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JP6230546B2 - 肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

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Description

本発明は，肥満症の予防及び治療作用を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
肥満は，脂肪組織の過剰な蓄積を引き起こし，糖尿病，循環器系疾患，うつ病などの様々な健康上のリスクを高める（非特許文献１参照）。この問題は，現代社会において非常に大きな経済的及び社会的損失を生じさせる。脂肪細胞代謝の分子メカニズムは広範囲に研究されている（非特許文献２及び３参照）。
シノビオリンは，リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見されたタンパク質である（特許文献１参照）。そして，遺伝子改変動物を用いた研究により，シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。
タンパク質構造予測システムにより，シノビオリンはリングフィンガー（RING finger）モチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすＥ３ユビキチンライゲースという酵素に多く見出されている。そして，シオビオリンがＥ３ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（特許文献１参照）。
国際公開第０２／０５２００７号パンフレット
Wickelgren, I. (1998). Obesity: how big aproblem? Science 280, 1364-1367. Lefterova, M.I., and Lazar, M.A. (2009).New developments in adipogenesis. Trends Endocrinol Metab 20, 107-114. Rosen, E.D., and MacDougald, O.A. (2006).Adipocyte differentiation from the inside out. Nat Rev Mol Cell Biol 7,885-896.
肥満症の予防及び治療作用を有する物質又は候補化合物をスクリーニングする方法の開発が望まれている。
本発明者は，シノビオリン遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを用いて，シノビオリン遺伝子を破壊すると，対象の体重減少及び脂肪細胞の分化誘導阻害を惹き起こすという実施例に基づく知見を得た。このため，本発明者は，シノビオリンの発現を阻害するか，シノビオリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることで，脂肪細胞分化誘導調節作用，脂肪組織量調節作用及び体重調節作用を有する化合物をスクリーニングできることを見出し，本発明を完成させた。
本発明の第１の側面は，抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。この方法は，被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞と接触させる工程と，被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程と，を含む。シノビオリン遺伝子の発現への影響の例は，シノビオリンｍＲＮＡ量への影響や，シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響である。抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法とは，抗肥満作用を有する物質の候補を探す方法である。
第１の側面の好ましい態様は，抗肥満作用が，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である。すなわち，この態様では，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用のある化合物をスクリーニングすることができる。
本発明の第２の側面は，抗肥満薬に関する。この抗肥満薬は，シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む。この抗肥満薬は，例えば，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用を有する。
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分がシノビオリンのｓｉＲＮＡのものである。シノビオリンのｓｉＲＮＡの例は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。配列番号２〜４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Ｉｚｕｍｉ Ｔ， ｅｔ ａl．, Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ. ２００９; ６０(１):６３−７２.，Ｙａｍａｓａｋｉ Ｓ, ｅｔ ａｌ．, ＥＭＢＯ Ｊ. ２００７; ２６(１): １１３−２２.に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
配列番号２：５’−ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ−３’
配列番号３：５’−ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ−３’
配列番号５：５’−ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ−３’
「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Tsuchimochi K, et al., Mol Cell Biol. 2005;25(16):7344-56.に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ−３’
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，シノビオリンのアンチセンス核酸である。
本発明によって，肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供することができる。
図１Ａは，シノビオリンコンディショナルノックアウトマウス（syvn1 cKO）の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図である。エキソンは黒色の箱，黒色矢印はネオマイシン(Neo)，白抜き矢印はジフテリア毒素遺伝子サブユニットＡを示す。白抜き三角形はloxP部位を示し，黒丸はFRT部位を示す。内在性シノビオリン遺伝子座とターゲッティングベクターとの間で相同遺伝子組換えを行うことで，エキソン2〜12の上流及び下流に隣接してloxPが導入され，更にネオマイシンカセットの上流及び下流に隣接してFRTが導入された染色体が得られる。「Flox Allele」には，ネオマイシンを除去した後の，loxPが導入されたアリルを示す。欠損アリルは，タモキシフェン(Tam)によって誘導される，Creリコンビナーゼを介して除去されたものを示す。 図１Ｂは，タモキシフェン処理後の，(CAG)-Cre-ER;syvn1+/+マウス，(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/+マウス及び(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス由来のゲノムDNAをPCR解析した写真である。野生型アリルは，70bpのフラグメント（下側のバンド）として検出され，標的アリルは，100bpのフラグメント（上側のバンド）として検出される。 図１Ｃは，タモキシフェン処理後のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及び(CAG)-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)由来の脂肪細胞をリアルタイムPCR解析したグラフである。 図１Ｄは，syvn1 WT mice及びsyvn1 cKO mice由来の尾部蛋白質の，抗シノビオリン抗体を用いたウエスタンブロットである。 図１Ｅは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける生存割合を示すグラフである。 図２Ａは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける体重変化を示すグラフである。 図２Ｂは，シノビオリンノックアウトマウス（雄及び雌）の食物摂取量を示すグラフである。 図２Ｃは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける皮下脂肪の様子を示す写真である。白色矢印は皮下脂肪を示す。 図２Ｄは，syvn1 WT(左側)及びsyvn1 cKO(右側)の精巣上体脂肪組織を示す写真である。 図２Ｅは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける内臓脂肪の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。 図２Ｆは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける精巣上体（上図）及び皮下脂肪（下図）の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。 図３Ａは，syvn1 cKO:ob/obマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる体重変化を示すグラフである。 図３Ｂは，syvn1 cKO:ob/obマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる皮下脂肪の様子を示す写真である。黒矢印は皮下脂肪を示す。 図３Ｃは，syvn1 cKO:db/dbマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる体重変化を示すグラフである。 図３Ｄは，syvn1 cKO:db/dbマウスにおける新生後のシノビオリンノックアウトによる皮下脂肪の様子を示す写真である。黒矢印は皮下脂肪を示す。 図４は，３Ｔ３−Ｌ１細胞株の脂肪細胞分化誘導に対する，シノビオリン遺伝子抑制の影響を示す写真である。○：分化した脂肪細胞，□：正常な脂肪細胞でない脂肪滴。 図５Ａは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスを作製できたことを示すPCRの結果である。aP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウスとSyvn1flox/floxマウス（対照）のWAT及びBATから単離したゲノムDNAを増幅したPCR産物を常法のゲル電気泳動で分離した。 図５Ｂは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスの生存率を示すグラフである。aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスと対照マウス（Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス）生存分析を行ったものであり，カプラン・マイヤー曲線は日齢に対する生存率を示す。 図５Ｃは，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスの体重変化を示すグラフである。生後３日目から体重を測定した。Adipose KO：aP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウス。Contorol：Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス。Adipose heterozygous：aP2-Cre;Syvn1flox/+マウス。結果は，平均 ± SDで示す。* P < 0.01：aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスと他のマウスとの比較はANOVAのpost hoc検定（Tukey-Kramer法）で行った。 図５Ｄは，生後19日目の対照マウスとaP2-Cre;Syvn1flox/flox（脂肪特異的ノックアウト）マウスの写真である。 図５Ｅは，図５Ｄのマウスにおける腹部の皮下脂肪の写真である。白い矢印は皮下脂肪を示す。 図５Ｆは，図５Ｄのマウスにおける精巣上体の写真である。 図５Ｇは，図５Ｄのマウスにおける背部の皮下脂肪の写真である。aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスにおけるWATの減少（BATは減少しない）。 図５Ｈは，生後18日目の対照マウス（左）及びaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウス（右）における脂肪組織の顕微鏡写真である。倍率：400倍。スケールバー：50μm。黒矢印：脂肪滴。 図６Ａは，LS-102処理の体重変化率への影響を示すグラフである。C57BL/6JマウスにDMSO又は50 mg/kg LS-102を腹腔内注射する処理を毎日行い，体重を測定した。結果は平均値±SDで示した。*P < 0.05：C57BL/6J DMSO処理マウスとC57BL/6J LS-102処理マウスとの比較はStudent’s t検定で行った。 図６Ｂは，LS-102処理の食物摂取への影響を示すグラフである。一日の食物摂取の平均を測定した。結果は平均値±SDで示し，Student’s t検定を行った。 図６Ｃは，LS-102処理によって精巣上体の脂肪量の減少することを示す写真とグラフである。DMSO（左）又は50 mg/ kg LS-102（右）で57日間処理したC57BL/6Jマウスの精巣上体の脂肪組織である。結果は平均値±SDで示し，Student’s t検定を行った（n=4）。 図６Ｄは，LS-102処理によって脂肪滴が減少することを示す写真である。DMSO（左）及び50 mg/ kg LS-102（右）で処理されたC57BL/6Jマウスの精巣上体の脂肪組織をHEで染色した。倍率：400倍。スケールバー：50μm。黒い矢印：脂肪滴。 図７は，syvn1WT（WT），syvn1 cKO（KO），ob/+マウス，ob/obマウスの皮下脂肪白色脂肪組織におけるシノビオリンタンパク質の発現量を観察したウエスタブロット（左図），及ぶび画像解析に基づく発現量の度合いを示すグラフ（右図）である。
本発明の第１の側面は，抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。この方法は，被験物質をシノビオリン遺伝子発現細胞と接触させる工程と，被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する工程と，を含む。抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法とは，抗肥満作用を有する物質の候補を探す方法である。
抗肥満作用のひとつが体重調節作用である。体重調節作用とは，処置の前後で，体重を有意差をもって変化させることを意味する。体重調節作用は，例えば脂肪組織量調節や脂肪細胞分化誘導調節を通して作用する。
ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号は，AB024690（配列番号１）である。
ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質以外のタンパク質であっても，これと高い相同性（通常70％以上，好ましくは80％以上，より好ましくは90％以上，最も好ましくは95％以上）を有し，かつ，シノビオリンタンパク質が有する機能を持つタンパク質は，本発明のシノビオリンに含まれる。
本発明における「シノビオリン遺伝子」には，例えば，配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトのシノビオリン遺伝子のホモログ等）が含まれる。
また，配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは，一般的に，配列番号１に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは，50％以上，好ましくは70％以上，さらに好ましくは80％以上，より好ましくは90％以上(例えば，95％以上，さらには96％，97％，98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は，mBLASTアルゴリズム(Altschul et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8;Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また，該DNAは，生体内から単離した場合，配列番号１に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては，例えば「2×SSC，0.1％SDS，50℃」，「2×SSC，0.1％SDS，42℃」，「1×SSC，0.1％SDS，37℃」，よりストリンジェントな条件として「2×SSC，0.1％SDS，65℃」，「0.5×SSC，0.1％SDS，42℃」および「0.2×SSC，0.1％SDS，65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては，他の生物におけるシノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を，シノビオリン遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお，本明細書においては，ヒト以外の生物におけるシノビオリンタンパク質（遺伝子）に相当するタンパク質（遺伝子），あるいは，上述のシノビオリンと機能的に同等なタンパク質（遺伝子）を，単に「シノビオリンタンパク質（遺伝子）」と記載する場合がある。
本発明の「シノビオリン」は，天然のタンパク質のほか，遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は，例えばシノビオリンタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方，組換えタンパク質は，シノビオリンタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は，例えば，後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
本発明において「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」とは，シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること，またはこれらの転写・翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。
上述の各種機能は，当業者においては，一般的な技術を用いて，適宜，評価（測定）することが可能である。具体的には，後述の実施例に記載の方法，あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
従って，「シノビオリンタンパク質の発現および／または機能を阻害する」とは，野生型シノビオリン遺伝子またはタンパク質の量，機能または活性と比較して，その量，機能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には，機能と発現の両者を阻害すること，およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。
ユビキチン化は，具体的には，ユビキチン活性化酵素（E1），ユビキチン結合酵素（E2）およびユビキチンリガーゼ（E3）などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返すことにより，基質となるタンパク質にユビキチン分子を枝状に結合させてポリユビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリユビキチン鎖は，ユビキチン分子内の４８番目のリシン残基のε‐アミノ基を介して形成され，26Sプロテアソームへの分解シグナルとなり，標的タンパク質を分解に導く。
被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響又はシノビオリン蛋白質の活性への影響を確認する方法は，例えば国際公開ＷＯ２００６−１３７５１４号パンフレットに開示されている方法を適宜用いればよい。
被験物質によるシノビオリン遺伝子の発現への影響
シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる。この際に用いられる「細胞」の例は，ヒト，マウス，又はラットに由来する細胞である。シノビオリンを発現するように形質転換された大腸菌，酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノビオリン遺伝子を発現する細胞」の例は，内在性のシノビオリン遺伝子を発現している細胞，または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され，該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は，通常シノビオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは，一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては，特に制限されないが，例えば，天然化合物，有機化合物，無機化合物，タンパク質，ペプチドなどの単一化合物，並びに，化合物ライブラリー，遺伝子ライブラリーの発現産物，細胞抽出物，細胞培養上清，発酵微生物産生物，海洋生物抽出物，植物抽出物等が挙げられる。
シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は，通常シノビオリン遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが，この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には，該タンパク質を発現するDNAベクターを，該細胞へ導入することにより，上記「接触」を行うことができる。
本方法においては次いで，シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には，転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は，当業者に公知の方法によって行うことができる。
例えば，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し，このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法，RT-PCR法，DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また，シノビオリン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し，シノビオリンタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに，シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて，ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより，遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用いる抗体としては，検出可能な抗体であれば特に制限はないが，例えばモノクローナル抗体，またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本方法においては，次いで，被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は抗肥満のための薬剤となる。
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して，該タンパク質の活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。シノビオリン蛋白質の活性への影響の例は，シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響である。
シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響
例えば，特開２００８−７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）には，プルムバギン（２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）及びケルセチン（２−(３,４−ジヒドロキシフェニル)−３,５,７−トリヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラノ−４−オン）がシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を阻害することが開示されている。シノビオリンの自己ユビキチン化とは，特開２００８−７４７５３号公報に開示されるように，シノビオリン同士の相互作用により生じるタンパク質のユビキチン化を意味する。タンパク質のユビキチン化は，タンパク質にシノビオリンが結合することにより生じる。
シノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化への影響は，特開２００８−７４７５３号公報（特許第５００８９３２号）に開示された方法を用いて確認すればよい。例えば，被験物質をＭＢＰ−Syvn1 ΔＴＭ-Ｈｉｓのin
vitro自己ユビキチン化反応液に添加し，３７℃で３０分間反応を行う。反応後，抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット法によりユビキチン化タンパク質を検出する。ＭＢＰ−Syvn1 ΔＴＭ-Ｈｉｓは，N末端側にマルトース結合タンパク質（MBP），C末端側にHisタグを融合させた膜貫通領域欠損させたシノビオリンを意味する。
第１の側面の好ましい態様は，抗肥満作用が，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用である。すなわち，この態様では，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用のある化合物をスクリーニングすることができる。
本発明の第２の側面は，抗肥満薬に関する。この抗肥満薬は，シノビオリンのｓｉＲＮＡ，シノビオリンのデコイ核酸又はシノビオリンのアンチセンス核酸を有効成分として含む。この抗肥満薬は，例えば，脂肪組織量減少作用又は脂肪細胞分化誘導抑制作用を有する。
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分がシノビオリンのｓｉＲＮＡのものである。RNAi効果による阻害作用を有する核酸は，一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは，標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下，「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより，標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し，当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば，dsRNAを細胞内に導入すると，そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは，標的遺伝子の発現を抑制し得ることから，従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として，または，遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは，シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが，完全な相同性を有することが好ましい。
siRNAの設計は，以下の通り行うことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく，任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば，ヒトの場合では，GenBank アクセッション番号 AB024690（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
(b) 選択した領域から，AAで始まる配列を選択し，その配列の長さは19〜25塩基，好ましくは19〜21塩基である。その配列のGC含量は，例えば40〜60%となるものを選択するとよい。
（ａ）シノビオリン遺伝子を発現する細胞に，被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して，発現量を低下させる化合物を選択する工程
シノビオリンのｓｉＲＮＡの例は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列，これらの塩基配列と相補の塩基配列，又はこれらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。配列番号２〜４に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，Izumi T, et al., Arthritis Rheum. 2009;60(1):63-72.， ＥＭＢＯ，Yamasaki S, et al., ＥＭＢＯ J. 2007; 26(1):113-22.に実験を用いて開示されるとおり公知である。配列番号５及び６に示される塩基配列を有するＲＮＡがシノビオリンのｓｉＲＮＡであることは，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットに実験を用いて開示されるとおり公知である。
配列番号２：５’−ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ−３’
配列番号３：５’−ＧＧＵＧＵＵＣＵＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＧ−３’
配列番号４：５’−ＧＧＵＵＣＵＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＣＣ−３’
配列番号５：５’−ＣＧＵＵＣＣＵＧＧＵＡＣＧＣＣＧＵＣＡ−３’
配列番号６：５’−ＧＵＵＵＴＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡ−３’
「これらのいずれかの塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡ」は，配列番号２〜６から選択される一の塩基配列及びこれらの塩基配列と相補の塩基配列のいずれかの塩基配列から，１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するＲＮＡである。置換，挿入，欠失又は付加は，いずれか１種類が生じていても良いし，２つ以上が生じていても良い。
例えば，国際公開ＷＯ２００５−０１８６７５号パンフレット，ＷＯ２００５/０７４９８８号パンフレットには，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及び，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡのスクリーニング方法及び評価方法が開示されている。本発明においても，この公報に開示された方法を適宜用いて，シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡを評価することができる。
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，配列番号７で示される塩基配列又は配列番号７で示される塩基配列から１又は２個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した塩基配列を有するシノビオリンのデコイ核酸である。配列番号７で示される塩基配列を有する核酸がシノビオリンのデコイ核酸であることは，例えば，Tsuchimochi K, et al., Mol Cell Biol.2005;25(16):7344-56.に実施例を用いて示されているとおり公知である。
配列番号７：５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＵＧＧＵＧＣＵＡＡＧＡ−３’
また，シノビオリンのデコイ核酸及びその確認方法は，例えば国際公開ＷＯ２００５−０９３０６７号パンフレット，及び国際公開ＷＯ２００５−０７４９８８号パンフレットに開示されるとおり公知である。
本発明の第２の側面のある態様は，有効成分が，シノビオリンのアンチセンス核酸である。シノビオリンのアンチセンス核酸及びシノビオリンのアンチセンス核酸をスクリーニングする方法は，例えば，特開２００９−１５５２０４号公報，再表２００６−１３７５１４号及び再表２００５−０７４９８８号に開示されている。シノビオリンのアンチセンス核酸とは，シノビオリン遺伝子に相補的な配列を有し，当該遺伝子にハイブリダイズすることにより，シノビオリン遺伝子の発現を阻害することができる核酸を意味する。アンチセンス核酸は，シノビオリンをコードする遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学的手法などにより調製することができる。当該核酸化合物がシノビオリンの産生を効率的に阻害するかどうかを評価するためには，遺伝子の発現量を指標としたスクリーニング試験を行えばよい。上記アンチセンス核酸化合物としては，例えばシノビオリンの発現を，コントロールと比較して少なくとも50％以下に抑えることができるものである。
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては，アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては，以下のような複数の要因が存在する。即ち，三重鎖形成による転写開始阻害，RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害，合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害，イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害，スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害，キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害，翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害，開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害，mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害，および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は，転写，スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで，標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人,
1993, 319-347.）。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は，上記のいずれの作用によりシノビオリン遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては，シノビオリン遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば，遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また，コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように，シノビオリン遺伝子の翻訳領域だけでなく，非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も，本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は，適当なプロモーターの下流に連結され，好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は，公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は，形質転換される動物（細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが，遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて，完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上，最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子（シノビオリン）の発現を効果的に阻害するには，アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが，本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず，例えば100塩基以上，または500塩基以上であってもよい。
また，シノビオリン遺伝子の発現の阻害は，リボザイム，またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが，中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により，RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには，グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1
RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが，ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
例えば，ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは，G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが，その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ，C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば，標的RNA中のUC，UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al.,
FEBS Lett, 1988, 239, 285.，小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.，Koizumi, M. et al., Nucl
Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
また，ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは，例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986,
323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも，標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.，菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように，リボザイムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで，該遺伝子の発現を阻害することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は，さらに，標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA
interference，以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
本発明の治療剤は，経口，非経口投与のいずれでも可能である。非経口投与の場合は，経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの），経鼻投与剤型，経皮投与剤型（例えば軟膏，クリーム剤），注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は，例えば点滴等の静脈内注射，筋肉内注射，腹腔内注射，皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
投与方法は，患者の年齢，症状により適宜選択する。有効投与量は，一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ，好ましくは１〜１０μｇである。但し，上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。ｓｉＲＮＡ等の核酸を混合する場合，当該核酸の用量の例は，０．０１〜１０μｇ／ｍｌ，好ましくは０．１〜１μｇ／ｍｌである。
本発明の治療剤は，常法にしたがって製剤化することができ，医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として，水，医薬的に許容される有機溶剤，コラーゲン，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，カルボキシビニルポリマー，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリアクリル酸ナトリウム，アルギン酸ナトリウム，水溶性デキストラン，カルボキシメチルスターチナトリウム，ペクチン，メチルセルロース，エチルセルロース，キサンタンガム，アラビアゴム，カゼイン，寒天，ポリエチレングリコール，ジグリセリン，グリセリン，プロピレングリコール，ワセリン，パラフィン，ステアリルアルコール，ステアリン酸，ヒト血清アルブミン，マンニトール，ソルビトール，ラクトース，医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は，本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば，注射用製剤として使用する場合，精製されたＥＲストレス誘導物質を溶剤（例えば生理食塩水，緩衝液，ブドウ糖溶液等）に溶解し，これにＴｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０，ゼラチン，ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは，使用前に溶解する剤型とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては，例えば，マンニトール，ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明は，シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスを産生し，それによりシノビオリンの発現を阻害するかシノビオリンの活性を阻害することで，肥満症の治療に有効であることを見出した。シノビオリン遺伝子のノックアウトマウスとは，シノビオリン遺伝子領域の配列が人為的に改変されたことによって，その正常な発現が阻害されていること，その結果，生体においてシノビオリンが正常に機能していないことを意味する。
また，シノビオリン遺伝子は，一部又は全部を改変又は欠損することができる。ここで，「全部」とは，シノビオリンゲノムＤＮＡのエクソン１の５'端から最後のエクソンの３'端までの領域をいう。また，「一部」とは，この領域の一部であって，シノビオリン遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な長さの領域をいう。さらに，「改変」とは，単一または複数のヌクレオチドを置換，欠失，挿入，及び／又は転位させることにより，ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
シノビオリン遺伝子の一部又は全部を改変又は欠損しているノックアウト動物は，公知の方法で作製することができる。例えば，下記実施例の記載のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において，シノビオリン遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより，シノビオリンの正常な発現を阻害できる。また，本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は，同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず，さらにその子孫をも含む。
本発明のノックアウト動物の対象となる動物は，非ヒト動物であり，特に限定されない。例えば，ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち，実験動物として用いるには，ウサギ，イヌ，ネコ，モルモット，ハムスター，マウス，ラットが好ましく，なかでも齧歯目がさらに好ましく，近交系が多数作出されており，受精卵の培養，体外受精等の技術を考慮するとマウス及びラットが，特に好ましい。
ターゲッティングベクター構築のため，対象となる動物のシノビオリン遺伝子の一部を単離する。例えば，ノックアウトマウスを作製する場合は，マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからシノビオリン遺伝子をスクリーニングする。得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて，相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく，シノビオリン遺伝子を破壊し，そしてシノビオリンの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。また，ターゲッティングベクターは，公知の方法により作製することができ，例えば市販のプラスミドをバックボーンとして，上記ゲノムＤＮＡクローン，ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカーなどの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。
上記方法により作製したターゲッティングベクターを，受精卵，初期胚，又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し，その後，目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は，ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。選択後，目的とする相同組換えが起こった細胞を，サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を，妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と，野生型ｓｙｎｖ１遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより，第１世代（Ｆ１）として，相同染色体上の一方のｓｙｎｖ１遺伝子が相同組換えにより破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るヘテロ接合体を得ることができる。さらに，これらヘテロ接合体同士を交配させることにより，第２世代（Ｆ２）として，相同染色体上の双方のｓｙｎｖ１遺伝子が破壊された，又は一定条件下或いは部位特異的に欠失させ得るホモ接合体，即ち本発明のｓｙｎｖ１ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は，体の一部（例えば尻尾）を切断し，ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜作製例１：シノビオリンノックアウトマウスの作製＞
本実施例のシノビオリンノックアウトマウス（syvn1 cKOマウス）の作製に使用した遺伝子ターゲッティングベクターの設計図を図１Ａに示した。図中，上から順に，正常のシノビオリン遺伝子（Wild allele），シノビオリンノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting Vector），相同組換えを起こしたアレル（Targeted
allele），ｌｏｘＰ配列が導入されたアレル（Flox Allele），ｌｏｘＰ−Ｅｘｏｎ２〜１４−ｌｏｘＰが除去されたアレル（Deleted Allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
マウスシノビオリン遺伝子のエクソン１の上流からエクソン１６の下流の領域である１４．８ｋｂの遺伝子領域をターゲッティングベクター構築のために使用した。ＦＲＴ配列で挟んだＮｅｏ耐性遺伝子をエクソン１とエクソン２との間に挿入した。また，エクソン２の上流及びエクソン１４の下流にｌｏｘＰ配列を導入した。
上記ターゲッティングベクターを，ＥＳ細胞に導入した。目的の相同組換えが起こったアレルを有するクローンを，Ｃｒｅ処理によるｌｏｘＰ−エクソン−ｌｏｘＰ配列の除去及びＦＬＰ処理によるＦＲＴ−ネオマイシン−ＦＲＴの除去をＰＣＲ産物の長さで確認することによって，選抜した。
相同組換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを，公知の方法（たとえば，EMBO J 16:1850-1857）のとおりに，マウス胚に導入することにより，キメラマウスを得た。さらに，このキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させ，ネオマイシン配列が除去されたマウスを獲得した。また，ターゲッティングベクターに組み込まれているエクソン−Long arm間のｌｏｘＰ配列は，相同組換え時に欠損している可能性があるため，その存在をＰＣＲで確認した。
得られたネオマイシン除去マウスをＣＡＧ−Ｃｒｅ-ＥＲマウスと掛け合わせ，CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウスを得た。
（実施例１：新生後のシノビオリンノックアウトの表現型）
新生後のシノビオリンの機能を解明するため，タモキシフェン(Tam)で誘導可能なシノビオリンノックアウトマウス（CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス）にタモキシフェンを投与することでｌｏｘＰ−エクソン−ｌｏｘＰの除去を誘導した（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（＋）syvn1flox/flox）。また，対照として，C57BL／6J（溶媒対照，タモキシフェン投与）及び（ＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ（−）syvn1flox/flox）（溶媒対照，タモキシフェン投与）の各群を設けた。
具体的には，生後7-8週間後，C57BL/6Jマウス，Cre導入遺伝子を欠くホモ接合型のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及びCAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン溶液を５日間連続して投与した。タモキシフェン投与によってシノビオリンがノックアウトされていることは，ゲノム上のシノビオリンのPCR，シノビオリンmRNAのリアルタイムPCR及びシノビオリン蛋白質のウエスタンブロッティングで確認した（図１Ｂ〜Ｄ）。syvn1flox/floxマウスはコントロールである。
タモキシフェン投与後のC57BL/6Jマウス(n=3)，syvn1
WTマウス(n=10)，及びsyvn1 cKOマウス(n=10)における日齢に対する生存割合を示すKaplan-Meier曲線を作成した。結果を図１Ｅに示す。
syvn1 cKOマウスは生存できず，Tam投与後２１日後までに全頭が死亡した。一方，C57BL/6Jマウス及びsyvn1 WTマウスは生存していた（図１Ｅ）。
（実施例２−１：シノビオリンノックアウトによる体重変化）
生後7-8週間後，C57BL/6Jマウス，ホモ接合型のsyvn1flox/floxマウス(syvn1 WT)及びCAG-Cre;syvn1flox/floxマウス(syvn1 cKO)の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン(Tam)溶液又は対照としての溶媒を５日間連続して投与した。結果を図２Ａに示す。
図２Ａから，syvn1 cKOマウスの群では，Tam投与後１週間で体重の顕著な減少が観察され，syvn1 WTマウス群の体重のおよそ半分まで飼育日数依存的に体重の減少が認められた。一方，いずれの対照群においても，体重の減少は，認められなかった。
syvn1 cKOマウスが吸収段階で摂食障害及び／又は栄養障害をもっていないかを調べるため，次の三つの試験を行った。
（実施例２−２：シノビオリンノックアウトによる食物摂取量への影響）
前記syvn1 cKOマウスにおける体重の減少が食物摂取の減少によるものか否かを調べるため，毎日の食物摂取量を測定した。図２Ｂでは，タモキシフェン処理後１日間後及び11日間後に一日当たりの平均食物摂取量を示す。
図２Ｂから，syvn1 cKOマウスと対照マウスとで食物摂取量に差はないことがわかった。この結果から，syvn1 cKOマウスにおける体重の減少は摂食障害や単なる脱力によるものではないことが示唆された。
（実施例２−３：シノビオリンノックアウトによる栄養，肝臓及び腎臓機能への影響）
更に，血清の生物化学実験によって，総蛋白質,アルブミン,血糖, トリグリセリド, 総コレステロール, AST, ALT, BUN，及びCrを含む，栄養，肝臓及び腎臓機能に対するいくつかのバイオマーカーについて調べた。結果は，下記表１に示す通り，二つの群で顕著な変化はなかった。
Figure 0006230546
（実施例２−４：シノビオリンノックアウトによる脂肪組織への影響）
次に，syvn1 cKOマウスにおいて肉眼及び顕微鏡での脂肪組織の解析を行った。タモキシフェン投与後16日間後におけるsyvn1 WTマウス(左側)及びsyvn1 cKOマウス(右側)について開腹手術を施し，脂肪組織の観察を行った。結果を図２Ｃ及びＤに示す。
図２Ｃから，syvn1 cKOマウスの腸には相当量の食物残渣があり，組織学的に異常は見られなかった。また，syvn1 cKOマウスにおいて，皮下脂肪が減少していることが分かった。
また，図２Ｄから，syvn1 cKOマウスでは白色脂肪組織(WAT)が顕著に減少していることが分かった。特に精巣上体の白色脂肪組織は観察されなかった。
（実施例２−５：シノビオリンノックアウトによる脂肪滴への影響）
シノビオリンノックアウトによる脂肪組織内への影響を調べるため，syvn1 WTマウス及びsyvn1 cKOマウスの内臓脂肪組織をヘマトキシリン・エオシン染色して観察した。上記syvn1 cKOマウスにおいてかろうじて残っている脂肪組織を用いて組織学的解析を行った。結果を図２Ｅに示す。
図２Ｅから，syvn1 cKOにおいて，脂肪滴が減少していることが分かった。また，この脂肪滴の減少は，syvn1 cKOマウスにおいてのみ観察され，syvn1 WTマウスでは観察されなかった。
次にsyvn1 WTマウス及びsyvn1
cKOマウスの精巣上体及び皮下脂肪についても同様にして観察を行った。その結果を図２Ｆに示す。図２Ｆは，新生後のシノビオリンコンディショナルノックアウトマウスにおける精巣上体（上図）及び皮下脂肪（下図）の脂肪滴の様子を示す顕微鏡写真である。黒色矢印は脂肪滴を示す。倍率は400倍である。
脂肪細胞のサイズの増大及び前駆脂肪細胞の分化による脂肪細胞数の増加は，肥満の進行において最初に観察される事象であること(Ｆａｕｓｔ ｅｔ ａｌ。， １９７８; Ｊｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９)，及び脂肪組織において過剰なエネルギーを蓄えられないことが，インシュリン耐性や代謝性の合併症に関わっていること(Ｔａｎ ａｎｄ Ｖｉｄａｌ−Ｐｕｉｇ, ２００８; Ｖｉｒｔｕｅ ａｎｄ Ｖｉｄａｌ−Ｐｕｉｇ, ２００８)から，シノビオリンの発現抑制又は機能抑制による抗肥満作用が強く示唆された。
（実施例３：ob/obマウス及びdb/dbマウスにおけるシノビオリンノックアウトの効果）
肥満マウスを用いて，恒常的に高脂肪食を摂取させる条件下でシノビオリンのノックアウトがこれらのマウスの体重減少を誘導するか否かを検証した。
まずは，代表的な肥満マウスであるｏｂ/ｏｂ(レプチン遺伝子の異常)，ｄｂ/ｄｂ（レプチン受容体遺伝子の異常）マウス（いずれも中枢性に摂食が効かなくなり過食となり肥満，糖尿病，メタボリック症候群などのモデルとして汎用）を用いて，これらのマウスとシノビオリンのコンディショナルノックアウトマウスとを交配し，それぞれｏｂ又はｄｂ遺伝子ホモ，かつシノビオリン遺伝子もホモ，すなわち完全にノックアウトできるマウスを作出した。これらのマウスの遺伝子型としては次の通り。CAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 cKO:ob/obマウス)，syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 WT:ob/obマウス)，CAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 cKO:db/dbマウス)，及びsyvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 WT:db/dbマウス)。
具体的な手順としては，まずCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス及びCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウスを作製するため，CAG-Cre-ER;syvn1flox/floxマウスをob/+及びdb/+マウスと交配させた。
二次交配でCAG-Cre-ER;syvn1flox/+:ob/+マウスを交配させてCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 cKO:ob/ob)及びsyvn1flox/flox:ob/obマウス(syvn1 WT:ob/ob)を作製した。同様にして，二次交配でCAG-Cre-ER;syvn1flox/+:db/+マウスを交配させてCAG-Cre-ER;syvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 cKO:db/db)及びsyvn1flox/flox:db/dbマウス(syvn1 WT:db/db)を作製した。
生後7-8週間後の前記マウス（syvn1 cKO:ob/ob，syvn1 WT:ob/ob，syvn1 cKO:db/db及びsyvn1 WT:db/db）の腹腔内に，一日当たり125mg/kgのタモキシフェン(Tam)溶液を５日間連続して投与した。タモキシフェン投与後の体重測定を毎日行い，体重変化率を求めた。結果を図３Ａ及びＣに示す。また，タモキシフェン投与後２５日目のsyvn1 WT:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスと，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスの脂肪組織を解剖により観察した。結果を図３Ｂ及びＤに示す。
図３Ａ及びＣから，タモキシフェン投与後，syvn1 WT:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスの体重は，約130％まで増加した。一方，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスの体重は，試験開始時の体重の約半分まで顕著に減少した。つまり，新生後のシノビオリンノックアウトがob/obマウス及びdb/dbマウスの体重を減少させることが分かった。
図３Ｂ及びＤから，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 WT:db/dbマウスに比べ，syvn1 cKO:ob/obマウス及びsyvn1 cKO:db/dbマウスでは脂肪の体積が減少していることが明らかとなった。つまり，新生後のシノビオリンノックアウトがob/obマウス及びdb/dbマウスの白色脂肪細胞を減少させることが分かった。
上記の摂食量に変化ないというデータ（図２Ｂ）と併せて考えると，これらの結果は，中枢神経系レベルでのレプチンシグナルの不活性化及び／又は高エネルギー摂取によって誘導される肥満に対して，シノビオリン欠失による体重の減少が優性耐性であることを示唆している。すなわち，シノビオリンの欠失は，中枢神経系に対する作用ではなく，末梢の脂肪細胞におけるエネルギー消費に作用していると考えられる。
（実施例４：シノビオリンの発現抑制及びユビキチン化活性阻害による肥満症への効果）
マウスの脂肪前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１細胞を，１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地；Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）でｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達した後３日間培養した。５００μＭ ＩＢＭＸ（isobutyl-methylxanthine），１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，５ μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎを添加し分化を誘導した。同時に１０μＭ ＬＳ−１０２（シノビオリンのユビキチン化活性阻害剤）もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後，４μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎを含む培地に置換し１０μＭ ＬＳ−１０２もしくはＤＭＳＯを添加した。３日間培養後，１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に置換し３日間培養した。ｓｉＲＮＡに関しては，分化誘導２日前に２００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ Syvn1７７０（センス鎖が下記配列番号２の配列からなる）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００により導入した。
配列番号２：５’−ＧＣＵＧＵＧＡＣＡＧＡＵＧＣＣＡＵＣＡ−３’
培養後の３Ｔ３−Ｌ１細胞をＰＢＳ（−）（Phosphate Buffered Saline溶液からマグネシウムとカルシウムを除いたもの）で洗ったのち，１０％ｆｏｒｍａｌｉｎで固定した。ＰＢＳ（−）で洗浄し６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌに置換した。１８ｍｇ／ｍＬ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（溶媒はＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）で２０分間染色し，６０％Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ及びＰＢＳ（−）で洗浄し顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。
図４から，ｓｉＲＮＡでシノビオリン遺伝子の活性を阻害した細胞では，対照と比較して，分化した脂肪細胞が少なく，分化が抑制されていることが示唆された。また，輪環状の正常な脂肪細胞ではない脂肪滴が認められた。以上の結果から，シノビオリン遺伝子の発現抑制及びシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化抑制が，肥満症の予防及び治療に有効であることが示された。
（実施例５：脂肪特異的にシノビオリンをノックアウトしたマウスでの脂肪減少）
シノビオリン遺伝子（SYVN1）のノックアウトが白色脂肪組織を直接標的にしているか否かを確認するため，脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウス（aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウス：ａｄｉｐｏｓｅ ＫＯ）を作製した。
脂肪特異的シノビオリンノックアウトマウスを作製するため，まずはSyvn1flox/floxマウスと脂肪酸結合蛋白質4（aP2）-Creマウス(Jackson Immunoresearch Laboratories)とを交配させてaP2-Cre-ER;Syvn1flox/+マウスなどを含む複合ヘテロ接合体を得た。次に二次交配としてaP2-Cre;Syvn1flox/+マウスをSyvn1flox/floxマウスと交配させ，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスを得た。なお，Syvn1flox/flox又はSyvn1flox/+の遺伝子型を持つ，Creトランスジーンを欠いたマウスを対照マウスと呼ぶ。
得られたaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスのWAT（白色脂肪組織）及びBAT（褐色脂肪組織）においてCreリコンビナーゼを介したSyvn1ノックアウトが起きていることは，PCRで確認した（図５Ａ）。
aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの生存率を確認したところ，200を超える同腹仔のうち，ほとんど全てのaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスが生後24日までに死亡した（図５Ｂ）。
また，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの体重変化を観察したところ，対照マウス（Syvn1flox/flox及びSyvn1flox/+マウス）及びaP2-Cre;Syvn1flox/+マウス（Syvn1ヘテロ接合体）と比較し，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスでは，体重がほぼ半減することが分かった（図５Ｃ及びＤ）。
更に，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの脂肪組織を観察したところ，WATの顕著な減少が観察された（図５Ｅ及びＦ）。一方，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスにおいてBATの減少は見られなかった（図５Ｇ）。
また，aP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスの組織切片を観察するため，ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行ったところ，対照マウスと比較してaP2-Cre;Syvn1flox/floxマウスでは多数の脂肪滴が減少することが示された（図５Ｈ）。
これらの結果は，体重調節においてシノビオリンがWATを直接の標的としていることを示唆している。
（実施例６：シノビオリンの選択的阻害剤LS-102による体重増加及び脂肪量減少）
LS-102がシノビオリン（SYVN1）のE3ユビキチンリガーゼ活性の選択的阻害剤であることはこれまでに示されてきた（Yagishita, N., et al. Int. J. Mol. Med. 30, 1281-1286 (2012).）。そこで，SYVN1の薬理学的な阻害が肥満を改善するか否かを調べた。
まず，C57BL/6Jマウスに，対照としての溶媒（DMSO）又は50 mg/kg体重のLS-102を投与し，約２ヵ月間体重を測定した（図６Ａ）。その結果，LS-102で処理したマウスでは食物摂取によって生じる体重増加が抑制された。なお，LS-102の食物摂取への影響はなかった（図６Ｂ）。
また，LS-102で処理したマウスを解剖して，精巣上体のWATにおける脂肪を観察し，計量したところ，脂肪量の減少が認められた（図６Ｃ）。
更に，マウスの組織切片を観察したところ，対照マウスと比較してLS-102処理したマウスでは脂肪滴も減少していた（図６Ｄ）。
これらの結果から，ＬＳ−１０２はＳＹＶＮ1の阻害を通じて肥満を抑制することが強く示唆された。
（実施例７：シノビオリンのバイオマーカーとしての利用可能性）
実施例３から肥満マウスであるob/obマウスでシノビオリンをノックアウトさせたことにより体重や白色脂肪細胞を減少することがわかった。このことから，次にシノビオリンを肥満のバイオマーカーとして利用できるかどうかを確認した。syvn1 ＷＴマウス，syvn1 ｃＫＯマウス，ｏｂ/＋マウス，ｏｂ/ｏｂマウスの皮下脂肪にある白色脂肪組織（ＷＡＴ）から得た細胞抽出液を用意した。抗シノビオリン（SYVN1）抗体及び抗-beta-actin抗体（内部標準用）を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果を図７に示す。図７は，ob/+ 及びob/ob
マウスの皮下脂肪白色脂肪組織におけるシノビオリン蛋白質の発現を示すウエスタブロット（左図）及び画像解析に基づく発現量の度合いを示すグラフ（右図）である。
syvn1
cKOマウスではシノビオリンタンパク質の発現は確認されなかった。一方，ob/obマウスはsyvn1 WTマウスに比べてシノビオリンタンパク質の発現量が増加した。肥満マウスでシノビオリンの発現量が増加していたことから，シノビオリンをバイオマーカーとしての利用できる可能性が見出された。
本発明のスクリーニング方法は，シノビオリン機能を抑制することを指標とすることで，肥満症の予防又は治療に有効な医薬組成物を選択することができる。
また，本発明の抗肥満薬は，シノビオリンの発現又はシノビオリン蛋白質の自己ユビキチン化を抑制することで，摂食制限することなく脂肪細胞の分化を抑制でき，脂肪組織量及び体重を調整するものであり，従来の食欲抑制剤や消化吸収阻害剤と異なる，新たな種類の抗肥満薬として有用である。
配列番号２：合成ＲＮＡ
配列番号３：合成ＲＮＡ
配列番号４：合成ＲＮＡ
配列番号５：合成ＲＮＡ
配列番号６：合成ＲＮＡ
配列番号７：合成ＲＮＡ

Claims (1)

  1. シノビオリンのデコイ核酸を有効成分として含み，
    前記シノビオリンのデコイ核酸が，配列番号７で示される塩基配列を有する，
    抗肥満薬。
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