの集団および本明細書に開示された特定、選択、単離および産生の方法を、さまざまな例示的な態様および実施態様に関して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができ、その要素を同等のもので置換できることは、当業者に理解されるであろう。さらに、本発明の必須の範囲を逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多くの改変を行ってもよい。したがって、本開示は、企図された任意の特定の実施態様に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にあるすべての実施態様を含むものとする。
以下の実施例は、改善された安定性を示す新規なＺ変異体ポリペプチドを開示している。本明細書では、以前の骨格生成に基づくＺ変異体ポリペプチドの性質を、本明細書に開示された骨格に基づくＺ変異体ポリペプチドと比較した。
〔比較実施例１〕知られているＣ５結合Ｚ変異体の安定性試験
ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）で表したＣ５結合Ｚ変異体を、２５ｍＭ ＮａＰ／１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０中で調製し、３７℃で２週間の加速安定性研究にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）によって、安定性試験後の新たな変異体の出現により安定性を測定した。両分析では、初期サンプルおよび安定性研究にかけたものを並行して実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、タンパク質７．５μｇを各ウェルに装填した。ＲＰＣは、Agilent 1100 HPLCにおいて、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％イソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを用いて実施した。
ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）で表したＣ５結合Ｚ変異体を、２５ｍＭ ＮａＰ／１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０中で調製し、３７℃で２週間の加速安定性研究にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）によって、安定性試験後の新たな変異体の出現により安定性を測定した。両分析では、初期サンプルおよび安定性研究にかけたものを並行して実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、タンパク質７．５μｇを各ウェルに装填した。ＲＰＣは、Agilent 1100 HPLCにおいて、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％イソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを用いて実施した。
結果は、タンパク質の新たな形態がインキュベーション中に形成され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２）中にバンドとして、そして逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）クロマトグラム（図３）中に新たなピークとして視覚化されたことを示している。図３において、２週間のインキュベーション後の主要ピークは、元のタンパク質サンプルの５７％に相当する。
配列番号：１の位置１～６０は、配列番号：７５３としてＷＯ２０１３／１２６００６に以前に開示されたポリペプチドＺ０６１７５ａに相当する。
〔実施例２〕修飾されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物の安定性試験
修飾されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物を本質的にＷＯ２０１３／１２６００６に記載されたとおり合成し、そして精製した。
修飾されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物を本質的にＷＯ２０１３／１２６００６に記載されたとおり合成し、そして精製した。
簡潔に言えば、Ｃ５結合Ｚ変異体をコードしているＤＮＡは、GeneArt, GmbHによって最適化され、そして合成されたE. coliコドンであった。新たなＣ５結合Ｚ変異体を表す合成遺伝子をサブクローニングし、そしてE. coli中で発現させた。
細胞内に発現されたＺ変異体を、慣用のクロマトグラフ法を用いて精製した。ホモジナイズおよび清澄化は、超音波処理、続いて遠心分離および濾過よって実施した。陰イオン交換クロマトグラフィーを捕捉ステップとして用いた。さらなる精製を疎水的相互作用クロマトグラフィーによって行った。精製は、酸性条件（ｐＨ５．５）で実行した。研磨（polishing）および緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施した。
精製されたタンパク質を２５ｍＭ ＮａＰ／１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．０中で調製し、そして３７℃で２週間の加速安定性研究にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）によって、安定性試験後の新たな変異体の出現により安定性を測定した。両分析では、初期サンプルおよび安定性研究にかけたものを並行して実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、タンパク質７．５μｇを各ウェルに装填した。生成したゲルの例を図４に示す。
ＲＰＣは、Agilent 1100 HPLCにおいて、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％のイソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを用いて実施した。配列番号：５に関して生成したクロマトグラムの例を図５に示す。
安定性試験の結果を、表１にまとめる。
表１から、特定の修飾されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物は、ＰＳＩ０２４２と比較したときに、増加した安定性のような改善された性質を有することが結論付けられた。このような改善されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物としては、ＰＳＩ０３３４（配列番号：５）、ＰＳＩ０３４０（配列番号：１０）、ＰＳＩ０３６９（配列番号：１１）、ＰＳＩ０３７７（配列番号：１２）、ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）、ＰＳＩ０３７９（配列番号：１４）、ＰＳＩ０３８１（配列番号：１５）、ＰＳＩ０３８３（配列番号：１６）、ＰＳＩ０４００（配列番号：２２）、ＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）、ＰＳＩ０４０３（配列番号：２４）およびＰＳＩ０４０４（配列番号：２５）が含まれる。前述の変異体の６つ（配列番号：５、１２、１３、１４、１６および２２）は、位置５２～５３のアミノ酸残基が、ＮＤ（参照ＰＳＩ０２４２）からＳＥに置換されていることで共通している。配列番号：１５では、置換がＮＤからＥＳに相当する。配列番号：２４では、位置５３のアミノ酸残基のみがＤからＥに置換されているのに対して、配列番号：２５では、位置５２のアミノ酸残基がＮからＳに置換されている。
〔実施例３〕修飾された化合物のヒトＣ５に対する結合
ヒト血清アルブミンを、アミンカップリングによってアミン反応性第二世代（Amine Reactive 2nd generation）（ＡＲ２Ｇ）ディップアンドリードバイオセンサ（Dip and Read Biosensors）（ポールライフサイエンシズ（Pall Life sciences）（ForteBio）Cat # 18-5092）に固定した。リードバッファー（read buffer）（ＨＢＳ－ＥＰバッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０］、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、カタログ番号ＢＲ１００１８８）中のＰＳＩ０２４２（配列番号：１；１μＭ）および修飾されたＣ５結合化合物（１μＭ）を、それぞれＨＳＡと共に別々のセンサ上に１２０秒間装填し、続いてリードバッファー中で６０秒間のベースライン記録後、リードバッファー中０．７９ｎＭから２５ｎＭの範囲の濃度でヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３））にかけ、各濃度の間に再生サイクルおよびベースライン記録した。センサの再生条件は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２（３０秒で３回のパルスおよび６０秒間のランニングバッファー（running buffer））であった。それぞれのスペクトログラムは、アルブミン結合ドメイン（配列番号：２）を含有するがＣ５結合能力のない類似の構築物のそれに対して基準値を減算した。ForteBio Analysis 7.1（Pall Life sciences（ForteBio）動態ソフトウェア）を用いて、ラングミュア１：１モデルに従ってデータを分析した。
ヒト血清アルブミンを、アミンカップリングによってアミン反応性第二世代（Amine Reactive 2nd generation）（ＡＲ２Ｇ）ディップアンドリードバイオセンサ（Dip and Read Biosensors）（ポールライフサイエンシズ（Pall Life sciences）（ForteBio）Cat # 18-5092）に固定した。リードバッファー（read buffer）（ＨＢＳ－ＥＰバッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０］、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、カタログ番号ＢＲ１００１８８）中のＰＳＩ０２４２（配列番号：１；１μＭ）および修飾されたＣ５結合化合物（１μＭ）を、それぞれＨＳＡと共に別々のセンサ上に１２０秒間装填し、続いてリードバッファー中で６０秒間のベースライン記録後、リードバッファー中０．７９ｎＭから２５ｎＭの範囲の濃度でヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３））にかけ、各濃度の間に再生サイクルおよびベースライン記録した。センサの再生条件は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２（３０秒で３回のパルスおよび６０秒間のランニングバッファー（running buffer））であった。それぞれのスペクトログラムは、アルブミン結合ドメイン（配列番号：２）を含有するがＣ５結合能力のない類似の構築物のそれに対して基準値を減算した。ForteBio Analysis 7.1（Pall Life sciences（ForteBio）動態ソフトウェア）を用いて、ラングミュア１：１モデルに従ってデータを分析した。
ＰＳＩ０２４２（配列番号；１）とＣ５との相互作用の相対ＫＤを表２に示す。ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）のＫＤは、種々の実行において１～３ｎＭ変動する。
表２の結果は、本開示によるＣ５結合化合物が、ＷＯ２０１３／１２６００６に開示されたポリペプチドＰＳＩ０２４２（配列番号：１）のものと類似したヒトＣ５に対する結合能力を有することを示している。
〔実施例４〕化学合成されたＣ５結合ポリペプチドの安定性
化学合成されたＰＳＩ０４００（配列番号：２２）をバッヘムＡＧ（BACHEM AG）に注文した。ポリペプチドの安定性を実施例２と同じ方法論に従って試験した。安定性試験の結果を表３に示す。
化学合成されたＰＳＩ０４００（配列番号：２２）をバッヘムＡＧ（BACHEM AG）に注文した。ポリペプチドの安定性を実施例２と同じ方法論に従って試験した。安定性試験の結果を表３に示す。
ＰＳＩ０４００の安定性は、実施例２のE. coli中で産生された同じポリペプチドに匹敵した。
ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを用いて、ＰＳＩ０４００（配列番号：２２）の折り畳みの完全性を、実施例２の方法に従って産生された組換えＣ５結合ポリペプチド（ＰＳＩ０２５７、配列番号：２６）と比較した。
ＣＤスペクトルは、Ｊ－７２０ＣＤ分光偏光計（ジャスコ（Jasco）、日本）によって記録した。Ｐｉバッファー（５ｍＭ Ｎａ－Ｋ－ＰＯ４、ｐＨ７．０）を用いてサンプルを０．１７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。ＰｉバッファーのＣＤスペクトルを最初に記録し、次いで、サンプルのそれぞれついて、最後に再びＰｉバッファーについてスペクトルを記録した。２つのバッファースペクトルが一致するように、最初に記録されたスペクトルを、バッファースペクトルとして用いた。畳み込み幅（convolution width）２５でSavitzky-Golay法を用いてバッファースペクトルを滑らかにした。他のスペクトルは、同じ方法に従って畳み込み幅１５で滑らかにした。次いで、他の滑らかにしたスペクトルのそれぞれから、滑らかにしたバッファースペクトルを減算した。ＣＤＮＮプログラムを用いてタンパク質の二次含量を推定し、得られた推定値を表４に示す。結果は、位置５２および５３の２つのアミノ酸置換も、化学合成によるポリペプチド産生も、化学合成されたポリペプチドの二次構造含量に影響を与えないことを示した。二次構造含量の完全性を、組換えにより産生されたＰＳＩ０２５７（配列番号：２６）と比較した。
〔実施例５〕修飾されたＺ変異体およびポリペプチドのヒトＣ５に対する結合
ビアコアＴ２００（Biacore T200）機器（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて、Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）、ＰＳＩ０３４０（配列番号：１０）、ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）ならびにヒトＣ５に関するＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）の結合親和性を分析した。ヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３）を、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサチップ（９００ＲＵ）に結合させた。ｈＣ５を１０ｍＭ酢酸ＮａバッファーｐＨ５（ＧＥヘルスケア）中７．５μｇ／ｍｌの濃度で注射することによってカップリングを実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトＣ５を注射しなかった。固定されたｈＣ５に対するＣ５ポリペプチドおよび化合物の結合を単一のサイクル動態方法で研究し、ここでは、５つの濃度、典型的にＨＢＳ－ＥＰバッファー中２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭのサンプルを、注射間で再生することなく同じサイクルで、２５℃で３０μｌ／分の流速で順々に注射した。バルク屈折率（bulk refractive index）変化を補正するため参照セルからのデータを減算した。ほとんどの場合、センサーグラムがダブルブランクとなるように、対照としてＨＢＳ－ＥＰの注射も含んだ。表面をＨＢＳ－ＥＰバッファーで再生した。速度定数は、ビアコアＴ２００（Biacore T200）評価ソフトウェアバージョン１．０のラングミュア１：１検体モデルを用いてセンサーグラムから算出した。得られた相互作用のＫＤ値を表５に示す。
ビアコアＴ２００（Biacore T200）機器（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて、Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）、ＰＳＩ０３４０（配列番号：１０）、ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）ならびにヒトＣ５に関するＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）の結合親和性を分析した。ヒトＣ５（クイデル（Quidel）、カタログ番号Ａ４０３）を、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサチップ（９００ＲＵ）に結合させた。ｈＣ５を１０ｍＭ酢酸ＮａバッファーｐＨ５（ＧＥヘルスケア）中７．５μｇ／ｍｌの濃度で注射することによってカップリングを実施した。参照細胞は、同じ試薬で処理したが、ヒトＣ５を注射しなかった。固定されたｈＣ５に対するＣ５ポリペプチドおよび化合物の結合を単一のサイクル動態方法で研究し、ここでは、５つの濃度、典型的にＨＢＳ－ＥＰバッファー中２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭのサンプルを、注射間で再生することなく同じサイクルで、２５℃で３０μｌ／分の流速で順々に注射した。バルク屈折率（bulk refractive index）変化を補正するため参照セルからのデータを減算した。ほとんどの場合、センサーグラムがダブルブランクとなるように、対照としてＨＢＳ－ＥＰの注射も含んだ。表面をＨＢＳ－ＥＰバッファーで再生した。速度定数は、ビアコアＴ２００（Biacore T200）評価ソフトウェアバージョン１．０のラングミュア１：１検体モデルを用いてセンサーグラムから算出した。得られた相互作用のＫＤ値を表５に示す。
本データは、安定性強化アミノ酸置換が、Ｃ５に結合する分子の能力においてなんら有意な悪影響がなく、そのため、それらの生物活性に影響を及ぼさないことを示している。
〔実施例６〕溶血の阻害
古典的補体経路機能ならびにＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）、およびＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）によるその阻害の研究のため、アルセバー液中の新たなヒツジ全血（スウェーデン国立獣医研究所（Swedish National Veterinary Institute））からヒツジ赤血球を調製した。その後、赤血球をウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清（シグマ）で処理して抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）とした。過程全体を無菌条件下で実施した。他のすべての試薬は、商業的供給源のものであった。
古典的補体経路機能ならびにＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）、およびＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）によるその阻害の研究のため、アルセバー液中の新たなヒツジ全血（スウェーデン国立獣医研究所（Swedish National Veterinary Institute））からヒツジ赤血球を調製した。その後、赤血球をウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清（シグマ）で処理して抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）とした。過程全体を無菌条件下で実施した。他のすべての試薬は、商業的供給源のものであった。
インビトロ試験は、９６ウェルＵ型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびＥＡ懸濁液の逐次添加によって行った。すべての試薬の最終濃度は、ウェル当たり５０μｌの全反応体積中かつｐＨ７．３～７．４で、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２；０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；３ｍＭ ＮａＮ３；１３８ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ゼラチン；１．８ｍＭナトリウムバルビタール；３．１ｍＭバルビツール酸；５，０００，０００ＥＡ；適した希釈度の補体タンパク質Ｃ５血清、および所望の濃度のＣ５結合化合物またはポリペプチドであった。
Ｃ５結合化合物およびポリペプチドを、上記の補体血清と共に氷上で２０分間プレインキュベートした後、ＥＡ懸濁液の添加によって反応を開始した。溶血反応を撹拌条件下、３７℃で４５分間進行させ、次いで、場合により０．０２％ツイーン２０（Tween 20）を含有する氷冷生理食塩水１００μｌの添加によって終了させた。細胞をバイアルの底に遠心分離し、上清１００μｌに相当する上方部分をハーフエリアおよび平底のウェルを有する透明なマイクロプレートに移した。４１５ｎｍの波長でマイクロタイタープレートリーダーを用いて反応結果を光学濃度として分析した。
非阻害および完全阻害の反応値を確定するため、それぞれ、各プレートには対照試料（ＰＳＩ０２４２、配列番号：１）およびビヒクルが含まれている。これらの値を用いて任意の所定のサンプル濃度での補体溶血の％阻害を算出した。試験されたＣ５結合化合物およびポリペプチドの阻害能力（ＩＣ５０値）は、Ｃ５減損血清（C5 depleted serum）に添加されたヒトＣ５の制御濃度の存在下で、同じ試験を適用することによって確定した。高度に強力な阻害薬（低ナノモルからナノモル以下）に関して、反応混合物の最終的なＣ５濃度は、０．１ｎＭで制御されており、これは場合によりＣ５減損または欠損血清を用いて確立した。結果を下の表６に示す。
溶血試験からの結果は、改善されたＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号：１３）およびＰＳＩ０４１０（配列番号：２３）が、機能に関して参照化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）と大きく異ならないことを示している。Ｃ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号：２２）は本試験において機能的であるが、それはアルブミン結合ドメインを含まないので、結果を参照化合物のものと直接比較することはできない。
〔実施例７〕ヒトアルブミンに対する結合
アルブミンに対するＣ５結合化合物の親和性の評価のため、コーティング（ノボザイム（Novozymes））として組換えヒトアルブミンならびにアフィボディＡＢ（一次）およびダコサイトメーション（DakoCytomation）（検出）から商業的に入手可能な抗体を使用してヒトアルブミンＥＬＩＳＡを用いた。ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）から調製され、かつＣ５結合ポリペプチドおよび連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインを含む方法標準をサンプルの定量に用いた。
アルブミンに対するＣ５結合化合物の親和性の評価のため、コーティング（ノボザイム（Novozymes））として組換えヒトアルブミンならびにアフィボディＡＢ（一次）およびダコサイトメーション（DakoCytomation）（検出）から商業的に入手可能な抗体を使用してヒトアルブミンＥＬＩＳＡを用いた。ＰＳＩ０２４２（配列番号：１）から調製され、かつＣ５結合ポリペプチドおよび連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインを含む方法標準をサンプルの定量に用いた。
９６ウェルマイクロプレートを組換えヒトアルブミンでコーティングした。次いで、プレートを、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ＰＢＳ中の１％カゼインで１～２時間ブロックした。プレート洗浄後、標準、方法対照、対照サンプルおよび試験サンプルをプレートに加える。２時間インキュベーション後、非結合物質を洗浄によって除去した。ヤギ抗アフィボディ（anti-Affibody）（R）ＩｇＧ（アフィボディＡＢ（Affibody AB）、カタログ番号２０．１０００．０１．０００５）をウェルに加え、プレートを１．５時間インキュベートして、結合されたＣ５結合化合物に結合させた。洗浄後、ウサギ抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰ（ダコサイトメーション（DakoCytomation））を、ヤギ抗体に１時間結合させた。最終洗浄後、結合したＨＲＰの量を、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）の添加によって検出したところ、それは酵素によって青色の生成物に変換された。３０分後、１Ｍ塩酸の添加により反応を停止し、ウェル内容物の色は青色から黄色に変わった。参照波長として６５０ｎｍの吸光度を用いて４５０ｎｍの吸光度を測光的に測定した。色の強さはＰＳＩ０２４２（配列番号：１）の量に比例しており、サンプル濃度は検量線から決定した。
連鎖球菌Ｇタンパク質からのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の誘導体を含むＣ５結合化合物は、ヒトアルブミンに結合できることが示された。データを表７に示す。
試験の解釈では、調査した改善された安定性を有するＣ５結合ポリペプチドはいずれも、ヒト血清アルブミンを結合するそれらの能力を維持している。
〔実施例８〕Ｃ５結合Ｚ変異体およびポリペプチドの３ヵ月の安定性試験
３７℃で２週間の安定性試験においてＰＳＩ０２４２と比較して改善された安定性を示したＣ５結合変異体およびポリペプチド（実施例２）を、３７℃でより長い３ヵ月の安定性試験にかけた。安定性試験およびＲＰＣによる分析の設定は実施例２に記載されたとおりであった。クロマトグラムの主要ピークを測定し、対応する総タンパク質含量のパーセンテージを算出することによって安定性の評価を行った。実施例２のデータは、解釈をより容易にするため下の表８に含まれる。
３７℃で２週間の安定性試験においてＰＳＩ０２４２と比較して改善された安定性を示したＣ５結合変異体およびポリペプチド（実施例２）を、３７℃でより長い３ヵ月の安定性試験にかけた。安定性試験およびＲＰＣによる分析の設定は実施例２に記載されたとおりであった。クロマトグラムの主要ピークを測定し、対応する総タンパク質含量のパーセンテージを算出することによって安定性の評価を行った。実施例２のデータは、解釈をより容易にするため下の表８に含まれる。
ＰＳＩ０２４２と比較して位置５２～５３においてＳＥからＮＤのアミノ酸置換を含むＣ５結合化合物（配列番号：１３、１４および１６）は、同じ条件下で２週間後のＰＳＩ０２４２（配列番号：１）（表１参照）よりも、３７℃で３ヵ月後における元の形態のタンパク質の割合がより高いことを示した。また、他の試験化合物もＰＳＩ０２４２と比較して増加した安定性を示す。
〔実施例９〕種々の標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成、安定性研究および結合評価
種々の標的に対して特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成：本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成される。別法として、分子全体の化学合成によって、またはＺ変異体ポリペプチドの結合モチーフを新たな骨格に移植するための、当業者に知られている他の分子生物学的方法を用いることによって新たな分子を作ってもよい。
種々の標的に対して特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成：本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成される。別法として、分子全体の化学合成によって、またはＺ変異体ポリペプチドの結合モチーフを新たな骨格に移植するための、当業者に知られている他の分子生物学的方法を用いることによって新たな分子を作ってもよい。
種々の標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの比較安定性研究：上記のように生成されたそれぞれの新たなポリペプチドに関して、元のポリペプチドまたは別の類似のポリペプチドの安定性と安定性を比較する。ポリペプチドを異なる条件、例えば［２５ｍＭ ＮａＰ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０］中の調製物ならびに実施例２に記載された２週間および／または実施例８に記載された３ヵ月の３７℃でのインキュベーションにかける。安定性は、実施例２に記載したようなＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＲＰＣ分析を実施して新たな変異体の出現を分析することによって評価する。
骨格位置に導入された修飾を有するポリペプチドは、実施例２および実施例１２に示した結果と同様に改善された安定性を示すことが期待される。
骨格修飾されたポリペプチドの結合評価：改善された安定性を示しているポリペプチドを、骨格における改変の導入後にその標的に対する結合能力の保存に関してさらに評価する。結合研究は、バイオセンサー機器、または当業者に知られている他のいずれかの機器において２つまたはそれ以上の分子間の相互作用を測定して実施する。例えば、標的分子またはそのフラグメントを機器のセンサチップ上に固定し、被検ポリペプチドを含有するサンプルをチップ上に通過させる。別法として、被検ポリペプチドを機器のセンサチップ上に固定し、所定の標的を含有するサンプルまたはそのフラグメントをチップ上に通過させる。結合親和性は、抗体コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でポリペプチドのサンプルを捕捉し、ビオチン化された所定の標的またはそのフラグメント、ストレプトアビジン結合ＨＲＰを加える実験において試験してもよい。ＴＭＢ基質を加え、マルチウェルプレートリーダー、例えばビクター３（Victor3）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。また、例えば相互作用のＥＣ５０値（最大半減有効濃度）を決定するため、定量的尺度が望ましい場合、ＥＬＩＳＡを用いてもよい。上記のようにＥＬＩＳＡを用いて、所定の標的またはそのフラグメントの希釈系列に対するポリペプチドの反応を測定する。このような実験およびＥＣ５０値によって得られた結果は、例えばグラフパッドプリズム５（GraphPad Prism 5）および非線形回帰を用いて結果から算出してもよい。ポリペプチドがアルブミン結合ドメインを含有する場合、アルブミン結合における効果を、実施例３に記載したように、または実施例７に記載したように同様に評価する。
本明細書に記載された骨格変異、およびさらにその標的に対する類似のまたは改善された結合能力を有するポリペプチドは、例えば生物医薬品へとさらに開発するためのより良好な候補であると考えられる。
〔実施例１０〕４つの異なる標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの生成
本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成した。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０２８９１（配列番号：２７）；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦ－Ｒβ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１５８０５（配列番号：３０）；新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１０１０３（配列番号：３３）；および炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０９７８２（配列番号：３６）中の骨格位置のアミノ酸置換は、表９に明記されている。
本明細書に記載された新たな骨格を含むポリペプチド変異体は、種々の標的に対する特異性を有するＺ変異体ポリペプチドを取り上げ、骨格内の選択された位置で部位特異的突然変異誘発を実施することによって生成した。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０２８９１（配列番号：２７）；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦ－Ｒβ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１５８０５（配列番号：３０）；新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ１０１０３（配列番号：３３）；および炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的とするポリペプチド変異体Ｚ０９７８２（配列番号：３６）中の骨格位置のアミノ酸置換は、表９に明記されている。
すべての変異体は、Ｎ末端６×ヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ６）付きでクローニングされ、そして得られた構築物は、フォーマットＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ［Ｚ＃＃＃＃＃］のポリペプチドをコードした。所望のアミノ酸置換をコードしているオーバーラップオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、確立された分子生物学的手法を適用することによって本発明のポリペプチドのプラスミドに変異を導入した。正確なプラスミド配列は、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。
元のおよび本発明のポリペプチドをコードする遺伝子フラグメントを含有するプラスミドを用いてE coli（菌株Ｔ７Ｅ２）細胞（ジーンブリッジ（GeneBridge））を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴＳＢ－ＹＥ培地中３７℃で細胞を培養し、その後、ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。沈殿した細胞を、ファストプレップ（FastPrep）（R）２４ホモジナイザー（Nordic Biolabs）を用いて破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。Ｈｉｓ６タグ付けされたタンパク質としてＺ変異体を含有するそれぞれの上清を、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってHis GraviTrapTMカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて製造元の説明書に従って精製した。精製したＺ変異体を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）にバッファー交換した。それぞれのポリペプチドの正確な同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ－ＭＳによって検証した。
〔実施例１１〕骨格修飾されたポリペプチドの円偏光二色性分光分析
融解温度（Ｔｍ）を決定し、かつアミノ酸置換の結果として本発明のポリペプチドの二次構造における潜在的変化を評価するために円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した。精製されたＨｉｓ６タグ付けされたＺ変異体をＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。希釈された各Ｚ変異体に関して、２５０～１９５ｎｍのＣＤスペクトルを２０℃で記録した。Ｔｍを決定するために可変温度測定（ＶＴＭ）を実施した。ＶＴＭでは、５℃／分の温度勾配で温度を２０℃から９０℃まで上昇させながら、吸光度を２２１ｎｍで測定した。ＶＴＭ後、２５０～１９５ｎｍでの第２のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。ＣＤ測定は、１ｍｍの光路長を有するセルを用いてジャスコ（Jasco）Ｊ－８１０分光偏光計（ジャスコスカンジナビアＡＢ（Jasco Scandinavia AB））において実施した。
融解温度（Ｔｍ）を決定し、かつアミノ酸置換の結果として本発明のポリペプチドの二次構造における潜在的変化を評価するために円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した。精製されたＨｉｓ６タグ付けされたＺ変異体をＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。希釈された各Ｚ変異体に関して、２５０～１９５ｎｍのＣＤスペクトルを２０℃で記録した。Ｔｍを決定するために可変温度測定（ＶＴＭ）を実施した。ＶＴＭでは、５℃／分の温度勾配で温度を２０℃から９０℃まで上昇させながら、吸光度を２２１ｎｍで測定した。ＶＴＭ後、２５０～１９５ｎｍでの第２のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。ＣＤ測定は、１ｍｍの光路長を有するセルを用いてジャスコ（Jasco）Ｊ－８１０分光偏光計（ジャスコスカンジナビアＡＢ（Jasco Scandinavia AB））において実施した。
ＣＤシグナル対温度プロットで遷移の中点から決定されたそれぞれ個々のポリペプチドのＴｍを表１０に示す。すべての変異ポリペプチドは、保存されたアルファヘリックス構造を示し、かつ可逆的にまたはほぼ可逆的にリフォールディングされた。ＣＤスペクトルの選択されたセットを図７に示す。
〔実施例１２〕４つの異なる標的に対する特異性を有する骨格修飾されたポリペプチドの比較安定性研究
実施例１０に記載したように作製されたそれぞれの新たなポリペプチドについて、その安定性を、元のポリペプチドの安定性と比較した。ＰＢＳ ｐＨ７．４中で調製されたポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌのアリコートを３７℃で２週間インキュベートした。安定性試験の前および後に採取されたサンプルは、１０％Bis-Tris NuPAGEゲル（インビトロゲン）を用いて、タンパク質５μｇを各ウェルに装填してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。得られたクーマシーブルー染色ゲルを図８に示す。高められた温度でインキュベーション後、新たな変異体の出現によって安定性を評価し、変異した変異体を、それぞれの元のポリペプチドと比較した。
実施例１０に記載したように作製されたそれぞれの新たなポリペプチドについて、その安定性を、元のポリペプチドの安定性と比較した。ＰＢＳ ｐＨ７．４中で調製されたポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌのアリコートを３７℃で２週間インキュベートした。安定性試験の前および後に採取されたサンプルは、１０％Bis-Tris NuPAGEゲル（インビトロゲン）を用いて、タンパク質５μｇを各ウェルに装填してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。得られたクーマシーブルー染色ゲルを図８に示す。高められた温度でインキュベーション後、新たな変異体の出現によって安定性を評価し、変異した変異体を、それぞれの元のポリペプチドと比較した。
表９に記載した骨格位置に導入された修飾を有するすべてのポリペプチドは、それぞれの元のポリペプチドと比較して改善された安定性を示した。元のポリペプチドのサンプルでは、ゲル上で第２のバンドが主要バンドのすぐ上に認めることができた。置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを有する本発明のポリペプチドのサンプルでは、対応する第２のバンドを認めることができなかった。これは、実施例２および４に示した結果と類似している。したがって、本発明の骨格変異に関して観察された安定化効果は、Ｚ変異体または上記Ｚ変異体を含むポリペプチドの標的特異性に関係なく共通の効果であると考えられる。置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを単独でまたは置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わせて有するポリペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で類似のプロファイルを示した。単独の、または置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わせた置換Ｄ５３Ｅは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で第２のバンドとして観察された別の確証を有する種の量を低減すると考えられるが、しかし、この種の形成を完全に防ぐことができなかった。
〔実施例１３〕骨格修飾されたポリペプチドの結合評価
実施例１２で改善された安定性を示す一組のポリペプチドを、骨格における改変の導入後だけでなく安定性試験にかけた後、すなわち３７℃で２週間インキュベートした後のそれらの標的に対する結合能力の保存に関してさらに評価した。比較速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）は、ビアコア２０００（Biacore 2000）機器を用いて決定した。標的タンパク質ヒトＨＥＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号１１２９－ＥＲ－０５０）、ヒトＰＤＧＦ－Ｒβ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号３８５－ＰＲ－１００／ＣＦ）、ヒトＦｃＲｎ（Biorbyt、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）およびヒトＣＡＩＸ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号２１８８－ＣＡ）を、それぞれＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））のカルボキシル化デキストラン層表面上に固定した。固定化は、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用い、かつランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰを用いて実施した。チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、そして検体注射におけるブランクとして使用するため不活性化した。それぞれの表面上の標的タンパク質の固定化レベルは、ＨＥＲ２に関して約８５０ＲＵ、ＰＤＧＦ－Ｒβに関して２２００ＲＵ、ＦｃＲｎに関して７５０、そしてＣＡＩＸに関して５８０ＲＵであった。
実施例１２で改善された安定性を示す一組のポリペプチドを、骨格における改変の導入後だけでなく安定性試験にかけた後、すなわち３７℃で２週間インキュベートした後のそれらの標的に対する結合能力の保存に関してさらに評価した。比較速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）は、ビアコア２０００（Biacore 2000）機器を用いて決定した。標的タンパク質ヒトＨＥＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号１１２９－ＥＲ－０５０）、ヒトＰＤＧＦ－Ｒβ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号３８５－ＰＲ－１００／ＣＦ）、ヒトＦｃＲｎ（Biorbyt、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）およびヒトＣＡＩＸ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、カタログ番号２１８８－ＣＡ）を、それぞれＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））のカルボキシル化デキストラン層表面上に固定した。固定化は、製造元のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を用い、かつランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰを用いて実施した。チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、そして検体注射におけるブランクとして使用するため不活性化した。それぞれの表面上の標的タンパク質の固定化レベルは、ＨＥＲ２に関して約８５０ＲＵ、ＰＤＧＦ－Ｒβに関して２２００ＲＵ、ＦｃＲｎに関して７５０、そしてＣＡＩＸに関して５８０ＲＵであった。
ＨＢＳ－ＥＰ（ＨＥＲ２、ＰＤＧＦ－Ｒβ、ＣＡＩＸ）またはｐＨ６．０のＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸バッファー（１２６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３７ｍＭクエン酸）（ＦｃＲｎ）をランニングバッファーとして用い、さらに後述するように、２５℃で実施した結合実験では、流速は３０μｌ／分であった。
ＨＥＲ２を標的とするＺ変異体Ｚ０２８９１（配列番号：２７）、Ｚ１７３４１（配列番号：２８）およびＺ１７３４２（配列番号：２９）をランニングバッファー中で３．３３、１０、３０および９０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で３０分解離させた。１０ｍＭ ＨＣｌと１０ｍＭ ＮａＯＨとを交互に繰り返す４回の適用、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。
ＰＤＧＦ－Ｒβを標的とするＺ変異体Ｚ１５８０５（配列番号：３０）、Ｚ１７３４３（配列番号：３１）およびＺ１７３４４（配列番号：３２）をランニングバッファー中で６．６７、２０、６０および１８０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で２０分間解離させた。１０ｍＭ ＮａＯＨの３回の適用、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。
ＦｃＲｎを標的設定とするＺ変異体Ｚ１０１０３（配列番号：３３）、Ｚ１７３４７（配列番号：３４）およびＺ１７３４８（配列番号：３５）をランニングバッファー中で３．３３、１０および３０ｎＭの最終濃度に希釈し、３分間注射し、続いてランニングバッファー中で１５分間解離させた。ＨＢＳ－ＥＰの３回の適用、続いてランニングバッファー中の１０分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。
ＣＡＩＸを標的とするＺ変異体Ｚ０９７８２（配列番号：３６）、Ｚ１７３５１（配列番号：３７）、Ｚ１７３５５（配列番号：３９）およびＺ１７３５９（配列番号：４１）をランニングバッファー中で３０、９０および２７０ｎＭの最終濃度に希釈し、５分間注射し、続いてランニングバッファー中で１５分解離させた。１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ３．０の３回の適用、による再生、続いてランニングバッファー中の５分の平衡化による再生を、各検体注射後に適用した。
速度定数は、ラングミュア１：１モデル（ＨＥＲ２、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ）またはBiaEvaluationソフトウェア４．１（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））の物質移動モデルによる１：１の結合（ＰＤＧＦ－Ｒβ）を用いてセンサーグラムから算出した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算し、試験サンプルサイクルのデータからバッファーサイクルのデータを減算してシグナル中の任意の変動を補正した。
標的分子に結合するＺ変異体に関する比較速度定数を表１１に示し、分析された相互作用のサブセットに関するセンサーグラムを図９に示す。そのデータは、位置５２～５３におけるＮＤからＳＥの置換によってごくわずかしか親和性がもたらされず、一組の変異体、Ｚ１７３４１（配列番号：２８）およびＺ１７３４３（配列番号：３１）では、親和性がごくわずかに改善されることを示している。Ｚ１７３４２（配列番号：２９）、Ｚ１７３４４（配列番号：３２）およびＺ１７３４８（配列番号：３５）中のような、位置５２～５３におけるＳＥからＮＤの置換と、置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅとの組合せは、より速い解離速度のため、主に親和性においてよりマイナスの効果を有したが、しかし、１０－９Ｍの範囲のＫＤを有する機能的な結合剤が得られた。また、評価された変異体は、３７℃で２週間のインキュベーション後、結合能力も保存していた。
実施態様の項目化されたリスト
１．ポリペプチドであって、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．Ｘ１６がＴである、項目１に記載のポリペプチド。
３．Ｘ２６がＫである、項目１または２に記載のポリペプチド。
４．Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２がＤＤＰＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
５．Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２がＲＱＰＥである、項目１～３のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
６．Ｘ３５がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
７．Ｘ３６がＥである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
８．Ｘ３９がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
９．Ｘ４５がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１０．Ｘ４５がＥである、項目９に記載のポリペプチド。
１１．Ｘ４５がＳである、項目９に記載のポリペプチド。
１２．Ｘ４６がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１３．Ｘ４６がＥである、項目１２に記載のポリペプチド。
１４．Ｘ４６がＳである、項目１２に記載のポリペプチド。
１５．Ｘ４６がＤである、項目１２に記載のポリペプチド。
１６．Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤまたはＥではない、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１７．Ｘ４５Ｘ４６がＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１８．Ｘ４５Ｘ４６がＥＳおよびＳＥから選択される、項目１７に記載のポリペプチド。１９．Ｘ４５Ｘ４６がＥＳである、項目１８に記載のポリペプチド。
２０．Ｘ４５Ｘ４６がＳＥである、項目１８に記載のポリペプチド。
２１．Ｘ４５Ｘ４６がＳＤである、項目１８に記載のポリペプチド。
２２．Ｘ４７がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２３．さらなるアミノ酸残基を含む、項目１～２２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２４．上記ポリペプチドのＣ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２５．上記ポリペプチドのＣ末端のさらなるアミノ酸残基がＡＰを含む、項目２４に記載のポリペプチド。
２６．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２７．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基は、ＡＥＡＫＹＡＫを含む、項目２６に記載のポリペプチド。
２８．ポリペプチドの結合、産生、精製、安定化、カップリングまたは検出の目的で、上記さらなるアミノ酸残基が付加される、項目２３～２７のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２９．上記さらなるアミノ酸残基が１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成する、項目２３～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３０．上記１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインが、結合機能、酵素機能、金属イオンキレート化機能および蛍光機能またはそれらの混合の群から選択された機能を有する、項目２９に記載のポリペプチド。
３１．項目１～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチドであって、
ＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ；および
ＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３２．項目３１に記載のポリペプチドであって、
ＡＤＮＮＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３３．上記標的が、ＡＢＤ、ＨＥＲ２、ＴＮＦα、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ、ＨＥＲ３、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ、アミロイドβ、ＣＤ４、ＩＬ８、ＩＬ６およびインスリンからなる群から場合により選択される、所定の標的に対する親和性を有する、項目１～３２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３４．項目１～３３のいずれか１項目に記載のポリペプチドを一部分として含む融合ポリペプチド。
３５．標識をさらに含む、項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３６．治療剤をさらに含む、項目１～３５のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３７．検出試薬、補足試薬または分離試薬としての、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドの使用。
３８．治療に使用するための、項目１から３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３９．診断剤として使用するための、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
４０．項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
４１．共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含む集団。
４２．少なくとも１×１０４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４１に記載の集団。
４３．少なくとも１×１０６個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４２に記載の集団。
４４．少なくとも１×１０８個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４３に記載の集団。
４５．少なくとも１×１０１０個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４４に記載の集団。
４６．少なくとも１×１０１２個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４５に記載の集団。
４７．少なくとも１×１０１４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４６に記載の集団。
４８．ポリヌクレオチドの集団であって、そのそれぞれのメンバーが、項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする集団。
４９．項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチド集団と、項目４８に記載のポリヌクレオチド集団との組合せであって、ポリペプチドの上記集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している組合せ。
５０．上記遺伝子型－表現型カップリング手段がファージディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が細胞表面選択ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５２．上記細胞表面ディスプレイシステムが原核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５３．上記原核細胞がグラム陽性細胞である、項目５２に記載の組合せ。
５４．上記細胞表面ディスプレイシステムが真核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５５．上記真核生物細胞が酵母細胞である、項目５４に記載の組合せ。
５６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が無細胞ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５７．上記無細胞ディスプレイシステムがリボソームディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５８．上記無細胞ディスプレイシステムがインビトロ区画化ディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５９．上記無細胞ディスプレイシステムがシスディスプレイ用のシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６０．無細胞ディスプレイシステムがミクロビーズディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が非ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
６２．上記非ディスプレイシステムがタンパク質－フラグメント相補性アッセイである、項目６１に記載の組合せ。
６３．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法。
６４．ステップ（ａ）が、項目４８に記載のポリヌクレオチドの集団を準備し、上記ポリヌクレオチドの集団を発現させて上記ポリペプチドの集団を得る準備ステップを含む、項目６３に記載の方法。
６５．上記ポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している、項目６４に記載の方法。
６６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が項目５０～６２のいずれか１項目に定義されたとおりである、項目６５に記載の方法。
６７．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・項目６３に記載の方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法。
６８．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・項目６７に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法。
６９．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法。
７０．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
・項目６８に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するか、
または項目６９および７０のいずれか１項目に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。
７２．上記産生が、所望のポリペプチドのデノボ化学合成を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７３．上記産生が、所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの組換え発現を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７４．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ１）項目６８に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）項目６９および７０のいずれか１項目に記載の第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。
１．ポリペプチドであって、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．Ｘ１６がＴである、項目１に記載のポリペプチド。
３．Ｘ２６がＫである、項目１または２に記載のポリペプチド。
４．Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２がＤＤＰＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
５．Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２がＲＱＰＥである、項目１～３のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
６．Ｘ３５がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
７．Ｘ３６がＥである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
８．Ｘ３９がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
９．Ｘ４５がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１０．Ｘ４５がＥである、項目９に記載のポリペプチド。
１１．Ｘ４５がＳである、項目９に記載のポリペプチド。
１２．Ｘ４６がＥおよびＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１３．Ｘ４６がＥである、項目１２に記載のポリペプチド。
１４．Ｘ４６がＳである、項目１２に記載のポリペプチド。
１５．Ｘ４６がＤである、項目１２に記載のポリペプチド。
１６．Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤまたはＥではない、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１７．Ｘ４５Ｘ４６がＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから選択される、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
１８．Ｘ４５Ｘ４６がＥＳおよびＳＥから選択される、項目１７に記載のポリペプチド。１９．Ｘ４５Ｘ４６がＥＳである、項目１８に記載のポリペプチド。
２０．Ｘ４５Ｘ４６がＳＥである、項目１８に記載のポリペプチド。
２１．Ｘ４５Ｘ４６がＳＤである、項目１８に記載のポリペプチド。
２２．Ｘ４７がＳである、上記項目のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２３．さらなるアミノ酸残基を含む、項目１～２２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２４．上記ポリペプチドのＣ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２５．上記ポリペプチドのＣ末端のさらなるアミノ酸残基がＡＰを含む、項目２４に記載のポリペプチド。
２６．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基を含む、項目２３に記載のポリペプチド。
２７．上記ポリペプチドのＮ末端でさらなるアミノ酸残基は、ＡＥＡＫＹＡＫを含む、項目２６に記載のポリペプチド。
２８．ポリペプチドの結合、産生、精製、安定化、カップリングまたは検出の目的で、上記さらなるアミノ酸残基が付加される、項目２３～２７のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
２９．上記さらなるアミノ酸残基が１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを構成する、項目２３～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３０．上記１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインが、結合機能、酵素機能、金属イオンキレート化機能および蛍光機能またはそれらの混合の群から選択された機能を有する、項目２９に記載のポリペプチド。
３１．項目１～２８のいずれか１項目に記載のポリペプチドであって、
ＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ；および
ＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰ
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３２．項目３１に記載のポリペプチドであって、
ＡＤＮＮＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ ＡＰＫ；
（配列中、各Ｘｙは、項目１～２２のいずれか１項目に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３３．上記標的が、ＡＢＤ、ＨＥＲ２、ＴＮＦα、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ、ＨＥＲ３、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＡＩＸ、アミロイドβ、ＣＤ４、ＩＬ８、ＩＬ６およびインスリンからなる群から場合により選択される、所定の標的に対する親和性を有する、項目１～３２のいずれか１項目に記載のポリペプチド。
３４．項目１～３３のいずれか１項目に記載のポリペプチドを一部分として含む融合ポリペプチド。
３５．標識をさらに含む、項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３６．治療剤をさらに含む、項目１～３５のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３７．検出試薬、補足試薬または分離試薬としての、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドの使用。
３８．治療に使用するための、項目１から３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
３９．診断剤として使用するための、項目１～３６のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチド。
４０．項目１～３４のいずれか１項目に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
４１．共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドが、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ ＰＸ３２ＱＳＸ３５Ｘ３６ＬＬＸ３９Ｅ ＡＫＫＬＸ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｑ
（配列中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２５およびＸ２８のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ２９Ｘ３０ＰＸ３２は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ３５は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ３６は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ３９は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ４５は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ４６は、Ｄ、ＥおよびＳから選択されるが、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでなく；
Ｘ４７は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ４５がＮであるとき、Ｘ４６はＤでない、
から選択されるアミノ酸配列を含む集団。
４２．少なくとも１×１０４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４１に記載の集団。
４３．少なくとも１×１０６個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４２に記載の集団。
４４．少なくとも１×１０８個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４３に記載の集団。
４５．少なくとも１×１０１０個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４４に記載の集団。
４６．少なくとも１×１０１２個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４５に記載の集団。
４７．少なくとも１×１０１４個の独特なポリペプチド分子を含む、項目４６に記載の集団。
４８．ポリヌクレオチドの集団であって、そのそれぞれのメンバーが、項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする集団。
４９．項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチド集団と、項目４８に記載のポリヌクレオチド集団との組合せであって、ポリペプチドの上記集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している組合せ。
５０．上記遺伝子型－表現型カップリング手段がファージディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が細胞表面選択ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５２．上記細胞表面ディスプレイシステムが原核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５３．上記原核細胞がグラム陽性細胞である、項目５２に記載の組合せ。
５４．上記細胞表面ディスプレイシステムが真核細胞を含む、項目５１に記載の組合せ。５５．上記真核生物細胞が酵母細胞である、項目５４に記載の組合せ。
５６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が無細胞ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
５７．上記無細胞ディスプレイシステムがリボソームディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５８．上記無細胞ディスプレイシステムがインビトロ区画化ディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
５９．上記無細胞ディスプレイシステムがシスディスプレイ用のシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６０．無細胞ディスプレイシステムがミクロビーズディスプレイシステムを含む、項目５６に記載の組合せ。
６１．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が非ディスプレイシステムを含む、項目４９に記載の組合せ。
６２．上記非ディスプレイシステムがタンパク質－フラグメント相補性アッセイである、項目６１に記載の組合せ。
６３．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、その標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）上記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法。
６４．ステップ（ａ）が、項目４８に記載のポリヌクレオチドの集団を準備し、上記ポリヌクレオチドの集団を発現させて上記ポリペプチドの集団を得る準備ステップを含む、項目６３に記載の方法。
６５．上記ポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している、項目６４に記載の方法。
６６．上記遺伝子型－表現型カップリング手段が項目５０～６２のいずれか１項目に定義されたとおりである、項目６５に記載の方法。
６７．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・項目６３に記載の方法を用いて、ポリペプチドの集団から、上記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法。
６８．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・項目６７に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、上記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法。
６９．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）項目４１～４７のいずれか１項目に記載のポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法。
７０．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
・項目６８に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するか、
または項目６９および７０のいずれか１項目に記載の方法を用いて所望のポリペプチドを選択および特定するステップと；
・上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。
７２．上記産生が、所望のポリペプチドのデノボ化学合成を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７３．上記産生が、所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの組換え発現を用いて実施される、項目７１に記載の方法。
７４．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ１）項目６８に記載の方法を用いて、上記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；または
（ａ２）項目６９および７０のいずれか１項目に記載の第９の態様による選択および特定方法を用いて、特定されたポリペプチドを逆翻訳するステップと；
（ｂ）こうして単離されたポリヌクレオチドを発現させて上記所望のポリペプチドを産生するステップと
を含む方法。
Claims (16)
- ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29Ｘ30 ＰＸ32ＱＳＸ35Ｘ36ＬＬＸ39Ｅ ＡＫＫＬＸ45Ｘ46Ｘ47Ｑ
（配列中、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ 6 、Ｘ7、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ25およびＸ28のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ29Ｘ30ＰＸ32は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ35は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ36は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ39は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ45Ｘ46は、ＳＥ、ＥＳまたはＳＤであり；
Ｘ47は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ45Ｘ46はＳＥ、ＥＳまたはＳＤである、
から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、
当該選択されたアミノ酸配列とＸ 45 Ｘ 46 がＮＤである点でのみ相異するアミノ酸配列を含むポリペプチドよりも安定であるポリペプチドであって、
但し、ヒト補体成分５に結合することができ、かつＸ10がＤでＸ20がＷであるポリペプチドは除外される、ポリペプチド。 - Ｘ45Ｘ46がＳＥまたはＳＤである、請求項１に記載のポリペプチド。
- Ｘ45Ｘ46がＥＳである、請求項１に記載のポリペプチド。
- Ｘ45Ｘ46がＳＥである、請求項２に記載のポリペプチド。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、
ＹＡＫ ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦ
ＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29Ｘ30 ＰＸ32ＱＳＸ35Ｘ36ＬＬＸ39Ｅ ＡＫＫＬＸ45Ｘ46Ｘ47Ｑ ＡＰ；および
ＦＮＫ ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦ
ＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29Ｘ30 ＰＸ32ＱＳＸ35Ｘ36ＬＬＸ39Ｅ ＡＫＫＬＸ45Ｘ46Ｘ47Ｑ ＡＰ
（配列中、各Ｘｙは、請求項１～４のいずれか１項に定義されたとおりである）
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
但し、ヒト補体成分５に結合することができ、かつＸ10がＤでＸ20がＷであるポリペプチドは除外される、ポリペプチド。 - 請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを一部分として含む融合ポリペプチド。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
- 共通の骨格に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団中のそれぞれのポリペプチドが、
ｉ）ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＸ10 Ｘ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20 Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29Ｘ30 ＰＸ32ＱＳＸ35Ｘ36ＬＬＸ39Ｅ ＡＫＫＬＸ45Ｘ46Ｘ47Ｑ
（配列中、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ 6 、Ｘ7、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ25およびＸ28のそれぞれは、独立して任意のアミノ酸残基に相当し；そして
配列中、互いに独立して、
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ29Ｘ30ＰＸ32は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ35は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ36は、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ39は、Ａ、ＣおよびＳから選択され；
Ｘ45Ｘ46は、ＳＥ、ＥＳまたはＳＤであり；
Ｘ47は、ＡおよびＳから選択される）および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、但し、Ｘ45Ｘ46はＳＥ、ＥＳまたはＳＤである、
から選択されるアミノ酸配列を含む集団。 - 少なくとも１×１０4個の独特なポリペプチド分子を含む、請求項８に記載の集団。
- ポリヌクレオチドの集団であって、そのそれぞれのメンバーが、請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする集団。
- 請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチド集団と、請求項１０に記載のポリヌクレオチド集団との組合せであって、ポリペプチドの前記集団のそれぞれのメンバーが、遺伝子型－表現型カップリング手段を介してそのメンバーをコードしているポリヌクレオチドと物理的にまたは空間的に関連している組合せ。
- 前記遺伝子型－表現型カップリング手段がファージディスプレイシステムを含む、請求項１１に記載の組合せ。
- ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択
する方法であって、
（ａ）請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団を準備するステップと；
（ｂ）標的と、該標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用が可能となる条件下でポリペプチドの集団を該所定の標的と接触させるステップと；
（ｃ）前記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択するステップと
を含む方法。 - 所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、
・請求項１３に記載の方法を用いて、ポリペプチドの集団から、前記所望のポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチドを選択するステップと；
・こうして分離された所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと
を含む方法。 - 所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを特定する方法であって、
・請求項１４に記載の方法を用いて、前記所望のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離するステップと；
・ポリヌクレオチドを配列決定して、前記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推論することによって確定するステップと
を含む方法。 - ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択および特定する方法であって、
（ａ）請求項８～９のいずれか１項に記載のポリペプチドの集団のそれぞれのメンバーを個々の担体またはビーズ上で合成するステップと；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて担体またはビーズを選択または富化するステップと；
（ｃ）タンパク質特性評価方法論によってポリペプチドを特定するステップと
を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13182022.7 | 2013-08-28 | ||
| EP13182022 | 2013-08-28 | ||
| PCT/EP2014/068259 WO2015028550A1 (en) | 2013-08-28 | 2014-08-28 | C5 binding polypeptides |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020113704A Division JP2020180133A (ja) | 2013-08-28 | 2020-07-01 | 変異した骨格を有する結合ポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016535061A JP2016535061A (ja) | 2016-11-10 |
| JP7138411B2 true JP7138411B2 (ja) | 2022-09-16 |
Family
ID=49034001
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016537294A Active JP7138411B2 (ja) | 2013-08-28 | 2014-08-28 | 変異した骨格を有する結合ポリペプチド |
| JP2020113704A Pending JP2020180133A (ja) | 2013-08-28 | 2020-07-01 | 変異した骨格を有する結合ポリペプチド |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020113704A Pending JP2020180133A (ja) | 2013-08-28 | 2020-07-01 | 変異した骨格を有する結合ポリペプチド |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9982022B2 (ja) |
| EP (1) | EP3039033B1 (ja) |
| JP (2) | JP7138411B2 (ja) |
| KR (2) | KR102497083B1 (ja) |
| CN (3) | CN117964710A (ja) |
| AU (1) | AU2014314214C1 (ja) |
| CA (1) | CA2920005C (ja) |
| DK (1) | DK3039033T3 (ja) |
| ES (1) | ES2742505T3 (ja) |
| IL (1) | IL243849A0 (ja) |
| LT (1) | LT3039033T (ja) |
| MX (1) | MX367423B (ja) |
| MY (1) | MY176200A (ja) |
| PL (1) | PL3039033T3 (ja) |
| PT (1) | PT3039033T (ja) |
| RU (1) | RU2714156C2 (ja) |
| TR (1) | TR201911279T4 (ja) |
| WO (1) | WO2015028550A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA201600721B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2715638T3 (es) | 2012-02-20 | 2019-06-05 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Polipéptidos que se unen al complemento humano C5 |
| MX366425B (es) | 2013-03-15 | 2019-07-04 | Affibody Ab | Nuevos polipeptidos. |
| US9994626B2 (en) | 2013-08-28 | 2018-06-12 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Stable polypeptides binding to human complement C5 |
| BR112017004189A2 (pt) * | 2014-09-17 | 2017-12-12 | Affibody Ab | dímero de ligação ao fcrn, proteína de fusão ou conjugado, e, composição |
| BR112019028269A2 (pt) | 2017-07-11 | 2020-07-14 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | polipeptídeos que se ligam ao componente c5 do complemento ou à albumina sérica e suas proteínas de fusão |
| JP2022521353A (ja) | 2019-03-22 | 2022-04-06 | リフレクション ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｖｅｇｆのためのｄ－ペプチド性化合物 |
| WO2020198075A2 (en) | 2019-03-22 | 2020-10-01 | Reflexion Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent d-peptidic compounds for target proteins |
| WO2021089695A1 (en) * | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Affibody Ab | Polypeptides |
| JP2024506070A (ja) | 2021-02-15 | 2024-02-08 | アフィボディ アクティエボラーグ | 新規ｈｅｒ２結合ポリペプチド |
| MX2024005285A (es) * | 2021-11-01 | 2024-09-18 | Ipc Res Llc | Administracion de proteinas de union a c5. |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011509073A (ja) | 2007-12-21 | 2011-03-24 | アフィボディ・アーベー | 所定のスカフォールドを有するポリペプチドライブラリー |
| WO2012074463A1 (en) | 2010-11-29 | 2012-06-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Affinity chromatography matrix |
| US20120238039A1 (en) | 2011-03-18 | 2012-09-20 | Postech Academy-Industry Foundation | Novel immobilizing fusion protein for effective and oriented immobilization of antibody on surfaces |
| JP2016529270A (ja) | 2013-08-28 | 2016-09-23 | スウェディッシュ・オーファン・バイオヴィトラム・アーベー（ペーウーベーエル） | ヒト補体ｃ５に結合する安定なポリペプチド |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
| CA2096953A1 (en) * | 1990-11-26 | 1992-05-27 | Anthony Atkinson | Immunoglobulin-binding proteins and recombinant dna molecules coding therefor |
| US6074642A (en) | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
| SE9901379D0 (sv) * | 1999-04-19 | 1999-04-19 | Pharmacia & Upjohn Ab | Receptor structures |
| PT1325033E (pt) | 2000-10-10 | 2010-04-15 | Genentech Inc | Inibição da activação do complemento c5 para o tratamento e a prevenção da rejeição diferida de um xenoenxertos ou de uma rejeição vascular aguda |
| AT410798B (de) | 2001-01-26 | 2003-07-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen |
| CA2457461C (en) | 2001-08-17 | 2013-12-24 | Tanox, Inc. | Complement pathway inhibitors binding to c5 and c5a without preventing the formation of c5b |
| ITMI20021527A1 (it) | 2002-07-11 | 2004-01-12 | Consiglio Nazionale Ricerche | Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso |
| CA2579635A1 (en) | 2003-09-10 | 2005-03-17 | Baxter International Inc. | Peptides that inhibit complement activation |
| SE0400274D0 (sv) * | 2004-02-09 | 2004-02-09 | Affibody Ab | New polypeptide |
| GB0518443D0 (en) | 2005-09-09 | 2005-10-19 | Evolutec Ltd | Method of treating myasthenia gravis |
| EP2001490A1 (en) | 2006-03-15 | 2008-12-17 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement |
| DK2190863T3 (en) | 2007-07-31 | 2015-11-30 | Affibody Ab | New albumin binding compositions, methods and uses |
| US9187535B2 (en) | 2007-12-19 | 2015-11-17 | Affibody Ab | Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF |
| ES2373832T3 (es) | 2007-12-19 | 2012-02-09 | Affibody Ab | Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf. |
| EP2072525A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Affibody AB | New polypeptides having affinity for HER2 |
| NZ600622A (en) | 2008-08-05 | 2013-12-20 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c5 |
| JP5960598B2 (ja) | 2009-11-04 | 2016-08-02 | アフィボディ・アーベー | Ｈｅｒ３結合ポリペプチド |
| EP2327725A1 (en) | 2009-11-26 | 2011-06-01 | InflaRx GmbH | Anti-C5a binding moieties with high blocking activity |
| NO2933262T3 (ja) | 2010-07-09 | 2018-09-29 | ||
| CN102127554B (zh) | 2010-12-22 | 2012-07-25 | 南京农业大学 | 一种日本脑炎颗粒疫苗及其制备方法和应用 |
| ES2715638T3 (es) | 2012-02-20 | 2019-06-05 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Polipéptidos que se unen al complemento humano C5 |
| JP5980104B2 (ja) | 2012-11-22 | 2016-08-31 | 三菱電機株式会社 | 液晶表示装置の製造方法および液晶表示装置の製造システム |
| US9957330B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-05-01 | Affibody Ab | Polypeptides |
-
2014
- 2014-08-28 RU RU2016108976A patent/RU2714156C2/ru not_active Application Discontinuation
- 2014-08-28 TR TR2019/11279T patent/TR201911279T4/tr unknown
- 2014-08-28 CN CN202410280105.0A patent/CN117964710A/zh active Pending
- 2014-08-28 CN CN201480046781.6A patent/CN105473606A/zh active Pending
- 2014-08-28 CA CA2920005A patent/CA2920005C/en active Active
- 2014-08-28 DK DK14755841.5T patent/DK3039033T3/da active
- 2014-08-28 US US14/911,319 patent/US9982022B2/en not_active Ceased
- 2014-08-28 LT LT14755841T patent/LT3039033T/lt unknown
- 2014-08-28 EP EP14755841.5A patent/EP3039033B1/en active Active
- 2014-08-28 PL PL14755841T patent/PL3039033T3/pl unknown
- 2014-08-28 JP JP2016537294A patent/JP7138411B2/ja active Active
- 2014-08-28 KR KR1020227003426A patent/KR102497083B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-28 WO PCT/EP2014/068259 patent/WO2015028550A1/en active Application Filing
- 2014-08-28 MY MYPI2016700292A patent/MY176200A/en unknown
- 2014-08-28 CN CN202310964771.1A patent/CN116987154A/zh active Pending
- 2014-08-28 KR KR1020167007561A patent/KR20160068744A/ko not_active IP Right Cessation
- 2014-08-28 ES ES14755841T patent/ES2742505T3/es active Active
- 2014-08-28 MX MX2016002208A patent/MX367423B/es active IP Right Grant
- 2014-08-28 AU AU2014314214A patent/AU2014314214C1/en active Active
- 2014-08-28 PT PT14755841T patent/PT3039033T/pt unknown
- 2014-08-28 US US16/840,882 patent/USRE49495E1/en active Active
-
2016
- 2016-01-28 IL IL243849A patent/IL243849A0/en active IP Right Grant
- 2016-02-02 ZA ZA2016/00721A patent/ZA201600721B/en unknown
-
2020
- 2020-07-01 JP JP2020113704A patent/JP2020180133A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011509073A (ja) | 2007-12-21 | 2011-03-24 | アフィボディ・アーベー | 所定のスカフォールドを有するポリペプチドライブラリー |
| WO2012074463A1 (en) | 2010-11-29 | 2012-06-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Affinity chromatography matrix |
| US20120238039A1 (en) | 2011-03-18 | 2012-09-20 | Postech Academy-Industry Foundation | Novel immobilizing fusion protein for effective and oriented immobilization of antibody on surfaces |
| JP2016529270A (ja) | 2013-08-28 | 2016-09-23 | スウェディッシュ・オーファン・バイオヴィトラム・アーベー（ペーウーベーエル） | ヒト補体ｃ５に結合する安定なポリペプチド |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7138411B2 (ja) | 変異した骨格を有する結合ポリペプチド | |
| JP6475630B2 (ja) | ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法 | |
| AU2016293063B2 (en) | Novel immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification | |
| EP2231860B1 (en) | Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf | |
| KR20190038560A (ko) | 친화성 크로마토그래피를 위한 알칼리 안정 fc-결합 단백질 | |
| JP2023507268A (ja) | 酵素酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の結合タンパク質及びその使用 | |
| JP2022504487A (ja) | 免疫グロブリンＦｃドメインに対する結合親和性を持たない新規三重らせんポリペプチド及び同ポリペプチドの使用 | |
| JP2016529270A (ja) | ヒト補体ｃ５に結合する安定なポリペプチド | |
| Ren et al. | Characterization and comparison of two peptide-tag specific nanobodies for immunoaffinity chromatography | |
| US11008365B2 (en) | Polypeptide exhibiting affinity to antibodies forming non-native three-dimensional structure | |
| Aoki et al. | Engineering a low-immunogenic mirror-image VHH against vascular endothelial growth factor | |
| US20150274771A1 (en) | Method for the separation of proteins containing an albumin-binding | |
| WO2005000883A1 (en) | Polypeptides having binding affinity for insulin | |
| JP2017014112A (ja) | 抗サバイビン抗体又は抗体誘導体及びそれらの利用 | |
| NZ716426B2 (en) | Binding polypeptides having a mutated scaffold | |
| BR112016003336B1 (pt) | Polipeptídeo; polipeptídeo de fusão; polinucleotídeo; população das variantes de polipeptídeo com base em um scaffold comum; população de polinucleotídeos; combinação de uma população de polipeptídeo; e métodos para selecionar um polipeptídeo desejado tendo uma afinidade com um alvo predeterminado a partir de uma população de polipeptídeos; isolar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo desejado tendo uma afinidade com um alvo predeterminado; identificar um polipeptídeo desejado tendo uma afinidade com um alvo predeterminado; e selecionar e identificar um polipeptídeo desejado tendo uma afinidade com um alvo predeterminado a partir de uma população de polipeptídeos | |
| WO2021176075A1 (en) | Novel immunoglobulin binding polypeptides | |
| Koide et al. | c12) United States Patent | |
| JPWO2015190439A1 (ja) | 抗体に結合する低分子化合物のスクリーニング方法 | |
| JP2009213485A (ja) | 巨大分子用アフィニティ・リガンドの設計 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170803 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180620 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180703 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180928 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181003 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20190319 |
|
| A256 | Written notification of co-pending application filed on the same date by different applicants |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A2516 Effective date: 20190319 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190913 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200303 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200701 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200701 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200708 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200714 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20200911 |
|
| C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20200915 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20210420 |
|
| C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20211124 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220111 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220126 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220405 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220510 |
|
| C302 | Record of communication |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C302 Effective date: 20220517 |
|
| C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20220607 |
|
| C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20220712 |
|
| C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20220712 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220809 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220906 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7138411 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |