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JP6384929B2 - ターゲット分析用具およびターゲット分析方法 - Google Patents

ターゲット分析用具およびターゲット分析方法 Download PDF

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Description

本発明は、ターゲット分析用具およびターゲット分析方法に関する。
ターゲットの分析においては、一般的に、前記ターゲットに対する結合性を有する結合物質を使用し、前記ターゲットと前記結合物質との結合体を形成させ、これを直接的または間接的に検出することによって、ターゲットの有無または量を分析できる（特許文献１、特許文献２）。
しかし、このように結合物質を使用した分析方法においては、前記ターゲットと結合した結合物質と前記ターゲットに未結合の結合物質との分離が必要とされているため、一つの分析用具内で一連の処理を行い、ターゲットを検出することが困難である。
特表２０１４−５０７６７０号公報 特表２００７−５１８９９４号公報
そこで、本発明の目的は、ターゲットを簡便に分析するためのターゲット分析用具を提供することにある。
本発明の第１のターゲット分析用具は、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質が担体に固定化された固定化第１結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に結合する第２結合物質に標識物質が付加された標識化第２結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第２結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第１のターゲット分析方法は、前記本発明の第１のターゲット分析用具を使用し、
前記ターゲット分析用具の前記第１室に、試料を保持した試料保持用具を挿入する工程、
前記第１室において、前記第１試薬と前記試料とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第１試薬である前記固定化第１結合物質とを結合させる工程、
前記第１室内の前記試料保持用具を、前記第１室と前記第２室との間の第１隔壁に接触させ、前記隔壁を破壊し、前記第２室に、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物を導入する工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物とを接触させ、前記固定化第１結合物質と前記第２試薬である前記標識化第２結合物質とを結合させる工程、
未結合の前記標識化第２結合物質を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記標識化第２結合物質における前記標識物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の第２のターゲット分析用具は、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に標識物質が結合した標識化第１結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に結合する第２結合物質が担体に固定化された固定化第２結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第１結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁または前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第２のターゲット分析方法は、前記本発明の第２のターゲット分析用具を使用し、
前記ターゲット分析用具の前記第１室に、試料を保持した試料保持用具を挿入する工程、
前記第１室において、前記第１試薬と前記試料とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第１試薬である前記標識化第１結合物質とが結合した第１結合体を形成させる工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物とを接触させ、前記混合物中の前記ターゲットに未結合の前記標識化第１結合物質を前記第２試薬である前記固定化第２結合物質に結合させる工程、
前記第１結合体を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記第１結合体における前記標識化第１結合物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の第３のターゲット分析用具は、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に結合する第２結合物質に標識物質が付加された標識化第２結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質が担体に固定化された固定化第１結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第２結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁または前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第３のターゲット分析方法は、前記本発明の第３のターゲット分析用具を使用し、
試料を保持した試料保持用具を前記ターゲット分析用具の前記第１室に挿入する工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物と接触させ、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記固定化第１結合物質とを結合させ、且つ、未結合の前記固定化第１結合物質と前記１試薬である前記標識化第２結合物質とを結合させる工程、
未結合の前記標識化第２結合物質を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記標識化第２結合物質における前記標識物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の第４のターゲット分析用具は、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に結合する第２結合物質が担体に固定化された固定化第２結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に標識物質が結合した標識化第１結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第１結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第４のターゲット分析方法は、前記本発明の第４のターゲット分析用具を使用し、
試料を保持した試料保持用具を前記ターゲット分析用具の前記第１室に挿入後、前記第１室と前記第２室との前記第１隔壁に接触させ、前記第２室に前記試料と前記第１試薬とを導入する工程、
前記第２室において、前記試料と前記第１試薬と前記第２試薬とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記標識化第１結合物質とが結合した第１結合体を形成させ、且つ前記ターゲットに未結合の前記標識化第１結合物質を前記第１試薬である前記固定化第２結合物質に結合させる工程、
前記第１結合体を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記第１結合体における前記標識化第１結合物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析用具によれば、簡便に試料中のターゲットを分析することができる。
図１は、本発明の第１のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図２は、本発明の第１のターゲット分析用具を用いた分析方法の一例を示す概略図である。 図３は、本発明の第２のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図４は、本発明の第２のターゲット分析用具を用いた分析方法の一例を示す概略図である。 図５は、本発明の第２のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図６は、本発明の実施例１における吸光度を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例１における吸光度を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例２における標識化相補鎖の回収割合を示すグラフである。 図９は、本発明の第２のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図１０は、本発明の第３のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図１１は、本発明の第３のターゲット分析用具を用いた分析方法の一例を示す概略図である。 図１２は、本発明の第４のターゲット分析用具の一例を示す概略図である。 図１３は、本発明の第４のターゲット分析用具を用いた分析方法の一例を示す概略図である。 図１４は、本発明の実施例３における発光量を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例４における発光量を示すグラフである。 図１６は、本発明の実施例５における発光量を示すグラフである。 図１７は、本発明の実施例６における発光量を示すグラフである。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記固定化第１結合物質における前記担体が、ビーズである。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第２結合物質における前記標識物質が、酵素、核酸、蛍光物質、色素物質、発光物質、放射性物質、および電子供与体からなる群から選択された少なくとも１つの物質である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記試料保持用具は、棒状の把持部および試料の保持部を含み、前記把持部の先端に前記保持部を有する。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記固定化第１結合物質における前記第１結合物質が、アプタマーである。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第２結合物質における前記第２結合物質が、前記アプタマーに相補的な核酸分子である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第２結合物質における前記標識物質が、触媒機能を示す核酸分子である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記触媒機能を示す核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅおよびＲＮＡｚｙｍｅの少なくとも一方である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記第２室は、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含む。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記吸着担体が、シリカ製ビーズである。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記固定化第１結合物質における前記第１結合物質が、前記ターゲットを抗原とする抗体であり、前記標識化第２結合物質における前記第２結合物質が、前記抗体を抗原とする抗体である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有し、
前記内筒が、前記外筒の内部に収容でき、
前記内筒が、前記第１室および前記第２室を有し、
前記外筒の内部に前記内筒を収容した際、前記外筒の底部と前記内筒の底部との間に空間を有する。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記第１室が、前記第２室とは反対側で、前処理室に連続して配置され、
前記前処理室は、
その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能であり、
前記試料から、前記試料内部の成分を抽出する抽出液を含み、
前記前処理室と前記第１室の間に、隔壁を有し、
前記隔壁は、前記前処理室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁である。
本発明の第１および第３のターゲット分析用具は、例えば、前記前処理室は、前記第１室との前記隔壁の反対側に、前記前処理室の開口のカバーを有し、
前記カバーは、その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第１結合物質における前記第１結合物質が、アプタマーであり、前記固定化第２結合物質における前記第２結合物質が、前記アプタマーに相補的な核酸分子である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第１結合物質における前記標識物質が、酵素、核酸、蛍光物質、色素物質、発光物質、放射性物質、および電子供与体からなる群から選択された少なくとも１つの物質である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記標識化第１結合物質における前記標識物質が、触媒機能を示す核酸分子である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記触媒機能を示す核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅおよびＲＮＡｚｙｍｅの少なくとも一方である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記固定化第２結合物質における前記担体が、ビーズである。
本発明の第２のターゲット分析用具は、例えば、前記固定化第２結合物質における前記担体が、前記第２室の内壁である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記試料保持用具は、棒状の把持部および試料の保持部を含み、前記把持部の先端に前記保持部を有する。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記第２室は、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含む。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記吸着担体が、シリカ製ビーズである。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有し、
前記内筒が、前記外筒の内部に収容でき、
前記内筒が、前記第１室および前記第２室を有し、
前記外筒の内部に前記内筒を収容した際、前記外筒の底部と前記内筒の底部との間に空間を有する。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記第１室が、前記第２室とは反対側で、前処理室に連続して配置され、
前記前処理室は、
その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能であり、
前記試料から、前記試料内部の成分を抽出する抽出液を含み、
前記前処理室と前記第１室の間に、隔壁を有し、
前記隔壁は、前記前処理室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁である。
本発明の第２および第４のターゲット分析用具は、例えば、前記前処理室が、前記第１室との前記隔壁の反対側に、前記前処理室の開口のカバーを有し、
前記カバーは、その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能である。
本発明の第２および第３のターゲット分析方法は、例えば、前記第１室内の前記試料保持用具を、前記第１室と前記第２室との間の第１隔壁に接触させ、前記隔壁を破壊し、前記第２室に、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物を導入する工程を含む。
本発明の第３のターゲット分析方法は、例えば、前記試料保持具を前記第１室に挿入後、前記試料と前記第１試薬とを混合する工程を含む。
本発明の第４のターゲット分析方法は、例えば、前記試料保持用具を前記第１室に挿入することにより、前記試料と前記第１試薬とを混合する工程、および
前記第１室内の前記試料保持用具を、前記第１室と前記第２室との前記第１隔壁に接触させ、前記隔壁を破壊し、前記第２室に、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物を導入する工程を含む。
［第１のターゲット分析用具および第１のターゲット分析方法］
本発明の第１のターゲット分析用具および第１のターゲット分析方法について、以下に、具体的に説明する。なお、特に示さない限り、後述する第２〜４のターゲット分析用具および第２〜４のターゲット分析方法の記載を援用できる。
本発明の第１のターゲット分析用具は、前述のように、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質が担体に固定化された固定化第１結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に結合する第２結合物質に標識物質が付加された標識化第２結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第２結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第１のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明の第１のターゲット分析用具を使用し、
前記ターゲット分析用具の前記第１室に、試料を保持した試料保持用具を挿入する工程、
前記第１室において、前記第１試薬と前記試料とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第１試薬である前記固定化第１結合物質とを結合させる工程、
前記第１室内の前記試料保持用具を、前記第１室と前記第２室との間の第１隔壁に接触させ、前記隔壁を破壊し、前記第２室に、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物を導入する工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物とを接触させ、前記固定化第１結合物質と前記第２試薬である前記標識化第２結合物質とを結合させる工程、
未結合の前記標識化第２結合物質を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記標識化第２結合物質における前記標識物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明によれば、まず、前記第１室において、試料中のターゲットと前記第１試薬である前記固定化第１結合物質とが結合する。そして、前記試料保持用具により前記第１室と前記第２室との間の第１隔壁を破壊すると、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物が、前記第２室に導入される。前記第２室では、前記固定化第１結合物質のうち、ターゲットが未結合の前記固定化第１結合物質に、前記標識化第２結合物質が結合する。そして、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる前記多孔性隔壁であるため、前記固定化第１結合物質は、前記隔壁を通過せずに前記第２室に残る。つまり、前記固定化第１結合物質に結合した前記標識化第２結合物質は、前記第３室に移動することなく前記第２室に残る。他方、前記固定化第１結合物質に未結合の遊離した前記標識化第２結合物質は、前記隔壁を通過して前記第３室に導入される。本発明のターゲット分析用具における前記標識化第２結合物質は、例えば、既知量とすることができるため、前記固定化第１結合物質に未結合の前記標識化第２結合物質の量は、前記試料中のターゲット量と間接的に対応することになる。このため、前記第３室に導入された前記未結合の標識化第２結合物質を検出することによって、間接的に、前記試料中のターゲットの有無または量を分析することができる。
本発明において、分析とは、例えば、前記ターゲットの有無を判断する定性分析でもよいし、前記ターゲットの量を判断する定量分析でもよい。
本発明において使用するターゲットに結合する第１結合物質は、例えば、ターゲットに結合すればよく、その種類は、特に制限されない。前記第１結合物質の具体例としては、例えば、アプタマー、抗体等があげられる。以下に、本発明の第１のターゲット分析用具および前記第１のターゲット分析方法について、アプタマーを使用する第１Ａ形態を、例にあげて説明する。
本発明の第１Ａ形態は、前記固定化第１結合物質における前記第１結合物質として、前記アプタマーを使用する形態である。前記アプタマーは、前記ターゲットに結合できればよい。前記アプタマーは、例えば、ＤＮＡアプタマーでもよいし、ＲＮＡアプタマーでもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとを含むキメラアプタマーでもよい。また、前記アプタマーは、天然核酸からなるアプタマーでもよいし、非天然核酸からなるアプタマーでもよいし、前記天然核酸および前記非天然核酸を含むアプタマーでもよい。また、前記アプタマーは、例えば、修飾アプタマーでもよい。前記アプタマーは、例えば、一本鎖である。
前記標識化第２結合物質における前記第２結合物質は、前記アプタマーに結合可能であればよく、例えば、前記アプタマーに相補的な核酸分子（以下、「相補性核酸分子」ともいう。）があげられる。前記アプタマーに相補的とは、例えば、前記アプタマーまたはその部分配列にハイブリダイズ可能な程度の相補性を有していればよく、相補性１００％には制限されない。前記相補性は、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％である。前記第２結合物質として前記相補的な核酸分子を使用することによって、例えば、前記第１結合体と前記標識化第２結合物質との反応を容易に行うことができることから、反応時間を短縮でき、また、より感度が良く、ダイナミックレンジにも優れる。前記相補的な核酸分子は、例えば、前記ターゲットには非結合であることが好ましい。
前記固定化第１結合物質における前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記ビーズの材質は、特に制限されず、例えば、アガロース、セファロース、セルロース等のポリマー等があげられる。また、前記ビーズは、例えば、磁気ビーズがあげられる。前記磁気ビーズは、例えば、磁性材料からなるビーズ、前記磁性材料を含むビーズでもよいし、その表面が前記磁性材料でコーティングされたビーズでもよい。前記磁性材料としては、例えば、可磁化物質があげられ、具体例としては、例えば、γＦｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４等があげられる。前記ビーズの形状は、特に制限されず、例えば、真球状等の球状があげられる。前記ビーズの平均直径は、特に制限されず、例えば、１〜１０μｍ、１０〜１００μｍ、１００〜１０００μｍである。前記担体としては、例えば、Sepharose、Sephadex等の樹脂も使用できる。
前記固定化第１結合物質において、前記担体に固定化するアプタマーの量は、特に制限されない。前記担体に固定化するアプタマーの量は、例えば、前記担体の表面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。
前記標識化第２結合物質における前記標識物質は、例えば、触媒機能を示す触媒核酸分子、酵素等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等があげられる。本形態において、前記標識物質は、例えば、前記第１結合物質および前記第２結合物質と同様に、前記触媒核酸分子が好ましい。
前記触媒核酸分子は、特に制限されず、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＮＡｚｙｍｅがあげられる。前記標識化第２結合物質における前記触媒核酸分子の触媒機能は、例えば、前記標識化第２結合物質への前記ターゲットの結合の有無にかかわらず、触媒機能を奏することが好ましい。前記結合物質と前記触媒核酸分子との結合形態は、特に制限されず、例えば、ホスホジエステル結合である。また、前記結合物質と前記触媒核酸分子とは、例えば、直接的に結合させてもよいし、リンカーを介して間接的に結合させてもよい。前記リンカーは、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一方からなる核酸分子である。前記触媒核酸分子は、例えば、一本鎖が好ましい。前記標識物質が前記触媒核酸分子の場合、前記触媒核酸分子が、前記標識物質と前記第２結合物質の両方を兼ねてもよい。すなわち、前記触媒核酸分子が前記第１結合物質に相補的であれば、前記触媒核酸分子を前記標識化第２結合物質とすることもできる。
前記試料は、特に制限されず、例えば、食品由来試料等があげられる。前記食品由来試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。前記試料の形態は、特に制限されず、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを前記試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。前記試料は、例えば、前記ターゲットを含む試料でもよいし、前記ターゲットを含まない試料でもよいし、ターゲットを含むか不明の試料であってもよい。
本発明の第１Ａ形態では、例えば、前記第１結合物質としてアプタマー、前記第２結合物質として相補性核酸分子、前記標識物質として触媒核酸分子を使用できることから、例えば、熱安定性であり、保存がより容易である。また、前記標識物質として、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素を使用できることから、例えば、感度よくターゲットを分析できる。
前記第１室と前記第２室との間の第１隔壁は、前述のように、前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁である。前記第１隔壁は、例えば、前記第１室の底部であり、前記第２室の上部であるともいえる。前記第１隔壁は、前記試料保持用具の先端を接触させることで破壊できればよく、その材質や特性等は、特に制限されない。前記第１隔壁としては、例えば、アルミ箔等の金属薄膜、紙、合成繊維等が使用できる。
前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁は、前述のように、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる多孔性隔壁である。前記第２隔壁の孔径は、例えば、前記固定化第１結合物質および前記標識化第２結合物質の大きさに応じて適宜設定できる。前記第２隔壁における孔径は、例えば、０．２〜１００μｍ、０．２〜５０μｍ、０．５〜１０μｍである。
前記標識物質として触媒核酸分子を使用する場合、前記第２室は、前記第２試薬として、さらに、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含むことが好ましい。前記第２室が前記吸着担体を含む場合、前記第２室において、前記吸着担体にタンパク質および脂質等が吸着される。このため、例えば、前記第３室に、前記触媒核酸分子の触媒機能に影響を与えるタンパク質、脂質等が導入することを防止し、前記第３室における前記未結合の標識化第２結合物質の検出を、より精度良く行うことができる。本形態において、前記ターゲットに結合する第１結合物質であるアプタマー、前記第１結合物質に結合する第２結合物質である相補的な核酸分子は、いずれも核酸であることから、核酸以外の成分である、タンパク質および脂質等を前記吸着担体で第２室に保持することで、より精度よくターゲットの分析を行うことができる。
前記吸着担体の材質は、特に制限されず、例えば、シリカ、多孔性構造を有する架橋高分子、活性炭等があげられる。前記吸着担体の形状は、特に制限されず、例えば、ビーズがあげられる。前記吸着担体としては、例えば、シリカ製ビーズが好ましい。前記吸着担体の大きさは、特に制限されず、例えば、前記第２隔壁（多孔性隔壁）を通過できない大きさであることが好ましい。前記吸着担体の大きさは、例えば、前記固定化第１結合物質における前記担体の大きさと同様である。
前記第３室は、前記標識化第２結合物質における前記標識物質が前記触媒性核酸分子または前記酵素の場合、例えば、さらに、その触媒機能に対する基質を含むことが好ましい。前記基質としては、例えば、ＡＴＰとルシフェリンの組合せ、ルミノール反応液等があげられる。
本発明の第１Ａ形態のターゲット分析用具を用いたターゲット分析方法の一例について、図面を用いて、具体的に説明する。なお、本発明は、この例には制限されない。
図１は、前記第１Ａ形態のターゲット分析用具およびそれを用いたターゲット分析方法の概略を示す図面である。ターゲット分析用具１は、第１室１１、第２室１２、第３室１３を有し、第１室１１には、アプタマー１４１がビーズ１４２に固定化された固定化アプタマー１４が配置され、第２室１２には、アプタマー１４１に対する相補鎖１５１にＤＮＡｚｙｍｅ１５２が付加した標識化相補鎖１５、および、シリカ製ビーズ１６が配置されている。第１室１１と第２室１２との間には、第１隔壁１１１を有し、第２室１２と第３室１３との間には、多孔性の第２隔壁１２１を有する。また、試料保持用具１７は、棒状の把持部１７１と試料の保持部１７２とを有し、前記把持部１７１の先端に保持部１７２が配置されている。試料保持用具１７は、保持部１７２で試料を採取する。保持部１７２には、例えば、前記試料中のターゲット１８やターゲット以外の夾雑物１９が付着する。
つぎに、図１のターゲット分析用具１を使用した分析方法について、図２を用いて説明する。図２は、ターゲット分析用具１の使用方法を示す概略図である。
まず、ターゲット分析用具１の第１室１１に、保持部１７２に試料を保持させた試料保持用具１７を挿入し、第１室１１において、試料中のターゲット１８を固定化アプタマー１４のアプタマー１４１に結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜４５℃、時間が、例えば、１０秒〜１０分である。前記両者の結合は、例えば、液体溶媒中で行うことが好ましく、前記液体溶媒は、例えば、水、緩衝液、生理食塩水、これらの混合液等の水性溶媒があげられる。
つぎに、試料保持用具１７により、第１隔壁１１１を破壊し、第１室１１内の内容物を第２室１２に導入する。そして、ビーズ１４２に固定化されたアプタマー１４１のうち、ターゲット１８と未結合であるアプタマー１４１に、標識化相補鎖１５を結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜４５℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
第２隔壁１２１は、固定化アプタマー１４を通過せず、標識化相補鎖１５を通過する多孔性隔壁であるため、標識化相補鎖１５のうち、固定化アプタマー１４に未結合のもののみが、第２隔壁１２１を通過して、第３室１３に導入される。また、第２室１２には、シリカ製ビーズ１６が配置されているため、例えば、試料由来のタンパク質や脂質等の夾雑物１９は、シリカ製ビーズ１６に吸着され、第３室１３への導入が抑制される。そして、第３室１３において、未結合の標識化相補鎖１５について、ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の触媒機能を測定することにより、間接的に、試料中のターゲットを分析できる。ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の触媒機能の測定は、ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の種類に応じて適宜決定できる。
また、本発明の第１のターゲット分析用具は、例えば、さらに、前処理室を備えてもよい。前記前処理室は、例えば、後述する説明を援用できる。
また、本発明の第１のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有してもよい。この場合、前記内筒が、前記外筒の内部に収容でき、前記内筒が、前記第１室および前記第２室を有し、前記外筒の内部に前記内筒を収容した際、前記外筒の底部と前記内筒の底部との間に空間を有する。前記外筒と前記内筒とを有する場合、前記内筒の第２室から前記外筒へ未結合の標識化相補鎖を導入後、前記内筒を取り外すことにより、前記外筒を前記第３室として使用することができる。
［第２のターゲット分析用具および第２のターゲット分析方法］
本発明の第２のターゲット分析用具および第２のターゲット分析方法について、以下に、具体的に説明する。なお、特に示さない限り、前記第１、３および４のターゲット分析用具ならびに前記第１、３および４のターゲット分析方法の記載を援用できる。
本発明の第２のターゲット分析用具は、前述のように、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に標識物質が結合した標識化第１結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に結合する第２結合物質が担体に固定化された固定化第２結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第１結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁または前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質（第１の結合体）が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第２のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明の第２のターゲット分析用具を使用し、
前記ターゲット分析用具の前記第１室に、試料を保持した試料保持用具を挿入する工程、
前記第１室において、前記第１試薬と前記試料とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第１試薬である前記標識化第１結合物質とが結合した第１結合体を形成させる工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物とを接触させ、前記混合物中の前記ターゲットに未結合の前記標識化第１結合物質を前記第２試薬である前記固定化第２結合物質に結合させる工程、
前記第１結合体を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記第１結合体における前記標識化第１結合物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明によれば、まず、前記第１室において、試料中のターゲットと前記第１試薬である前記標識化第１結合物質とが結合する。そして、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物が、前記第２室に導入されると、前記第２室では、前記標識化第１結合物質のうち、ターゲットが未結合の前記第１結合物質に、前記固定化第２結合物質が結合する。そして、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質が通過できる前記多孔性隔壁であるため、前記固定化第２結合物質は、前記隔壁を通過せずに前記第２室に残る。つまり、前記固定化第２結合物質に結合した前記標識化第１結合物質は、前記第３室に移動することなく前記第２室に残る。他方、前記固定化第２結合物質に未結合の遊離した前記標識化第１結合物質、すなわち前記第１結合体を形成している前記標識化第１結合物質は、前記隔壁を通過して前記第３室に導入される。本発明のターゲット分析用具における前記標識化第１結合物質は、例えば、既知量とすることができるため、前記固定化第２結合物質に未結合の前記標識化第１結合物質の量は、前記試料中のターゲット量と間接的に対応することになる。このため、前記第３室に導入された前記未結合の標識化第１結合物質を検出することによって、間接的に、前記試料中のターゲットの有無または量を分析することができる。
本発明において、前記第１隔壁は、例えば、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁でもよいし、前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁でもよい。前者の場合、破壊により、例えば、前記第１室の内容物を前記第２室に移動することができ、後者の場合、前記多孔性隔壁を通じて、前記第１室の内容物を前記第２室に移動することができる。前者の場合、前述のような破壊可能な部材が使用できる。後者の場合、例えば、前記第１室の内容物が通過可能な孔を有する膜が使用できる。
本発明において、分析とは、例えば、前記ターゲットの有無を判断する定性分析でもよいし、前記ターゲットの量を判断する定量分析でもよい。
本発明において使用するターゲットに結合する第１結合物質は、前述のように、例えば、ターゲットに結合すればよく、その種類は、特に制限されない。前記第１結合物質の具体例としては、例えば、アプタマー、抗体等があげられる。以下に、本発明の第２のターゲット分析用具および前記第２のターゲット分析方法について、アプタマーを使用する第２Ａ形態を、例にあげて説明する。
本発明の第２Ａ形態は、前記標識化第１結合物質における前記第１結合物質として、前記アプタマーを使用する形態であり、前記アプタマーは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記固定化第２結合物質における前記第２結合物質は、前記アプタマーに結合可能であればよく、例えば、前記アプタマーに相補的な核酸分子があげられる。前記アプタマーに相補的な核酸分子は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記標識化第１結合物質における前記標識物質は、例えば、触媒機能を示す触媒核酸分子または酵素が好ましく、前記触媒核酸分子および前記酵素は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記固定化第２結合物質における前記担体は、例えば、ビーズでもよいし、前記第２室の内壁でもよい。前記ビーズは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。前記担体が前記ビーズの場合、前記担体（ビーズ）に固定化する第２結合物質の量は、特に制限されず、例えば、前記ビーズの表面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。また、前記担体が前記第２室の内壁の場合、前記担体（内壁）に固定化する第２結合物質の量は、特に制限されず、例えば、前記第２室の内壁の面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。
本発明の第２Ａ形態では、前述のように、前記第１結合物質としてアプタマー、前記第２結合物質として相補性核酸分子、前記標識物質として触媒核酸分子を使用できることから、例えば、熱安定性であり、保存がより容易である。また、前記標識物質として、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素を使用できることから、例えば、感度よくターゲットを分析できる。
前記第１室と前記第２室との間の前記第１隔壁、前記第２室と前記第３室との間の前記第２隔壁は、それぞれ、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第２室は、前記第２試薬として、さらに、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含むことが好ましい。前記吸着担体は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第３室は、例えば、さらに、前記触媒性核酸分子または前記酵素の触媒機能に対する基質を含むことが好ましい。前記基質としては、例えば、ペルオキシダーゼに対する基質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素に対する基質等があげられる。
本発明の第２Ａ形態のターゲット分析用具を用いたターゲット分析方法の一例について、図面を用いて、具体的に説明する。なお、本発明は、この例には制限されない。また、本発明の第２Ａ形態は、特に示さない限り、前記第１Ａ形態の記載を援用できる。
図３は、前記第２Ａ形態のターゲット分析用具およびそれを用いたターゲット分析方法の概略を示す図面である。図３において、図１と同一箇所には同一符号を付している。ターゲット分析用具２は、第１室１１、第２室１２、第３室１３を有し、第１室１１には、アプタマー２４１にＤＮＡｚｙｍｅ２４２が付加した標識化アプタマー２４が配置され、第２室１２には、アプタマー２４１に対する相補鎖２５１がビーズ２５２に固定化された固定化相補鎖２５と、シリカ製ビーズ１６とが配置されている。第１室１１と第２室１２との間には、第１隔壁１１１を有し、第２室１２と第３室１３との間には、多孔性の第２隔壁１２１を有する。
つぎに、図３のターゲット分析用具２を使用した分析方法について、図４を用いて説明する。図４は、ターゲット分析用具２の使用方法を示す概略図である。
まず、ターゲット分析用具２の第１室１１に、保持部１７２に試料を保持させた試料保持用具１７を挿入し、第１室１１において、試料中のターゲット１８を標識化アプタマー２４のアプタマー２４１に結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
つぎに、試料保持用具１７により、第１隔壁１１１を破壊し、第１室１１内の内容物を第２室１２に導入する。そして、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
第２隔壁１２１は、固定化相補鎖２５を通過せず、標識化アプタマー２４を通過する多孔性隔壁であるため、標識化アプタマー２４のうち、固定化相補鎖２５に未結合のもののみが、第２隔壁１２１を通過して、第３室１３に導入される。また、第２室１２には、シリカ製ビーズ１６が配置されているため、例えば、試料由来のタンパク質や脂質等の夾雑物１９は、シリカ製ビーズ１６に吸着され、第３室１３への導入が抑制される。そして、第３室１３において、未結合の標識化アプタマー２４について、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能を測定することにより、間接的に、試料中のターゲットを分析できる。ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能の測定は、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の種類に応じて適宜決定できる。
また、図５に、前記第２Ａ形態のターゲット分析用具について、その他の例の概略図を示す。図５は、特に示さない限り、図３と同様である。図５において、相補鎖２５１は、第２室１２の内壁に固定化されている。第２室１２の内壁に固定化されていることから、第２室１２の内壁に固定化された相補鎖２５１に結合した前記標識化アプタマー２４は、第２室１２から第３室１３に移動することなく、第２室１２にとどまる。
また、本発明の第２のターゲット分析用具は、例えば、さらに、前処理室を備えてもよい。本発明の第２のターゲット分析用具において、前記第１室が、前記第２室とは反対側で、前記前処理室に連続して配置されてもよい。つまり、本発明の第２ターゲット分析用具は、前記前処理室、前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で配置されていることが好ましい。
前記前処理室は、例えば、その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能であり、前記試料から、前記試料内部の成分を抽出する抽出液を含む。前記抽出液は、特に制限されず、分析に供する前記試料の種類、分析対象の成分の種類等によって、適宜選択できる。
本発明の第２のターゲット分析用具は、例えば、前記前処理室と前記第１室の間に、隔壁を有し、前記隔壁は、前記前処理室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁である。前記破壊される隔壁は、例えば、前述と同様であり、例えば、アルミ箔等があげられる。
本発明の第２のターゲット分析用具は、例えば、前記前処理室が、前記第１室との前記隔壁の反対側に、前記前処理室の開口のカバーを有し、前記カバーは、その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能である。前記カバーは、前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁が好ましく、前述と同様の隔壁が例示できる。
また、本発明の第２のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有してもよい。前記外筒および前記内筒は、例えば、前述の説明を援用できる。
本発明の第２のターゲット分析用具および前記第２のターゲット分析方法について、図９を用いて、さらに前記前処理室を備える第２Ｂ形態を例にあげて説明する。この第２Ｂ形態は、前記第２Ａ形態の変形例であり、同様に、前記第１結合物質としてアプタマーを使用し、前記第２結合物質として前記アプタマーに相補的な核酸分子を使用する。なお、前記第２Ｂ形態は、特に示さない限り、前記第２Ａ形態の記載を援用できる。
図９は、前記第２Ｂ形態のターゲット分析用具の概略を示す図面である。図９において、図３および図４と同一箇所には同一符号を付している。ターゲット分析用具１０は、前処理室９１、第１室９２、第２室９３、第３室９４を有する。第１室９２には、アプタマーにＤＮＡｚｙｍｅが付加した標識化アプタマー２４が配置されている。標識化アプタマー２４は、例えば、劣化をより防止できることから、乾燥状態であることが好ましい。第２室９３には、前記アプタマーに対する相補鎖がビーズ（例えば、樹脂でもよい）に固定化された固定化相補鎖２５が充填されている。第３室９４には、ＤＮＡｚｙｍｅの基質９５が配置されており、乾燥状態であることが好ましい。前処理室９１は、その上部の開口を覆うカバー９０１を有し、前処理室９１と第１室９２との間には、隔壁９１１を有し、第１室９２と第２室９３との間には、多孔性の第１隔壁９２１を有し、第２室９３と第３室９４との間には、多孔性の第２隔壁９３１を有する。前処理室９１の内部には、抽出液９６が導入されている。
つぎに、図９のターゲット分析用具１０を使用した分析方法について説明する。
まず、ターゲット分析用具１０に、試料を保持させた試料保持用具１７を挿入し、その先端で、前処理室９１のカバー９０１と隔壁９１１とを貫通させる。これにより、前処理室９１中の抽出液９６が、第１室９２に導入される。そして、第１室９２中で、試料中のターゲット１８との標識化アプタマー２４とを結合させる。この際、ターゲット分析用具を振って、ターゲット１８と標識化アプタマー２４とを混合することが好ましい。
試料保持用具１７において、第１隔壁９２１は多孔性であるため、第１室９２内の内容物が、第１隔壁９２１の孔を通じて、第２室９３に導入される。そして、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。
第２隔壁９３１は、固定化相補鎖２５を通過せず、標識化アプタマー２４を通過する多孔性隔壁であるため、標識化アプタマー２４のうち、固定化相補鎖２５に未結合のもののみが、第２隔壁９３１を通過して、第３室９４に導入される。そして、第３室９４において、未結合の標識化アプタマー２４について、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能を測定することにより、間接的に、試料中のターゲットを分析できる。ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能の測定および第３室９４に配置する基質９５は、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の種類に応じて適宜決定できる。
前記第２Ｂ形態によれば、例えば、試料保持用具１７をワンプッシュし、任意で撹拌するのみで、容易に分析を行うことができる。なお、本実施形態において、ＤＮＡｚｙｍｅに代えて、例えば、酵素を使用しても同様に分析できる。
［第３のターゲット分析用具および第３のターゲット分析方法］
本発明の第３のターゲット分析用具および第３のターゲット分析方法について、以下に、具体的に説明する。なお、特に示さない限り、前記第１、２および４のターゲット分析用具ならびに前記第１、２および４のターゲット分析方法の記載を援用できる。
本発明の第３のターゲット分析用具は、前述のように、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に結合する第２結合物質に標識物質が付加された標識化第２結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質が担体に固定化された固定化第１結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第２結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁または前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第３のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明の第３のターゲット分析用具を使用し、
試料を保持した試料保持用具を前記ターゲット分析用具の前記第１室に挿入する工程、
前記第２室において、前記第２試薬と、前記試料と前記第１試薬との混合物と接触させ、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記固定化第１結合物質とを結合させ、且つ、未結合の前記固定化第１結合物質と前記１試薬である前記標識化第２結合物質とを結合させる工程、
未結合の前記標識化第２結合物質を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記標識化第２結合物質における前記標識物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明によれば、まず、前記第１室において、例えば、試料中のターゲットと前記第１試薬である前記標識化第２結合物質とが混合する。そして、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物が、前記第２室に導入されると、前記第２室では、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記固定化第１結合物質とが結合し、且つ、未結合の前記固定化第１結合物質と前記１試薬である前記標識化第２結合物質とが結合する。そして、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁は、前記固定化第１結合物質が通過できず、前記標識化第２結合物質が通過できる前記多孔性隔壁であるため、前記固定化第１結合物質は、前記隔壁を通過せずに前記第２室に残る。つまり、前記固定化第１結合物質に結合した前記標識化第２結合物質は、前記第３室に移動することなく前記第２室に残る。他方、前記固定化第１結合物質に未結合の遊離した前記標識化第２結合物質は、前記隔壁を通過して前記第３室に導入される。本発明のターゲット分析用具における前記標識化第２結合物質は、例えば、既知量とすることができるため、前記固定化第１結合物質に未結合の前記標識化第２結合物質の量は、前記試料中のターゲット量と間接的に対応することになる。このため、前記第３室に導入された前記未結合の標識化第２結合物質を検出することによって、間接的に、前記試料中のターゲットの有無または量を分析することができる。
本発明において、前記第１隔壁は、例えば、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁でもよいし、前記第１室の内容物を前記第２室に通過できる多孔性隔壁でもよい。前者の場合、破壊により、例えば、前記第１室の内容物を前記第２室に移動することができ、後者の場合、前記多孔性隔壁を通じて、前記第１室の内容物を前記第２室に移動することができる。前者の場合、前述のような破壊可能な部材が使用できる。後者の場合、例えば、前記第１室の内容物が通過可能な孔を有する膜が使用できる。
本発明において、分析とは、例えば、前記ターゲットの有無を判断する定性分析でもよいし、前記ターゲットの量を判断する定量分析でもよい。
本発明において使用するターゲットに結合する第１結合物質は、前述のように、例えば、ターゲットに結合すればよく、その種類は、特に制限されない。前記第１結合物質の具体例としては、例えば、アプタマー、抗体等があげられる。以下に、本発明の第３のターゲット分析用具および前記第３のターゲット分析方法について、アプタマーを使用する第３Ａ形態を、例にあげて説明する。
本発明の第３Ａ形態は、前記固定化第１結合物質における前記第１結合物質として、前記アプタマーを使用する形態であり、前記アプタマーは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記標識化第２結合物質における前記第２結合物質は、前記アプタマーに結合可能であればよく、例えば、前記アプタマーに相補的な核酸分子があげられる。前記アプタマーに相補的な核酸分子は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記標識化第２結合物質における前記標識物質は、例えば、触媒機能を示す触媒核酸分子または酵素が好ましく、前記触媒核酸分子および前記酵素は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記固定化第１結合物質における前記担体は、例えば、ビーズでもよいし、前記第２室の内壁でもよい。前記ビーズは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。前記担体が前記ビーズの場合、前記担体（ビーズ）に固定化するアプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記ビーズの表面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。また、前記担体が前記第２室の内壁の場合、前記担体（内壁）に固定化するアプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記第１室の内壁の面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。
本発明の第３Ａ形態では、前述のように、前記第１結合物質としてアプタマー、前記第２結合物質として相補性核酸分子、前記標識物質として触媒核酸分子を使用できることから、例えば、熱安定性であり、保存がより容易である。また、前記標識物質として、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素を使用できることから、例えば、感度よくターゲットを分析できる。
前記第１室と前記第２室との間の前記第１隔壁、前記第２室と前記第３室との間の前記第２隔壁は、それぞれ、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第２室は、前記第２試薬として、さらに、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含むことが好ましい。前記吸着担体は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第３室は、例えば、さらに、前記触媒性核酸分子または前記酵素の触媒機能に対する基質を含むことが好ましい。前記基質としては、例えば、ペルオキシダーゼに対する基質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素に対する基質等があげられる。
本発明の第３Ａ形態のターゲット分析用具を用いたターゲット分析方法の一例について、図面を用いて、具体的に説明する。なお、本発明は、この例には制限されない。また、本発明の第３Ａ形態は、特に示さない限り、前記第１Ａおよび２Ａ形態の記載を援用できる。
図１０は、前記第３Ａ形態のターゲット分析用具およびそれを用いたターゲット分析方法の概略を示す図面である。図１０において、図１と同一箇所には同一符号を付している。ターゲット分析用具３は、第１室１１、第２室１２、第３室１３を有し、第１室１１には、アプタマー１４１に対する相補鎖１５１にＤＮＡｚｙｍｅ１５２が付加した標識化相補鎖１５が配置され、第２室１２には、アプタマー１４１がビーズ１４２に固定化された固定化アプタマー１４と、シリカ製ビーズ１６とが配置されている。第１室１１と第２室１２との間には、第１隔壁１１１を有し、第２室１２と第３室１３との間には、多孔性の第２隔壁１２１を有する。
つぎに、図１０のターゲット分析用具３を使用した分析方法について、図１１を用いて説明する。図１１は、ターゲット分析用具３の使用方法を示す概略図である。
まず、ターゲット分析用具３の第１室１１に、保持部１７２に試料を保持させた試料保持用具１７を挿入し、第１室１１において、試料中のターゲット１８と標識化相補鎖１５とを混合させる。前記両者の混合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
つぎに、試料保持用具１７により、第１隔壁１１１を破壊し、第１室１１内の内容物を第２室１２に導入する。そして、前記内容物中のターゲット１８を固定化アプタマー１４に結合させ、また、固定化アプタマー１４のうち、ターゲット１８と未結合である固定化アプタマー１４を、標識化相補鎖１５に結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
第２隔壁１２１は、固定化アプタマー１４を通過せず、標識化相補鎖１５を通過する多孔性隔壁であるため、標識化相補鎖１５のうち、固定化アプタマー１４に未結合のもののみが、第２隔壁１２１を通過して、第３室１３に導入される。また、第２室１２には、シリカ製ビーズ１６が配置されているため、例えば、試料由来のタンパク質や脂質等の夾雑物１９は、シリカ製ビーズ１６に吸着され、第３室１３への導入が抑制される。そして、第３室１３において、標識化相補鎖１５について、ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の触媒機能を測定することにより、間接的に、試料中のターゲットを分析できる。ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の触媒機能の測定は、ＤＮＡｚｙｍｅ１５２の種類に応じて適宜決定できる。
また、本発明の第３のターゲット分析用具は、例えば、さらに、前処理室を備えてもよい。前記前処理室は、例えば、前述の説明を援用できる。また、本発明の第３のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有してもよい。前記外筒および前記内筒は、例えば、前述の説明を援用できる。
［第４のターゲット分析用具および第４のターゲット分析方法］
本発明の第４のターゲット分析用具および第４のターゲット分析方法について、以下に、具体的に説明する。なお、特に示さない限り、前記第１〜３のターゲット分析用具ならびに前記第１〜３のターゲット分析方法の記載を援用できる。
本発明の第４のターゲット分析用具は、前述のように、第１室、第２室および第３室を含み、
前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に結合する第２結合物質が担体に固定化された固定化第２結合物質を含み、
前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に標識物質が結合した標識化第１結合物質を含み、
前記第３室は、前記標識化第１結合物質が検出される検出部であり、
前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁であり、
前記第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質（第１の結合体）が通過できる多孔性隔壁である
ことを特徴とする。
本発明の第４のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明の第４のターゲット分析用具を使用し、
試料を保持した試料保持用具を前記ターゲット分析用具の前記第１室に挿入後、前記第１室と前記第２室との前記第１隔壁に接触させ、前記第２室に前記試料と前記第１試薬とを導入する工程、
前記第２室において、前記試料と前記第１試薬と前記第２試薬とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記標識化第１結合物質とが結合した第１結合体を形成させ、且つ前記ターゲットに未結合の前記標識化第１結合物質を前記第１試薬である前記固定化第２結合物質に結合させる工程、
前記第１結合体を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
前記第３室において、前記第１結合体における前記標識化第１結合物質を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明によれば、まず、前記第１室において、例えば、試料中のターゲットと前記第１試薬である前記固定化第２結合物質とが混合する。そして、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物が、前記第２室に導入されると、前記第２室では、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記標識化第１結合物質とが結合し、且つ、未結合の前記標識化第１結合物質と前記１試薬である前記固定化第２結合物質とが結合する。そして、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質が通過できる前記多孔性隔壁であるため、前記固定化第２結合物質は、前記隔壁を通過せずに前記第２室に残る。つまり、前記固定化第２結合物質に結合した前記標識化第１結合物質は、前記第３室に移動することなく前記第２室に残る。他方、前記固定化第２結合物質に未結合の遊離した前記標識化第１結合物質、すなわち前記第１結合体を形成している前記標識化第１結合物質は、前記隔壁を通過して前記第３室に導入される。本発明のターゲット分析用具における前記標識化第１結合物質は、例えば、既知量とすることができるため、前記固定化第２結合物質に未結合の前記標識化第１結合物質の量は、前記試料中のターゲット量と間接的に対応することになる。このため、前記第３室に導入された前記未結合の標識化第１結合物質を検出することによって、間接的に、前記試料中のターゲットの有無または量を分析することができる。
本発明において、分析とは、例えば、前記ターゲットの有無を判断する定性分析でもよいし、前記ターゲットの量を判断する定量分析でもよい。
本発明において使用するターゲットに結合する第１結合物質は、前述のように、例えば、ターゲットに結合すればよく、その種類は、特に制限されない。前記第１結合物質の具体例としては、例えば、アプタマー、抗体等があげられる。以下に、本発明の第４のターゲット分析用具および前記第４のターゲット分析方法について、アプタマーを使用する第４Ａ形態を、例にあげて説明する。
本発明の第４Ａ形態は、前記標識化第１結合物質における前記第１結合物質として、前記アプタマーを使用する形態であり、前記アプタマーは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記固定化第２結合物質における前記第２結合物質は、前記アプタマーに結合可能であればよく、例えば、前記アプタマーに相補的な核酸分子があげられる。前記アプタマーに相補的な核酸分子は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記標識化第１結合物質における前記標識物質は、例えば、触媒機能を示す触媒核酸分子または酵素が好ましく、前記触媒核酸分子および前記酵素は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記固定化第２結合物質における前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記ビーズは、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。前記担体が前記ビーズの場合、前記担体（ビーズ）に固定化するアプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記ビーズの表面積１ｍｍ２あたり、０．１ｆｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１ｆｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ〜１ｐｍｏｌである。
本発明の第４Ａ形態では、前述のように、前記第１結合物質としてアプタマー、前記第２結合物質として相補性核酸分子、前記標識物質として触媒核酸分子を使用できることから、例えば、熱安定性であり、保存がより容易である。また、前記標識物質として、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素を使用できることから、例えば、感度よくターゲットを分析できる。
前記第１室と前記第２室との間の前記第１隔壁、前記第２室と前記第３室との間の前記第２隔壁は、それぞれ、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第２室は、前記第２試薬として、さらに、タンパク質および脂質の少なくとも一方を吸着する吸着担体を含むことが好ましい。前記吸着担体は、例えば、前記第１Ａ形態と同様である。
前記第３室は、例えば、さらに、前記触媒性核酸分子または前記酵素の触媒機能に対する基質を含むことが好ましい。前記基質としては、例えば、ペルオキシダーゼに対する基質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素に対する基質等があげられる。
本発明の第４Ａ形態のターゲット分析用具を用いたターゲット分析方法の一例について、図面を用いて、具体的に説明する。なお、本発明は、この例には制限されない。また、本発明の第４Ａ形態は、特に示さない限り、前記第１〜３Ａ形態の記載を援用できる。
図１２は、前記第４Ａ形態のターゲット分析用具およびそれを用いたターゲット分析方法の概略を示す図面である。図１２において、図３と同一箇所には同一符号を付している。ターゲット分析用具４は、第１室１１、第２室１２、第３室１３を有し、第１室１１には、アプタマー２４１に対する相補鎖２５１がビーズ２５２に固定化された固定化相補鎖２５が配置され、第２室１２には、アプタマー２４１にＤＮＡｚｙｍｅ２４２が付加した標識化アプタマー２４と、シリカ製ビーズ１６とが配置されている。第１室１１と第２室１２との間には、第１隔壁１１１を有し、第２室１２と第３室１３との間には、多孔性の第２隔壁１２１を有する。第１室１１と第２室１２との間には、第１隔壁１１１を有し、第２室１２と第３室１３との間には、多孔性の第２隔壁１２１を有する。
つぎに、図１２のターゲット分析用具４を使用した分析方法について、図１３を用いて説明する。図１３は、ターゲット分析用具４の使用方法を示す概略図である。
まず、ターゲット分析用具４の第１室１１に、保持部１７２に試料を保持させた試料保持用具１７を挿入し、第１室１１において、試料中のターゲット１８と固定化相補鎖２５とを混合させる。前記両者の混合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
つぎに、試料保持用具１７により、第１隔壁１１１を破壊し、第１室１１内の内容物を第２室１２に導入する。そして、前記内容物中のターゲット１８を標識化アプタマー２４に結合させ、また、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。前記両者の結合の処理条件は、特に制限されず、温度が、例えば、４〜３７℃、時間が、例えば、１０秒〜３０分である。
第２隔壁１２１は、固定化相補鎖２５を通過せず、標識化アプタマー２４を通過する多孔性隔壁であるため、標識化アプタマー２４のうち、固定化相補鎖２５に未結合のもののみが、第２隔壁１２１を通過して、第３室１３に導入される。また、第２室１２には、シリカ製ビーズ１６が配置されているため、例えば、試料由来のタンパク質や脂質等の夾雑物１９は、シリカ製ビーズ１６に吸着され、第３室１３への導入が抑制される。そして、第３室１３において、標識化アプタマー２４について、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能を測定することにより、間接的に、試料中のターゲットを分析できる。ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の触媒機能の測定は、ＤＮＡｚｙｍｅ２４２の種類に応じて適宜決定できる。
また、本発明の第４のターゲット分析用具は、例えば、さらに、前処理室を備えてもよい。前記前処理室は、例えば、前述の説明を援用できる。また、本発明の第４のターゲット分析用具は、例えば、外筒と内筒とを有してもよい。前記外筒および前記内筒は、例えば、前述の説明を援用できる。
（実施例１）
前記第１Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図１および図２に示すように、第２室１２にシリカ製ビーズ１６を配置することで、タンパク質等の夾雑物を付着させ、前記夾雑物が前記第３室１３に導入することを抑制できる。そこで、本実施例においては、シリカ製ビーズ１６により夾雑物であるタンパク質が除去されることを確認した。
（１）タンパク質の除去の確認１
緩衝液として、２×buffer（８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した。夾雑物のタンパク質として、ヒトα−トロンビンを使用し、前記ヒトα−トロンビンが２００ｐｐｍとなるように、５０％グリセロールに添加して、トロンビン液を調製した。シリカ製ビーズ（商品名Silicon dioxide、SIGMA社製）が１ｇ／ｍＬの濃度となるように、蒸留水に添加して、シリカ製ビーズ液を調製した。
前記緩衝液２５μＬに、前記ヒトα−トロンビンが終濃度１００ｐｐｍとなるように前記トロンビン液を添加し、さらに、前記シリカ製ビーズ液５μＬを混合し、前記混合液中、前記ヒトα−トロンビンを前記シリカ製ビーズに吸着させた。そして、前記混合液を遠心（１１，０００Ｇ、１分）し、前記シリカ製ビーズを除去して液体画分を回収した。前記液体画分について、前記ヒトα−トロンビンの検出を行った。前記ヒトα−トロンビンの検出は、前記液体画分について、分光光度計（商品名NanoDrop、Thermo SCIENTIFIC社、以下同様）を用いて、２３０〜３３０ｎｍの波長で吸光度を測定することにより行った。コントロールとして、前記緩衝液２５μＬに前記トロンビン液２５μＬを添加した、１００ｐｐｍのヒトα−トロンビンを含む液について、吸光度を測定した。
この結果を図６に示す。図６は、前記液体画分の吸光度を示すグラフであり、シリカ製ビーズで処理した液体画分の結果と、１００ｐｐｍの前記ヒトα−トロンビン液の結果とを示す。図６に示すように、１００ｐｐｍのヒトα−トロンビン液は、２８０ｎｍ付近で吸収が見られた。これに対して、シリカ製ビーズで処理した前記液体画分は、２８０ｎｍ付近の吸収が見られなかったことから、ヒトα−トロンビンが前記シリカ製ビーズに吸着したことで除去されたといえる。
（２）タンパク質の除去の確認２
前記（１）において、前記シリカ製ビーズによって、夾雑物であるタンパク質が除去できることがわかった。他方、ターゲットに対する第１結合物質として、アプタマー等の核酸分子を使用し、前記第１結合物質に結合する第２結合物質として、前記アプタマーに相補的な核酸分子を使用する場合がある。そこで、前記核酸分子が前記シリカ製ビーズによって除去されないことを確認した。
前記核酸分子として、下記配列のＤＮＡ分子を使用した。
ＤＮＡ分子（配列番号１）
5’-AAAAACCAACCACACCAACC-3’
前記緩衝液２５μＬに、前記ヒトα−トロンビン濃度が終濃度１００ｐｐｍとなるように前記トロンビン液２５μＬを添加し、つぎに、終濃度２５μｍｏｌ／Ｌとなるように前記ＤＮＡ分子を添加し、さらに、前記シリカ製ビーズ液５μＬを混合し、前記混合液中、前記ヒトα−トロンビンを前記シリカ製ビーズに吸着させた。そして、前記混合液を遠心（１１，０００Ｇ、１分）し、前記シリカ製ビーズを除去して液体画分を回収した。前記液体画分について、前記分光光度計を用いて、２３０〜３３０ｎｍの波長で吸光度を測定した。コントロール１として、前記緩衝液２５μＬに前記トロンビン液および前記ＤＮＡ分子を添加した、１００ｐｐｍのヒトα−トロンビンおよび２５μｍｏｌ／ＬのＤＮＡ分子を含む液１、コントロール２として、前記緩衝液５０μＬに、終濃度２５μｍｏｌ／Ｌとなるように前記ＤＮＡ分子を添加した液２について、それぞれ、吸光度を測定した。
この結果を図７に示す。図７は、前記液体画分の吸光度を示すグラフであり、１００ｐｐｍシリカ製ビーズで処理した液体画分の結果、ならびに、コントロール１および２の結果を示す。図７に示すように、コントロール１（１００ｐｐｍ トロンビン＋２５μｍｏｌ／Ｌ ＤＮＡ）は、タンパク質（トロンビン）と核酸（ＤＮＡ分子）とを含むため、広い波長域において、最も高い吸光度を示した。これに対して、タンパク質と核酸とを含む混合液を前記シリカ製ビーズで処理した液体画分は、タンパク質のみが前記シリカ製ビーズによって除去されたことから、核酸のみを含むコントロール２（２５μｍｏｌ／Ｌ ＤＮＡ）と重なる吸光度曲線が得られ、２６０ｎｍに吸収を示したことから、ＤＮＡを検出できることがわかった。
（実施例２）
前記第１Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図２に示すように、第２室１２おいて、固定化アプタマー１４のアプタマー１４１と標識化相補鎖１５の相補鎖１５１とを結合させ、標識化相補鎖１５のうち固定化アプタマー１４に未結合の標識化相補鎖１５のみを、第３室に導入する。そこで、本実施例においては、ターゲットであるタンパク質の存在下で処理を行い、最終的に回収される相補鎖の量を確認した。
（１）固定化アプタマー
ビーズにアプタマーを結合させて、固定化アプタマーを作製した。前記ビーズは、ストレプトアビジンが付加された磁性ビーズ（商品名Dynabeads MyOne streptavidin C1、Invitrogen社製）を使用し、前記アプタマーは、３’末端にビオチンと５塩基のチミンとを付加した下記配列からなる、トロンビンに結合するトロンビンアプタマー（ＴＡ−３ｂｉｏ）を使用した。前記固定化アプタマーは、前記磁性ビーズ２ｍｇあたりに１０００ｐｍｏｌの前記トロンビンアプタマーを固定化した。
トロンビンアプタマー（配列番号２）
5’-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTT-3’
（２）相補鎖
前記トロンビンアプタマーに対する相補鎖を作製した。
相補鎖（配列番号３）
5’-AAAAACCAACCACACCAACC-3’
（３）方法
前記固定化アプタマーを、前記緩衝液に添加して、固定化アプタマー液を調製した。前記相補鎖を蒸留水に添加して、相補鎖液を調製した。シリカ製ビーズ（商品名Silicon dioxide、ＳＩＧＭＡ社製）が１ｇ／ｍＬの濃度となるように、蒸留水に添加して、シリカ製ビーズ液を調製した。ターゲットタンパク質として、ヒトα−トロンビンを使用し、前記ヒトα−トロンビンを５０％グリセロールに添加して、トロンビン液を調製した。
前記緩衝液２５μＬに、前記固定化アプタマー由来のアプタマー量が１０００ｐｍｏｌとなるように前記固定化アプタマー液１００μＬを添加し、前記ヒトα−トロンビンの終濃度が所定濃度（０、１、３、１０、３０、１００ｐｐｍ）となるように前記トロンビン液２５μＬを添加し、これらを室温（２５℃前後）で１０分、混合した。これにより、前記固定化アプタマーをターゲットタンパク質のヒトα−トロンビンに結合させた。この混合液に、さらに、前記固定化アプタマー由来のアプタマー量と同量の相補鎖量（２５μｍｏｌ／Ｌ）となるように、前記相補鎖液１００μＬ（前記相補鎖１０００ｐｍｏｌ）を添加して、室温で１０分、混合した。これにより、前記ターゲットタンパク質と未結合の前記固定化アプタマーのアプタマーに、前記相補鎖を結合させた。そして、この混合液から５０μＬをサンプリングし、前記シリカ製ビーズ液５μＬを混合した。そして、前記混合液を遠心（１１，０００Ｇ、１分）し、前記シリカ製ビーズを除去して液体画分を回収した。前記液体画分について、前記分光光度計を用いて、２３０〜３３０ｎｍの波長で吸光度を測定した。また、コントロールとして、前記相補鎖を蒸留水に添加して、終濃度２５μｍｏｌ／Ｌの相補鎖液を調製し、その吸光度を測定した。
前記回収した液体画分には、前記固定化アプタマーに未結合の前記相補鎖が含まれるため、前記液体画分の吸光度は、未結合の前記相補鎖の吸光度（Ｃ）と言える。他方、終濃度２５μｍｏｌ／Ｌの相補鎖液の吸光度は、前記固定化アプタマーに接触させる前の全相補鎖の吸光度（Ｉ）と言える。そこで、前記液体画分における回収した前記相補鎖の吸光度（Ｃ）を、前記固定化アプタマーと反応させる前の前記相補鎖の吸光度（Ｉ）で割ることにより、最初に添加した前記相補鎖（Ｉ）に対する回収された前記相補鎖（Ｃ）の割合（１００×[Ｃ／Ｉ］、単位％）を求めた。
この結果を図８に示す。図８は、前記ヒトα−トロンビン濃度と前記割合％との関係を示すグラフである。図８に示すように、ターゲットタンパク質であるトロンビン濃度の上昇にしたがって、回収される相補鎖の量が上昇した。このことから、前記アプタマーと前記アプタマーに相補的な相補鎖を用いることで、ターゲットの検出が可能であることがわかった。
（実施例３）
前記第２Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図４に示すように、第１室１１おいて、標識化アプタマー２４のアプタマー２４１と、試料保持用具１７の試料内のターゲット１８とを結合させ、第２室１２において、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。そこで、本実施例においては、試料保持器具１７の綿棒で試料を取得し、前記順序で反応させた際にターゲットの量を測定できることを確認した。
（１）試料
市販のピーナッツ（種子）について、ミルにより粉砕した。得られた粉末５ｇを２０ｍＬのＳＢ１Ｔ緩衝液と混合後、振盪機用い、室温（２５℃前後、以下同様）、９０−１１０ｒｐｍの条件で１分間振盪した。前記ＳＢ１Ｔ緩衝液の組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．００５（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とした。
前記振盪後の混合液について、１００００ｇ、室温の条件で、３０分間遠心した。つぎに、上清を回収後、前記上清について、フィルター（孔径０．８μｍ）を用いてろ過し、ピーナッツ抽出液を調製した。そして、前記ピーナッツ抽出液について、タンパク質濃度測定キット（Protein Assay reagent、Bio-Rad社製）を用いて、タンパク質濃度を定量した。
（２）標識化アプタマー
ストレプトアビジンが付加されたルシフェラーゼ（Streptavidin Lucia 、Invivogen社製）に、ビオチン化アプタマーを結合させて、標識化アプタマーを作製した。前記アプタマーは、５’末端にビオチンを付加した下記配列からなる、ピーナッツアレルゲンに結合するピーナッツアプタマーを使用した。前記標識化アプタマーは、前記ストレプトアビジン１００ｐｍｏｌあたりに４００ｐｍｏｌの前記アプタマーを固定化した。
ピーナッツアプタマー（配列番号４）
5’-GGATATTGCCTCGCCACAGTTAAGTCAGGTGGTTGGTTATGGTTGGGACTGACTCTCTACAGGGAACGCTCGGATTATC-3’
（３）固定化相補鎖
ビーズに相補鎖を結合させて、固定化相補鎖を作製した。前記ビーズは、ストレプトアビジンが付加された磁性ビーズ（MyOne SA beads、Invirogen社製）を使用し、前記アプタマーは、５’末端にビオチンを付加した下記配列からなる、相補鎖を使用した。前記固定化相補鎖は、前記磁性ビーズ１ｍｇあたりに５００ｐｍｏｌの前記相補鎖を固定化した。
相補鎖（配列番号５）
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAGAGAGTCAGTCCCAACCA-3’
（４）方法
前記標識化アプタマーを、前記緩衝液に添加して、標識化アプタマー液を調製した。また、前記固定化相補鎖を蒸留水に添加して、固定化相補鎖液を調製した。
ピーナッツタンパク質濃度が、所定濃度（０、１、１０、１００、１０００または７７００ｐｐｍ）となるように、前記ピーナッツ抽出液を前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で希釈し、サンプルを調製した。前記サンプル１００μＬをアルミ箔に塗布後、綿棒でアルミ箔をぬぐった。前記綿棒を前記ＳＢ１Ｔ緩衝液４００μＬと接触させ、室温で１分間インキュベートすることにより、前記綿棒に保持されているターゲットを抽出し、抽出液を得た。前記抽出液２５μＬに、前記標識化アプタマー由来のアプタマー量が１ｐｍｏｌとなるように前記標識化アプタマー液２５μＬを添加し、これらを室温で１分、混合した。これにより、前記標識化アプタマーをターゲットタンパク質のピーナッツアレルゲンに結合させた。この混合液に、さらに、前記標識化アプタマー由来のアプタマー量と同量の相補鎖量（１０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、前記固定化相補鎖液４μＬ（前記相補鎖４０ｐｍｏｌ）を添加して、室温で４分、混合した。これにより、前記ターゲットタンパク質と未結合の前記標識化アプタマーのアプタマーに、前記固定化相補鎖を結合させた。
つぎに、得られた混合液を磁気ホルダーに設置し、前記磁性ビーズの画分と、前記磁性ビーズ以外の画分とに分離し、後者を回収した。そして、前記上清３０μＬに、基質液３０μＬ（Quanti-Luc（商標）、Invivogen社製）を添加後ピペッティングし、プレートリーダー（Infinite M1000 Pro、TECAN社製）により、各サンプルの発光量を測定した。
この結果を図１４に示す。図１４は、発光量を示すグラフである。図１４において、横軸は、前記抽出液と前記標識化アプタマーとを混合後の混合液におけるピーナッツタンパク質濃度を示し、縦軸は、発光量を示す。図１４に示すように、ピーナッツタンパク質の濃度依存的に、発光量が増加した。このことから、試料保持器具１７の綿棒で試料を取得し、前記順序で反応させることでターゲットの量を測定できることがわかった。
（実施例４）
前記第２Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図４に示すように、第１室１１おいて、標識化アプタマー２４のアプタマー２４１と、試料保持用具１７の試料内のターゲット１８とを結合させ、第２室１２において、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。そして、標識化アプタマー２４とターゲット１８との第１結合体のみを、第３室に導入する。そこで、本実施例においては、前記順序で反応後、標識化アプタマー２４、固定化相補鎖２５およびターゲット１８の混合物を、第２隔壁１２１のフィルターを通過させ、得られた溶液中の第１結合体を検出することにより、ターゲットの量を測定できることを確認した。
まず、前記磁性ビーズに代えて、ストレプトアビジンが付加されたレジンビーズ（Pierce（商標）Streptavidin Plus UltraLink（商標）Resin、PIERCE社製）を用いた以外は、前記実施例３と同様にして、ピーナッツ抽出液、標識化アプタマー液、および固定化相補鎖液を調製した。
ピーナッツタンパク質濃度が、所定濃度（０、０．００２、０．０１、０．０５、０．２５、１．２５、または６．２５ｐｐｍ）となるように、前記ピーナッツ抽出液を前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で希釈し、サンプルを調製した。前記サンプル２５μＬに、前記標識化アプタマー由来のアプタマー量が１ｐｍｏｌとなるように前記標識化アプタマー液２５μＬを添加し、これらを室温で１分、混合した。これにより、前記標識化アプタマーをターゲットタンパク質のピーナッツアレルゲンに結合させた。この混合液に、さらに、前記標識化アプタマー由来のアプタマー量と同量の相補鎖量（４μｍｏｌ／Ｌ）となるように、前記固定化相補鎖液１０μＬ（前記相補鎖４０ｐｍｏｌ）を添加して、室温で４分、混合した。これにより、前記ターゲットタンパク質と未結合の前記標識化アプタマーのアプタマーに、前記固定化相補鎖を結合させた。得られた混合液について、フィルタープレート（孔径０．２２μｍ、マルチスクリーン（登録商標）、ミリポア社製）を用いて遠心ろ過した。得られたろ液３０μＬに、前記基質液３０μＬを添加後ピペッティングし、前記プレートリーダーにより、各サンプルの発光量を測定した。
この結果を図１５に示す。図１５は、発光量を示すグラフである。図１５において、横軸は、ピーナッツタンパク質濃度を示し、縦軸は、発光量を示す。図１５に示すように、ピーナッツタンパク質の濃度依存的に、発光量が増加した。このことから、前記順序で反応後、標識化アプタマー２４、固定化相補鎖２５およびターゲット１８の混合物を、第２隔壁１２１のフィルターを通過させ、得られた溶液中の第１結合体を検出することにより、ターゲットの量を測定できることがわかった。
（実施例５）
前記第４Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図１３に示すように、第１室１１おいて、固定化相補鎖２５と試料保持用具１７の試料内のターゲット１８とを混合し、第２室１２において、第１室１１の内容物中のターゲット１８を標識化アプタマー２４に結合させ、また、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。そこで、本実施例においては、前記順序で反応させた際にターゲットの量を測定できることを確認した。
まず、前記実施例３と同様にして、ピーナッツ抽出液、標識化アプタマー液、および固定化相補鎖液を調製した。
ピーナッツタンパク質濃度が、所定濃度（０、０．００２、０．０１、０．０５、０．２５、１．２５、６．２５）となるように、前記ピーナッツ抽出液を前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で希釈し、サンプルを調製した。前記サンプル２５μＬに、前記固定化相補鎖由来の相補鎖量が１ｐｍｏｌとなるように前記固定化相補鎖液２５μＬを添加し、これらを室温で１分、混合した。この混合液に、さらに、前記固定化相補鎖由来の相補鎖量と同量のアプタマー量（１０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、前記標識化アプタマー液４μＬ（前記アプタマー４０ｐｍｏｌ）を添加して、室温で４分、混合した。これにより、前記標識化アプタマーをターゲットタンパク質のピーナッツアレルゲンに結合させ、また、前記ターゲットタンパク質と未結合の前記標識化アプタマーのアプタマーに、前記固定化相補鎖を結合させた。
つぎに、得られた混合液を磁気ホルダーに設置し、前記磁性ビーズの画分と、前記磁性ビーズ以外の画分とに分離し、後者を回収した。そして、前記上清３０μＬに、前記基質液３０μＬを添加後ピペッティングし、前記プレートリーダーにより、各サンプルの発光量を測定した。
この結果を図１６に示す。図１６は、発光量を示すグラフである。図１６において、横軸は、ピーナッツタンパク質濃度を示し、縦軸は、発光量を示す。図１６に示すように、ピーナッツタンパク質の濃度依存的に、発光量が増加した。このことから、前記順序で反応させた際にターゲットの量を測定できることがわかった。
（実施例６）
前記第２Ａ形態のターゲット分析用具は、例えば、前記図４に示すように、第１室１１おいて、標識化アプタマー２４のアプタマー２４１と、試料保持用具１７の試料内のターゲット１８とを結合させ、第２室１２において、標識化アプタマー２４のうち、ターゲット１８と未結合である標識化アプタマー２４を、固定化相補鎖２５に結合させる。そして、標識化アプタマー２４とターゲット１８との第１結合体のみを、第３室に導入する。そこで、本実施例においては、前記順序で反応後、標識化アプタマー２４、固定化相補鎖２５およびターゲット１８の混合物を、第２隔壁１２１のフィルターを通過させ、得られた溶液中の第１結合体を検出することにより、ターゲットの量を測定できることを確認した。
前記ピーナッツの粉末と前記ＳＢ１Ｔ緩衝液とを混合後、終夜（約１６時間）振盪した以外は、前記実施例３と同様にして、ピーナッツ抽出液２を調製し、タンパク質濃度を定量した。また、実施例３と同様にして、標識化アプタマー液および固定化相補鎖液を調製した。
前記ピーナッツ抽出液２を、前記標識化アプタマー液および前記固定化相補鎖液との混合後の反応液におけるタンパク質濃度が、所定濃度（０、１．２５、５、２０または８０ｐｐｍ）となるように、前記ＳＢ１Ｔ緩衝液で希釈し、ピーナッツ希釈液を調製した。つぎに、チューブに、４０μＬの前記固定化相補鎖液および１６０μＬの前記ＳＢ１Ｔ緩衝液を添加し、希釈固定化相補鎖液を調製した。また、別のチューブに、２５０μＬの前記標識化アプタマー液を添加し、さらに、２５０μＬの前記ピーナッツ希釈液をチューブに添加した。前記添加後、攪拌した。さらに、前記チューブに、２００μＬの前記希釈固定化相補鎖液を添加後、攪拌し、室温で１分間インキュベートした。
前記インキュベート後の反応液について、５ｍＬのシリンジと、フィルター（孔径０．４５μｍ）を用いてろ過し、８００μＬの前記基質液が予め添加された測定容器にろ液を回収した。前記回収後、前記測定容器を攪拌し、３０秒〜１分インキュベートした。そして、ルミノメーター（Clean-Trace（商標）、３Ｍ社製）を用い、前記測定容器中の測定サンプルの発光量を測定した。
これらの結果を図１７に示す。図１７は、発光量を示すグラフである。図１７において、横軸は、タンパク質濃度を示し、縦軸は、発光量を示す。図１７に示すように、ピーナッツタンパク質の濃度依存的に、発光量が増加した。このことから、前記順序で反応後、標識化アプタマー２４、固定化相補鎖２５およびターゲット１８の混合物を、第２隔壁１２１のフィルターを通過させ、得られた溶液中の第１結合体を検出することにより、ターゲットの量を測定できることがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
この出願は、２０１５年１月２２日に出願された日本出願特願２０１５−０１０５１４および２０１５年７月２２日に出願された日本出願特願２０１５−１４５２８０を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
本発明によれば、簡便に試料中のターゲットを分析することができる。
１、２、３、４，１０ ターゲット分析用具
１１、９２ 第１室
１２、９３ 第２室
１３、９４ 第３室
１４ 固定化アプタマー
１５ 標識化相補鎖
２４ 標識化アプタマー
２５ 固定化相補鎖
１４１、２４１ アプタマー
１４２、２５２ ビーズ
１５１、２５１ 相補鎖
１５２、２４２ ＤＮＡｚｙｍｅ
１６ シリカ製ビーズ
１７ 試料保持用具
１７１ 把持部
１７２ 保持部
１８ ターゲット
１９ 夾雑物
９１ 前処理室
９５ 基質
９６ 抽出液
１１１、９２１ 第１隔壁
１２１、９３１ 第２隔壁
９０１ カバー
９１１ 隔壁

Claims (10)

  1. 第１室、第２室および第３室を含み、
    前記第１室、前記第２室および前記第３室が、この順序で連続して配置され、
    前記第１室は、第１試薬として、ターゲットに結合する第１結合物質に結合する第２結合物質が担体に固定化された固定化第２結合物質を含み、
    前記第２室は、第２試薬として、前記第１結合物質に標識物質が結合した標識化第１結合物質を含み、
    前記第３室は、前記標識化第１結合物質が検出される検出部であり、
    前記第１室と前記第２室との間に、第１隔壁を有し、
    前記第２室と前記第３室との間に、第２隔壁を有し、
    前記第１室は、その外部から内部に、試料を有する試料保持用具を挿入可能であり、
    前記第１隔壁は、前記第１室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁であり、
    前記第２隔壁は、前記固定化第２結合物質が通過できず、前記標識化第１結合物質が通過できる多孔性隔壁である
    ことを特徴とするターゲット分析用具。
  2. 前記標識化第１結合物質における前記第１結合物質が、アプタマーであり、前記固定化第２結合物質における前記第２結合物質が、前記アプタマーに相補的な核酸分子である、請求項１記載のターゲット分析用具。
  3. 前記標識化第１結合物質における前記標識物質が、酵素、核酸、蛍光物質、色素物質、発光物質、放射性物質、および電子供与体からなる群から選択された少なくとも１つの物質である、請求項１または２記載のターゲット分析用具。
  4. 前記固定化第２結合物質における前記担体が、ビーズである、請求項１から３のいずれか一項に記載のターゲット分析用具。
  5. 前記試料保持用具は、棒状の把持部および試料の保持部を含み、
    前記把持部の先端に前記保持部を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のターゲット分析用具。
  6. 外筒と内筒とを有し、
    前記内筒が、前記外筒の内部に収容でき、
    前記内筒が、前記第１室および前記第２室を有し、
    前記外筒の内部に前記内筒を収容した際、前記外筒の底部と前記内筒の底部との間に空間を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のターゲット分析用具。
  7. 前記第１室が、前記第２室とは反対側で、前処理室に連続して配置され、
    前記前処理室は、
    その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能であり、
    前記試料から、前記試料内部の成分を抽出する抽出液を含み、
    前記前処理室と前記第１室の間に、隔壁を有し、
    前記隔壁は、前記前処理室に挿入された前記試料保持用具の先端を接触させることにより破壊される隔壁である、請求項１から６のいずれか一項に記載のターゲット分析用具。
  8. 前記前処理室は、前記第１室との前記隔壁の反対側に、前記前処理室の開口のカバーを有し、
    前記カバーは、その外部から内部に、前記試料保持用具を挿入可能である、請求項７記載のターゲット分析用具。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載のターゲット分析用具を使用し、
    試料を保持した試料保持用具を前記ターゲット分析用具の前記第１室に挿入後、前記第１室と前記第２室との前記第１隔壁に接触させ、前記第２室に前記試料と前記第１試薬とを導入する工程、
    前記第２室において、前記試料と前記第１試薬と前記第２試薬とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記第２試薬である前記標識化第１結合物質とが結合した第１結合体を形成させ、且つ前記ターゲットに未結合の前記標識化第１結合物質を前記第１試薬である前記固定化第２結合物質に結合させる工程、
    前記第１結合体を、前記第２室と前記第３室との間の第２隔壁を通過させ、前記第３室に導入する工程、および、
    前記第３室において、前記第１結合体における前記標識化第１結合物質を検出する工程を含むことを特徴とするターゲット分析方法。
  10. 前記試料保持用具を前記第１室に挿入することにより、前記試料と前記第１試薬とを混合する工程、および
    前記第１室内の前記試料保持用具を、前記第１室と前記第２室との前記第１隔壁に接触させ、前記隔壁を破壊し、前記第２室に、前記第１室における前記試料と前記第１試薬との混合物を導入する工程を含む、請求項９記載のターゲット分析方法。
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