JP6735887B2

JP6735887B2 - 間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤、間葉系幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、間葉系幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び間葉系幹細胞の細胞老化抑制方法

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Publication number: JP6735887B2
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Description

本開示は、幹細胞の細胞老化抑制剤、幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び幹細胞の細胞老化抑制方法に関する。

細胞老化（cellular senescence）とは、細胞に不可逆的な細胞周期の停止が起こる現象である。例えば、細胞分裂に伴うＤＮＡ複製エラーの蓄積、酸化ストレス、放射線、がん遺伝子の活性化等によりＤＮＡに損傷が生じると、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ；DNA Damage Response）が活性化される。このＤＮＡ損傷応答により、細胞分裂に関与するサイクリンキナーゼの阻害因子であるｐ１６^INK4a、ｐ２１^CIP1、ｐ５３等の発現が亢進し、細胞周期の停止が引き起こされる。ＤＮＡの損傷の程度が小さければ細胞は再び細胞周期を復帰させ増殖するが、損傷の程度が大きいと細胞周期が不可逆的に停止し、細胞老化へと至る。細胞老化を起こした細胞（老化細胞）は、老化関連酸性β-ガラクトシダーゼ（SA β-Gal；Senescence Associated β-Galactosidase）活性が向上することが知られている。

老化細胞は、単に細胞周期を停止しているだけでなく、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、及びＭＭＰ（Matrix MetalloProteinase）のほか、ＩＧＦ（Insulin-like Growth Factor）に結合して細胞老化を誘引するＩＧＦＢＰ（IGF Binding Protein）−４、ＩＧＦＢＰ−７などを分泌し、周囲環境に悪影響を与えることが知られている。このような現象は、ＳＡＳＰ（Senescence-Associated Secretory Phenotype）とも称される。

ところで、幹細胞は、細胞分裂により同一の細胞を産生する自己複製能と、様々な細胞に分化する多分化能とを併せ持つ細胞である。受精卵が代表的な幹細胞であるが、成人の組織にも組織幹細胞が存在し、組織の恒常性維持に寄与している。例えば、皮膚組織の真皮層には間葉系幹細胞が存在しており、真皮層に豊富に含まれるコラーゲン等の細胞外マトリクスを産生する線維芽細胞へと分化する。

近年、幹細胞も細胞老化を起こすことが明らかとなり、組織の再生を担う幹細胞の細胞老化が個体老化の本質であるという考え（ステムセルエイジング）が提唱されるに至っている。

また、間葉系幹細胞等の幹細胞は、細胞療法に用いるバイオツールとしても注目されている。幹細胞は、骨髄、脂肪組織等から採取することができるものの、細胞療法を実施するために充分な数の幹細胞を直接採取することは困難である。そのため、採取した幹細胞をin vitroで培養し、増殖させる必要がある。しかし、幹細胞の継代を繰り返すと、幹細胞の細胞老化が引き起こされ、細胞療法の治療効果が低減することがある。

このような背景から、近年、幹細胞の細胞老化を抑制するための技術が盛んに研究されている。

例えば、特許文献１には、Ｎ−アセチルシステインの存在下で、ＡＴＭ（Ataxia Telangiectasia Mutated）ホモ欠損マウス由来の造血幹細胞を培養することにより、造血幹細胞内の活性酸素量が低下し、自己複製能が回復することが示されている。
特許文献２には、抗酸化剤及びＦＧＦ（Fibroblast Growth Factor）−２の存在下で間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞の細胞増殖が亢進し、また、間葉系幹細胞の分化潜在能力が高まることが示されている。
特許文献３には、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ；LysoPhosphatidic Acid）受容体アンタゴニストの存在下で幹細胞を培養することにより、幹細胞の機能を保持したまま、分裂回数が向上することが示されている。

国際公開第２００５／１２１３２０号特開２０１５−７７０７４号公報特開２０１５−８４６４９号公報

しかし、特許文献１で使用されているＮ−アセチルシステインについて本発明者らが確認したところ、正常ヒト幹細胞の細胞老化が抑制され難いことが判明した。
また、特許文献２で使用されているＦＧＦ−２は安定性に劣り、また、皮膚外用組成物等への応用が困難であると考えられる。
また、特許文献３で使用されているＬＰＡ受容体アンタゴニストは、広範な機能を有する脂質メディエーターを阻害するものであるため、細胞老化抑制以外の悪影響が懸念される。

本開示は、上記事情に鑑み、幹細胞の細胞老化を効果的に抑制可能な新規な幹細胞の細胞老化抑制剤を提供することを課題とする。また、本開示は、その幹細胞の細胞老化抑制剤を用いた幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び幹細胞の細胞老化抑制方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞アスタキサンチンを有効成分として含有する幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜２＞幹細胞が間葉系幹細胞である＜１＞に記載の幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜３＞さらに、トコフェロール類を有効成分として含有する＜１＞又は＜２＞に記載の幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜４＞トコフェロール類がニコチン酸トコフェロールを含む＜３＞に記載の幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜５＞ｐ１６、ｐ２１、γＨ２ＡＸ、ＩＧＦＢＰ−４、及びＩＧＦＢＰ−７からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現を抑制する＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜６＞ｐ１６及びｐ２１のタンパク質の発現を抑制する＜５＞に記載の幹細胞の細胞老化抑制剤。
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の幹細胞の細胞老化抑制剤を含有する幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物。
＜８＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の幹細胞の細胞老化抑制剤を含有する幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品。
＜９＞＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の幹細胞の細胞老化抑制剤の存在下で幹細胞を培養することを含む幹細胞の細胞老化抑制方法。

本開示によれば、幹細胞の細胞老化を効果的に抑制可能な新規な幹細胞の細胞老化抑制剤を提供することができる。また、本開示によれば、その幹細胞の細胞老化抑制剤を用いた幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び幹細胞の細胞老化抑制方法を提供することができる。

図１は、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた後、アスタキサンチン単独、又はアスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせを適用した場合のγＨ２ＡＸの発現量を、免疫染色法により可視化し、顕微鏡画像の核中蛍光量を定量した結果を示す図である。図２は、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた後、アスタキサンチン単独、又はアスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせを適用した場合の、細胞増殖率の測定結果を示す図である。図３は、ニコチン酸トコフェロールを適用し、幹細胞の継代を繰り返した場合のｐ１６の発現量を、ウェスタンブロッティングにより測定した結果を示す図である。

以下、本開示の幹細胞の細胞老化抑制剤、幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物、幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品、及び幹細胞の細胞老化抑制方法について詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。

本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
本明細書中に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本明細書中に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本明細書において各成分の濃度又は含有率は、各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、複数種の物質の合計の濃度又は含有率を意味する。

＜幹細胞の細胞老化抑制剤＞
本開示の幹細胞の細胞老化抑制剤（以下、単に「細胞老化抑制剤」ともいう。）は、アスタキサンチンを有効成分として含有する。本開示の細胞老化抑制剤によれば、幹細胞の細胞老化を効果的に抑制することができる。すなわち、本開示によれば、幹細胞の細胞老化を抑制するためのアスタキサンチンの使用もまた提供される。

上述したとおり、細胞老化には、酸化ストレスが関与することが知られている。酸化ストレスの関与は、例えば、培養細胞を過酸化水素で処理すると細胞老化が促進されることからも示唆されている（Chen, Q.M. et al., Biochem. J., 332, pp.43-50 (1998)）。
一方、アスタキサンチン等のカロテノイド類は、活性酸素又はフリーラジカルのうち、一重項酸素及び脂質ラジカルに対しては強い消去能を有するものの、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、及びヒドロキシラジカルの消去能は殆ど有しないことが知られている（眞岡孝至、食品・臨床栄養、第２巻、３頁−１４頁（２００７））。
しかし、本発明者らの実験によって、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた場合の細胞老化が、アスタキサンチンによって抑制されることが明らかとなった。アスタキサンチンがこのような細胞老化抑制効果を奏することは驚くべきことである。

細胞老化の抑制対象となる幹細胞の種類は特に制限されない。幹細胞としては、体性幹細胞（間葉系幹細胞、肺幹細胞、骨髄幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、造血幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、毛母幹細胞、毛包幹細胞、色素幹細胞等）、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。ある実施態様では、細胞老化の抑制対象となる幹細胞は間葉系幹細胞である。

本開示の細胞老化抑制剤を後述する皮膚外用組成物又は機能性飲食品に適用する場合、細胞老化の抑制対象となる幹細胞はヒトの幹細胞であることが好ましい。
一方、本開示の細胞老化抑制剤を後述する細胞老化抑制方法に適用する場合、細胞老化の抑制対象となる幹細胞の由来は特に制限されない。幹細胞の由来生物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物が挙げられる。培養した幹細胞を細胞療法に用いる場合には、幹細胞は、治療対象のヒト（患者）由来の幹細胞であることが好ましい。

本開示の細胞老化抑制剤による細胞老化抑制効果は、公知の分子マーカーにより確認することができる。
本開示の細胞老化抑制剤としては、ｐ１６、ｐ２１、γＨ２ＡＸ、ＩＧＦＢＰ−４、及びＩＧＦＢＰ−７からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現を抑制するものが好ましい。ｐ１６及びｐ２１は、細胞分裂に関与するサイクリンキナーゼの阻害因子として知られている。γＨ２ＡＸは、ヒストンＨ２ＡＸのアミノ酸配列の１３９番目のセリン残基がリン酸化されたものであり、細胞老化を引き起こすＤＮＡ損傷の分子マーカーとして知られている。ＩＧＦＢＰ−４及びＩＧＦＢＰ−７は、ＩＧＦに結合し、細胞老化を誘引することが知られている。特に、本開示の細胞老化抑制剤としては、ｐ１６及びｐ２１のタンパク質の発現を抑制するものがより好ましい。細胞老化の経路のうちｐ１６が関与する経路とｐ２１が関与する経路との両者を抑制することにより、幹細胞の細胞老化をより効果的に抑制することができる。

（アスタキサンチン）
本開示の細胞老化抑制剤は、アスタキサンチンを有効成分として含有する。
アスタキサンチンは、化学名：３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン−４，４’−ジオンで表される化合物である。アスタキサンチンは、３位及び３’位のヒドロキシ基の立体配置により、（３Ｒ，３’Ｒ）体、（３Ｒ，３’Ｓ）体、及び（３Ｓ，３’Ｓ）体の３種の異性体が存在し、さらに分子内の共役二重結合の存在によりシス体及びトランス体の異性体も存在する。本開示の細胞老化抑制剤に含有されるアスタキサンチンは、これら異性体のいずれであってもよく、複数種の異性体の混合物であってもよい。
また、アスタキサンチンは、３位及び３’位のヒドロキシ基の少なくとも一方が脂肪酸等とエステルを形成したエステル体であってもよく、複数種のエステル体の混合物であってもよい。
本開示では、特に断らない限り、アスタキサンチンのエステル体を含めて「アスタキサンチン」と総称する。

アスタキサンチンは、植物類、藻類、甲殻類、バクテリア等の天然物から精製して得られるものであってもよく、合成により得られるものであってもよい。アスタキサンチンは、Enzo Life Sciences社等から市販品を入手することもできる。

また、アスタキサンチンは、アスタキサンチンを含有する天然物からの抽出物として、本開示の細胞老化抑制剤中に含有されていてもよい。アスタキサンチンを含有する抽出物としては、ヘマトコッカス藻抽出物、オキアミ抽出物、ファフィア酵母抽出物等が挙げられる。これらの中でも、アスタキサンチンの安定性等の観点から、ヘマトコッカス藻抽出物が好ましい。

ヘマトコッカス藻抽出物の原料としては、具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（Haematococcus capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス（Haematococcus droebakensis）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Haematococcus zimbabwiensis）等が挙げられる。

ヘマトコッカス藻抽出物は、上記の原料を、必要に応じて細胞壁を破砕して、アセトン、エーテル、クロロホルム、アルコール等の有機溶剤、又は超臨界二酸化炭素等の抽出媒体を加えて抽出することによって得ることができる。

また、ヘマトコッカス藻抽出物は、市販品を用いることもできる。ヘマトコッカス藻抽出物の市販品としては、富士フイルム（株）のＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−ＳＳ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−Ｓ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−１０ＯＳ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−５ＯＳ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−１０Ｏ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−５Ｏ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−２．０ＰＷ、ＡＳＴＯＴＳ（登録商標）−３．０ＭＢ等；アスタリール（株）のアスタリール（登録商標）オイル５０Ｆ、アスタリール（登録商標）オイル５Ｆ、アスタリール（登録商標）パウダー２０Ｆ等；東洋酵素化学（株）のＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標）ＳＣＥ７、ＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標）ＳＣＥ１０等；Algatechnologies社のＡｓｔａＰｕｒｅ；などが挙げられる。

ヘマトコッカス藻抽出物中のアスタキサチンの色素純分としての含有率は、例えば、０．００１質量％〜６０質量％であることが好ましく、０．０１質量％〜５０質量％であることがより好ましい。
また、ヘマトコッカス藻抽出物中のアスタキサチンの合計に占めるエステル体の割合は、例えば、５０モル％以上であることが好ましく、７５モル％以上であることがより好ましく、９０％モル以上であることがさらに好ましい。

（トコフェロール類）
本開示の細胞老化抑制剤は、さらに、トコフェロール類を有効成分として含有していてもよい。本開示の細胞老化抑制剤がトコフェロール類を含有することにより、幹細胞の細胞老化をより効果的に抑制することができる傾向にある。

トコフェロール類としては、特に制限されず、トコフェロール；酢酸トコフェロール、ニコチン酸トコフェロール、リノール酸トコフェロール、オレイン酸トコフェロール、コハク酸トコフェロール等のトコフェロール誘導体；トコトリエノール；酢酸トコトリエノール等のトコトリエノール誘導体；などが挙げられる。本開示の細胞老化抑制剤は、トコフェロール類を１種単独で含有していてもよく、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。

本開示の細胞老化抑制剤は、これらのトコフェロール類の中でも、ニコチン酸トコフェロールを含有することが好ましい。ニコチン酸トコフェロールは、細胞老化の経路のうちｐ１６が関与する経路を抑制する効果に優れている。一方、アスタキサンチンは、細胞老化の経路のうちｐ２１が関与する経路を抑制する効果に優れている。このため、本開示の細胞老化抑制剤がアスタキサンチンとニコチン酸トコフェロールとの両者を含有することにより、幹細胞の細胞老化をより効果的に抑制することができる。

アスタキサンチンの含有量に対するトコフェロール類（好ましくはニコチン酸トコフェロール）の含有量の割合（トコフェロール類の含有量／アスタキサンチンの含有量）は特に制限されず、例えば、質量基準で０．０００１〜１００００であることが好ましく、０．００１〜１０００であることがより好ましい。

（その他の成分）
本開示の細胞老化抑制剤は、必要に応じて、アスタキサンチン及びトコフェロール類以外のその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、公知の抗酸化剤（アスコルビン酸及びその誘導体等）などが挙げられる。

＜幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物＞
本開示の幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物（以下、単に「皮膚外用組成物」ともいう。）は、本開示の細胞老化抑制剤を含有する。

本開示の皮膚外用組成物中における細胞老化抑制剤の含有率は、幹細胞の細胞老化抑制効果が奏される限り特に制限されない。本開示の皮膚外用組成物中におけるアスタキサンチンの含有率は、例えば、０．０００００１質量％〜０．２質量％であることが好ましく、０．０００００５質量％〜０．１質量％であることがより好ましく、０．００００１質量％〜０．０５質量％であることがさらに好ましい。

本開示の皮膚外用組成物は、本開示の細胞老化抑制剤を含有することにより、幹細胞の細胞老化抑制効果を発揮する。

例えば、本開示の皮膚外用組成物を顔等の皮膚に適用し、皮膚に存在する間葉系幹細胞の細胞老化を抑制することで、皮膚の老化に伴うシワ、たるみ等の改善を期待し得る。
この点について本発明者らは以下のように考えている。
一般的な皮膚科学においては、ケラチノサイト等の表皮細胞に着目した細胞老化抑制の研究が進められている。これに対し、本発明者らは、幹細胞に着目した細胞老化抑制の研究を進めた結果、驚くべきことに、幹細胞の細胞老化を抑制することが表皮細胞の細胞老化を抑制することよりも効果的であることを見出した。幹細胞は、表皮細胞よりもターンオーバーの遅い細胞であることから、幹細胞の細胞老化を抑制することで、より効果的に皮膚の老化を抑制できるものと考えられる。

また、本開示の皮膚外用組成物を頭皮に適用し、頭皮に存在する毛母幹細胞、毛包幹細胞等の細胞老化を抑制することで、脱毛又は薄毛の治療又は予防も期待し得る。

本開示の皮膚外用組成物は、細胞老化抑制剤以外に、皮膚外用組成物に通常用いられる添加成分を適宜含有することができる。このような添加成分としては、油剤、溶剤、界面活性剤、乳化剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、保湿剤、エモリエント剤、ビタミン類、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、着色剤等が挙げられる。

本開示の皮膚外用組成物の形態は特に制限されず、液状、ジェル状、クリーム状等が挙げられる。

本開示の皮膚外用組成物は、化粧料、経皮医薬品、経皮医薬部外品等の用途に適用することができる。化粧料としては、化粧水、美容液、乳液、ローション、クリーム等のスキンケア化粧料が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

＜幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品＞
本開示の幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品（以下、単に「機能性飲食品」ともいう。）は、本開示の細胞老化抑制剤を含有する。ここで、「機能性飲食品」とは、含有される成分に特有の機能に基づいて、生体における所望の生理学的作用を期待し得る飲食品を意味する。

本開示の機能性飲食品中における細胞老化抑制剤の含有率は、幹細胞の細胞老化抑制効果が奏される限り特に制限されない。本開示の機能性飲食品中におけるアスタキサンチンの含有率は、例えば、０．０００００１質量％〜０．５質量％であることが好ましく、０．０００００５質量％〜０．２質量％であることがより好ましく、０．００００１質量％〜０．１質量％であることがさらに好ましい。

本開示の機能性飲食品は、本開示の細胞老化抑制剤を含有することにより、幹細胞の細胞老化抑制効果を発揮する。本開示の機能性飲食品を摂取することにより、各種組織の恒常性維持の効果を期待し得る。

本開示の機能性飲食品は、細胞老化抑制剤以外に、機能性飲食品に通常用いられる添加成分を適宜含有することができる。このような添加成分としては、蛋白質、オリゴペプチド、アミノ酸、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、甘味料、香料、着色剤等が挙げられる。

本開示の機能性飲食品の形態は特に制限されず、栄養食、半消化態栄養食、自然流動食、ドリンク剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

＜幹細胞の細胞老化抑制方法＞
本開示の幹細胞の細胞老化抑制方法（以下、単に「細胞老化抑制方法」ともいう。）は、本開示の細胞老化抑制剤の存在下で幹細胞を培養することを含む。例えば、本開示の細胞老化抑制剤を含有する培地中で幹細胞を培養することにより、幹細胞の細胞老化を効果的に抑制することができる。本開示の細胞老化抑制方法によれば、幹細胞の細胞老化による機能低下を抑制しながら、幹細胞をin vitroで増殖させることが可能となる。

幹細胞としては、体性幹細胞（間葉系幹細胞、肺幹細胞、骨髄幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、造血幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、毛母幹細胞、毛包幹細胞、色素幹細胞等）、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。
幹細胞の由来生物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物が挙げられる。培養した幹細胞を細胞療法に用いる場合には、幹細胞は、治療対象のヒト（患者）由来の幹細胞であることが好ましい。

幹細胞を培養する際の培地中における細胞老化抑制剤の含有率は、幹細胞の細胞老化抑制効果が奏される限り特に制限されない。培地中におけるアスタキサンチンの含有率は、例えば、０．００００１質量ｐｐｍ〜１０質量ｐｐｍであることが好ましく、０．０００１質量ｐｐｍ〜５質量ｐｐｍであることがより好ましく、０．０００５質量ｐｐｍ〜０．１質量ｐｐｍであることがさらに好ましい。

幹細胞を培養する培地は特に制限されず、幹細胞の種類に応じて、既知の基本培地に必要に応じて添加剤を加えたものを用いることができる。基本培地としては、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium）、ＭＥＭα（Minimum Essential Medium Alpha modification）、ＲＰＭＩ１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640）培地、ＨａｍＦ１２（Ham's F12）培地等が挙げられる。添加剤としては、血清（ウシ胎仔血清等）、アミノ酸（Ｌ−グルタミン酸等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）などが挙げられる。

幹細胞の培養条件は特に制限されず、３７℃かつ５ｖ／ｖ％ＣＯ_２等の公知の培養条件を採用することができる。

以下、本発明の実施形態をさらに具体的に説明する。但し、本発明の実施形態は、その主旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

以下の実施例及び参考例において、幹細胞としては、ヒト間葉系幹細胞（Lonza社）を使用した。また、培地としては、間葉系幹細胞用培地（Mesenchymal Stem Cell Basal Medium、Lonza社）を使用した。

以下の説明中、濃度に関する「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。
また、以下の説明中、「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）を意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝液（Phosphate Buffered Saline）を意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）を意味し、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate）を意味し、「ＰＶＤＦ」はポリフッ化ビニリデン（PolyVinylidene DiFluoride）を意味する。

＜実施例１＞
実施例１では、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた場合の各被験物質による細胞老化抑制効果を、ＩＧＦＢＰ−７を分子マーカーとして評価した。使用した被験物質を下記表１に示す。

まず、ヒト間葉系幹細胞を２５００個／ｃｍ^２の細胞密度で４８ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、１ｍＭ過酸化水素を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、３０分間培養した。次いで、間葉系幹細胞用培地にて１回洗浄した後、各被験物質を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。その間、２日〜３日毎に培地交換を行った。培養５日目に間葉系幹細胞用培地に培地交換して２４時間培養した後、培地を回収した。

次いで、回収した培地中のＩＧＦＢＰ−７の濃度をＥＬＩＳＡキット（R&D Systems社）により測定した。さらに、細胞増殖測定用キット（Cell Counting Kit-8、（株）同仁化学研究所）を用いて細胞増殖率を測定し、細胞増殖率の測定値によってＩＧＦＢＰ−７の濃度の測定値を補正した。そして、被験物質を適用しないコントロールに対するＩＧＦＢＰ−７の抑制率を算出した。
なお、各被験物質の適用濃度としては、細胞増殖率が１０％以上抑制されない濃度を上限とし、ＩＧＦＢＰ−７の抑制率が最も高かった濃度を採用した。

ＩＧＦＢＰ−７の抑制率を算出する手順の詳細は、下記（１）〜（４）のとおりである。
（１）各被験物質について同条件のサンプルを５つ以上（すなわち、ｎ≧５）調製した後、回収した培地中のＩＧＦＢＰ−７の濃度を測定する。
（２）上記（１）の測定結果のうち、最高値及び最低値をそれぞれ１点ずつ除き、残りのサンプル（３サンプル以上）の値を採用する。
（３）上記（２）で採用された各サンプルのＩＧＦＢＰ−７の濃度を細胞増殖率の測定値で補正し、コントロールに対するＩＧＦＢＰ−７の抑制率を下記式に従って算出する。なお、抑制率が０％未満の場合は、ＩＧＦＢＰ−７の分泌が促進されたこと、すなわち細胞老化が促進されたことを意味する。
ＩＧＦＢＰ−７の抑制率（％）＝｛（細胞増殖率による補正後のコントロールの値）−（細胞増殖率による補正後のサンプルの値）｝／（細胞増殖率による補正後のコントロールの値）×１００
（４）上記（１）及び（２）を各被験物質について３回繰り返し、上記（３）によって算出されたＩＧＦＢＰ−７の抑制率（３サンプル×３回以上）を算術平均する。

各被験物質を適用した場合のＩＧＦＢＰ−７の抑制率を下記表２に示す。

表２に示すとおり、アスタキサンチンは、他の被験物質と比較して適用濃度が顕著に低いにも関わらず、ＩＧＦＢＰ−７の抑制率が最も高かった。この結果から、アスタキサンチンは、他の被験物質と比較して細胞老化抑制効果が顕著に優れることが分かる。

＜実施例２＞
実施例２では、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた場合のアスタキサンチン単独、又はアスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせによる細胞老化抑制効果を、γＨ２ＡＸを分子マーカーとして評価した。

まず、ヒト間葉系幹細胞を５０００個／ｃｍ^２の細胞密度で３５ｍｍマルチウェルガラスボトムディッシュ（ウェルサイズ：９．５ｍｍ、カバーガラス厚：０．１５ｍｍ〜０．１８ｍｍ、ポリ−Ｌ−リシンコート）に播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、１ｍＭ過酸化水素を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、３０分間培養した。次いで、間葉系幹細胞用培地にて１回洗浄した後、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチン、又は０．０００５質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．０５質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。６時間培養後、ＰＢＳにて２回洗浄した。

次いで、４ｗ／ｖ％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで１５分間処理することにより細胞を固定し、ＰＢＳで１回洗浄した。０．２ｖ／ｖ％ Triton-X 100含有ＰＢＳで１５分間処理して膜透過処理を行った後、ＰＢＳで１回洗浄した。１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間処理することによりブロッキングを行い、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、抗γＨ２ＡＸウサギポリクローナル抗体（Abcam社）を５００倍希釈した溶液を添加して、４℃で終夜反応させた。さらに、０．０５ｖ／ｖ％ Tween 20含有ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄した後、緑色蛍光色素で標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Abcam社）を２５０倍希釈した溶液で１時間反応させた。その後、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡観察した。細胞内のγＨ２ＡＸは、細胞核の緑色蛍光強度を測定することにより定量した。

γＨ２ＡＸの発現量の定量結果を図１に示す。図１は、過酸化水素によって酸化ストレスを与えない場合のγＨ２ＡＸの発現量を１とした相対値で示したものである。図１に示すとおり、過酸化水素によって酸化ストレスを与えることで、細胞内のγＨ２ＡＸの発現量は約２．５倍に増加した。しかし、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチンを適用した場合には、γＨ２ＡＸの発現量が約３０％減少し、０．０００５質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．０５質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、γＨ２ＡＸの発現量が約５３％減少した。

なお、アスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせ以外の２種の被験物質の組み合わせについても、上記と同様にして細胞老化抑制効果を評価した。その結果、アスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせが最も有効であることが確認された。

＜実施例３＞
実施例３では、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた場合のアスタキサンチン単独、又はアスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせによる細胞老化抑制効果を、ｐ２１を分子マーカーとして評価した。

まず、ヒト間葉系幹細胞を２５００個／ｃｍ^２の細胞密度で６ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、１ｍＭ過酸化水素を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、３０分間培養した。次いで、間葉系幹細胞用培地にて１回洗浄した後、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチン、又は０．０００５質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．１質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。その間、２日〜３日毎に培地交換を行った。４日間〜５日間の培養後、細胞を回収して可溶化し、ウェスタンブロッティングに供した。

各レーンにつき２０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに展開した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング剤（Blocking One、ナカライテスク（株））で１時間処理することによりブロッキングを行った後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄した。次いで、抗ｐ２１ウサギモノクローナル抗体（Abcam社）を５００倍希釈した溶液を添加して、４℃で終夜反応させた。また、内部標準として、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社）を２００００倍希釈した溶液を添加して、室温で１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、それぞれ２次抗体に反応させた。ｐ２１のバンドの濃さを画像解析し、β−アクチンのバンドの濃さにて補正した。

その結果、被験物質を適用しなかった場合と比較して、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチンを適用した場合には、ｐ２１の発現量が約３３％減少し、０．０００５質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．１質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、ｐ２１の発現量が約３８％減少したことが確認された。

＜実施例４＞
実施例４では、過酸化水素によって幹細胞に酸化ストレスを与えた場合におけるアスタキサンチン単独、又はアスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールの組み合わせによる細胞老化抑制効果を、細胞増殖率により評価した。

まず、ヒト間葉系幹細胞を２５００個／ｃｍ^２の細胞密度で４８ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、１ｍＭ過酸化水素を添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、３０分間培養した。次いで、間葉系幹細胞用培地にて１回洗浄した後、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチン、又は０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．０５質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。その間、２日〜３日毎に培地交換を行った。４日間の培養後、細胞増殖測定用キット（Cell Counting Kit-8、（株）同仁化学研究所）を用いて細胞増殖率を測定した。

細胞増殖率の測定結果を図２に示す。図２は、被験物質を適用していない場合の細胞増殖率を１とした相対値で示したものである。図２に示すとおり、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチンを適用した場合には、細胞増殖率が約１１％亢進し、０．００２質量ｐｐｍアスタキサンチン及び０．０５質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、細胞増殖率が約１９％亢進した。この結果は、実施例３においてｐ２１の発現量が減少した結果と整合するものであった。

＜参考例１＞
参考例１では、幹細胞の継代を繰り返した場合のニコチン酸トコフェロールによる細胞老化抑制効果を、ｐ１６を分子マーカーとして評価した。

まず、６継代目〜８継代目のヒト間葉系幹細胞を２５００個／ｃｍ^２の細胞密度で６ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、０．１質量ｐｐｍ又は０．３質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、６日間培養した。その間、２日〜３日毎に培地交換を行った。培養後、細胞を回収して可溶化し、ウェスタンブロッティングに供した。

各レーンにつき２０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに展開した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング剤（Blocking One、ナカライテスク（株））で１時間処理することによりブロッキングを行った後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄した。次いで、抗ｐ１６ウサギモノクローナル抗体（Abcam社）を１０００倍希釈した溶液を添加して、４℃で終夜反応させた。また、内部標準として、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社）を２００００倍希釈した溶液を添加して、室温で１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄した後、それぞれ２次抗体に反応させた。ｐ１６のバンドの濃さを画像解析し、β−アクチンのバンドの濃さにて補正した。

ｐ１６のウェスタンブロッティングの結果を図３に示す。図３は、被験物質を適用しなかった場合のｐ１６の発現量を１とした相対値で示したものである。図３に示すとおり、被験物質を適用しなかった場合と比較して、０．１質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、ｐ１６の発現量が約１４％減少し、０．３質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、ｐ１６の発現量が約２７％減少した。

＜参考例２＞
参考例２では、幹細胞の継代を繰り返した場合のニコチン酸トコフェロールによる細胞老化抑制効果を、ＩＧＦＢＰ−４を分子マーカーとして評価した。

まず、６継代目〜８継代目のヒト間葉系幹細胞を２５００個／ｃｍ^２の細胞密度で４８ウェルプレートに播種し、間葉系幹細胞用培地中で培養した。細胞を播種した翌日に、０．１質量ｐｐｍ又は０．３質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを添加した間葉系幹細胞用培地に培地交換し、培養を継続した。その間、２日〜３日毎に培地交換を行った。培養５日目に間葉系幹細胞用培地に培地交換して２４時間培養した後、培地を回収した。

回収した培地中のＩＧＦＢＰ−４の含有率をＥＬＩＳＡキット（R&D Systems社）により測定した。さらに、細胞増殖測定用キット（Cell Counting Kit-8、（株）同仁化学研究所）を用いて細胞増殖率を測定し、細胞増殖率の測定値によってＩＧＦＢＰ−４の濃度の測定値を補正した。

その結果、被験物質を適用しなかった場合と比較して、０．１質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、ＩＧＦＢＰ−４の発現量が約１０％減少し、０．３質量ｐｐｍニコチン酸トコフェロールを適用した場合には、ＩＧＦＢＰ−４の発現量が約１３％減少したことが確認された。

Claims

アスタキサンチン及びニコチン酸トコフェロールを有効成分として含有する間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤。
アスタキサンチンの含有量とニコチン酸トコフェロールの含有量との比（ニコチン酸トコフェロールの含有量／アスタキサンチンの含有量）が質量基準で０．００１〜１０００である請求項１に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤。
ｐ１６、ｐ２１、γＨ２ＡＸ、ＩＧＦＢＰ−４、及びＩＧＦＢＰ−７からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現を抑制する請求項１又は請求項２に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤。
ｐ１６及びｐ２１のタンパク質の発現を抑制する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤。
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤を含有する間葉系幹細胞の細胞老化抑制用皮膚外用組成物。
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤を含有する間葉系幹細胞の細胞老化抑制用機能性飲食品。
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞の細胞老化抑制剤の存在下で間葉系幹細胞を培養することを含む間葉系幹細胞の細胞老化抑制方法。但し、人間を治療する方法を除く。