JP6830294B1 - トレハロースを含む哺乳動物細胞保存用液 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕トレハロース若しくはその誘導体又はこれらの塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含み、かつ、pHが6.5〜8.5である哺乳動物細胞保存用液。
〔2〕炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、上記〔1〕に記載の保存用液。
〔3〕さらに、多糖類若しくはその誘導体又はこれらの塩を含む、上記〔1〕又は〔2〕に記載の保存用液。
〔4〕等張液である、上記〔1〕〜〔3〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔5〕等張液が、乳酸リンゲル液である、上記〔4〕に記載の保存用液。
〔6〕多糖類が、デキストランである、上記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔7〕トレハロース若しくはその誘導体又はこれらの塩の濃度が、2.0〜6.0(w/v)%である、上記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔8〕デキストラン若しくはその誘導体又はこれらの塩の濃度が、4.0〜7.0(w/v)%である、上記〔6〕又は〔7〕に記載の保存用液。
〔9〕哺乳動物細胞を0〜40℃で保存するための、上記〔1〕〜〔8〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔10〕哺乳動物細胞を6時間〜14日間保存するための、上記〔1〕〜〔9〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔11〕哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、上記〔1〕〜〔10〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔12〕哺乳動物細胞の自己複製能低下を抑制するために用いられる、上記〔1〕〜〔11〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔13〕哺乳動物細胞の移植に用いられる、上記〔1〕〜〔12〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔14〕哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、上記〔1〕〜〔13〕のいずれか1項に記載の保存用液。
〔15〕哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、上記〔14〕に記載の保存用液。
〔16〕トレハロース若しくはその誘導体又はこれらの塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含む、上記〔1〕〜〔15〕のいずれか1項に記載の保存用液を調製するための粉末製剤。
[17]炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、上記[16]に記載の粉末製剤
〔18〕トレハロース若しくはその誘導体又はこれらの塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含み、かつ、pHが6.5〜8.5である保存用液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。
〔19〕炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、上記〔18〕に記載の保存方法。
〔20〕保存用液が、さらに、多糖類若しくはその誘導体又はこれらの塩を含む、上記〔18〕又は〔19〕に記載の保存方法。
〔21〕保存用液が等張液である、上記〔18〕〜〔20〕のいずれか1項に記載の保存方法。
〔22〕等張液が乳酸リンゲル液である、上記〔21〕に記載の保存方法。
〔23〕多糖類が、デキストランである、上記〔20〕〜〔22〕のいずれか1項に記載の保存方法。
〔24〕保存用液中で、哺乳動物細胞を6時間〜14日保存することを特徴とする上記〔18〕〜〔23〕のいずれか1項に記載の保存方法。
また、本発明には、トレハロース類を含む、本件哺乳動物細胞保存用液を調製するための粉末製剤が含まれる。当該粉末製剤には上記の任意成分を含んでいてもよい。
細胞(multipotent stem ce11)、単能性幹細胞(unipotent stem ce11)等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
1.材料及び方法
[哺乳動物細胞]
以下の実験1〜4には、以下の表1に記載のヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD−MSC)を用いた。
CSP−01液は、α,α−トレハロース(株式会社林原社製又は富士フィルム和光純薬社製)と、低分子デキストランL注(10[w/v]%デキストラン含有乳酸リンゲル液)(大塚製薬工場社製)とを、トレハロース及びデキストランの終濃度がそれぞれ3(w/v)%及び5(w/v)%となるように乳酸リンゲル液(ラクテック輸液;大塚製薬工場社製)へ添加し、調製した(特許文献2参照)。
CSP−11液は、α,α−トレハロース(株式会社林原社製又は富士フィルム和光純薬社製)を、トレハロースの終濃度が3(w/v)%となるように乳酸リンゲル液(ラクテック輸液;大塚製薬工場社製)へ添加し、調製した(特許文献2参照)。CSP−01液及びCSP−11液の組成を、以下の表2に示す。
hAD−MSCは定法にしたがって培養した。すなわち、hAD−MSCを、ヒト脂肪由来幹細胞添加因子セット(Lonza Walkersville社製、PT-4503)を含むADSC−BM(Adipose Derived Stem Cell Basal Medium)(Lonza Walkersville社製、PT-3273)(以下、単に「培養液」という)を添加した75cm2フラスコに入れ、CO2インキュベーター(37℃条件下)内で継代培養した。また、培養液の交換は3日毎行った。
hAD−MSC含有液を、以下の〔1〕〜〔10〕の手順に従って調製した。
〔1〕パーソナルインキュベーターを37±2℃に加温しておいた。
〔2〕hAD−MSCを培養している75cm2フラスコを、CO2インキュベーターから取り出した。
〔3〕倒立顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約80%コンフルエントのものを使用した。〔4〕培養液を吸引し、PBS(−)を各75cm2フラスコに8mLずつ添加した。
〔5〕PBS(−)を吸引後、トリプシン/EDTA(CC-5012、Lonza Walkersville社製)をフラスコに4mLずつ添加し、パーソナルインキュベーターにて37±2℃条件下で5分間インキュベートした。
〔6〕細胞が90%程度剥離するまで倒立顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔7〕トリプシン反応を停止させるために、トリプシン中和液(TNS;CC-5002、Lonza Walkersville社製)を8mLずつ加えて、ピペッティングにより細胞を剥離し、50mLのコニカルチューブに移した。
〔8〕遠心処理(210×g、5分間、20℃)後、上清を除去し、一定量(各75cm2フラスコ当たり1.5mL)のPBS(−)を添加し、細胞を懸濁した。
〔9〕細胞懸濁液から一部(20μL)分取し、20μLのトリパンブルー染色液(Gibco社製)と混合しワンセルカウンター(細胞計数盤;バイオメディカルサイエンス社製)で全細胞数(生細胞数及び死細胞数)を計測した。なお、細胞数は、ワンセルカウンターにおける9ヵ所のエリアのうち、4隅のエリア内にある細胞を計測し、以降の計測も同様に行った。
〔10〕全細胞数が5.0×105細胞/mLとなるようにPBS(−)を添加し、氷冷し、哺乳動物細胞含有液を調製した。
被験液中に哺乳動物細胞を保存したときの細胞生存率及び生細胞回収率を、以下の〔1〕〜〔4〕の手順に従って測定した。
〔1〕調製した哺乳動物細胞含有液を、フィンピペット(100−1000μL)を用いて、15mLクラリファインドポリプロピレンコニカルチューブに1mLずつ分注し、遠心処理(210×g、5分間、25℃)後、氷冷した。
〔2〕上清を除去し、フィンピペット(100−1000μL)を用いて、1mLの各被験液に細胞を懸濁した後、その一部(20μL)を、予めトリパンブルー染色液(Gibco社製)20μLを添加した1.5mLマイクロチューブに分取した。トリパンブルー染色液と混和した細胞懸濁液を、ワンセルカウンターに分取し、光学顕微鏡(ECLIPSE TS100、ニコン社製)を用いて全細胞数及びトリパンブルー陽性細胞(死細胞)数を計測することにより、保存開始直後の細胞生存率を算出した。
〔3〕残りの細胞懸濁液は、薬用冷蔵ショーケース(5℃に設定)にて各保存期間まで静置保存した。
〔4〕各保存期間が経過した時点において、チップの先を、細胞を含む液が入ったチューブの底から目視で5mm程度の位置まで挿入し、緩やかに攪拌(500μLの液量でのピペッティングを5回)することにより細胞が懸濁した状態で、その一部(20μL)を1.5mLマイクロチューブに採取し、トリパンブルー染色液(Gibco社製)20μLと混和後、ワンセルカウンターに分取し、光学顕微鏡(ECLIPSE TS100、ニコン社製)を用いて全細胞数及びトリパンブルー陽性細胞(死細胞)数を計測することにより、各保存期間における細胞生存率及び生細胞回収率を算出した。なお、細胞生存率は、式「(全生細胞数/全細胞数)×100=([全細胞数−死細胞数]/全細胞数)×100=細胞生存率(%)」を用いて算出し、また、生細胞回収率は、式「(各保存期間の全生細胞数/保存開始直後の全生細胞数)×100=([各保存期間の全細胞数−各保存期間の死細胞数]/[保存開始直後の全細胞数−保存開始直後の死細胞数])×100=生細胞回収率(%)」を用いて算出した。
被験液中に哺乳動物間葉系幹細胞を保存したときのコロニー形成能を、以下の〔1〕〜〔4〕の手順に従って測定した。
〔1〕調製した哺乳動物細胞含有液を、フィンピペット(100−1000μL)を用いて、15mLクラリファインドポリプロピレンコニカルチューブに1mLずつ分注し、遠心処理(210×g、5分間、25℃)後、氷冷した。
〔2〕上清を除去し、フィンピペット(100−1000μL)を用いて、1mLの各被験液に細胞を懸濁した後、その一部(20μL)を、60mmディッシュ(面積が21cm2)に、15細胞/cm2となるように播種し、約8日後に形成されたコロニー数を測定し、保存開始直後のコロニー形成単位(CFU)、すなわち、播種した細胞数に対するコロニー数の比率を算出した。
〔3〕残りの細胞懸濁液は、薬用冷蔵ショーケース(5℃に設定)にて各保存期間まで静置保存した。
〔4〕各保存期間が経過した時点において、チップの先を、細胞を含む液が入ったチューブの底から目視で5mm程度の位置まで挿入し、緩やかに攪拌(500μLの液量でのピペッティングを5回)することにより細胞が懸濁した状態で、60mmディッシュ(面積が21cm2)に、15細胞/cm2となるように播種し、約8日後に形成されたコロニー数を測定し、保存開始直後のCFUを算出した。
[実験1]
hAD−MSCを、以下の表3に示す6種類の被験液中に各保存期間(1日、2日間、4日間、7日間、及び14日間)保存したときの細胞生存率(表4及び図1A参照)及び生細胞回収率(表5及び図1B参照)を、上記[細胞生存率及び生細胞回収率の測定]の項目に記載の方法に従って測定した。
hAD−MSCを、以下の表6に示す4種類の被験液中に各保存期間(6時間、24時間、48時間、及び96時間)保存したときの細胞生存率(表7参照)及び生細胞回収率(表8参照)を、上記[細胞生存率及び生細胞回収率の測定]の項目に記載の方法に従って測定した。
hAD−MSCを、以下の表9に示す11種類の被験液中に各保存期間(24時間、48時間、96時間、及び168時間)保存したときの細胞生存率(表10及び12参照)及び生細胞回収率(表11及び13参照)を、上記[細胞生存率及び生細胞回収率の測定]の項目に記載の方法に従って測定した。
hAD−MSCを、以下の表14に示す4種類の被験液中に各保存期間(6時間、24時間、及び48時間)保存したときのコロニー形成能(表15参照)を、上記[CFUアッセイ]の項目に記載の方法に従って測定した。
1.材料及び方法
[哺乳動物細胞]
以下の実験には、以下の表16に記載のヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hBM−MSC)を用いた。
CSP−01液は、実施例1と同様に、α,α−トレハロース(株式会社林原社製又は富士フィルム和光純薬社製)と、低分子デキストランL注(10[w/v]%デキストラン含有乳酸リンゲル液)(大塚製薬工場社製)を、トレハロース及びデキストランの終濃度がそれぞれ3(w/v)%及び5(w/v)%となるように乳酸リンゲル液(ラクテック輸液;大塚製薬工場社製)へ添加し、CSP−01液(5.6未調整)を得た。0.5mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を、pHが7.300になるように添加し、CSP−01液(7.3NaOH)を得た。pH調整剤として炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、CSP−01液(7.2NaHCO3) を調製した。 CSP−01液(7.2NaHCO3) のpHは7.158であった。なお、各被験液におけるpHは、室温(21.2〜24.0℃)で測定した際の値である。
hBM−MSCを含む乳酸リンゲル液は、以下の手順〔1〕〜〔8〕に従って調製した。
〔1〕4×105個のhBM−MSCを、75cm2フラスコに加え、ヒト間葉系幹細胞専用培地キット(Lonza社製)(以下、「MSC培地」という)存在下で37℃、5%CO2インキュベーターにて培養を行った。顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約80%程度コンフルエントになるまで培養した。
〔2〕MSC培地を除き、10mLのPBS(−)でhBM−MSCをリンスした。
〔3〕PBS(−)を除き、4mLのトリプシン−EDTA(CC−3232、Lonza社製)を加え、室温で5分間静置した。
〔4〕hBM−MSCが90%程度剥離するまで顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔5〕5mLのMSC培地を加え、トリプシン反応を停止させ、ピペッティングによりhBM−MSCを回収し、50mL遠心チューブに移した。
〔6〕600×g、5分間、室温で遠心分離を行った。
〔7〕上清(MSC培地)を除き、9mLの乳酸リンゲル液を加え、沈殿(hBM−MSC)を懸濁した。
〔8〕細胞数を計測し、5×105cells/mLとなるように乳酸リンゲル液で調整し、hBM−MSCを含む乳酸リンゲル液を調製した。
各種被験用等張液中でのhBM−MSCの保存は、以下の手順〔1〕〜〔2〕に従って行った。
〔1〕調製したhBM−MSCを含む乳酸リンゲル液を、各チューブに0.5mLずつ分注し、遠心分離(600×g、5分間)を行った。
〔2〕上清(乳酸リンゲル液)を除き、沈殿(hBM−MSC)を、0.5mLの各種被験用等張液で懸濁し、5℃で3日間保存した。
トリパンブルー染色法によるhBM−MSCの細胞生存率の解析は、以下の手順〔1〕〜〔2〕に従って行った。
〔1〕5℃で3日間保存後のhBM−MSCを含む各種被験用等張液のそれぞれから、20μLを採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液(Gibco社製)20μLを混合した。なお、比較対照として、各種被験用等張液に懸濁する前(5℃で保存前)のhBM−MSCを含む乳酸リンゲル液のそれぞれから、20μLを採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液20μLを混合した。
〔2〕顕微鏡下にてワンセルカウンター(バイオメディカルサイエンス社製)を用いて全細胞数とトリパンブルー陽性細胞(死細胞)数の測定を行い、全細胞数に対するトリパンブルー陰性細胞の割合、すなわち、細胞生存率を算出した。細胞生存率(%)を以下の式1を用いて算出した。
[式1]
細胞生存率(%)=(全細胞数−死細胞数)/全細胞数×100
[実験]
hBM−MSCを、以下の表17に示す3種類の被験中に5℃で3日間保存したときの細胞生存率(図4参照)を、上記[細胞生存率の測定]の項目に記載の方法に従って測定した。結果を、表18及び図4に示す。
Claims (24)
- トレハロース又はその塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含み、かつ、pHが6.5〜8.5である哺乳動物細胞保存用液。
- 炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、請求項1に記載の保存用液。
- さらに、多糖類又はこれらの塩を含む、請求項1又は2に記載の保存用液。
- 等張液である、請求項1〜3のいずれかに記載の保存用液。
- 等張液が乳酸リンゲル液である、請求項4に記載の保存用液。
- 多糖類がデキストランである、請求項3〜5のいずれかに記載の保存用液。
- トレハロース又はその塩の濃度が、2.0〜6.0(w/v)%である、請求項1〜6のいずれかに記載の保存用液。
- デキストラン又はその塩の濃度が、4.0〜7.0(w/v)%である、請求項6又は7に記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞を0〜40℃で保存するための、請求項1〜8のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞を6時間〜14日間保存するための、請求項1〜9のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、請求項1〜10のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞の自己複製能低下を抑制するために用いられる、請求項1〜11のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞の移植に用いられる、請求項1〜12のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、請求項1〜13のいずれかに記載の保存用液。
- 哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、請求項14に記載の保存用液。
- トレハロース又はその塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含む、請求項1〜15のいずれかに記載の保存用液を調製するための粉末製剤。
- 炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、請求項16に記載の粉末製剤。
- トレハロース又はその塩、及び、pH調整剤としての炭酸水素塩を含み、かつ、pHが6.5〜8.5である保存用液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。
- 炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、請求項18に記載の保存方法。
- 保存用液が、さらに、多糖類又はこれらの塩を含む、請求項18又は19に記載の保存方法。
- 保存用液が等張液である、請求項18〜20のいずれかに記載の保存方法。
- 等張液が乳酸リンゲル液である、請求項21に記載の保存方法。
- 多糖類がデキストランである、請求項20〜22のいずれかに記載の保存方法。
- 保存用液中で、哺乳動物細胞を6時間〜14日保存する、請求項18〜23のいずれかに記載の保存方法。
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