JP7029822B2 - 抗原特異的ｔ細胞及びその使用 - Google Patents

Description

本出願は、２０１７年３月１９日に出願された米国出願第６２／４７８，２８０号の優先権を主張し、内容が参照により全て本明細書に組み込まれる。

本開示は、がんの治療に関する。具体的には、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞及びがんの成長及び転移を抑制するためのその使用に関する。

Ｔ細胞は、希少な細胞集団であり、末梢血において、５－１０％のＣＤ４^＋Ｔ細胞のみが見られる。Ｔ細胞の増殖は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、及びＩＬ－５）の刺激及び抗ＣＤ２８抗体により促進され得る。しかし、増殖のレベルは、臨床応用、例えば、活性化されたＴ細胞の数を増加させてヒトに戻す応用（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法）には十分ではない。

Ｔ細胞を活性化する又はＴ細胞の分化を誘導する１つの方法は、抗ＣＤ３抗体を使用してＣＤ３によって媒介されるシグナル伝達経路を活性化することである。今まで、ＣＤ３抗原複合体を介したヒトＴ細胞の活性化は、マウス抗ヒトＩｇＧ２ａ抗ヒト（ＯＫＴ３）モノクローナル抗体を使用して行われた。このようなＴ細胞の活性化は、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）と同等のマイトジェン応答を誘導することにより引き起こされる。しかし、非ヒト由来モノクローナル抗体（例えば、マウスＯＫＴ３ Ａｂ）の主な懸念の１つは、レシピエントに対する免疫原性であり、場合によっては危険なアレルギー反応を引き起こす恐れがある。マウスＯＫＴ３ Ａｂによって活性化されたヒトＴ細胞は、表面にマウスタンパク質断片が必然的に存在し、これにより、レシピエントに潜在的な脅威を与える。

上記の状況に鑑みて、当分野において、マウスＯＫＴ３抗体を代替可能な免疫原性の低い抗体、及びマウスＯＫＴ３抗体を使用せずにヒトＴ細胞を活性化する改良した方法が必要である。

本開示は、本開示のＢｓＡｂによって分化、増殖したＴ細胞、及びがんの治療におけるその使用を提供する。

したがって、本開示の第１の態様は、Ｔ細胞の分化及び／又は増殖を誘導する方法を提供する。各Ｔ細胞は、その表面に抗腫瘍抗原部分及び抗ＣＤ３部分を有する。この方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）とを培地中で培養することで、ＰＢＭＣをＴ細胞に分化させることを含む。各ＢｓＡｂは、Ｔ細胞の抗腫瘍抗原部分に対応する腫瘍抗原結合部位及びＴ細胞の抗ＣＤ３部分に対応するＣＤ３結合部位を含み、かつＢｓＡｂは、マウスＯＫＴ３抗体ではない。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ'）_２又はＩｇＧの構造を有する。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂの腫瘍抗原結合部位は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のいずれかに結合する。

本開示の任意の実施形態によれば、上記培地は、ＩＬ２、ＴＧＦ－β及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインをさらに含み得る。好ましい実施形態において、上記培地は、ＩＬ２及びＴＧＦ－βの両方を含み、このように形成したＴ細胞は、制御性Ｔ細胞である。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂにおいて、腫瘍抗原結合部位は、配列番号６９、７７、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４又は１２０のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する腫瘍抗原ｓｃＦｖを含み、ＣＤ３結合部位は、配列番号６７と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメイン及び配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１ドメインを含む。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂにおいて、腫瘍抗原結合部位は、配列番号７０、７８、８５、９１、９７、１０９又は１２１のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する抗腫瘍抗原ｓｃＦｖを含み、ＣＤ３結合部位は、配列番号６６又は７９と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂにおいて、腫瘍抗原結合部位は、配列番号６４、７５、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２又は１１８と少なくとも９０％の同一性を有する抗腫瘍抗原ＶＬ－Ｃｋドメイン、及び配列番号６５、７６、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３又は１１９と少なくとも９０％の同一性を有する抗腫瘍抗原ＶＨ－ＣＨ１ドメインを含み、ＣＤ３結合部位は、配列番号６６又は７９と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。

本開示の実施形態によれば、各ＢｓＡｂにおいて、腫瘍抗原結合部位は、配列番号７３、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６又は１２２と少なくとも９０％の同一性を有する抗腫瘍抗原ＶＬ－Ｃｋドメイン、及び配列番号７４、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７又は１２３と少なくとも９０％の同一性を有する抗腫瘍抗原ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃドメインを含み、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメイン、及び配列番号７２と少なくとも９０％の同一性を有する抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃドメインを含む。

実際には、本発明の方法により調製された抗原特異的Ｔ細胞を上述したヒト化ＢｓＡｂと混合した混合物をがんの治療を必要とする被験体に投与することができる。

したがって、本開示の第３の態様は、がんを治療するための医薬品キットを提供する。上記医薬品キットは、本発明の方法に従って分化、増殖されたＴ細胞、及び本開示のヒト化ＢｓＡｂを含む。

本開示の第４の態様は、がんに罹患している被験体を治療する方法を提供する。この方法は、有効量の上記方法により調製されたＴ細胞又は有効量の本発明のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を被験体に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態によれば、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、培地中で本発明のＢｓＡｂと共に培養されることにより、その表面に本開示のＢｓＡｂを備えるように修飾される。さらに、必要に応じて、上記培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－７及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインをさらに含み得る。

好ましくは、本開示のＴ細胞は、１ｘ１０^４から１ｘ１０^７細胞/Ｋｇ（被験体の体重）の量で被験体に投与される。投与量は、単回用量又は複数回のより少ない用量で投与することができる。

がん、好ましくはＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ又はＰＤ－Ｌ１の発現が陽性であるがんは、本発明の方法によって治療可能である。本発明の方法によって治療可能ながんの例は、膀胱がん、胆道がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸癌、大腸癌、食道がん、上皮がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経膠腫、リンパ系の造血器腫瘍、肝がん、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、肺がん、リンパ腫、腸がん、黒色腫、骨髄性白血病、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、卵巣がん、腎細胞がん、脾臓がん、扁平上皮がん、甲状腺がん及び甲状腺濾胞がんを含むがこれらに限定されない。

本開示の特定の実施形態によれば、上記がんは、トリプルネガティブ乳がんである。本開示の別の特定の実施形態によれば、上記がんは、悪性膵臓がんである。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の付随する説明に記載される。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

本発明の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面を参照してよりよく理解されるであろう。

本開示のＢｓＡｂの構造の概略図である。図１（Ａ）は、抗抗原Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖである。図１（Ｂ）は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗抗原ｓｃＦｖである。図１（Ｃ）は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ／抗抗原ｓｃＦｖである。図１（Ｄ）は、抗抗原ノブ（ｋｎｏｂ）／抗ＣＤ３ホール（ｈｏｌｅ）である。 本開示のＢｓＡｂを用いてワンステップ増殖、分化及び／又は修飾により調製された抗原特異的Ｔ細胞を使用して被験体を治療する概略図である。 本開示のＢｓＡｂを用いてワンステップ修飾により調製されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を使用して被験体を治療する概略図である。 本開示のＢｓＡｂを発現するためのＤＮＡ構築物の概略図である。 実施例１．２のＢｓＡｂの非還元条件（左側）及び還元条件（右側）でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。 実施例１．２のＢｓＡｂのフローサイトメトリー分析を示す。 本開示の実施例２のマウスＯＫＴ３抗体及びＢｓＡｂにより誘導されたＴ細胞の分化及び増殖を示す。 本開示の一実施形態に係る増殖したT細胞の表面上の抗抗原断片のフローサイトメトリー分析である。 本開示の一実施形態に係る、前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰに対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、腫瘍細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞の結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、種々のエフェクター細胞：標的化細胞（Ｅ／Ｔ比）でそれぞれマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを示す棒グラフである。 本開示の一実施形態に係る、種々のＥ／Ｔ比でのＬＮＣａＰ細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾された実施例２のＴ細胞の細胞毒性分析を示す線グラフである。 本開示の一実施形態に係る、種々のＥ／Ｔ比でのそれぞれマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾された実施例２のＴ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを示す棒グラフである。 本開示の一実施形態に係る、悪性膵臓細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、実施例２のＴ細胞又は抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ ＢｓＡｂでさらに修飾された実施例２のＴ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、Ｔ細胞表面に残った実施例１．２のＢｓＡｂの残存量の時間経過を示す。 本開示の一実施形態に係る、前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰに対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、それぞれマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１のＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを示す棒グラフである。 本開示の一実施形態に係る、前立腺腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ細胞）に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、ＨＴ２９細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、それぞれマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを示す棒グラフである。 本開示の一実施形態に係る、ＨＴ２９細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、ＬＮＣａＰ細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、それぞれマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞から分泌されたサイトカインのレベルを示す棒グラフである。 本開示の一実施形態に係る、ＬＮＣａＰ細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、悪性膵臓細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ ＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の細胞毒性分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のそれぞれの結合を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、修飾ＯＫＴ３ Ｔ細胞又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された動物の定量化された蛍光強度を示す。 本開示の一実施形態に係る、試験動物の異なる器官における修飾ＯＫＴ３ Ｔ細胞又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の分布様式を示す。 本開示の一実施形態に係る、実施例１．２のＢｓＡｂ、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された腫瘍のサイズ変化を示す線グラフである。 本開示の一実施形態に係る、実施例１．２のＢｓＡｂ、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された試験動物の体重変化を示す線グラフである。 本開示の一実施形態に係る、実施例１．２のＢｓＡｂ、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された腫瘍の重量を示す。 本開示の一実施形態に係る、実施例１．２のＢｓＡｂ、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、又は実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された腫瘍の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色及びＨ＆Ｅ染色の写真である。 本開示の一実施形態に係る、マウスＯＫＴ３、及び抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ又は抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖによって分化したＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、それぞれマウスＯＫＴ３、及び抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ又は抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖによって分化したＴ細胞の増殖を示す。 本開示の一実施形態に係る、ＯＫＴ３ Ｔ細胞、又は抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ若しくは抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有するＴ細胞に備える２種類の抗体断片のフローサイトメトリー分析を示す。 本開示の一実施形態に係る、ＬＮＣａＰ細胞に対するマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞のそれぞれの細胞毒性を示す。 本開示の一実施形態に係る、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂ及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖによるＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋制御性Ｔ細胞の誘導を示す。

添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例を構築又は利用できる唯一の形態を表すことを意図していない。この明細書では、実施例の機能と、実施例を構築及び操作するための一連の手順について説明する。ただし、同じ又は同等の機能及び手順は、異なる例で実現できる。

Ｉ．定義
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（望ましい生物学的活性を示し、即ち、タンパク質及び／又は他の分子の複雑な混合物中の標的抗原を優先的に認識してこの抗原に特異的に結合する限り）を含む。

本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、特定の方法による抗体の調製を必要とするものとして構築されるべきではない。ポリクローナル抗体は、典型的に異なるエピトープに向けられる異なる抗体を含むのに対して、各モノクローナル抗体は、それぞれ抗原上の単一の決定基（即ち、エピトープ）に向けられる。本開示のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法又は組換えＤＮＡ法によって調製され得る。本明細書のモノクローナル抗体には、具体的に「キメラ」抗体又は「組換え」抗体が含まれる。重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体、又は抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は同種であり、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分は、他の種に由来する抗体、他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、又はこれらの抗体の断片（望ましい生物学的活性を示す限り）における対応する配列と同一又は同種である。

「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、超可変領域残基が、所望の特異性、親和性を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種由来の超可変領域残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。一般には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインを実質的にすべて含み、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を任意に含んでもよい。

用語「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗体を指す。好ましい実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、２つの抗原結合部位を有し、１つが腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡなど）に向けられ、もう１つがＴ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）に向けられる。

用語「リンカー」及び「ペプチドリンカー」は、本開示において互換的に使用され、２つのポリペプチドを接続するための天然又は合成アミノ酸残基を有するペプチドを指す。例えば、ペプチドリンカーは、ＶＨとＶＬを結合して一本鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）を形成するか、又はｓｃＦｖを完全長抗体に接続して本開示のＢｓＡｂを形成するために用いられ得る。好ましくは、上記リンカーは、長さが少なくとも５アミノ酸残基（例えば、５～１００アミノ酸残基、好ましくは、１０～３０アミノ酸残基）のペプチドである。ｓｃＦｖにおけるリンカーは、長さが少なくとも５アミノ酸残基、好ましくは１５～２０アミノ酸残基のペプチドである。好ましくは、上記リンカーは、（Ｇ_ｎＳ）_ｍの配列を含み、ここで、Ｇがグリシンであり、Ｓがセリンであり、ｎ及びｍがそれぞれ独立して１～４である。一実施例において、上記リンカーは、（Ｇ_２Ｓ）_４の配列を含む。他の実施例において、上記リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_３の配列を含む。

用語「がん」及び「腫瘍」は、本開示において互換的に使用され、好ましくは、典型的には、細胞増殖が制御されないことを特徴とする哺乳動物、特にヒトの生理学的状態を指す。この点で、がんには、転移がん及び／又は薬剤耐性がんが含まれる。がんは、好ましくは、αｖβ３、α５β１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＩＡＸ、ｃＭｕｃ１、ＥＤ－Ｂ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、エリスロポエチン産生肝細胞Ａ３（ＥＰＨＡ３）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ｇｐＡ３３、Ｇｌｏｂｏ－Ｈ、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、ＯＣ１８３Ｂ２、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｌｅ^ｙ、ＭＥＴ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、テネイシン、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ＶＥＧＦＲ－２，及び／又はＶＥＧＦＲ－３の発現レベルの増加を示すがんである。したがって、本開示によって治療可能ながん又は腫瘍は、乳房がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、脾臓がん、腎臓がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、脳がん、膵臓がん、皮膚がん、骨がん、血液がん、胸腺がん、子宮がん、精巣がん、子宮頸部及びニューロンである。より具体的には、上記がんは、膀胱がん、胆道がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸癌、大腸癌、食道がん、上皮がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経膠腫、リンパ系の造血器腫瘍、肝がん、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、肺がん、リンパ腫、腸がん、黒色腫、骨髄性白血病、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、卵巣がん、腎細胞がん、脾臓がん、扁平上皮がん、甲状腺がん又は甲状腺濾胞がんからなる群より選択される。一実施例において、上記がんは、悪性膵臓がんである。他の実施例において、上記がんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。

本明細書において、用語「有効量」とは、がんの治療に関して所望の治療結果を達成するために、必要な投与量で、かつ必要な期間に有効な量を指す。

用語「投与される」、「投与する」又は「投与」は、本明細書において互換的に使用され、本開示のＢｓＡｂ、本開示のＢｓＡｂにより分化及び増殖したＴ細胞、又はそれらの組み合わせのいずれかを直接投与することを意味する。

用語「被験体」又は「患者」とは、本開示の組成物及び／又は方法で治療可能なヒト種を含む動物を指す。用語「被験体」又は「患者」は、性別が特に示されていない限り、男性と女性の両方の性別を指すことを意図している。また、用語「被験体」又は「患者」は、がんの治療から利益を得る可能性のある哺乳動物を含む。用語「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、上記患者は、ヒトである。

本明細書では、用語「同一」又は「パーセント同一性」とは、最も一致するように比較及び整列された場合、２以上の配列又はサブ配列が同じであるか、又は特定の割合のアミノ酸残基が同じであることを意味する。パーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２アミノ酸配列との最適な整列のために、第１アミノ酸配列の配列に隙間を導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。第１配列の位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重なり位置）×１００）。特定の実施形態において、２つの配列は、長さが同じである。

本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むように使用される。

ＩＩ．発明の説明
本開示の第１の態様は、抗原特異的Ｔ細胞、特に、本開示の組替え二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）によって活性化（又は誘導分化）されたＴ細胞を提供する。これらのＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から変換された表面に特異的抗腫瘍抗原及び抗ＣＤ３断片を保持するＴ細胞である。これによって、このような抗原特異的Ｔ細胞は、腫瘍細胞（悪性腫瘍細胞及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞を含む）により強く結合することで、腫瘍細胞の成長及び転移を抑制することができる。

１．本開示のＢｓＡｂ
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＤを含むタンパク質の免疫グロブリンクラスに属する。血清中に見られる最も豊富な免疫グロブリンはＩｇＧである。ＩｇＧは、４本の鎖（２本の軽鎖及び２本の重鎖）を有し、各軽鎖は２つのドメインを有し、各重鎖は４つのドメインを有する。抗原結合部位は、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、並びに定常軽鎖（ＣＬ）及び定常重鎖（ＣＨ１）ドメインを含む断片抗原結合（Ｆａｂ）領域に位置する。重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン領域は、結晶化可能断片（Ｆｃ）領域と呼ばれる。従って、完全長抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向でＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域（ＨＲ）、ＣＨ２及びＣＨ３から構成されるポリペプチド（ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略される）である。完全長抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向でＶＬ及びＣＬから構成されるポリペプチド（ＶＬ－ＣＬと略される）である。ここで、ＣＬは、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。ＩｇＧは、２本の重鎖を有するヘテロ四量体であると考えられている。上記２本の重鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間、及び２本の重鎖のヒンジ領域の間にあるジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）を介して結合される。

上記「定義」に記載のように、ＢｓＡｂは、異なる抗原に対して特異性を有するＡｂを指す。したがって、本開示のＢｓＡｂは、２つの異なる抗原（腫瘍抗原及びＣＤ３抗原）と結合可能な配列を含むように設計された組換えＡｂである。したがって、本開示の各ＢｓＡｂは、抗腫瘍抗原配列及び抗ＣＤ３配列を含む。本開示において、異なる組換えＢｓＡｂは、開発され、ＢｓＡｂの抗原に対応する表面部分に持つ抗原特異的Ｔ細胞への単核細胞の分化及び／又は増殖を誘導するために使用される。

図１は、本開示で適用されるＢｓＡｂｓの概略構造を示す。

いくつかの実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、単量体の二価二重特異性抗体である。このＢｓＡｂにおいて、腫瘍抗原（即ち、抗腫瘍抗原Ｆａｂ）に対するＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び軽鎖ＶＬ－Ｃｋは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）（ＶＨ－ＶＬと略される）に融合される（図１Ａ）。他の実施形態において、上記単量体の二価ＢｓＡｂは、構造的には、ＣＤ３に対するＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び軽鎖ＶＬ－Ｃｋから構成される抗ＣＤ３ Ｆａｂを含む。上記抗ＣＤ３ Ｆａｂは、ペプチドリンカーを介して腫瘍抗原に対するｓｃＦｖに融合される（図１Ｂ）。他の実施形態において、本開示の単量体の二価ＢｓＡｂは、抗腫瘍抗原ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖから構成され、２つの上記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して結合される（図１Ｃ）。別の実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）」の構造を有し、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおけるノブは、いくつかのアミノ酸側鎖を代替的なアミノ酸側鎖で置換することにより形成され、第２重鎖のＣＨ３ドメインにある対応位置におけるホールは、適切なアミノ酸側鎖を代替的なアミノ酸側鎖で置換することにより形成される。「ノブ・イントゥ・ホール」ＢｓＡｂ構造の模式図を図１Ｄに示す。ノブ・イン・ホール技術は、当業者に周知であり、本開示のＢｓＡｂの形成に容易に適用することができる。

本発明のＢｓＡｂをコードするＤＮＡは、既知の抗体に由来し、それらの遺伝子をクローン化し、融合することにより、所望のヒト化ＢｓＡｂのＤＮＡ構築物を形成する。詳細な調製方法は実施例に記載される。

このようにして、Ｔ細胞のＣＤ３及び腫瘍抗原と結合するための結合部位を有する組換えＢｓＡｂは形成される。上記腫瘍抗原は、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＥＡ、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２及びＶＣＡＭ－１からなる群より選択される。

いくつかの実施形態によれば、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号６５のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６４のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＰＳＭＡ結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号６９の抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含むＰＳＭＡ結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号７０の抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを含むＰＳＭＡ結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有し、そのＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＰＳＭＡ結合部位は、配列番号７３のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号７４のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号７５のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号７６のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＥＧＦＲ結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号７７の抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含むＥＧＦＲ結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位とを含む。別の実施例において、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号７８の抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含むＥＧＦＲ結合部位、並びに配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有し、そのＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＥＧＦＲ結合部位は、配列番号８０のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号８１のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号８３のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号８２のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＰＤ－Ｌ１結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号８４の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含むＰＤ－Ｌ１結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号８５の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含むＰＤ－Ｌ１結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＰＤ－Ｌ１結合部位は、配列番号８６のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号８７のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号８９のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号８８のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＨＥＲ２結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号９０の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含むＨＥＲ２結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号９１の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含むＨＥＲ２結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＨＥＲ２結合部位は、配列番号９２のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号９３のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号９５のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号９４のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＦＡＰ結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号９６の抗ＦＡＰ ｓｃＦｖを含むＦＡＰ結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号９７の抗ＦＡＰ ｓｃＦｖを含むＦＡＰ結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＦＡＰ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＦＡＰ結合部位は、配列番号９８のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号９９のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０１のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号１００のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０２の抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ ｓｃＦｖを含むＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０３の抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ ｓｃＦｖを含むＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１結合部位は、配列番号１０４のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号１０５のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０７のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号１０６のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０８の抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ ｓｃＦｖを含むＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１０９の抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ ｓｃＦｖを含むＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１結合部位は、配列番号１１０のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号１１１のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１１３のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号１１２のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＥＡ結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１１４の抗ＣＥＡ ｓｃＦｖを含むＣＥＡ結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１１５の抗ＣＥＡ ｓｃＦｖを含むＣＥＡ結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＣＥＡ結合部位は、配列番号１１６のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号１１７のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

いくつかの実施形態によれば、抗ＶＣＡＭ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは調製される。一実施例において、抗ＶＣＡＭ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１１９のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号１１８のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＶＣＡＭ１結合部位、並びに配列番号６６の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。他の実施例において、抗ＶＣＡＭ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１２０の抗ＶＣＡＭ１ ｓｃＦｖを含むＶＣＡＭ１結合部位、並びに配列番号６８のＶＨ－ＣＨ１ドメイン及び配列番号６７のＶＬ－Ｃｋドメインを含むＣＤ３結合部位を有する。別の実施例において、抗ＶＣＡＭ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、配列番号１２１の抗ＶＣＡＭ１ ｓｃＦｖを含むＶＣＡＭ１結合部位、及び配列番号７９の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＣＤ３結合部位を有する。さらなる実施例において、抗ＶＣＡＭ１／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂは、「ノブ・イントゥ・ホール」構造を有する。この構造において、ＣＤ３結合部位は、配列番号７１のＶＬ－Ｃｋノブドメイン及び配列番号７２のＶＨ－ＣＨ１ノブドメインを含み、ＶＣＡＭ１結合部位は、配列番号１２２のＶＬ－Ｃｋホールドメイン及び配列番号１２３のＶＨ１－ＣＨ１ホールドメインを含む。

本開示のさらなる実施形態によれば、ヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ＶＨ及びＣＬは調製される。これらの配列（表３９～４２）は、本開示に記載の関連する抗腫瘍抗原配列と融合して、所望のＢｓＡｂを形成することができる。

２．本発明のＢｓＡｂによる抗原特異的Ｔ細胞の活性化
本開示のＢｓＡｂは、本開示の抗原特異的Ｔ細胞への単核細胞（例えば、末梢血単核細胞）の分化及び増殖の誘導に用いられる。したがって、本開示の一態様は、表面に抗腫瘍抗原部分及び抗ＣＤ３部分を含む抗原特異的Ｔ細胞の調製に関する。

したがって、本開示は、Ｔ細胞の分化及び／又は増殖を誘導するための方法を含む。この方法は、被験体から採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を本開示の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）と共に培地に培養することにより、ＰＢＭＣをＴ細胞に分化させ、このように分化したＴ細胞を増殖させることを含む。各ＢｓＡｂは、各Ｔ細胞上の抗腫瘍抗原部分に対応する腫瘍抗原結合部位、及び各Ｔ細胞上の抗ＣＤ３部分に対応するＣＤ３結合部位を含み、且つＢｓＡｂは、マウスＯＫＴ３抗体ではない。

ＰＢＭＣは、当業者に知られている任意の方法（例えば、等密度遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ））を使用して、被験体の新鮮な血液から分離され得る。これは、血液中の異なる成分は、密度が異なるので、それに基づいて分離できるためである。

Ｔ細胞の分化及び増殖を達成するために、分離されたＰＢＭＣを本開示の任意のＢｓＡｂと共に正常培地中で十分な時間（例えば、少なくとも７日間、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３及び１４日間、好ましくは少なくとも１４日間）培養する。いくつかの実施形態において、７日間の培養後、ＣＤ３^＋ Ｔ細胞の数が増える。他の実施形態において、引き続き１４日間培養してＣＤ３^＋ Ｔ細胞の数は３倍増加する。さらに、必要に応じて、培地は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７及びそれらの組み合わせを含み得る。

本開示の実施形態によれば、調製されたＴ細胞は、それぞれの表面にＢｓＡｂの抗腫瘍抗原に対応する抗腫瘍抗原部分、及びＢｓＡｂの抗ＣＤ３に対応する抗ＣＤ３部分を含む。いくつかの実施例において、調製されたＴ細胞は、それぞれの表面に抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３部分を含む。他の実施例において、調製されたＴ細胞は、それぞれの表面に抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ３部分を含む。別の実施例において、調製されたＴ細胞は、それぞれの表面に抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＤ３部分を含む。

本開示のさらなる実施形態によれば、ＰＢＭＣを本開示のＢｓＡｂと共に少なくとも７日間培養することにより、末梢由来制御性Ｔ細胞が調製される。Ｔ細胞の表面に細胞マーカーＦｏｘＰ３が現れる。この場合には、培地は、サイトカイン、ＩＬ－２に加えて、抗ＣＤ ２８抗体をさらに含む。

本開示の実施形態によれば、本開示の抗原特異的Ｔ細胞（末梢由来制御性Ｔ細胞を含む）は、腫瘍細胞に対するより強い結合親和性を示すだけではなく、より高いレベルのサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリンを含むが、これらに限定されない）を産生する。したがって、これらのＴ細胞は、マウスＯＫＴ３ Ａｂによって活性化されたＴ細胞と比較して、腫瘍細胞（悪性がん細胞及びＴＮＢＣ細胞を含む）に対してより高いレベルの細胞毒性を示す。

３．がんの治療方法
３．１ 抗原特異的Ｔ細胞を用いるがんの治療
本開示の他の態様は、がんの治療方法を提供する。この方法では、セクション２で説明した抗原特異的Ｔ細胞を使用し、有効量のＴ細胞そのもの又はＢｓＡｂでさらに修飾されたＴ細胞をがんに罹患している被験体に投与することにより、がん細胞の成長を抑制又は阻害する。

図２Ａは、本発明の方法の概略図である。被験体の新鮮な血液からＰＢＭＣを分離した後、ワンステップ増殖及び分化により処理することにより、分化したＴ細胞に、それぞれＢｓＡｂの抗腫瘍抗原及び抗ＣＤ３に対応する部分を備えさせる。具体的には、ワンステップ増殖及び分化処理は、ＰＢＭＣを本開示のＢｓＡｂと共に培地中で、十分な数の所望のＴ細胞が産生されるまで、少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１４日間培養することを含む。さらに、必要に応じて、産生された抗原特異的Ｔ細胞をＢｓＡｂによってさらに修飾してもよい。この場合には、本発明の抗原特異的Ｔ細胞を本開示のＢｓＡｂと共にインキュベートする。このようなステップは、「ワンステップ増殖、分化及び修飾」と呼ばれ、図２Ａに示される。

いくつかの実施形態において、有効量の抗原特異的Ｔ細胞（即ち、ＢｓＡｂでさらに修飾されていない）を被験体に直接投与してがんを治療する。他の実施形態において、有効量のＢｓＡｂでさらに修飾された抗原特異的Ｔ細胞を被験体に投与してがんを治療する。

被験体に投与されるＴ細胞の量は、約１ｘ１０^４から１ｘ１０^７細胞／Ｋｇ（被験体の体重）である。特定の実施形態において、被験体に投与されるＴ細胞の量は、約１ｘ１０^５から１ｘ１０^６細胞／Ｋｇ（被験体の体重）である。投与量は、単回用量又は複数回のより少ない用量で投与することができる。

３．２ 本発明のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を用いるがんの治療
いくつかの実施形態において、セクション２で上述した抗原特異的Ｔ細胞の代わりに、本開示のＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞（即ち、マウスＯＫＴ３ ＡｂでＰＢＭＣを活性化させることで得られたＴ細胞）を使用してがんを治療する。図２Ｂは、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を本開示のＢｓＡｂで修飾してから被験体に投与する以外、図２Ａと同様である。図２Ａと同様に、修飾は、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を本開示のＢｓＡｂと共に培養することにより達成され、これによって、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞にＢｓＡｂの抗腫瘍抗原及び抗ＣＤ３を備えさせる。

本開示の実施形態によれば、少なくとも５００ｎｇ（例えば、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、及び３，０００ｎｇ）の本開示のＢｓＡｂは、所望の本開示のＢｓＡｂの抗腫瘍抗原がＴ細胞の表面に発現されるようにマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞（例えば、３ｘ１０^５個の細胞）を修飾するのに十分である。いくつかの実施例において、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を本開示の抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂでさらに修飾する。さらなる実施例において、本開示の抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して、レベルがより高いサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリンを含むが、これらに限定されない）を産生することができる。従って、これらの修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して腫瘍細胞（悪性がん細胞及びＴＮＢＣ細胞）に対してより高いレベルの細胞毒性を示す。

本開示のＢｓＡｂ、抗原特異的Ｔ細胞、及び修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、ＢｓＡｂ又はＴ細胞を所望の作用部位に効果的に送達可能な経路（例えば、経口、経鼻、経肺、経皮（例えば、受動的又はイオン導入送達）；又は非経口、例えば、直腸、デポ、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、小脳内、点眼液又は軟膏）により哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る。理解され得るように、選択されたがん治療薬、投与経路、並びに患者体内で所望の応答を誘発するＢｓＡｂ、Ｔ細胞及び／又はそれらの組み合わせの能力だけではなく、緩和しようとする疾患の病状又は重症度、年齢、性別、患者の体重、患者の状態、治療されている病的状態の重症度、患者に施される併用薬物治療及び特別食などの要因、並びに当業者に知られている他の要因のため、本開示の投与量は、患者ごとに異なり、担当医の裁量で決定される。投与計画は、治療反応を改善するために調整されてもよい。治療的有効量は、がん治療薬の毒性又は有害作用よりも治療上有益な効果を上回る量でもある。好ましくは、ＢｓＡｂ、Ｔ細胞又はそれらの組み合わせは、がん細胞の成長が抑制されるような投与量で一定の時間投与される。

本発明は、限定ではなく実証の目的で提供される以下の実施形態を参照して、より具体的に説明される。

実施例
材料及び方法

細胞及び動物
本開示において、ヒトＴリンパ球細胞株Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、ヒト前立腺腺がん細胞株ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ^＋／ＰＤ－Ｌ１^＋）、ヒト結腸腺がん細胞株ＨＴ－２９（ＥＧＦＲ^＋）、悪性膵臓細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＰＤ－Ｌ１^＋）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＥＧＦＲ^＋／ＰＤ－Ｌ１^＋）、及びＥｘｐｉ２９３細胞が使用された。

一般には、３７℃、５％ＣＯ_２でＨＴ－２９、ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンをサプリメントとして含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）中で増殖させた。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ及びＬＮＣａＰ細胞を同じサプリメントを含有するＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。３７℃、５％ＣＯ_２でＥｘｐｉ２９３細胞をＥｘｐｉ２９３^ＴＭ発現培地中で維持した。

ＳＣＩＤマウス（６－８週齢）は、国立実験動物センター（Ｔａｉｐｅｉ， Ｔａｉｗａｎ）から入手した。すべての動物実験は、規程に従って行われ、台北医科大学（Ｔａｉｐｅｉ， Ｔａｉｗａｎ）の実験動物施設及び病理コア委員会（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。

組換えＢｓＡｂの調製
本開示のＢｓＡｂの調製では、抗腫瘍抗原（例えば、抗ＰＳＭＡ、抗ＥＧＦＲ、抗ＰＤ－Ｌ１など）及び抗ＣＤ３をコードする核酸を、全遺伝子合成により他のＤＮＡ配列（例えば、シグナルペプチド、ＩＲＥＳ、リンカーなど）に移植して融合することで所望の構造物を得た。

次いで、調製されたＤＮＡ構築物を３７℃、８％ＣＯ_２で培養することによりＥｘｐｉ２９３細胞（７．５ｘ１０^７細胞/２５．５ｍＬ；トランスフェクションのために３０μｇの核酸を添加）中で増幅させた。６日後に培地を収集し、Ｎｉ－アフィニティークロマトグラフィーにより収集された培地からＢｓＡｂを精製した。Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して濃度を確定した。

ヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ及びＶＬの調製
相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植するためのヒトフレームワーク配列を選択するために、本発明者らは、ＩｇＢＬＡＳＴプログラムによりＯＫＴ３のＶＨ及びＶＬ配列と、国立生物工学情報センターのデータベースにおけるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリンの可変領域及び結合領域の配列とを比較した。ＩＧＨＶ１－４６＾０３／ＩＧＨＪ４は、ＯＫＴ３ ＶＨの可変／結合領域と最も相同性が高く、ＩＧＫＶ１－３９＾０１／ＩｇＫＪ４は、ＯＫＴ３ ＶＬの可変／結合領域と最も相同性が高いことが分かった。ヒト化ＯＫＴ３ ＶＨを構築するために、Ｋａｂａｔらの基準（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ： Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ； １９９１：１０３－５１１）に従ってＣＤＲを決定し、同様にＯＫＴ３ ＶＨの２つの残基（Ｔｈｒ７１及びＬｙｓ７３）をＩＧＨＶ１－４６＾０３／ＩＧＨＪ４に移植した。ヒト化ＯＫＴ３ ＶＬを構築するために、 Ｋａｂａｔらの基準に従ってＣＤＲを決定し、同様にＯＫＴ３ ＶＬの１つの残基（Ｔｙｒ７１）をＩＧＫＶ１－３９＾０１／ＩｇＫＪ４に移植した。全遺伝子合成によりヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ及びＶＬセグメントを構築した。

精製ＢｓＡｂの分析
ＢｓＡｂを還元又は非還元条件下で１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、クーマシーブルーで染色した。

Ｔ細胞の分化
ＣＤ８^＋ Ｔ細胞
健康被験体の血液から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はナイーブＣＤ８^＋ Ｔ細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｘ１０^６細胞/ｍＬの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁させた。次いで、懸濁細胞をＢｓＡｂ（１－１，０００ｎｇ／ｍＬ）及びヒト化ＩＬ－２（３，０００ＩＵ／ｍＬ）と共に３７℃、５％ＣＯ_２下で所定時間培養した。それぞれ７日目及び１４日目に一部のＴ細胞を収集し、フローサイトメトリーにより分析した。

ＣＤ４^＋ Ｔ細胞
ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の分化は、ＰＢＭＣを１ｘ１０^６細胞/ｍＬの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁させ、ＢｓＡｂ（１－１，０００ ｎｇ／ｍＬ）、ヒト化ＩＬ－２（２，０００ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ－７（２０ＩＵ／ｍＬ）の存在下で培養する以外、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の分化と同様であった。

制御性Ｔ細胞
制御性Ｔ細胞の分化は、ＰＢＭＣ又はナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を１ｘ１０^６細胞／ｍＬの濃度でＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁させ、ＢｓＡｂ（１－１，０００ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒト化ＩＬ－２（２，０００ＩＵ／ｍＬ）及びＤ－マンノース（２５ｍＭ）の存在下で培養する以外、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の分化と同様であった。

フローサイトメーター分析
腫瘍特異的抗原の認識及び／又は標的化
ＢｓＡｂ（１μｇ／ｍＬ）をＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ^＋／ＰＤ－Ｌ１^＋）、ＨＴ－２９（ＥＧＦＲ^＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＥＧＦＲ^＋／ＰＤ－Ｌ１^＋）、ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＰＤ－Ｌ１^＋）又はＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３^＋）細胞（３ｘ１０^５細胞）と共に４℃で６０分間インキュベートした後、マウス抗ヒスチジン抗体（１μｇ／ｍＬ）及びＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ）２抗マウス免疫グロブリン二次抗体（１μｇ／ｍＬ）と共に４℃で培養した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）により蛍光を測定し、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）により分析した。

Ｔ細胞分化
分化したＴ細胞（３ｘ１０^５細胞）をＦＩＴＣ標識結合抗ヒトＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ）、ＦＩＴＣ標識結合抗ヒトＣＤ４抗体（１μｇ／ｍＬ）、ＦＩＴＣ標識結合抗ヒトＣＤ８抗体（１μｇ／ｍＬ）又はＰＥ結合抗ヒトＦｏｘＰ３抗体と４℃で混合した。冷ＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）により生細胞の蛍光を測定し、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）により分析した。

Ｔ細胞の表面に残ったＢｓＡｂの量
Ｔ細胞又は実施例１のＢｓＡｂを備えるＴ細胞（３ｘ１０^５細胞）を２０％ＦＣＳを含有する培地中で培養し、それぞれ０、２４、４８及び７２時間目に収集した。ＰＢＳで洗浄した後、収集されたＴ細胞をマウス抗ヒスチジン抗体（１μｇ／ｍＬ）及びＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ）２抗マウス免疫グロブリン二次抗体（１ μｇ／ｍＬ）と４℃で混合した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）により生細胞の蛍光を測定し、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）により分析した。

細胞毒性アッセイ
腫瘍細胞（１０^４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。次いで、分化したＴ細胞（例えば、実施例２のＴ細胞）又はＯＫＴ３ Ｔ細胞を３：１、５：１又は１０：１のＥ／Ｔ比で腫瘍細胞に加え、１６時間引き続き培養した。次いで、細胞を収集し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性キットにより上清を分析して各分化したＴ細胞の細胞毒性を評価した。

ＥＬＩＳＡ
市販のＥＬＩＳＡキットにより製造業者の説明に従って分化したＴ細胞から分泌されたＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリンのレベルを測定した。簡単に言えば、実施例２のＴ細胞又はＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理された腫瘍細胞の上清を集取し、９６ウェル（１００μＬ／ウェル）に接種し、３６℃のインキュベータ中で１．５時間インキュベートした。洗浄緩衝液で洗浄した後、抗体（１００μＬ／ウェル）を加え、混合物をインキュベータに戻し、３６℃で引き続き１時間インキュベートした。洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１００μＬ／ウェル）を加え、さらに３０分間インキュベートした。洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（１００μＬ／ウェル）を加え、暗所で混合物を３６℃で１５分間インキュベートした。次いで、停止液（１００μＬ／ウェル）を加え、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。

ＥＧＦＲ^＋腫瘍を持つＳＣＩＤマウスの生体内イメージング
ＳＣＩＤマウスの背部にそれぞれＨＴ－２９（ＥＧＦＲ^＋）細胞（２ｘ１０^６細胞／１００μＬ）を注射して腫瘍の形成を誘導した。腫瘍をサイズが約８０－１００ｍｍ^３になるまで１４－１７日間成長させた後、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂでさらに修飾されたＮＩＲ７９７標識ＯＫＴ３ Ｔ細胞（１０^７細胞）を動物に静脈内注射した。注射後の４時間目及び２４時間目に、それぞれＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（励起波長：７４５ｎｍ、放射波長：８４０ｎｍ；Ｐｅｒｋｉｎ－ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， ＭＡ， ＵＳＡ）によりペントバルビタールで麻酔したマウスを撮影した。マウスを安楽死させた後、腫瘍及び器官（心臓、肺、腎臓、肝臓、胃、筋肉、骨、ボウル、腸、膵臓及び血液を含む）を回収し、ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステムにより分析した。

ＥＧＦＲ^＋腫瘍を持つＳＣＩＤマウスの治療
ＳＣＩＤマウスの背部にそれぞれＨＴ－２９（ＥＧＦＲ^＋）細胞（２ｘ１０^６細胞／１００μＬ）を注射して腫瘍の形成を誘導した。腫瘍をサイズが約３０－５０ｍｍ^３になるまで１０－１４日間成長させた後、抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂでさらに修飾されたＮＩＲ７９７標識Ｔ細胞（１０^７細胞／マウス）を動物に静脈内注射した。治療期間中に、各マウスに対して体重及び腫瘍のサイズ（長さｘ幅ｘ高さｘ１／２）を週に２回測定した。マウスを安楽死させた後、腫瘍を解剖し、Ｈ＆Ｅ染色又は抗ＣＤ３ Ａｂによる免疫染色により分析した。

統計分析

ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用してＪＭＰ ９．０ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）で平均値間の差の統計的有意性を推定した。細胞毒性アッセイ及び生体内毒性アッセイにおけるＰ値＜０．０５、及び治療におけるＰ値＜０．０１は、統計的に有意であると考えられる。

実施例１：ヒト化抗腫瘍／抗ＣＤ３抗体の調製及び特性評価
１．１抗腫瘍／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂの調製
本実施例において、図３に示されるＤＮＡ構築物を用いてそれぞれ図１に示される構造を有する組換えヒト化二重特異性Ａｂを調製した。抗腫瘍Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂである場合、構築物は順にＩｇＧシグナルペプチド（ＬＳ）、抗腫瘍ＶＬ－ＣＫ（例えば、抗ＥＧＦＲ ＶＬ－ＣＫ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、抗腫瘍ＶＨ－ＣＨ１（例えば、抗ＥＧＦＲ ＶＨ－ＣＨ１）、リンカーペプチド（Ｌ）、及び抗ＣＤ３ ＶＨ－ＶＬを含む（図３（Ａ））。抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖ ＢｓＡｂである場合、構築物は順にＬＳ、抗ＣＤ３ ＶＬ－ＣＫ、ＩＲＥＳ、ＬＳ、抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１、リンカーペプチド（Ｌ）、及び抗腫瘍ＶＨ－ＶＬを含む（図３（Ｂ））。抗腫瘍ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂである場合、構築物は順にＬＳ、抗腫瘍ＶＬ－ＶＨ、リンカーペプチド（Ｌ）、及び抗ＣＤ３ ＶＨ－ＶＬを含む（図３（Ｃ））。抗ＣＤ３ノブ／抗腫瘍ホールＢｓＡｂである場合、抗ＣＤ３ノブ構築物は順にＬＳ、抗ＣＤ３ ＶＬ－ＣＫ、ＩＲＥＳ、ＬＳ及び抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１－ノブＦｃを含み、抗腫瘍ホール構築物は順にＬＳ、抗腫瘍ＶＬ－ＣＫ、ＩＲＥＳ、ＬＳ及び抗腫瘍ＶＨ－ＣＨ１－ホールＦｃを含む。（図３（Ｄ））。

従って、抗ＣＤ３、抗腫瘍抗原（即ち、抗ＰＳＭＡ、抗ＥＧＦＲ、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＨＥＲ２、抗ＦＡＰ、抗ＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）、抗ＥｐＣＡＭ（ＭＯ２０１）、抗ＣＥＡ、及び抗ＶＣＡＭ－１）を含むＢｓＡｂを調製した。本発明のＢｓＡｂの成分、それぞれの核酸及びアミノ酸配列を表１から３６に示す。ＢｓＡｂは、Ｅｘｐｉ－２９３^ＴＭ発現システムにより調製され、各ＢｓＡｂの収率は１００ｍｇ／Ｌ以上であり、組み立て精度は９５％以上であった。

表１：抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表４：抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂの成分及び配列

表５：抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表６：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表７：抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表８：抗ＣＤ３ノブ／抗ＥＧＦＲホールＢｓＡｂの成分及び配列

表９：抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１０：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１１：抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１２：抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＤ－Ｌ１ホールＢｓＡｂの成分及び配列

表１３：抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１４：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１５：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１６：抗ＣＤ３ノブ／抗ＨＥＲ２ホールＢｓＡｂの成分及び配列

表１７：抗ＦＡＰ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１８：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表１９：抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２０：抗ＣＤ３ノブ／抗ＦＡＰホールＢｓＡｂの成分及び配列

表２１：抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２２：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２３：抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２４：抗ＣＤ３ノブ／抗ＥｐＣＡＭ ＭＯＣ３１ホールＢｓＡｂの成分及び配列

表２５：抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２６：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２７：抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表２８：抗ＣＤ３ノブ／抗ＥｐＣＡＭ ＭＴ２０１ホールＢｓＡｂの成分及び配列

表２９：抗ＣＥＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３０：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３１：抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３２：抗ＣＤ３ノブ／抗ＣＥＡホールＢｓＡｂの成分及び配列

表３３：抗ＶＣＡＭ１ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３４：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＶＣＡＭ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３５：抗ＶＣＡＭ１ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの成分及び配列

表３６：抗ＣＤ３ノブ／抗ＶＣＡＭ１ホールＢｓＡｂの成分及び配列

１．２抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、及び抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂの特性評価
図４は、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ ＢｓＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。これらは、還元条件下で約９５ｋＤａのＦａｂ断片から構成され流。一方、非還元条件下で１７０ｋＤａの抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂ及び５０ｋＤａの抗ＰＳＭＡｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖがそれぞれ観察された。ＳＤＳ ＰＡＧＥには、陽性対照として抗ＥＧＦＲ抗体であるアービタックスを含んだ。

本実施例において、フローサイトメトリーによりＢｓＡｂの二機能活性を調べた。結果を図３に示す。

抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂは、それぞれＣＤ３陽性Ｔ細胞（即ち、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）及びＰＳＭＡ陽性前立腺がん細胞（即ち、ＬＮＣａＰ細胞）に結合可能である。抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＥＧＦＲ陽性がん細胞（即ち、ＨＴ２９細胞）を特異的に認識可能である。抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖは、ＣＤ３陽性Ｔ細胞（即ち、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）及びＰＤ－Ｌ１陽性前立腺がん細胞（即ち、ＬＮＣａＰ細胞）を特異的に認識可能である。図５のデータから、実施例１の抗体は、異なる２種類の抗原を有することが確認された。

１．３ヒト化ＯＫＴ３抗腫瘍／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂの調製
本実施例において、「材料及び方法」セクションに記載の手順に従って組換えヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ及びＶＬ配列を調製した。ヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ、ＶＬアミノ酸配列及びそれぞれのＣＤＲは表３７及び３８に提供される。

表３７：ヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ及びそのＣＤＲのアミノ酸配列

表３８：ヒト化ＯＫＴ３ ＶＬ及びそのＣＤＲのアミノ酸配列

ヒト化ＯＫＴ３ ＶＨ及びＶＬ配列を表１から３６に記載の抗腫瘍配列に融合することにより、所望のヒト化ＯＫＴ３抗腫瘍／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂを構築することができる。抗腫瘍Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの配列は、表３９に提供される。抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋ及びＶＨ－ＣＨ１の配列は、表４０に提供される。抗腫瘍ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの配列は、表４１に提供される。抗ＣＤ３ノブ／抗腫瘍ホールを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ＶＬノブ及びＶＨノブの配列は、表４２に提供される。

表３９：抗腫瘍Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの配列

表４０：抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗腫瘍ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋ及びＶＨ－ＣＨ１の配列

表４１：抗腫瘍ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの配列

表４２：抗ＣＤ３ノブ／抗腫瘍ホールを構築するためのヒト化ＯＫＴ３抗ＣＤ３ ＶＬノブ及びＶＨノブの配列

実施例２：実施例１のＢｓＡｂによって分化したＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋細胞の増殖及び特性評価
実施例１のＢｓＡｂを備えるＴ細胞を調製するために、健康被験体の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、サイトカインＩＬ２、マウスモノクローナル抗体ＯＫＴ３又はサイトカインＩＬ２、及びの実施例１．２のＢｓＡｂ（即ち、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、及び抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂ）を含有する培地中で培養することで分化させた。培養された細胞をそれぞれ７日目及び１４日目に収集し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体を用いてフローサイトメーターにより分析した。定量結果を表４３及び図６にまとめる。

表４３におけるデータは、実施例１．２のヒトＢｓＡｂがＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋細胞へのＰＢＭＣの分化の誘導においてマウスＯＫＴ３と同程度に有効であることを示している。さらに、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで誘導された細胞以外、実施例１．２のＢｓＡｂで誘導されたＣＤ３^＋細胞群は、培養の７日後に８０％を超え、１４日後に９０％を超え、１８後にＣＤ３^＋／ＣＤ^８＋細胞の総数は約４－５倍になった（図６）。

表４３：実施例１．２のＯＫＴ３又はＢｓＡｂによるＣＤ３^＋／ＣＤ^８＋細胞へのＰＢＭＣの分化の誘導

分化したＴ細胞に実施例１．２のＢｓＡｂを備えているか否かを確認するために、増殖したＴ細胞の表面上にある抗抗原断片（例えば、抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３）をＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＦａｂ抗体を用いてフローサイトメーターで分析した。結果を図７に示す。

図７２におけるデータにより、実施例１．２のＢｓＡｂと共に１４日間培養されたＰＢＭＣは、表面に実施例１．２のＢｓＡｂの抗ＰＳＭＡ断片を備えることにより、ＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞への分化に成功したことが確認された。

実施例３：がん細胞に対する実施例２のＴ細胞の影響
３．１実施例２のＴ細胞の細胞毒性の影響
それぞれマウスＯＫＴ３及び実施例１．２のＢｓＡｂによって分化したＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ^＋）細胞におけるがん細胞死滅効果を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｇ１７８０）を用いて製造業者の説明に従って評価した。結果を表４４及び図８に示す。

３：１、５：１、１０：１のＥ／Ｔ比（標的化細胞に対するエフェクター細胞の比）で、約８．４％、１１．６％、及び１９．３％のＬＮＣａＰ細胞は、それぞれマウスＯＫＴ３で修飾されたＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋ Ｔ細胞によって死滅することが発見された。約６５％、８７％及び９７％のＬＮＣａＰ細胞は、同じＥ／Ｔ比で抗ＰＳＭＡＦａｂ／抗ＣＤ３ｓｃＦｖ ＢｓＡｂを備えるＴ細胞によって死滅した。同様の改善された細胞毒性の効果は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、及び抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂを備えるＴ細胞においても見られた（図８）。

撮影分析から分かるように、腫瘍細胞と接触すると、かなりの実施例２のＴ細胞（又は実施例１の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ若しくは抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂを備えるＴ細胞）はＬＮＣａＰ細胞の表面に特異的に結合するのに対して、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞は、８時間のインキュベーション後でもほとんど結合していなかった（図９）。

表４４：それぞれマウスＯＫＴ３及び実施例１．２のＢｓＡｂによって分化したＴ細胞の細胞毒性の影響

３．２ 実施例２のＴ細胞のがん細胞死滅効果の特性評価
実施例２のＴ細胞（又は実施例１のＢｓＡｂを備えるＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋ Ｔ細胞）の細胞死滅効果をさらに分析するために、これらのＴ細胞から分泌されたサイトカインを収集し、ＥＬＳＡにより分析した結果、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリンのレベルは、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞よりも顕著に高いことを示した（図１０）。

３．３ 実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾された実施例２のＴ細胞によるがん細胞死滅効果の増強
本実施例において、実施例１．２のＢｓＡｂを３：１、５：１及び１０：１のＥ／ＴＥ／Ｔ比で実施例２のＴ細胞の培地に加え、１８時間インキュベートした後、混合物をＰＳＭＡ^＋がん細胞（即ち、ＬＮＣａＰ細胞）に加えた。がん細胞死滅効果を実施例３．１と同様に細胞毒性アッセイにより評価し、ＬＮＣａＰ細胞から採取された上清におけるサイトカインのレベルをＥＬＳＡにより分析した。結果を図１１及び１２に示す。

図１１に示すように、実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾された実施例２のＴ細胞は、はるかに高い細胞死滅効果を示し、０：１のＥ／ＴＥ／Ｔ比で死滅効果が９０％以上である一方、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞は、同じＥ／ＴＥ／Ｔ比でわずか約２０％のレベルであった。予想通り、各サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリン）のレベルも対照群（即ち、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞）よりもはるかに高かった（図１２）。

３．４ 悪性膵臓がん又はトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に対する実施例１の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂを備えるＴ細胞の影響
悪性膵臓がん及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、死亡率が高く、治癒可能性が極めて限られている。本実施例において、悪性膵臓細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いて、これら２つの悪名高いがんに対する実施例１．２の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂを備えるＴ細胞の影響を調べた。

悪性膵臓がん細胞において、実施例１．２の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂを備えるＴ細胞は、対照Ｔ細胞（即ち、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞）と比較して、はるかに高い細胞毒性効果を示した。このＴ細胞が実施例１．２の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂでさらに修飾された場合、死滅効果はさらに増強された。実施例１．２の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂを備えるＴ細胞のがん死滅効果は、ＴＮＢＣ細胞においてより顕著であり、３：１の低いＥ／Ｔ比であってもほぼ１００％の死滅効果を示した。それに対して、Ｔ細胞は、同じＥ／Ｔ比でたった１０％の死滅効果を示した（図１３）。

撮影分析から分かるように、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞は、ほとんどＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に結合していない。実施例１．２の抗ＣＤ３／抗ＰＤ－Ｌ１ ＢｓＡｂでさらに修飾されたＴ細胞とインキュベートした後、かなりのＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はアポトーシスになった（図１４Ａ、１４Ｂ）。

３．５ Ｔ細胞の表面に残ったＢｓＡｂの量に対する時間の影響
実施例１．２の抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂを血清と共に異なる期間（即ち、０、２４、４８及び７２時間）インキュベートした後、フローサイトメトリー分析によりＴ細胞の表面に残ったＢｓＡｂの残存量を評価した。結果を図１５に示す。

Ｔ細胞の表面上のＢｓＡｂの量は、時間の経過とともに減少し、４つタイプ又は構造のＢｓＡｂのうち、抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂは、分解による影響が最も少なく、７２時間後にも約４７％のＢｓＡｂがＴ細胞の表面に残っていた一方、Ｔ細胞の表面に残った抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのレベルは１５％に減少した。

実施例４：実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の影響
実施例１から４の発見の通り、マウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞は、がん細胞に対する低結合親和性及び低サイトカイン分泌レベルのため、がん死滅効果において実施例２のＴ細胞（即ち、実施例１のＢｓＡｂが運ばれたＴ細胞）ほど効果的ではなかった。従って、本実施例において、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を実施例１．２のＢｓＡｂと共にインキュベートすることで修飾した後、がん細胞に対する細胞毒性効果を評価した。

４．１ 実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞
マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を修飾するために、約３ｘ１０^５のマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を異なる量（８、２４、１２０、６００及び３，０００ｎｇ）の実施例１．２の抗ＰＳＭＡ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂと混合した後、フローサイトメトリーにより分析した。結果は、実施例１．２のＢｓＡｂをマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の表面に被覆するのに、約６００ｎｇの実施例１．２のＢｓＡｂが十分であることを示した（データは示していない）。

４．２ ＰＳＭＡ^＋細胞に対する実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の影響
予想通り、実施例１のＢｓＡｂ（抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホール）で修飾されたマウスＯＫＴ３によって分化したＴ細胞は、修飾される前と比較して、ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ^＋）に対するがん細胞死滅能力が顕著に増強された。Ｅ／Ｔ比が１０：１である場合、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、ほぼ１００％の細胞死滅効果を示した（図１６）。実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞から分泌されたサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリン）のレベルは、未修飾の対照Ｔ細胞と比較して顕著に増加した（図１７）。

撮影分析から分かるように、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ又は抗ＣＤ３ノブ／抗ＰＳＭＡホールＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して、ＬＮＣａＰ細胞の表面により特異的に結合する（図１８）。

４．３ ＥＧＦＲ^＋細胞に対する実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の影響
本実施例において、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾した後、分析によりそのＥＧＦＲ^＋がん細胞（即ち、ＨＴ２９細胞）の死滅能力を調べた。

実施例５．１の発見結果と同様に、実施例１．２の抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾された後、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、強化された細胞毒性効果（１０：１のＥ／Ｔ比で約５０％の細胞死滅効果）（図１９Ａ）、及び向上したサイトカイン（ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリン）のレベル（図１９Ｂ）を示した。

撮影分析から分かるように、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して、ＨＴ２９細胞の表面により特異的に結合する（図２０）。

４．４ ＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対する実施例１．２のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の影響
本実施例において、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾した後、分析によりＰＤ－Ｌ１^＋がん細胞（即ち、ＬＮＣａＰ細胞）の死滅能力を評価した。

実施例５．１及び５．２の発見結果と同様に、実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾された後、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、強化された細胞毒性効果（１０：１のＥ／Ｔ比で約９２％の細胞死滅効果）（図２１Ａ）、及び向上したサイトカイン（ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、グランザイムＢ及びパーフォリン）のレベル（図２１Ｂ）を示した。

撮影分析から分かるように、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して、ＬＮＣａＰ細胞の表面により特異的に結合する（図２２）。

４．５ 悪性膵臓がん細胞及びＴＮＢＣ細胞に対する実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の影響
本実施例において、実施例３．４と同様の手順に従って、悪性膵臓がん細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＰＤ－Ｌ１^＋細胞）及びＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）を用いて実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞のがん死滅効果を調べた。

悪性膵臓がん細胞において、実施例１の抗ＣＤ３Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞（即ち、未修飾のマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞）と比較して、はるかに高い細胞毒性効果（約４０％のがん細胞が死滅した）を示した。ＴＮＢＣ細胞において、がん死滅効果はより高くなり、３：１の低いＥ／Ｔ比でもほぼ８０％のがん細胞が死滅した。それに対し、対照Ｔ細胞は、同じ比でわずか２０～３０％の死滅効果を示した（図２３）。

撮影分析から分かるように、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、未修飾のＯＫＴ３ Ｔ細胞と比較して、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞（図２４Ａ）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面に特異的に結合し（図２４Ｂ）、これによって、がん細胞のアポトーシスが増強された。

実施例５：実施例１のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の生体内影響
実施例１のＢｓＡｂがマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞の標的化効果を改善できるか否かを研究するために、マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を実施例１．２の抗ＥＧＦＲ／抗ＣＤ３ ＢｓＡｂで修飾すると同時に、蛍光指示薬ＮＩＲ７９７で標識した。次いで、修飾及び標識されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞をＩＶ注射により異種ＥＧＦＲ^＋腫瘍（ＨＴ２９細胞）を有するＳＣＩＤマウスに注射し、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて４時間目及び２４時間目にライブ写真を撮った。２４時間後に動物を安楽死させ、腫瘍自体及び器官（心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、胃、筋肉、骨、大腸、小腸、膵臓、血液）を回収し、ＩＶＩＳイメージングシステムにより分析した。結果を図２５及び２６に示す。

図２５の写真は、未修飾のマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理した動物と比較して、修飾されたＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理した動物体内の蛍光強度が主に腫瘍部位に集中していることを示した。この結果から明らかであるように、実施例１のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、確かに腫瘍を標的としており、これによって、腫瘍部位での蛍光強度が増強した。
さらに、修飾されたＴ細胞は、ＥＧＦＲ^＋腫瘍自体に集中している以外、生体内の分布様式が正常な健康動物と同様であった（図２６）。

さらに、修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞で処理した後、腫瘍のサイズ及び重量は顕著に抑制され（図２７Ａ及び図２７Ｃ）、動物の体重は２５日間の治療の間にわずかに減少した（図２７Ｂ）。

動物から採取された腫瘍を免疫組織化学（ＩＨＣ）染色及びＨ＆Ｅ染色によりさらに分析した。結果を図２８に示す。マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、主に腫瘍の隣接領域に集中していることが観察された。

実施例６：実施例２のＴ細胞と実施例４の修飾されたマウスＯＫＴ３細胞の比較的研究
本実施例において、実施例１．２のＢｓＡｂ（即ち、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）及びマウスＯＫＴ３で誘導されたＴ細胞の分化及び増殖を比較した。結果を図２９から３２に示す。

図２９Ａに示すように、実施例１．２のＢｓＡｂ（即ち、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）及びマウスＯＫＴ３は、いずれもＣＤ３^＋細胞へのＰＢＭＣの分化を誘導することができ、且つ９５％以上の細胞をＣＤ３^＋細胞に分化させた。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞へのＰＢＭＣの分化においては、実施例１．２のＢｓＡｂ（即ち、抗ＰＳＭＡ Ｆａｂ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）は、マウスＯＫＴ３よりも効果的であった。具体的には、実施例１．２のＢｓＡｂで処理した後、９０％以上のＰＢＭＣがＣＤ４^＋細胞に分化したのに対して、マウスＯＫＴ３で処理した後、約７５％のＰＢＭＣのみがＣＤ４^＋細胞に分化した。さらに、実施例１．２のＢｓＡｂで誘導されたＴ細胞の増殖比もマウスＯＫＴ３で誘導されたＴ細胞よりも高かった（図２９Ｂ）。フローサイトメトリー分析により、マウスＯＫＴ３ Ａｂで誘導されたＴ細胞と同様に、ＯＫＴ３ Ｔ細胞の表面に現れることが確認された。実施例１．２のＢｓＡｂのそれぞれに運ばれる２種類の抗体断片は、実施例１．２のＢｓＡｂで誘導されたＴ細胞の表面にも現れた（図３０）。

マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞及び実施例２のＴ細胞の細胞毒性についての研究は、図３１に提供される。示されるように、ＯＫＴ３ Ｔ細胞は、ＰＳＭＡ^＋細胞（ＬＮＣａＰ細胞）を死滅させることができないのに対して、実施例２のＴ細胞（又は実施例１のＢｓＡｂで誘導されたＴ細胞）は、少なくとも５０％の細胞毒性を示し、実施例１．２のＢｓＡｂでさらに修飾されると、Ｔ細胞の細胞毒性は、さらに向上する。例えば、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖによって分化したＴ細胞の細胞毒性は、Ｅ／Ｔ比が５：１及び１０：１である場合、それぞれ５１．３２％及び６０．９７％であり、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖでさらに修飾されることで、Ｅ／Ｔ比が５：１及び１０：１である場合、細胞毒性は、約７８．１５％及び８１．７５％に高くなった。同様の観察は、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖによって誘導されたＴ細胞においてもが見られた。

実施例７：実施例１．２のＢｓＡｂによる制御性Ｔ細胞のワンステップ分化、増殖
本実施例において、実施例１．２のＢｓＡｂを用いて制御性Ｔ細胞を誘導して形成した。簡単に言えば、健康被験体の血液からＰＢＭＣを分離し、実施例１．２の抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ又は抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと共に７日間培養し、必要に応じて培地にはＩＬ２、ＴＧＦ－β及び抗ＣＤ２８抗体も含まれた。次いで、分化したＴ細胞を回収してフローサイトメトリーにより分析した。結果を図３２に示す。

上記のデータは、抗ＣＤ３ Ｆａｂ／抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂ及び抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ／抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれ約１９．３％（図３２Ａ）及び７．２％（図３２Ｂ）のＣＤ４^＋ＦｏｘＰ３^＋制御性Ｔ細胞の形成を誘導できることを示している。

実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は１又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。

Claims (14)

1. 二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）によりＴ細胞への末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分化及び／又は増殖を誘導する方法であって、
   前記ＰＢＭＣを前記ＢｓＡｂと共に培地中で培養することで、前記ＰＢＭＣをＴ細胞に分化させることを含み、
   前記ＢｓＡｂは、抗腫瘍抗原ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、前記抗腫瘍抗原ｓｃＦｖは、配列番号６９、７７、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４又は１２０のアミノ酸配列からなり、前記抗ＣＤ３ Ｆａｂは、抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメイン及び抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１ドメインからなり、前記抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列からなり、前記抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列からなる、方法。
2. 前記培地は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＴＧＦ－β又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記培地は、ＩＬ２、ＩＬ７及びＴＧＦ－βの組み合わせを含み、
   前記方法によって形成されたＴ細胞は、制御性Ｔ細胞である、請求項２に記載の方法。
4. 請求項１から３のいずれかに記載の方法によって調製されるＴ細胞。
5. 抗腫瘍抗原ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ Ｆａｂを含む二重特異性抗体であって、
   前記抗腫瘍抗原ｓｃＦｖは、配列番号６９、７７、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４又は１２０のアミノ酸配列からなり、前記抗ＣＤ３ Ｆａｂは、抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメイン及び抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１ドメインからなり、前記抗ＣＤ３ ＶＬ－Ｃｋドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列からなり、前記抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列からなる、二重特異性抗体。
6. がんに罹患している被験体を治療するための医薬組成物であって、
   前記医薬組成物は、請求項４に記載のＴ細胞又は請求項５に記載のＢｓＡｂで修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を含む、がんに罹患している被験体を治療する医薬組成物。
7. 前記マウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をマウスＯＫＴ３モノクローナル抗体と共に培地中で培養することにより調製される、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記請求項４に記載のＴ細胞又は前記修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞は、請求項５に記載のＢｓＡｂによって修飾され、
   前記修飾は、前記請求項４に記載のＴ細胞又は前記修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞を請求項５に記載のＢｓＡｂの存在下で培地中で培養することにより行われる、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記培地は、Ｉｌ－２、ＩＬ－７及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインをさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記培地は、抗ＣＤ２８抗体をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記がんは、ＥＧＦＲ^＋、ＰＳＭＡ^＋又はＰＤ－Ｌ１^＋がんである、請求項６に記載の医薬組成物。
12. 前記がんは、膀胱がん、胆道がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸癌、大腸癌、食道がん、上皮がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経膠腫、リンパ系の造血器腫瘍、肝がん、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、肺がん、リンパ腫、腸がん、黒色腫、骨髄性白血病、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、卵巣がん、腎細胞がん、脾臓がん、扁平上皮がん、甲状腺がん又は甲状腺濾胞がんである、請求項６に記載の医薬組成物。
13. 前記乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 請求項４に記載のＴ細胞又は請求項５に記載のＢｓＡｂでさらに修飾されたマウスＯＫＴ３ Ｔ細胞、及び請求項５に記載のＢｓＡｂを含む、医薬品キット。

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