JP5876383B2 - 生体分子固定化担体および生体分子固定方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定対象とする生体マーカーを効率的に補足するための所望とする生体分子を局所的に固定するための生体分子固定化担体および生体分子固定方法に関する。

血液や唾液などの生体サンプル内に存在する生体マーカーは、生体内で異常が発生した際に形状や存在量が変化する。状態異常の初期段階でこれらの変化を検知することができれば、自覚症状のない状態遷移状態での早期治療が望め、治療も短期間で終了するため、患者自身の心身負担や医療費の削減を図ることができる。

近年これらの背景を受け、生体マーカーを精確に検出するための様々な医療用途センサが研究開発されている。サンプル溶液中の特定の生化学物質（生体マーカー）検出には、生体マーカーに対応した分子選択制を持つ機能性を有する生体分子または化合物を用いる。例えば、分子選択性を持つ機能性生体分子を予め基板の表面に固定しておき、ここにサンプル溶液を流し、サンプル液体中の特定生体マーカーを機能性生体分子と結合させる。この結合した状態を、電気化学的または光学的に検出する。

抗体など、タンパク質で構成される機能性生体分子を基板の表面に固定する方法としては、まず、機能性生体分子の持つ自身の凝集性および基板表面との吸着性を利用した方法がある。また、プロテインＡなどの機能性生体分子と強固に結合するタンパク質を基板上に塗布しておき、この上に上記機能性生体分子を載せることで、機能性生体分子を基板に強固に固定する方法がある。また、２種類の分子からなる接続分子（タグ）と呼ばれる化学結合物質の内の１つを、予めバッチ合成などにより機能性生体分子末端に取り付け、この対となる接続分子を表面に塗布した基板上に反応させて固定しておくことで、接続分子を介して機能性生体分子を基板上に固定する方法がある。

ところで、機能性生体分子としてタンパク質を用いる場合、時間経過に伴う劣化や保存環境に性能が大きく作用される。このため、抗体になり替わるアプタマーと呼ばれる分子が用いられるようになっている（非特許文献１参照）。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法により、ランダムなＤＮＡやＲＮＡの配列から作製されている。ただし、アプタマーは、凝集性や吸着性を持たないため、基板上に均一に固定することは容易ではない。

このようなアプタマーなど、自身は凝集性や吸着性を持たず基板上に均一に固定できない生体分子を基板の上に固定する技術として、例えば、アプタマーに結合する接続分子を表面に固定したプラットフォームを作製し、接続分子を介してアプタマーなどを基板に固定する技術がある。例えば、上記プラットフォームの上に、インクジェットスポッターを用いてアプタマーを含む溶液の吐出液滴を積み重ねることで、簡便に様々な分子の固定が行える。発明者らは、この方法を用い、多種類の分子を一度に測定可能とした分子同時測定用のバイオチップの製造方法を提案している。

特開２００２−２１４１３１号公報

S. Miyakawa et al. , "Structural and molecular basis for hyperspecificity of RNA aptamer to human immunoglobulin G",RNA, vol.14, pp.1154-1163, 2008.

しかしながら、近年では、微細加工技術の進展により、例えば、数ｎｍ単位のより微細な流路が形成可能となり、このようなマイクロフローセルを利用した生体マーカーの分析が求められるようになっている。このような微細な構成部品を利用する場合、機能性生体分子をより微細な領域に固定する技術が必要となる。例えば、マイクロアレイピンを用いた局所的な配置や、インクジェットスポッターによる吐出、また、これらと微細な開口部を有するステンシルマスクを用いた技術により、局所的に機能性生体分子を固定する技術がある。しかしながら、これらの技術を用いても、数ｎｍから数μｍ程度の微小領域に局所的に機能性生体分子を固定することは困難である。

また、微細な流路の形成では、従来行われてきている溝を上蓋で閉じることで作製する方法ではなく、基板に微細な穴をあけることにより流路を形成し、また、中空のポリマーを作製して流路とする技術が用いられるようになっている。この場合，開口部が、導入口と排出口のみであるため、流路の途中に、マイクロアレイやインクジェットスポッターを用いて機能性生体分子を配置することは困難である。

上述したような微細な流路においては、現在、流路に機能性生体分子を含む溶液を流し混み、流路内の全面（全域）に、同一の機能性生体分子の層を形成するような手法がとられている。この技術では、異なる複数の機能性生体分子を利用したマルチセンシングを実現することは困難である。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、所望とする機能性生体分子を、より微細な領域に固定できるようにすることを目的とする。

本発明に係る生体分子固定化担体は、アプタマーもしくはペプチドタグのいずれかからなる特異結合部と、特異結合部の一端と一端が結合した第１分子鎖と、特異結合部の他端に光開裂分子を介して一端が結合した第２分子鎖と、第１分子鎖の他端に一端が結合した第３分子鎖とを備える。

上記生体分子固定化担体において、特異結合部は、ＲＮＡ，ＤＮＡ，低分子タグのいずれかから構成されていればよい。なお、第１分子鎖は、鎖状高分子化合物であり、第２分子鎖および第３分子鎖は、オリゴマーであり、第２分子鎖および第３分子鎖は、塩基の配列から構成され、第３分子鎖は、第２分子鎖の相補鎖である。

また、本発明に係る生体分子固定方法は、アプタマーもしくはペプチドタグのいずれかからなる特異結合部と、特異結合部の一端と一端が結合した第１分子鎖と、特異結合部の他端に光開裂分子を介して一端が結合した第２分子鎖と、第１分子鎖の他端に一端が結合した第３分子鎖とを備える生体分子固定化担体の第２分子鎖の他端および第３分子鎖の他端の少なくとも一方を基板の上の固定領域に固定する第１工程と、生体分子固定化担体に光を照射して光開裂分子に光開裂反応を起こさせて特異結合部の他端と第２分子鎖の一端とを分離する第２工程と、特異結合部と特異的に結合する所望とする生体分子を固定領域に供給して特異結合部に生体分子を結合させる第３工程とを少なくとも備える。

上記生体分子固定方法において、特異結合部は、ＲＮＡ，ＤＮＡ，低分子タグのいずれかから構成されていればよい。なお、第１分子鎖は、鎖状高分子化合物であり、第２分子鎖および第３分子鎖は、オリゴマーであり、第２分子鎖および第３分子鎖は、塩基の配列から構成され、第３分子鎖は、第２分子鎖の相補鎖である。

上記生体分子固定方法において、第１工程では、同一の流路に配列された第１固定領域および第１固定領域とは異なる第２固定領域の各々に生体分子固定化担体を固定し、第２工程では、第１固定領域の生体分子固定化担体に光を照射して光開裂分子に光開裂反応を起こさせて特異結合部の他端と第２分子鎖の一端とを分離し、第３工程では、特異結合部と特異的に結合する所望とする第１生体分子を流路に供給して第１固定領域の生体分子固定化担体における特異結合部に第１生体分子を結合させ、新たに、第１固定領域において特異結合部に第１生体分子を結合させた後、第２固定領域の生体分子固定化担体に光を照射して光開裂分子に光開裂反応を起こさせて特異結合部の他端と第２分子鎖の一端とを分離する第４工程と、特異結合部と特異的に結合する所望とする第２生体分子を流路に供給して第２固定領域の生体分子固定化担体における特異結合部に第２生体分子を結合させる第５工程とを備えるようにしてもよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、所望とする機能性生体分子を、より微細な領域に固定できるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における生体分子固定化担体の構成を示す構成図である。 図２Ａは、本発明の実施の形態における生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図２Ｂは、本発明の実施の形態における生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図２Ｃは、本発明の実施の形態における生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図３Ａは、本発明の実施の形態における他の生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図３Ｂは、本発明の実施の形態における他の生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図３Ｃは、本発明の実施の形態における他の生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。 図４は、本発明の実施の形態における生体分子固定方法を用いて作製した分析チップの一部構成を示す構成図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子固定化担体の構成を示す構成図である。この生体分子固定化担体は、アプタマーもしくはペプチドタグのいずれかからなる特異結合部１０１と、第１分子鎖１０２と、第２分子鎖１０４と、第３分子鎖１０５とを備える。特異結合部１０１の一端に、第１分子鎖１０２の一端が結合している。また、特異結合部１０１の他端に、光開裂分子１０３を介して第２分子鎖１０４の一端が結合している。また、第１分子鎖１０２の他端に、第３分子鎖１０５の一端が結合している。

第１分子鎖１０２は、この生体分子固定化担体に柔軟性を持たせるために組み込まれたものであり、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの鎖状（線状）高分子化合物であればよい。ポリエチレングリコールは、エーテル結合「‐Ｃ‐Ｏ‐Ｃ‐」を主鎖にもつ重合体（ポリエーテル）の１つである。

第２分子鎖１０４および第３分子鎖１０５は、特異結合部１０１および第１分子鎖１０２を、固定する基板表面により所定距離離間させた状態で基板表面に固定するために用いる。第２分子鎖１０４および第３分子鎖１０５は、例えば、５−１０塩基が配列したオリゴマーから構成するとよい。また、第２分子鎖１０４および第３分子鎖１０５は、互いに相補配列の相補鎖より構成するとよい。この構成とすることで、第２分子鎖１０４と第３分子鎖１０５とがらせん状に絡んだ状態を形成するようになる。例えば、第２分子鎖１０４および第３分子鎖１０５は、ＤＮＡから構成することができる。

また、光開裂分子１０３は、２つのニトロベンジル基を備えるものであればよい。例えば、α−２−ニトロベンジル基の構造を持つ化合物を用い、αを、ホスホアミダイトとすればよい。ホスホアミダイトは、水酸基と反応するため、例えば、ＤＮＡから構成した第２分子鎖１０４の３’末端に、公知のホスホアミダイトＤＮＡ合成法により、光開裂分子１０３を結合させることができる。なお、特異結合部１０１と光開裂分子１０３との結合、特異結合部１０１と第１分子鎖１０２との結合、第１分子鎖１０２と第３分子鎖１０５との結合などは、よく知られた合成方法により行えばよい。

ところで、特異結合部１０１は、ＲＮＡ，ＤＮＡ，低分子タグのいずれかから構成可能であるが、特異結合部１０１をＲＮＡから構成する場合、ＲＮＡは、ＤＮＡよりも柔軟性がある。このため、第１分子鎖１０２を余り長くせず、光開裂分子１０３の長さにより、生体分子固定化担体全体の柔軟性を制御してもよい。

この生体分子固定化担体は、所望とする基板に、第２分子鎖１０４の他端および第３分子鎖１０５の他端を固定して用いる。この固定は、例えば、基板表面を金（Ａｕ）から構成した場合、第２分子鎖１０４の他端および第３分子鎖１０５のいずれかの他端にチオール基（−ＳＨ）を結合させればよい。この状態とした生体分子固定化担体の溶液を、９５℃で１０分間加熱して変性し、これをリフォールディングさせ、この後、表面をＡｕとした基板の表面に塗布し、２時間浸透させた後で基板を洗浄すればよい。このようにすることで、基板のＡｕ表面に、第２分子鎖１０４の他端または第３分子鎖１０５の他端が、チオール基により固定されるようになる。第２分子鎖１０４と第３分子鎖１０５とは、らせん状に絡んでおり、一歩の他端が固定されていればよい。

次に、上述した本実施の形態における生体分子固定化担体を用いた生体分子固定方法について、図２Ａ〜図２Ｃを用いて説明する。図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の実施の形態における生体分子固定方法を説明するための各工程における状態を示す構成図である。まず、上述した生体分子固定化担体を用意し、図２Ａに示すように、第２分子鎖１０４の他端および第３分子鎖１０５の他端の少なくとも一方を基板２０１の上の固定領域に固定する（第１工程）。図２Ａ〜図２Ｃでは、チオール基を用いて基板２０１のＡｕ表面に第２分子鎖１０４の他端または第３分子鎖１０５の他端を固定する例を示している。

次に、生体分子固定化担体に光を照射して光開裂分子１０３に光開裂反応を起こさせ、図２Ｂに示すように、特異結合部１０１の他端と第２分子鎖１０４の一端とを分離する（第２工程）。このように、特異結合部１０１の他端と第２分子鎖１０４の一端とを分離することで、特異結合部１０１の他端が自由な状態となり、特異結合部１０１と特異的に結合する所望とする生体分子が、特異結合部１０１に結合可能な状態となり、生体分子固定化担体が活性な状態となる。

照射する光は、例えば、３００〜４００ｎｍ、好ましくは３１０〜３６０ｎｍの波長の紫外線であればよい。ここでは、光照射により、例えば、特異結合部１０１の塩基配列を変化させないことが重要である。例えば、波長２５０ｎｍ程度の遠紫外線を照射すると、特異結合部１０１の塩基配列が変化する。このように変化すると、特異結合部１０１と後述する生体分子との特異的な結合が得られなくなる。

以上のように特異結合部１０１の他端と第２分子鎖１０４の一端とを分離した後、特異結合部１０１と特異的に結合する所望とする生体分子２０２を固定領域に供給し、図２Ｃに示すように、特異結合部１０１に生体分子２０２を結合させる（第３工程）。

ここで、前述したように、特異結合部１０１をＲＮＡから構成する場合、光開裂分子１０３の長さにより柔軟性を確保することができるが、光開裂分子１０３が長すぎると、上述した光照射を行う前の未活性な環状の状態において、ＲＮＡの部分に自由度が生じ、活性な状態としていなくても、生体分子が結合（吸着）しやすい状態となる。この状態は、光開裂分子１０３を長くしすぎると、より顕著となるので、光開裂分子１０３の長さは、数塩基程度に留めることが望ましい。

上述したように、本実施の形態によれば、基板２０１に固定した生体分子固定化担体を、光照射により活性な状態とし、この活性な状態で、生体分子２０２を供給して特異結合部１０１に結合させるところに特徴がある。光開裂分子１０３が、光開裂せずに特異結合部１０１の他端と第２分子鎖１０４の一端とが分離していない不活性な状態では、生体分子２０２を供給しても結合することがない。従って、本実施の形態によれば、基板２０１に固定した生体分子固定化担体のなかで、光照射をした箇所に選択的に生体分子２０２を結合させることができる。

よく知られているように、光照射は、非常に微細な領域に限定して行うことが可能である。また、透明な材料から流路を構成すれば、流路内に固定した生体分子固定化担体に対しても、局所的に光を照射することができる。この結果、本実施の形態によれば、所望とする機能性生体分子を、より微細な領域に固定できるようになる。また、生体分子２０２の固定は、分析などを行う段階で、光照射して行えばよく、冷蔵保存が必須で長期保存ができないタンパク質などから構成されている生体分子２０２を、使用開始の直前に固定することが可能となる。

また、上述したように、光照射した箇所に選択的に機能性生体分子を固定することができるので、異なる複数の機能性生体分子を、複数の生体分子固定化担体が固定されている固定領域に配列して配置させることができる。例えば、まず、図３Ａに示すように、流路３０１の固定領域３０２に、複数の生体分子固定化担体３０３を固定する。なお、流路３０１には、キャリア液３０４を流しておく。

次いで、図３Ｂに示すように、第１生体分子３０５をキャリア液３０４と共に固定領域３０２に供給する。この状態で、第１固定領域３２１に選択的に光照射を行う。これにより、第１固定領域３２１においては、活性な状態の生体分子固定化担体３０３ａに、第１生体分子３０５が結合する。

次に、図３Ｃに示すように、第２生体分子３０６をキャリア液３０４と共に固定領域３０２に供給する。この状態で、第２固定領域３２２に選択的に光照射を行う。これにより、第２固定領域３２２においては、活性な状態の生体分子固定化担体３０３ａに、第２生体分子３０６が結合する。

例えば、抗体の重鎖に特異的に結合するアプタマーを特異結合部とした生体分子固定化担体３０３を用い、上述した光照射と生体分子供給との切り替えを交互に行うことにより、微小な固定領域３０２に、各々機能（特性）が異なる複数の生体分子を、位置特異的に固定することが可能となる。

この固定方法を用いることで，図４に示すように、２つの主流路４０１，主流路４０２の間に設けた複数の分析流路４０４中の局所的な箇所に、各々異なる生体分子を固定した分析チップを形成することができる。分析流路４０４は、主流路４０１と主流路４０２とを連通させる細流路であり、各々の流路内に、未活性状態の複数の生体分子固定化担体が固定されている。この状態で、マスクパターンなどを用い、光照射部４１１の各々に、逐次に選択的に光照射を行い、各々に目的とする生体分子を含む溶液を導入し、導入した生体分子を結合させて固定化すればよい。

各々の分析流路４０４に対して上記処理をした後、測定対象とする生体サンプル検体を流路内に導入し、各々の分析流路４０４における各々の固定箇所において、吸着量を測定する。この吸着量の測定方法としては、例えば、公知の水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などがある（特許文献１参照）。これらの測定方法によれば、ラベルフリーで測定が行える。また、公知の、二次抗体によるサンドイッチ検出を行えば、二次抗体に付加されている蛍光試料の蛍光強度観察により、上記吸着量が測定できる。

ところで、局所的に活性化して生体分子を結合させる場合、他の領域の未活性な生体分子固定化担体には、生体分子が結合していない。このような状態で、実際の測定（分析）を行うと、生体サンプルに存在する想定外の生体分子が、未活性な生体分子固定化担体に吸着または結合する場合が発生する。このように、未活性な生体分子固定化担体に想定外の生体分子が結合すると、当然ながら、正確な測定が行えなくなる。

このような問題を防ぐために、生体分子固定化担体を基板に固定するときに、未活性な生体分子固定化担体の基板からの高さより長く、活性状態の生体分子固定化担体より短い鎖状のポリマーを、所定の割合で混合して結合領域に固定しておくとよい。固定の方法としては、前述したように、鎖状ポリマーの結合端にチオール基を付加しておけばよい。この鎖状ポリマーが存在していることで、未活性な生体分子固定化担体は、鎖状ポリマーにより隠れた状態となるが、活性状態の生体分子固定化担体は、特異結合部が、鎖状ポリマーより上部に突出した状態となる。この結果、未活性な生体分子固定化担体に対する想定外の生体分子の吸着などが抑制でき、一方で、目的とする生体分子が活性状態の生体分子固定化担体の特異結合部に結合することは阻害されない。

以上に説明したように、本発明によれば、特異結合部の一端には、第１分子鎖を結合し、特異結合部の他端には、光開裂分子を介して第２分子鎖が結合し、また、第１分子鎖の他端には第３分子鎖が結合した生体分子固定化担体を用い、第２分子鎖の他端および第３分子鎖の他端の少なくとも一方を、基板の固定領域に固定するようにした。この結果、本発明によれば、所望とする機能性生体分子を、より微細な領域に固定できるようになる。

また、本発明によれば、生体分子固定化担体を、環境耐性の高い材料から構成すれば、未活性状態で長期に保存可能であり、測定に利用する段階で、光照射して生体分子固定化担体を活性状態とし、目的の生体分子を結合させて用いることが可能となる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、上述した実施の形態では、チオール基を用いて固定するようにしたが、これに限るものではない。例えば、ピレンブタジエン酸などのピレン骨格を有する接着分子を用いれば、炭素材料からなる基板に吸着（接着）させることができる。

１０１…特異結合部、１０２…第１分子鎖、１０３…光開裂分子、１０４…第２分子鎖、１０５…第３分子鎖。

Claims (5)

1. アプタマーもしくはペプチドタグのいずれかからなる特異結合部と、
   前記特異結合部の一端と一端が結合した第１分子鎖と、
   前記特異結合部の他端に光開裂分子を介して一端が結合した第２分子鎖と、
   前記第１分子鎖の他端に一端が結合した第３分子鎖と
   を備える生体分子固定化担体の前記第２分子鎖の他端および前記第３分子鎖の他端の少なくとも一方を基板の上の固定領域に固定する第１工程と、
   前記生体分子固定化担体に光を照射して前記光開裂分子に光開裂反応を起こさせて前記特異結合部の他端と前記第２分子鎖の一端とを分離する第２工程と、
   前記特異結合部と特異的に結合する所望とする生体分子を前記固定領域に供給して前記特異結合部に前記生体分子を結合させる第３工程と
   を少なくとも備え、
   前記第１分子鎖は、鎖状高分子化合物であり、
   前記第２分子鎖および前記第３分子鎖は、オリゴマーであり、
   前記第２分子鎖および前記第３分子鎖は、塩基の配列から構成され、
   前記第３分子鎖は、前記第２分子鎖の相補鎖である
   ことを特徴とする生体分子固定方法。
2. 請求項１記載の生体分子固定方法において、
   前記特異結合部は、ＲＮＡ，ＤＮＡ，低分子タグのいずれかから構成されていることを特徴とする生体分子固定方法。
3. 請求項１または２記載の生体分子固定方法において、
   前記第１工程では、同一の流路に配列された第１固定領域および第１固定領域とは異なる第２固定領域の各々に前記生体分子固定化担体を固定し、
   前記第２工程では、前記第１固定領域の前記生体分子固定化担体に光を照射して前記光開裂分子に光開裂反応を起こさせて前記特異結合部の他端と前記第２分子鎖の一端とを分離し、
   前記第３工程では、前記特異結合部と特異的に結合する所望とする第１生体分子を前記流路に供給して前記第１固定領域の前記生体分子固定化担体における前記特異結合部に前記第１生体分子を結合させ、
   新たに、
   前記第１固定領域において前記特異結合部に前記第１生体分子を結合させた後、前記第２固定領域の前記生体分子固定化担体に光を照射して前記光開裂分子に光開裂反応を起こさせて前記特異結合部の他端と前記第２分子鎖の一端とを分離する第４工程と、
   前記特異結合部と特異的に結合する所望とする第２生体分子を前記流路に供給して前記第２固定領域の前記生体分子固定化担体における前記特異結合部に前記第２生体分子を結合させる第５工程と
   を備えることを特徴とする生体分子固定方法。
4. アプタマーもしくはペプチドタグのいずれかからなる特異結合部と、
   前記特異結合部の一端と一端が結合した第１分子鎖と、
   前記特異結合部の他端に光開裂分子を介して一端が結合した第２分子鎖と、
   前記第１分子鎖の他端に一端が結合した第３分子鎖と
   を備え、
   第１分子鎖は、鎖状高分子化合物であり、
   前記第２分子鎖および前記第３分子鎖は、オリゴマーであり、
   前記第２分子鎖および前記第３分子鎖は、塩基の配列から構成され、
   前記第３分子鎖は、前記第２分子鎖の相補鎖である
   ことを特徴とする生体分子固定化担体。
5. 請求項４記載の生体分子固定化担体において、
   前記特異結合部は、ＲＮＡ，ＤＮＡ，低分子タグのいずれかから構成されていることを特徴とする生体分子固定化担体。