JP2016026486A - 脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、糖尿病モデル非ヒト動物、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、糖尿病モデル細胞、スクリーニング方法、脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法、脊柱靱帯骨化症診断用キット、及び脊柱靱帯骨化症治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】脊柱靱帯骨化症のモデルとなる、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物を提供する。
【解決手段】１）ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。２）前記ＣＸＣＬ７遺伝子の機能の欠損又は抑制が、ＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換によるものである前記脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。３）前記ｍｉＲＮＡ−３４０の発現の亢進がｍｉＲＮＡ−３４０の導入によるものである前記脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
【選択図】なし

Description

本発明は、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、糖尿病モデル非ヒト動物、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、糖尿病モデル細胞、スクリーニング方法、脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法、脊柱靱帯骨化症診断用キット、及び脊柱靱帯骨化症治療剤に関する。

脊柱靱帯骨化症（OSL）は、骨化した靱帯の部分により、後縦靱帯骨化症(OPLL)、黄色靱帯骨化症、前縦靱帯骨化症などに分類されている。
後縦靱帯骨化症(OPLL)は、脊椎椎体の後縁を連結し脊柱のほぼ全長を縦走する後縦靱帯が骨化することにより、脊椎管狭窄をきたし、脊髄または神経根の圧迫障害を来す疾患である。後縦靱帯骨化症(OPLL)は、発症部分が頸椎であるため四肢麻痺を伴い、重篤な疾患である。頸椎に最も多いが、胸椎や腰椎にも生じる。
黄色靭帯骨化症は、脊髄の後方に存在し、脊椎椎弓間を連結する黄色靭帯が骨化し、脊髄麻痺を生じる疾患であり、胸椎部に好発する。後縦靱帯骨化症患者では、前縦靱帯骨化を中心として、広汎に脊柱靭帯骨化をきたす強直性脊椎骨増殖症を約40％に合併し、また黄色靭帯骨化や棘上靭帯骨化の合併も多く、脊椎靭帯骨化の一部分症として捉える考えもある。

従来、後縦靱帯骨化症の治療としては、前方よりの前方徐圧固定術、後方よりの椎弓切除術、脊柱管拡大術が行われている。また、黄色靱帯骨化症の治療としては、椎弓切除術が行われている。これらの疾患の予後として、脊椎麻痺の多くは進行性であり、転倒などの軽微な外傷で、急に麻痺の発生や憎悪をきたすことがある。長期にわたり麻痺を放置すると、全横断性脊髄麻痺となり、手術を行っても回復は得られ難い。
このように、脊柱靱帯骨化症には有効な治療法が確立されていないのが現状である。

発明者らはこれまでに、脊柱靭帯骨化症、とりわけ後縦靭帯骨化症の患者における、タンパク質等の発現状態の検討を行ってきた。その結果、脊柱靱帯骨化症の患者の血漿中には、健常人の血漿中には存在するケモカインの１種であるpro-platelet basic protein (chemokine (C-X-C motif) ligand 7)ＣＸＣＬ７由来のペプチド断片が認められず欠損することを見出した（特許文献１）。
しかし、これまでに、ＣＸＣＬ７の欠損と後縦靱帯骨化症の発症との関連、すなわちＣＸＣＬ７の欠損が後縦靱帯骨化症発症の原因となるかどうかは、実証されていなかった。また、これまでに、後縦靱帯骨化症発症のモデルとなる非ヒト動物に関する報告もなされていない。

特開２０１１−９７８６７号公報

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、糖尿病モデル非ヒト動物、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、糖尿病モデル細胞、該非ヒト動物又は該脊柱靱帯骨化症モデル細胞を用いた脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。また、新規マーカーによる脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法、脊柱靱帯骨化症診断用キット、及び脊柱靱帯骨化症治療剤の提供を課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、染色体上のＣＸＣＬ７遺伝子配列の一部を欠損させたマウスが、脊柱靱帯骨化症に特徴的な表現型を有していることを見出した。加えて、該マウスは、糖尿病に特徴的な表現型を有していることを見出した。またＣＸＣＬ７の発現が抑制された細胞が、脊柱靱帯骨化症に特徴的な表現型を有していることを見出した。さらに、本発明者は、後縦靭帯骨化症患者では血中のｍｉＲＮＡ-３４０の発現量が顕著に増大していることを見出し、この分子を標的とすることで脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出が可能となることを見出した。

すなわち、本発明は、下記の特徴を有する脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、糖尿病モデル非ヒト動物、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、糖尿病モデル細胞、スクリーニング方法、脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法、脊柱靱帯骨化症診断用キット、及び脊柱靱帯骨化症治療剤を提供するものである。

（１）ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
（２）前記ＣＸＣＬ７遺伝子の機能の欠損又は抑制が、ＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換によるものである前記（１）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
（３）前記ＣＸＣＬ７遺伝子が、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である前記（１）又は（２）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
（４）前記ｍｉＲＮＡ−３４０の発現の亢進がｍｉＲＮＡ−３４０の導入によるものである前記（１）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
（５）前記ｍｉＲＮＡ−３４０が、配列番号６で表されるＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドである前記（１）又は（２）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
（６）ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ３４０の発現が亢進されていることを特徴とする糖尿病モデル非ヒト動物。
（７）ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする脊柱靱帯骨化症モデル細胞。
（８）平行線維性結合組織の細胞である前記（７）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル細胞。
（９）ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする糖尿病モデル細胞。
（１０）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に、該脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物より得られる細胞に、或いは前記（７）又は（８）に記載の脊柱靱帯骨化症モデル細胞に被験物質を投与することを特徴とする脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
（１１）前記被験物質を投与した後に、病変部の骨形態を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する、前記（１０）に記載の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
（１２）前記被験物質を投与した後に、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する、前記（１０）又は（１１）に記載の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
（１３）生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０を検出することを特徴とする脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法。
（１４）ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを用いる前記（１３）に記載の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法。
（１５）ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを含むことを特徴とする脊柱靱帯骨化症診断用キット。
（１６）ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする脊柱靱帯骨化症治療剤。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物及び本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞によれば、脊柱靱帯骨化症のモデルを提供することができる。また、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物及び本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞によれば、これらを用いることにより脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニングを行うことができる。また、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物及び本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞によれば、脊柱靱帯骨化症発症メカニズムの解明に寄与する。
本発明の糖尿病モデル非ヒト動物及び本発明の糖尿病モデル細胞によれば、糖尿病のモデルを提供することができる。
本発明の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法、及び脊柱靱帯骨化症診断用キットによれば、脊柱靱帯骨化症の病状に関する情報を得ることができる。
本発明の脊柱靱帯骨化症治療剤によれば、脊柱靱帯骨化症の治療が可能となる。

ターゲッティングベクター及びターゲッティングベクターで置き換えられるマウスゲノムを表す模式図である。 ノックアウトマウス（KO）と野生型マウス（WT）の体重変化を比較したグラフである。 ノックアウトマウスと野生型マウスの血中及び尿中グルコースの値を比較したグラフである。 ノックアウトマウスと野生型マウスの飲水量を比較したグラフである。 ノックアウトマウスの脊椎の縦断面の３Ｄ−ＣＴ画像である。 後縦靭帯骨化症の分類を示す模式図である。 ノックアウトマウスの後縦靭帯にみられる靭帯骨化の様子を示す写真である。 骨形態計測のための標識物質投与のスケジュールを説明する図である。 ノックアウトマウスの膵臓ランゲルハンス島における、グルカゴンの分泌の様子を示す写真である。 ノックアウトマウスの膵臓組織のＨＥ染色像である。 後縦靭帯骨化症患者と健常者の血漿中のｍｉＲ−３４０の発現量を比較したグラフである。 in situ hybridizationによるｍｉＲ−３４０の発現の様子の解析結果を示す画像である。 後縦靭帯骨化症の連続型（continuation type）の患者と混合型（mixed type）の患者でのＣＸＣＬ７タンパク質発現量を比較したグラフである。 FACS (fluorescence activated cell sorting)を行い、骨化を示すBMP-2タンパク質を発現する細胞を測定した結果を示すグラフである。（Ｂ）ウマ間葉系幹細胞にPRELP遺伝子を導入して作製した靭帯組織の細胞に対する計測結果，（Ａ）該靭帯組織をshRNA-CXCL7にてノックダウンした後の靭帯組織の細胞に対する計測結果。 shRNAによってＣＸＣＬ７が抑制された細胞、及びmiR-340 inhibitorによってmiR-340が抑制された細胞における、骨化の程度を示す染色結果である。 shRNAによってＣＸＣＬ７が抑制された細胞、miRNA-340が導入された細胞、及びmiR-340 inhibitorによってmiR-340が抑制された細胞における、ＣＸＣＬ７及び骨化マーカーの発現量を比較したグラフである。 脊椎組織の細胞から抽出した、ＴＲＡＦ３及びユビキチンの電気泳動像を示す画像である。 ノックアウトマウスの脊椎組織及びヒトOPLL患者の脊椎組織に対し、ユビキチン抗体染色を行った結果を示す画像である。

≪脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物≫
本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されているものである。

＜第一実施形態＞
本実施形態に係る脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されているものである。
遺伝子の機能が欠損しているとは、遺伝子産物が動物体内に全く存在しないか、遺伝子産物が動物体内に存在していても、その機能が喪失している状態の両方を含む。ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されていることは、モデル動物種の正常群（野生型）と比較して、有意にＣＸＣＬ７の機能が欠損又は抑制されている状態を指す。遺伝子の機能が抑制されているとは、脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態若しくは形質が表れる、又は脊柱靱帯骨化症を発症させることのできる程度に遺伝子の機能が抑制されていることを指す。遺伝子産物としては、転写産物であるmRNA、それが翻訳されたタンパク質が挙げられる。動物体内における遺伝子機能の欠損及び抑制は、遺伝子産物の構造変化、遺伝子産物の量の低下等によって引き起こされることが知られている。
したがって、前記ＣＸＣＬ７遺伝子の機能の欠損又は抑制は、ＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換によって生じたものを例示することができる。

ＣＸＣＬ７遺伝子とはＣＸＣＬ７構造遺伝子であり、ＣＸＣＬ７遺伝子の発現制御領域としてはプローモーター、サイレンサー、エンハンサー等が挙げられる。

前記「非ヒト動物」とは、ヒト以外の動物であれば特に制限されないが、哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類に分類される動物であることがさらに好ましい。非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サルが挙げられる。

配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ヒトのＣＸＣＬ７タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２で表される塩基配列は、ヒトのＣＸＣＬ７遺伝子の塩基配列（コーディング領域の配列）である。
配列番号３で表されるアミノ酸配列は、マウス（Mus musculus）のＣＸＣＬ７タンパク質（Ppbp（pro-platelet basic protein）タンパク質）のアミノ酸配列である。配列番号４で表される塩基配列は、マウスのＣＸＣＬ７遺伝子（ppbp遺伝子）の塩基配列（コーディング領域の配列）である。

モデル動物となる非ヒト動物のＣＸＣＬ７遺伝子は、既にヒト又はマウスのＣＸＣＬ７遺伝子のオーソログであることが報告されているものについては、その情報に基づいて判断可能である。また、ヒト又はマウスのＣＸＣＬ７遺伝子のオーソログであることが報告されていないものについても、当業者であれば、例えば、上記ヒト又はマウスのＣＸＣＬ７遺伝子の配列をもとに、公知の手法を用いて、各非ヒト動物におけるヒト又はマウスのＣＸＣＬ７遺伝子のホモログ及びオーソログを判断することができる。

モデル動物となる非ヒト動物のＣＸＣＬ７遺伝子の一例として、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脊柱靱帯骨化症改善活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脊柱靱帯骨化症改善活性を有するポリペプチド

前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。

前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号３で表されるアミノ酸配列との同一性は、８０％以上であれば特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。

アミノ酸配列同士の同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。

モデル動物となる非ヒト動物のＣＸＣＬ７遺伝子にスプライシングバリアントや、トランケート型タンパク質が存在する場合、それらもＣＸＣＬ７遺伝子産物として含まれる。

本実施形態のモデル動物に複数のＣＸＣＬ７対立遺伝子がある場合、ＣＸＣＬ７遺伝子の欠失、挿入、付加、若しくは置換は、モデル動物となる動物に脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態若しくは形質が表れる、又はモデル動物となる動物が脊柱靱帯骨化症を発症する範囲において、一部のＣＸＣＬ７対立遺伝子における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換であってもよい。マウスを例とすると、例えば、２つのＣＸＣＬ７対立遺伝子のうち、片方のＣＳＣＬ７遺伝子における欠失、挿入、付加、若しくは置換によりＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されていてもよい。

＜第二実施形態＞
本実施形態の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されているものである。なお、先に記載の［第一実施形態］と共通する点については、説明を省略する。
配列番号５及び６で表されるＲＮＡ配列は、それぞれヒト及びマウスのｍｉＲＮＡ−３４０の核酸配列である。
ｍｉＲＮＡの発現が亢進されているとは、モデル動物種の正常群（野生型）と比較して、有意にｍｉＲＮＡの発現量が増加している状態を指す。
ｍｉＲＮＡの発現の亢進は、例えば、モデル動物となる動物の体内へｍｉＲＮＡ−３４０を導入することにより生じさせることができる。ここで、ｍｉＲＮＡ−３４０とは、ｍｉＲＮＡ−３４０そのものの他、Primary miRNA（pri-miRNA）に代表されるｍｉＲＮＡ前駆体、並びにゲノム上にコードされるｍｉＲＮＡ−３４０の対応領域及びｍｉＲＮＡ前駆体の対応領域を含む。ｍｉＲＮＡ−３４０を導入するとは、ゲノム上に導入されていてもよく、動物体内に導入されゲノム上に導入されていなくてもよい。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態又は形質を有することが好ましい。本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、脊柱靱帯骨化、四肢麻痺、低代謝回転骨状態、脊髄側皮質骨幅菲薄化、糖尿病発症、I型糖尿病発症、高血糖、高グルカゴン値、糖尿病性腎症、ＢＭＩ（体格指数：Body Math Index）の肥満を示す高値、及びｍｉＲＮＡ−３４０高発現からなる群から選ばれる少なくとも１つの病態又は形質を有していることがより好ましい。これらの病態又は形質は、脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態又は形質である。
本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物由来の個体（次世代個体等）であっても、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されており、且つ脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態又は形質を有する場合には、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に含めるものとする。

ヒトの脊柱靱帯骨化症患者では、高血糖の病態を呈し、糖尿病を併発する場合がある。また後述実施例で作製したＣＸＣＬ７ノックアウトマウスでも、ヒトの場合と同様に糖尿病の病状を示していた。このことから、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ３４０の発現が亢進されていることを特徴とする糖尿病モデル非ヒト動物を包含する。
本発明の糖尿病モデル非ヒト動物は、糖尿病発症、I型糖尿病発症、高血糖、高グルカゴン値、糖尿病性腎症、及びＢＭＩ（体格指数：Body Math Index）の肥満を示す高値、からなる群から選ばれる少なくとも１つの病態又は形質を有していることがより好ましい。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物及び本発明の糖尿病モデル非ヒト動物の製造方法は、モデル非ヒト動物となる動物の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現を亢進させることができるものであれば特に制限されず、それぞれＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の導入に代表される。これらは、公知のトランスジェニック動物等の製造方法に沿って実施することができる。例えば、人為的なゲノムへの変異導入、遺伝子ターゲッティングによるノックアウト若しくはノックダウン、ＲＮＡ干渉、リボザイム等を利用したノックダウンを例示できる。

ＣＸＣＬ７を標的とするＲＮＡ干渉を誘導する方法としては、ＣＸＣＬ７の発現を抑制し得るＲＮＡｉ誘導性核酸をモデル動物となる非ヒト動物の細胞に導入することが挙げられる。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、配列番号４で表される塩基配列に基づいて設計されたものが挙げられ、配列番号４で表される塩基配列の全部又は部分配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な配列からなるアンチセンス鎖を有する核酸が挙げられる。前記部分配列の配列長としては、１９〜３４１塩基、２０〜１００塩基、２１〜３９塩基等が挙げられる。
配列番号４で表される塩基配列の部分配列からなるセンス鎖としては、配列番号９で表される塩基配列中の５番目から２３番目の塩基からなる塩基配列が特に好ましい。

ＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換も、当業者に一般的な方法により実施することができる。モデル動物となる動物にｍｉＲＮＡ−３４０を導入することも、当業者に一般的な方法により実施することができる。例えば、後述の実施例で示すように、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いた遺伝子組み換え技術により実施することができる。

本発明の一実施形態として、上記の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている非ヒト動物を、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物として使用する方法を提供する。
本発明の一実施形態として、上記の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている非ヒト動物を、糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法を提供する。

≪脊柱靱帯骨化症モデル細胞・・糖尿病モデル細胞≫
本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞は、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されているものである。
ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている状態としては、上記≪脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物≫において説明したものと同様である。また、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法及び糖尿病モデル細胞について、上記≪脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物≫等において説明した内容を、動物を細胞と読み替えることにより説明可能な点について、説明を省略する。

脊柱靱帯骨化症モデル細胞の、細胞の種類は特に制限されないが、平行線維性結合組織の細胞であることが好ましく、腱・又は靭帯の細胞であることがより好ましい。「平行線維性結合組織」とは、膠原線維が一方向に並列配列した密性結合組織をいい、例えば、腱又は靭帯である。平行線維性結合組織の細胞とは、通常の平行線維性結合組織を構成している細胞である。腱又は靭帯の細胞とは、通常の腱又は靭帯を構成している細胞である。
平行線維性結合組織の細胞は、他の種類の細胞から分化誘導されて得られた平行線維性結合組織の細胞、又は、他の種類の細胞から分化誘導されて得られた平行線維性結合組織様の細胞であってもよい。腱又は靭帯の細胞は、他の種類の細胞から分化誘導されて得られた腱若しくは靭帯の細胞、又は、他の種類の細胞から分化誘導されて得られた腱様若しくは靭帯様の細胞であってもよい。
ここで、他の種類の細胞とは、多能性細胞、幹細胞（人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞）、腱・靭帯前駆細胞、線維芽細胞を例示できるが、これらの細胞に制限されない。
平行線維性結合組織様の細胞とは、既知の平行線維性結合組織の前駆細胞又は平行線維性結合組織の細胞に顕著な様々な表現型のうち少なくとも1つを有するものである。腱様若しくは靭帯様の細胞とは、既知の腱・靭帯前駆細胞又は腱・靭帯細胞に顕著な様々な表現型のうち少なくとも1つを有するものである。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞は、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物と同様に脊柱靱帯骨化症モデルとして使用可能であり、製造や扱いが容易であって利便性に優れる。

脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法は、平行線維性結合組織の細胞の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現を亢進させることで行うことができる。平行線維性結合組織の細胞の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現を亢進させる方法については、上記≪脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物≫において説明したものと同様であるため、説明を省略する。
脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法は、例えば、後述の実施例で示すように、ＣＸＣＬ７遺伝子に対するＲＮＡ干渉により、ＣＸＣＬ７の発現を抑制することにより実施することができる。ＲＮＡ干渉によるものとしては、ＣＸＣＬ７に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸等を細胞に導入することを例示できる。
前記平行線維性結合組織の細胞は、他の種類の細胞から分化誘導されたものであってもよい。他の種類の細胞とは、上記脊柱靱帯骨化症モデル細胞において説明したものと同様のものを例示でき、間葉系幹細胞が好ましい。

間葉系幹細胞から分化誘導して平行線維性結合組織を得る方法としては、特開２０１３−９４０９８号明細書「平行線維性結合組織の製造方法」に記載の、Proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein（ＰＲＥＬＰ）を用いる方法が挙げられる。

ＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現を亢進させる対象としては、平行線維性結合組織又は平行線維性結合組織の細胞が好ましい。また、平行線維性結合組織は、他の種類の細胞から分化誘導されて得られたものであってもよいので、任意の細胞でＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現を亢進させた後に、これを平行線維性結合組織又は平行線維性結合組織の細胞へと分化誘導してもよい。

したがって、脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法の一実施形態として、
ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養した後、培養された前記間葉系幹細胞に対して、ＲＮＡ干渉によりＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制可能な核酸又は該核酸を発現可能なベクターを導入することを含む脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法を例示できる。
また、別の、脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法の一実施形態として、
間葉系幹細胞に対してＲＮＡ干渉によりＣＸＣＬ７遺伝子の機能を欠損又は抑制可能な核酸又は該核酸を発現可能なベクターを導入した後、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で、前記間葉系幹細胞を培養することを含む脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法を例示できる。

更には、脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法の一実施形態として、
ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養した後、培養された前記間葉系幹細胞に対して、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを導入することを含む脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法を例示できる。
また、別の、脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法の一実施形態として、
間葉系幹細胞に対して、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを導入した後、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で、前記間葉系幹細胞を培養することを含む脊柱靱帯骨化症モデル細胞の製造方法を例示できる。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物の場合と同様に、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞は、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ３４０の発現が亢進されている糖尿病モデル細胞を包含する。

本発明の一実施形態として、上記の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている細胞を、脊柱靱帯骨化症モデル細胞として使用する方法を提供する。
本発明の一実施形態として、上記の、ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されている細胞を、糖尿病モデル細胞として使用する方法を提供する。

≪スクリーニング方法≫
本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法は、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に、該脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物より得られる細胞に、又は本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞に被験物質を投与するものである。投与される被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤の有効成分の候補である。
被験物質としては特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞、本発明に係る脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物から得られた細胞、及び該細胞の集合である組織、器官も脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に由来する表現型を有しているので、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に使用可能である。また、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物と掛け合わせて得られた個体も、脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態又は形質を有する場合には、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に使用可能である。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、及び本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞は、脊柱靱帯骨化症に特徴的な病態又は形質を示すため、被験物質の投与／非投与によるこれらの病態又は形質の違いを指標として、被験物質が脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる。前記形質とは、脊柱靱帯骨化、骨形態、血中成分、行動パターン、遺伝子発現量、ＢＭＰ−２、ＲＡＮＫＬ等の骨組織のマーカーの発現量など測定可能なあらゆる項目を対象とし得る。なかでも、脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物を用いる場合には、脊柱靱帯骨化症の最たる特徴である脊柱靱帯骨化をみることが、被験物質による効果を的確に把握するうえで好ましい。脊柱靱帯骨化症モデル細胞を用いる場合には、骨組織のマーカータンパク質量を測定することが、被験物質による効果を的確に把握するうえで好ましい。

本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、病変部の骨形態を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
例えば、骨組織のマーカーの発現を指標にする場合、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル細胞に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較して、骨組織のマーカーの発現が減少している場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤となり得ると判定することができる。
脊柱靱帯骨化症では、本来靭帯であるべき部分が骨化するという特徴的な病態を示す。したがって、被験物質を投与した後に、靭帯に異所的に形成された骨の骨形態の異常が改善されたことを指標として、被験物質が脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤となり得るかどうかを判定することができる。骨形態の計測項目としては、骨量、骨面積、骨芽細胞数、石灰化速度、破骨細胞面等を挙げることができる。例えば、骨量の変化を指標にする場合、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較して、靭帯に異所的に形成された骨の骨量が減少している場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤となり得ると判定することができる。

骨形態の計測にあたっては、標識物質を用いて骨を標識することを行ってもよい。骨を標識することにより、より明確に骨形態の情報を得ることができる。標識物質としては、例えば抗体、蛍光物質、アリザリン等をあげることができる。なかでも、テトラサイクリン、カルセイン等の蛍光カルシウムキレート剤を標識物質として用いることが好ましい。蛍光カルシウムキレート剤を被験物質と同時期に投与することで、被験物質投与期間中に形成された骨を標識することができる。

本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
後述する実施例で示すように、本発明者は、ヒトの後縦靭帯骨化症患者の血中において、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現量が増加していることを見出した。したがって、本発明に係る脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較して、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現量が低い場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤の有効成分になり得ると判定することができる。
ｍｉＲＮＡ−３４０の発現量の測定は、PCR等従来公知の方法により容易に行うことができるので、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現量を指標として用いることで、スクリーニングをより効果的に行うことができる。

本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
後述する実施例で示すように、本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を検出した。したがって、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較してＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化のレベルが低い又は非存在の場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤の有効成分になり得ると判定することができる。Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化の検出は、質量分析等の公知の方法により行うことができる。
マウスのＥ３ユビキチンリガーゼのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。後述する実施例において示すように、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、少なくとも、配列番号１２で表されるアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び４２７番目のセリンが、リン酸化されていることが判明した。したがってこれらのアミノ酸のリン酸化を検出することで、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を検出してもよい。
配列番号１２以外のＥ３ユビキチンリガーゼであっても、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンに対応するアミノ酸部位のリン酸化を検出することで、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を検出してもよい。

本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、ＴＲＡＦ３（tumor necrosis factor-associated facor 3）のリン酸化を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
後述する実施例で示すように、本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、ＴＲＡＦ３のリン酸化を検出した。したがって、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較してＴＲＡＦ３のリン酸化のレベルが低い又は非存在の場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤の有効成分になり得ると判定することができる。ＴＲＡＦ３のリン酸化の測定は、質量分析等の公知の方法により行うことができる。
マウスのＴＲＡＦ３のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。後述する実施例において示すように、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、少なくとも、配列番号１３で表されるアミノ酸配列の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンが、リン酸化されていることが判明した。したがってこれらのアミノ酸のリン酸化を検出することで、ＴＲＡＦ３のリン酸化を検出してもよい。
配列番号１３以外のＴＲＡＦ３であっても、配列番号１３で表されるアミノ酸配列の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンに対応するアミノ酸部位のリン酸化のいずれか１以上を検出することで、ＴＲＡＦ３のリン酸化を検出してもよい。

本発明の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、ＴＺＦ−Ｌ（zinc finger protein TZF-L）のリン酸化を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
後述する実施例で示すように、本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出した。したがって、本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較してＴＺＦ−Ｌのリン酸化のレベルが低い又は非存在の場合、投与した被験物質は、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤の有効成分になり得ると判定することができる。ＴＺＦ−Ｌのリン酸化の測定は、質量分析等の公知の方法により行うことができる。
マウスのＴＺＦ−Ｌのアミノ酸配列を配列番号１５に示す。後述する実施例において示すように、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、少なくとも、配列番号１５で表されるアミノ酸配列の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンが、リン酸化されていることが判明した。したがってこれらのアミノ酸のリン酸化を検出することで、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出してもよい。
配列番号１５以外のＴＺＦ−Ｌであっても、配列番号１５で表されるアミノ酸配列の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンに対応するアミノ酸部位のリン酸化のいずれか１以上を検出することで、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出してもよい。

上記に説明した被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する各指標は、それぞれ単独で用いてもよく、複数を組合せて用いてもよい。

本発明の一実施形態として、糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法は、本発明の糖尿病モデル非ヒト動物に、該糖尿病モデル非ヒト動物より得られる細胞に、又は本発明の糖尿病モデル細胞に被験物質を投与するものである。
被験物質としては特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
本発明の糖尿病モデル細胞、本発明に係る糖尿病モデル非ヒト動物から得られた細胞、及び該細胞の集合である組織、器官も糖尿病モデル非ヒト動物に由来する表現型を有しているので、糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に使用可能である。また、糖尿病モデル非ヒト動物と掛け合わせて得られた個体も、糖尿病に特徴的な病態又は形質を有する場合には、糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法に使用可能である。

本発明の糖尿病モデル非ヒト動物、及び本発明の糖尿病モデル細胞は、糖尿病に特徴的な病態又は形質を示すため、被験物質の投与／非投与によるこれらの病態又は形質の違いを指標として、被験物質が糖尿病の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる。前記形質とは、糖尿病発症、I型糖尿病発症、高血糖、高グルカゴン値、血中成分、行動パターン、遺伝子発現量、糖尿病マーカーの発現量など測定可能なあらゆる項目を対象とし得る。なかでも、糖尿病モデル非ヒト動物を用いる場合には、糖尿病の最たる特徴である高血糖をみることが、被験物質による効果を的確に把握するうえで好ましい。糖尿病モデル細胞を用いる場合には、糖尿病のマーカータンパク質量を測定することが、被験物質による効果を的確に把握するうえで好ましい。

本発明に係る糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、糖尿病に関連する血中成分存在を示す値を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
例えば、血糖値を指標にする場合、本発明の糖尿病モデル細胞に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較して、血糖値が減少している場合、投与した被験物質は、糖尿病の予防剤又は治療剤となり得ると判定することができる。

本発明の糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法の一実施形態として、前記被験物質を投与した後に、アディポネクチンのリン酸化を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断することが挙げられる。
後述する実施例で示すように、本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの血中において、アディポネクチンのリン酸化を検出した。したがって、本発明の糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した群では、被験物質を投与していない群と比較してアディポネクチンのリン酸化のレベルが低い又は非存在の場合、投与した被験物質は、糖尿病の予防剤又は治療剤の有効成分になり得ると判定することができる。アディポネクチンのリン酸化の測定は、質量分析等の公知の方法により行うことができる。
マウスのアディポネクチンのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。後述する実施例において示すように、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、少なくとも、配列番号１４で表されるアミノ酸配列の６４番目のスレオニン、１１９番目のセリン及び１２７番目のスレオニンが、リン酸化されていることが判明した。したがってこれらのアミノ酸のリン酸化を検出することで、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出してもよい。
配列番号１４以外のアディポネクチンであっても、配列番号１４で表されるアミノ酸配列の６４番目のスレオニン、１１９番目のセリン及び１２７番目のスレオニンに対応するアミノ酸部位のリン酸化のいずれか１以上を検出することで、アディポネクチンのリン酸化を検出してもよい。

上記に説明した被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する各指標は、それぞれ単独で用いてもよく、複数を組合せて用いてもよい。

≪脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法≫
本発明の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法は、生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０を検出するものである。生体試料としては、脊柱靱帯骨化症が疑われる患者から採取された試料が挙げられ、バイオプシーに用いられる試料が挙げられる。
本発明者は、脊柱靱帯骨化症患者由来の生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０の発現量が増加していることを見出した。したがって、生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０を検出することにより、脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。また、正常対照群である健常者由来の生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０の発現量と比較して、被験者由来の生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０の発現量が有意に増加している場合、被験者が脊柱靱帯骨化症病変細胞を有しており、脊柱靱帯骨化症の罹患を検出できる。

本発明の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法には、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを用いてもよい。ここで、ｍｉＲＮＡ−３４０とは、ｍｉＲＮＡ−３４０の他、Primary miRNA（pri-miRNA）に代表されるｍｉＲＮＡ前駆体であってもよく、ｍｉＲＮＡ−３４０であることが好ましい。
ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブとしては、配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを例示できる。他にも、ｍｉＲＮＡ−３４０と特異的にハイブリダイズし得るものであれば、配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加されている塩基配列を有するポリヌクレオチドであっても、プローブとして同様に用いることができる。ここで、１〜数個とは、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。プローブは、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るものであれば、標識物質、酵素等の任意の物質が付加されていたり、種々の化学修飾を含んでいたり、また、少なくとも一部がPNA、LNA等の核酸類縁体により構成されていたりしてもよい。

本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を検出した。したがって、生体試料中のＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を検出することにより、脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。また、正常対照群である健常者由来の生体試料中のＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化レベルと比較して、被験者由来の生体試料中のＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化が検出された場合又はリン酸化レベルが有意に増加していた場合、被験者が脊柱靱帯骨化症病変細胞を有しており、脊柱靱帯骨化症の罹患を検出できる。

生体試料中のＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化であって、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンのリン酸化、を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンがリン酸化されたＥ３ユビキチンリガーゼは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
Ｅ３ユビキチンリガーゼ断片ポリペプチドであって、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンのリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

配列番号１２以外のＥ３ユビキチンリガーゼであっても、生体試料中のＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化であって、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンに対応するアミノ酸部位のリン酸化、を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１２以外のＥ３ユビキチンリガーゼであっても、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンに対応するアミノ酸部位がリン酸化されたＥ３ユビキチンリガーゼは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
配列番号１２以外のＥ３ユビキチンリガーゼであっても、Ｅ３ユビキチンリガーゼ断片ポリペプチドであって、配列番号１２に示すアミノ酸配列中の４１９番目のセリン及び／又は４２７番目のセリンに対応するアミノ酸部位のリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、ＴＲＡＦ３のリン酸化を検出した。したがって、生体試料中のＴＲＡＦ３のリン酸化を検出することにより、脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。また、正常対照群である健常者由来の生体試料中のＴＲＡＦ３のリン酸化レベルと比較して、被験者由来の生体試料中のＴＲＡＦ３のリン酸化が検出された場合又はリン酸化レベルが有意に増加していた場合、被験者が脊柱靱帯骨化症病変細胞を有しており、脊柱靱帯骨化症の罹患を検出できる。

生体試料中のＴＲＡＦ３のリン酸化であって、配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンのリン酸化のいずれか１以上を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンのいずれか１以上がリン酸化されたＴＲＡＦ３は、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
ＴＲＡＦ３断片のポリペプチドであって、配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及びは４１３番目のチロシンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

配列番号１３以外のＴＲＡＦ３であっても、生体試料中のＴＲＡＦ３のリン酸化であって、配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、４１３番目のチロシンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化、を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１３以外のＴＲＡＦ３であっても、配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位がリン酸化されたＴＲＡＦ３は、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
配列番号１３以外のＴＲＡＦ３であっても、ＴＲＡＦ３断片ポリペプチドであって、配列番号１３に示すアミノ酸配列中の２１１番目のスレオニン、４１２番目のセリン、及び４１３番目のチロシンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

本発明者は、ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの脊椎組織の細胞において、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出した。したがって、生体試料中のＴＺＦ−Ｌのリン酸化を検出することにより、脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。また、正常対照群である健常者由来の生体試料中のＴＺＦ−Ｌのリン酸化レベルと比較して、被験者由来の生体試料中のＴＺＦ−Ｌのリン酸化が検出された場合又はリン酸化レベルが有意に増加していた場合、被験者が脊柱靱帯骨化症病変細胞を有しており、脊柱靱帯骨化症の罹患を検出できる。

生体試料中のＴＺＦ−Ｌのリン酸化であって、配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのリン酸化のいずれか１以上を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのいずれか１以上がリン酸化されたＴＺＦ−Ｌは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
ＴＺＦ−Ｌ断片のポリペプチドであって、配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

配列番号１５以外のＴＺＦ−Ｌであっても、生体試料中のＴＺＦ−Ｌのリン酸化であって、配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化、を検出することにより脊柱靱帯骨化症病変細胞を検出することができる。
配列番号１５以外のＴＺＦ−Ｌであっても、配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位がリン酸化されたＴＺＦ−Ｌは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。
配列番号１５以外のＴＺＦ−Ｌであっても、ＴＺＦ−Ｌ断片ポリペプチドであって、配列番号１５に示すアミノ酸配列中の６７７番目のセリン、１６５２番目のメチオニン、及び１６６８番目のセリンのいずれか１以上に対応するアミノ酸部位のリン酸化を含むポリペプチドは、脊柱靱帯骨化症病変細胞のマーカーとして利用可能である。

上記に説明した、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現量、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化、ＴＲＡＦ３のリン酸化、ＴＺＦ−Ｌのリン酸化は、脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出において、それぞれ単独で用いてもよく、複数を組合せて用いてもよい。複数を組合せて用いる場合、その他の公知の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出に用いられる因子と組み合わせて用いてもよい。

脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物、脊柱靱帯骨化症モデル細胞、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法、脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法について説明したが、脊柱靱帯骨化症は糖尿病を併発するため、糖尿病を表すために使用される形質や、病態、指標、特徴等により、脊柱靱帯骨化症を間接的に検出してもよい。
同じく、糖尿病モデル非ヒト動物、糖尿病モデル細胞、糖尿病の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法、脊柱靱帯骨化症は糖尿病を併発するため、脊柱靱帯骨化症を表すために使用される形質や、病態、指標、特徴等により、糖尿病を間接的に検出してもよい。

≪脊柱靱帯骨化症診断用キット≫
本発明の脊柱靱帯骨化症診断用キットは、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを含むものである。当該プローブとしては、≪脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法≫において説明したものと同様のものを例示できる。
また、脊柱靱帯骨化症診断をより簡便にするという観点から、本発明の脊柱靱帯骨化症診断用キットは、ｍｉＲＮＡ−３４０の検出に必要な試薬類、器具類等を備えていることが好ましい。このように、ｍｉＲＮＡ−３４０の検出に必要な試薬類、器具類等をキット化することにより、脊柱靱帯骨化症診断をより簡便に行うことができる。

≪脊柱靱帯骨化症治療剤≫
本発明の脊柱靱帯骨化症治療剤の一実施形態は、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とするものである。
核酸がｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることにより、ｍｉＲＮＡの機能が阻害されることが知られている。したがって、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸は、ｍｉＲＮＡ−３４０の機能を阻害するので、脊柱靱帯骨化症治療剤として使用することができる。ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸が、任意の発現ベクターに組み込まれたものも、脊柱靱帯骨化症治療剤として使用することができる。ベクターを用いることにより、長期にわたる脊柱靱帯骨化症治療効果を得ることができる。

同様に、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現を抑制し得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とするもの、並びに、ｍｉＲＮＡ−３４０と競合してｍｉＲＮＡ−３４０の機能を阻害し得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とするものも、脊柱靱帯骨化症治療剤として例示できる。

＜医薬製剤＞
本発明の医薬の有効成分はｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターであるから、剤型は、吸収され易い非経口投与剤が好ましく、注射剤がより好ましい。非経口投与剤としては、注射剤、吸入剤、貼付剤、坐剤などが挙げられる。

（注射剤）
注射剤としては、病態靭帯内注射剤、静脈内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、点滴注射剤などが挙げられる。注射剤は、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液（注射剤用担体）に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが挙げられる。適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられる。溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。

注射剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100 w/v%、好ましくは約0.1〜30w/v%とすればよい。
注射剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターの含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100 w/v%、好ましくは約0.1〜30w/v%とすればよい。

（貼付剤）
貼付剤としては、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを含む基剤を支持体に支持させた硬膏剤、パップ剤、テープ剤、プラスター剤等が挙げられる。基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール4000等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。さらに、溶解補助剤、無機充填剤、pH調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などの添加剤が添加されていてもよい。

基剤中ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。
基剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターの含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。
これらは添付剤として使用するが、更に有効に実施するためには、添付した後、超音波浸透させることが推奨される。超音波浸透により、より効率的に患部に浸透させることが出来る。

（吸入剤）
吸入剤としては、エアゾール剤、吸入用粉末剤、吸入用液剤（例えば、吸入用溶液、吸入用懸濁剤等）、カプセル状吸入剤等が挙げられる。吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁させて使用する形態であってもよい。
吸入剤は常法に従い製造できる。例えば、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを乾燥粉末または液状にして、吸入噴射剤、担体、又はその両者に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造される。ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を粉末化する場合、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム等とともに微粉末にし、均一な混合物にするか、造粒して粉末剤を調製することができる。また、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を液状にする場合、水、生理食塩液、バッファー等の液状担体に溶解すればよい。
噴射剤としては、従来公知の噴射剤、例えば、代替フロン、液化ガス噴射剤（例えば、フッ化炭化水素、液化石油、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル等）、圧縮ガス（例えば、可溶性ガス（例えば、炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）、不溶性ガス（例えば、窒素ガス等）などが用いられる。

吸入剤には、さらに、必要に応じて添加剤を配合してもよい。添加剤としては、吸入用液剤の場合は、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、着色剤、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、増粘剤（例えば、カリボキシビニルポリマー等）、吸収促進剤等が挙げられる。また、吸入用粉末剤の場合は、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等）、矯味剤（例えば、クエン酸、メントール、グリチルリチンアンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉末等）、結合剤（例えば、デンプン、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、白糖等）、賦形剤（例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット、マルトース、セルロース等）、着色剤、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム等）、吸収促進剤（胆汁酸塩、キトサン等）等が挙げられる。

噴霧剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の含有量は、吸入用液剤の場合は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100 w/v%、好ましくは約0.1〜30w/v%とすればよい。また、吸入用粉末剤の場合は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。
噴霧剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターの含有量は、吸入用液剤の場合は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100 w/v%、好ましくは約0.1〜30w/v%とすればよい。また、吸入用粉末剤の場合は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。

（座剤）
坐剤は、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを通常用いられる坐薬用基剤と混合することにより調製されるものを例示できる。
座剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。
座剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターの含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。

（経口投与剤）
経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。固形製剤は、上記有効成分に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製されるものを例示できる。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、上記の有効成分を、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製されるものを例示できる。

経口投与剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜50重量％とすればよい。
経口投与剤中のｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターの含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜100重量％、好ましくは約0.1〜30重量％とすればよい。

＜使用方法＞
投与経路は、注射投与（病態靭帯内注入、静脈内注入、皮下注入、皮内注入、筋肉内注入、点滴）、経皮投与、気道内投与、直腸内投与、経口投与などが挙げられる。特に、注射投与が好ましく、病態靭帯内注入がより好ましい。
本発明の治療剤の使用対象は、脊柱靭帯骨化症患者である。脊柱靭帯骨化症には、後縦靱帯骨化症、黄色靱帯骨化症、及び前縦靱帯骨化症が含まれる。本発明の治療剤の対象としては、特に後縦靭帯骨化症患者等が好適である。
本発明の脊柱靭帯骨化症治療剤の使用量は、対象の症状や年齢などにより異なるが、非経口投与の場合、ヒト成人に対する1日投与量は以下の通りである。

即ち、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の1日投与量が、乾燥重量に換算して、約0.01 mg〜500 mgであることが好ましく、約0.1 mg〜200 mgであることがより好ましい。また、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターのヒトへの1日投与量が、乾燥重量に換算して、約0.1μg〜1 gであることが好ましく、約0.1μg〜500 mgであることがより好ましい。
また、経口投与の場合、ヒト成人に対する1日投与量は以下の通りである。
即ち、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸の1日投与量が、乾燥重量に換算して、約0.1 mg〜1000 mgであることが好ましく、約1 mg〜500 mgであることがより好ましい。また、ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターのヒトへの1日投与量が、乾燥重量に換算して、約1μg〜1000mgであることが好ましく、約1μg〜500 mgであることがより好ましい。

脊柱靱帯骨化症治療剤の有効量を、ヒト脊柱靭帯骨化症患者に投与することは、脊柱靭帯骨化症の治療方法として実施することができる。脊柱靱帯骨化症治療剤の有効量としては、上記に例示したものが挙げられる。
本発明において、「治療」には、治癒させること、症状を緩和又は改善すること等が含まれる。

以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの作製］
発明者らはＰｐｂｐ遺伝子（マウスのＣＸＣＬ７遺伝子）のゲノム配列の核酸配列に基づき、Ｐｐｂｐゲノム配列のエクソン１とエクソン２の間と、Ｐｐｂｐゲノム配列のエクソン３の３’arm側にloxP配列が組み込まれたターゲッティングベクターを構築した。図１に、構築したターゲッティングベクターの模式図、およびターゲッティングベクターで置き換えられるゲノムの模式図を示す。このターゲッティングベクターを、エレクトロポレーションにより、マウスＥＳ細胞株であるＣ５７ＢＬ／６由来ＲＥＮＫＡに導入した。その中から相同組み換えを起こしたＥＳ colonyを選択した。選択したＥＳ細胞をマウス胚の胚盤胞に移植し、生殖系列細胞に導入した。次いで、Ｐｐｂｐ遺伝子コンディショナル・ノックアウトマウスの第２世代（Ｆ２）ヘテロ接合体マウス（ＰｐｂｐｄＥ^２Ｅ3/＋：ＣＡＧ−Cree）と野生型マウスとの自然交配で、第３世代（Ｆ３）マウスを作製し、産子の組織よりゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲ解析により遺伝型を解析した。ターゲッティングベクターのloxP配列に囲まれた部分をＣｒｅにより欠失させ、Ｐｐｂｐ遺伝子のエクソン２及びエクソン３を欠失させて、Ｐｐｂｐ遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合体（Ｐｐｂｐ^{ｄＥ２Ｅ３／＋}）を得た。Creトランスジーンが除去されたF3マウス（Ppbp^dE2E3/+）が目標の2ペア得られなかったため、Creトランスジーンが除去されたF3ヘテロ接合体マウス（Ppbp^dE2E3/+）♂と野生型マウス♀との自然交配によりF4産子を作製した。
F4産子の体組織よりDNA抽出後、遺伝型解析から、9 匹（♂3 匹、♀6 匹）のF4マウスが、Creトランスジーンが除去されたヘテロ接合体マウス（Ppbp^dE2E3/+）であると判定した。そして、ヘテロ接合体同士の自然交配により、Ｐｐｂｐ遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスのホモ接合体（Ｐｐｂｐ^{ｄＥ２Ｅ３／ｄＥ２Ｅ３}）を得た。以下、Ｐｐｂｐ遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスのホモ接合体を「ノックアウトマウス」と略す。

ノックアウトマウスのホモの雄：雌の誕生比は、２：１であった。ヒトの脊柱靱帯骨化症患者の男：女比も約２：１であることから、この数値は、ヒトの脊柱靱帯骨化症患者の男女比と同様の値といえる。

［ＣＸＣＬ７ノックアウトマウスの表現型］
生後２ヶ月後までは、野生型のマウスとノックアウトマウスでは、両者の体重に違いは見られなかった。しかし、生後２ヶ月を過ぎると、ノックアウトマウスでは、野生型のマウスと比べて、体重が徐々に増加していった（図２）。ノックアウトマウスでは、野生型のマウスと比べて、血中及び尿中グルコースの値並びにＨｂＡ１ｃレベルも、上昇していた（図３）。ノックアウトマウスでは、野生型のマウスと比べて、多飲多尿であった（図４）。ノックアウトマウス（ホモ）の尿中カリウムを測定した結果、103.2 mEq/L （正常値 3.6〜5.0 mEq/L）と高値を示した。この値は、インスリン欠乏、腎不全などを意味している。これらの結果から、マウスが糖尿病性腎症を発症していることが示唆された。
ノックアウトマウスの内臓脂肪を計測したところ、肥満度指数（ＢＭＩ）は５０かそれ以上であった。３DマイクロX線CT（リガク社製）により皮下脂肪、内臓脂肪組織の量を確認したところ、皮下脂肪及び精巣の状態から、脂肪肝と示唆された。
生後４ヶ月では、ノックアウトマウスの後肢の運動機能が徐々に低下し、歩行困難となった。マウスに微温湯中での水泳をさせた場合、通常野生型のマウスでは、後肢を動かすことによって泳ぐことができるのだが、ノックアウトマウスでは、後肢に持続性の硬直が見られ、後肢に著しい機能障害が認められた。
ノックアウトマウスのなかには、網膜症を発症したものがいた。

図５は、生後８か月のノックアウトマウス（ホモ）の３Ｄ−ＣＴ画像である。画像は脊椎の縦断面で取得したものである。図中の矢印先端部に靭帯の骨化が確認された。ノックアウトマウスでは、誕生から８ヶ月（中年期）以降に、脊柱靱帯骨化症を発症した。
後縦靭帯骨化症は、靭帯の骨化状態により、連続型（Ａ）、分節型（Ｂ）、混合型（Ｃ）、その他：椎間板限局型（Ｄ）に分類される（図６参照、Journal of Bone and Mineral Metabolism, November 1999, Volume 17, Issue 4, pp 296-300）。これらの型のうち、連続型（Ａ）が最も重篤な病態である。３Ｄ−ＣＴ画像解析の結果、ノックアウトマウス（ホモ）の骨化状態は、連続型（Ａ）であった。

図７に、ノックアウトマウス（ホモ・雄）の後縦靭帯の写真を示す。脊椎の１番（Ｌ１）の部分の後縦靭帯に、靭帯骨化が明確に確認できた。図７から明らかなように、球状の骨組織が観察され、その下方にも連続した骨組織が観察された。

（骨形態計測）
骨形態計測を簡便に行うため、計測対象のマウスに標識物質を投与した後に、骨形態計測を行った。
図８は、マウスへの標識物質投与のスケジュールを説明する図である。Sacrifice５日前に、第一回骨標識処理として、標識物質テトラサイクリン（ＴＣ）をマウスに投与した。第一回骨標識処理の７２時間後に、第二回骨標識処理として標識物質カルセイン（ＣＬ）をマウスに投与した。これらの処理により、非脱灰組織での骨代謝情報を明確にすることができる。

続いて、生後８か月のマウスの脊椎の形態計測を、連続脊椎矢状断の標本を用いて行った。表１に、海綿骨、Ｌ１を計測対象とした骨形態計測の結果の一部を示す。

海綿骨を計測対象とした骨形態計測の結果から、ノックアウトマウス（ホモ）では、野生型に比べて石灰化速度が低値であり、全体的に低代謝回転骨の状態であった。これは、ヒトの異所性骨化の症例と等しい。

表２に、皮質骨を計測対象とした骨形態計測の結果の一部を示す。

皮質骨を計測対象とした骨形態計測の結果から、ノックアウトマウス（ホモ）では、野生型に比べて脊髄側の皮質骨幅の菲薄化が見られた。

（糖尿病関連）
糖尿病に関して、さらに解析を行った。
図９は、ノックアウトマウスの膵臓のランゲルハンス島における、グルカゴンの分泌の様子を示す顕微鏡写真である。写真中の円形の像は、ＤＡＰＩ染色された核由来のシグナルである。この核由来のシグナルの他に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識されたグルカゴンが確認でき、ノックアウトマウスでのグルカゴン陽性が確認された。
また、ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、血清中のグルカゴン値が有意に高かった。後縦靭帯骨化症の患者でも、ノックアウトマウスと同じく、健常者と比較して、血清中のグルカゴン値が高かった。

図１０は、ノックアウトマウスの膵臓組織の、ＨＥ染色像である。膵臓組織のインスリンの分泌は確認されず、毛細血管からの出血、萎縮性変化及びβ細胞の数の減少が確認された。

これらの結果から、ノックアウトマウスはＩ型糖尿病を合併していることが示唆された。

［ｍｉＲ−３４０］
ヒトの後縦靭帯骨化症は、家系的な要因があるとされている。しかし、発明者らによる患者らのＣＸＣＬ７の解析の結果では、ＣＸＣＬ７のエクソンの異常及びＳＮＰは発見されなかった。そこで、発明者らは、ＣＸＣＬ７タンパク質の発現量がｍｉｃｒｏＲＮＡにより影響されているのではとの考えのもと、ヒトの後縦靭帯骨化症患者の組織及び血液サンプルに対して、ｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ解析を行った。
その結果、ヒトの後縦靭帯骨化症患者らでは、健常者と比較してｍｉＲ−３４０の発現量が有意に上昇していることが明らかとなった。

・リアルタイムＰＣＲ
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、miRCURY RNA Isolation (Exiqon, Vedbaek)を用い、製品添付のプロトコルに沿って抽出した。RNA integrityは、Agilent 2100 Bioanalyserを用いて解析した。integrity valueが9.0又はそれ以上のＲＮＡサンプルを逆転写した。逆転写には、Superscript VILO cDNA Synthesis Kit（Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いた。次いで、StepOnePlus Real-Time PCR Analysis System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)により、リアルタイムＰＣＲを行った。解析に用いたプローブはExiqonから入手した。
リアルタイムＰＣＲで使用したプローブの配列を以下に示す。
Has-miR-340：５’−uccgucucaguuacuuuauagc−３’（配列番号７）
図１１に、リアルタイムＰＣＲにより求めた血漿中のｍｉＲ−３４０の発現量を示す。ヒトの後縦靭帯骨化症患者の血漿中のｍｉＲ−３４０の発現量は、健常者と比べて有意に高値を示した。

・In situ hybridization
In situ hybridization はmiRCURY LNA microRNA ISH Optimization (Exiqon, Vedbaek, Denmark)を用いて行った。ハイブリダイゼーションは６５℃で行った。
In situ hybridizationで使用したプローブの配列を以下に示す。
Has-miR-340：５’−aatcaG(L)t5(L)aT(L)tG(L)cT(L)ttataa_N(6)_Y−３’（配列番号８）
上記配列中、小文字はＤＮＡを表し、大文字（Ｌ）は大文字がＬＮＡであることを表す。Ｎ(６)は、ａｍｉｎｏ Ｃ６ ｌｉｎｋｅｒを表し、ＹはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８を表す。５は、５−メチルシチジン（５−ｍＣ）を表し、５(Ｌ)は、５−ｍＣのＬＮＡを表す。
図１２は、ノックアウトマウスのＬ５−６部分と、ヒトの後縦靭帯骨化症患者のＣ５−６部分の組織におけるｍｉＲ−３４０の分布を、in situ hybridization により解析した結果を示す写真である。図１２中、島状に点在しているシグナルは、核のＤＡＰＩ染色像である。ノックアウトマウス及び後縦靭帯骨化症患者の両者ともに、核由来のシグナルの他に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８で標識されたプローブ由来のシグナルが組織全体で確認できた。

［ＣＸＣＬ７タンパク質発現量と後縦靭帯骨化症の分類］
ＣＸＣＬ７タンパク質発現量と後縦靭帯骨化症の病態との関連を調べるため、前述した後縦靭帯骨化症の病態の分類（図６参照）のうち、連続型（Ａ）の病態にある患者と混合型（Ｃ）の病態にある患者の血清中のＣＸＣＬ７タンパク質発現量を求めた。解析は、ELISA Kit (Ray Biotech, Norcross GA) を用いて行った。ＣＸＣＬ７抗体はキット付属のウェルに固定されているものを使用した。
図１３に結果を示す。より病態の軽い混合型（Ｃ）の患者におけるＣＸＣＬ７の発現量の方が、連続型（Ａ）の患者のＣＸＣＬ７の発現量よりも低い値であった。このことは、ＣＸＣＬ７の発現量と後縦靭帯骨化症の重篤度合いの間に、相関があることを示している。

［幹細胞から誘導した靭帯組織でのCXCL7の抑制］
ウマ間葉系幹細胞にPRELP遺伝子を導入し、靭帯組織を作製した。
得られた靭帯組織に対しshRNA-CXCL7にてCXCL７タンパク質を抑制した。陰性対照として、shRNA-CXCL7の代わりにshRNA-GAPDHを使用した。
shRNA-CXCL7の配列を以下に示す。
shRNA-CXCL7：５’−aaaagaacccattgcaaccaagtttggatccaaacttggttgcaatgggttc−３’（配列番号９）
shRNA-GAPDHの配列を以下に示す。
shRNA-GAPDH：５’−aaaacgggaagcttgtcatcaatttggatccaaattgatgacaagcttcccg−３’（配列番号１０）
上記shRNA-CXCL7の配列をｐLV−H1−CMV−greenベクター（BiOSETTIA）に組み込み、幹細胞及び幹細胞から靭帯を誘導した組織のそれぞれに対し、shRNA-CXCL7を導入した。shRNA-GAPDHに関しても同様に導入した。ベクター導入後の細胞をシングル細胞にした後、BMP-2抗体にて標識し、FACSにてBMP-2抗体が吸着している細胞をカウントした（n=3）。BMP-2は、骨誘導タンパク質で、骨形成因子である。得られたデータの一部を図１４に示す。図１４（Ｂ）はウマ間葉系幹細胞にPRELP遺伝子を導入して作製した靭帯組織の細胞に対する計測結果である。図１４（Ａ）は、該靭帯組織をshRNA-CXCL7にてノックダウンした後の靭帯組織の細胞に対する計測結果である。結果を表３に示す。

幹細胞及び同じ幹細胞から誘導した靭帯組織では、BMP-2の陽性細胞の値に変化は見られなかったが、該靭帯組織をshRNAにてCXCL7をノックダウンするとBMP-2陽性細胞の値が増加を示した。このことは、幹細胞から誘導した靭帯組織でのCXCL7の抑制が、靭帯骨化を誘発することを意味する。

［ｍｉＲ−３４０の抑制］
・石灰化染色
マウスの骨芽細胞MC3T3―E1に、shRNA-CXCL7を導入した。また、マウスの骨芽細胞MC3T3―E1に、miR-340 inhibitorを導入した。陰性対照として、shRNA-CXCL7の代わりにshRNA-LacZを使用した。
shRNA-CXCL7の配列は、上記の配列番号９で表される塩基配列と同一である。
shRNA-CXCL7：５’−aaaagaacccattgcaaccaagtttggatccaaacttggttgcaatgggttc−３’（配列番号９）
miR-340 inhibitorは、市販のＥＸＩＱＯＮ社製のmiRCURY LNA Power Inhibitor,has-miR-340を使用した。has-miR-340はｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズする核酸である。
shRNA-lacZの配列を以下に示す。
shRNA-lacZ：５’−aaaagcagttatctggaagatcaggttggatccaacctgatcttccagataactgc-３’（配列番号１１）
上記shRNA-CXCL7の配列をｐLV−H1−CMV−greenベクター（BiOSETTIA）に組み込み、MC3T3-E1に対し、shRNA-CXCL7を導入した。miR-340 inhibitor とshRNA-lacZに関しても同様に導入した。
次いで、細胞の骨化の表現型を確認するため、石灰化染色により、石灰かした骨結節を染色し、骨化の進行の程度を確認した。
結果を図１５に示す。shRNAが導入されていないコントロールのMC3T3−E1細胞（control）では、染色は確認されなかった。同様に、shRNA-LacZが導入されたMC3T3−E1細胞（sh-LacZ）でも、染色は確認されなかった。対して、shRNA-CXCL7が導入されたMC3T3−E1細胞（sh-CXCL7）では、顕著に染色が確認され、骨化が進行していることが確認された。miR-340 inhibitorが導入されたMC3T3−E1細胞（miR-340 inhibitor）では、shRNA-CXCL7が導入されたMC3T3−E1細胞（sh-CXCL7）と比較して染色の範囲が小さいことが確認された。これらの結果から、ｍｉＲ−３４０を抑制することによって、細胞の骨化を抑制可能であることが示された。

・リアルタイムＰＣＲ
shRNAが導入されたMC3T3−E1細胞に対して、リアルタイムPCRを行い、CXCL7、BMP-2、及びRANKL（receptor activator of nuclear factor-кB ligand）の発現量を求めた。RANKLは骨組織のマーカーとして用いられる因子である。

上記の［ｍｉＲ−３４０の抑制］に記した方法と同様にして、shRNA-lacZが導入されたMC3T3−E1細胞を作製した（shRNA-lacZ）。同様に、shRNA-CXCL7が導入されたMC3T3−E1細胞（shRNA- CXCL7）、miR-340が導入されたMC3T3−E1細胞（miR-340）、miRNA-inhibitor-controlが導入されたMC3T3−E1細胞（miRNA-inhibitor-control）、miRNA-inhibitorが導入されたMC3T3−E1細胞（miRNA-inhibitor）を作製した。
miR-340の配列は配列番号６で表される塩基配列である。
miRNA-inhibitorは、Exiqon, (Vedbaek, Denmark)から入手した。

上記の各細胞から、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用い、製品添付のプロトコルに沿って抽出した。RNA integrityは、Agilent 2100 Bioanalyserを用いて解析した。逆転写には、Superscript VILO cDNA Synthesis Kit（Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いた。次いで、StepOnePlus Real-Time PCR Analysis System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)により、リアルタイムＰＣＲを行った。解析に用いたプローブはExiqonから入手した。
リアルタイムＰＣＲで使用したプローブは、Taqman probes CXCL7, Mm01347901_g1, BMP-2, Mm01254942_m1, RANKL, Mm00441906_m1, 18S, Mm03928990_g1, RANK, Mm00437132_m1である。

図１６に、リアルタイムＰＣＲにより求めたCXCL7、BMP-2、及びRANKLの発現量を示す。miRNA-inhibitorが導入されたMC3T3−E1細胞（miRNA-inhibitor）では、コントロールと比較して、ＣＸＣＬ７の発現の低下が確認された。shRNA-CXCL7が導入されたMC3T3−E1細胞（shRNA- CXCL7）及びmiR-340が導入されたMC3T3−E1細胞（miR-340）では、どちらもＢＭＰ−２及びＲＡＮＫＬの発現量の増加が確認された。これらの結果から、ｍｉＲ−３４０の抑制により、ＣＸＣＬ７の発現の抑制されることが示された。また、ＣＸＣＬ７の抑制とmiRNA-340の発現の亢進とが、骨化の促進に対して同様の傾向を示すことが明らかとなった。

［ノックアウトマウスの脊椎組織の初期細胞におけるリン酸化修飾解析］
ノックアウトマウスの脊椎組織から細胞を採取し、タンパク質を抽出し、ペプチドを精製した。精製したペプチド（２０〜３０ｐmol）を、UltiMate 3000 RSLCnano system (HPLC) pump (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)二重収束扇形磁場型質量分析計を用いて分析した。加速電位は5kVとした。サンプルのイオン化は6-KeVのXenonビームにより行い、常法により、解析試料の調製を行った。イオンのスペクトルはlinear ion trap mass spectrometer Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)、nano-ESI interfaceにより解析した。 micro RPLC-MS/MS 解析に用いたサンプルはトラップカラムに注入した (nano 75 μm i.d. × 280 μm o.d.; packed with 15 cm of Acclaim PepMap C18)。LTQ 質量範囲m/z 350−2000（サイクル時間45秒）について複数スキャンし、データを収集した。

リン酸化修飾解析の結果、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＴＲＡＦ３、アディポネクチン、ＴＺＦ−Ｌについて、リン酸化が検出された。
Ｅ３ユビキチンリガーゼについては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうち、４０９番目〜４４９番目の領域からなるポリペプチドの、４１９番目のセリン及び４２７番目のセリンが、リン酸化されていることが判明した。
ＴＲＡＦ３については、配列番号１３で表されるアミノ酸配列のうち、２０７番目〜２１４番目の領域からなるポリペプチドの２１１番目のスレオニンがリン酸化されていることと、３９８番目〜４２２番目の領域からなるポリペプチドの４１２番目のセリン及び４１３番目のチロシンが、リン酸化されていることが判明した。
アディポネクチンについては、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、６２番目〜８０番目の領域からなるポリペプチドの６４番目のスレオニンがリン酸化されていることと、１１６番目〜１３４番目の領域からなるポリペプチドの１１９番目のセリン及び１２７番目のスレオニンがリン酸化されていることが判明した。
ＴＺＦ−Ｌについては、配列番号１５で表されるアミノ酸配列のうち、６７６番目〜６８３番目の領域からなるポリペプチドの６７７番目のセリンがリン酸化されていることと、１６５１番目〜１６７２番目の領域からなるポリペプチドの１６５２番目のメチオニン及び１６６８番目のセリンがリン酸化されていることが判明した。

図１７に、脊椎組織の細胞から抽出した、ＴＲＡＦ３及びユビキチンの電気泳動像を示す。レーン１は野生型マウスの初期培養細胞primary cellsのものであり、レーン２は、ノックアウトマウスの初期培養細胞primary cellsのものである。
図１７に示す結果としてバンドシフトが確認されたことから、ＴＲＡＦ３のE3ユビキチンリガーゼが翻訳後修飾されたことが分かる。また、Ｅ３ユビキチンリガーゼによるＣＸＣＬ７の分解が確認されたことから、後縦靭帯骨化症の原因タンパク質であるＣＸＣＬ７の体内消失は、このＴＲＡＦ３とＥ３ユビキチンリガーゼによるものであると考えられる。

次に、ノックアウトマウスの脊椎組織及びヒトOPLL患者の脊椎組織に対し、ユビキチン抗体染色を行った。結果を図１８に示す。ユビキチン抗体染色のシグナルが、図１８中に示されるように細長の形状で確認された。島状に点在しているシグナルは、核のＤＡＰＩ染色像である。
図１８に示す結果から、ノックアウトマウスの脊椎組織及びヒトOPLL患者の脊椎組織において、ユビキチンが発現し、ＣＸＣＬ７を分解していると考えられる。

以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

本発明の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物は、脊柱靱帯骨化症の病態を示すため、脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニングを行うことができる。また、脊柱靱帯骨化症のメカニズムの解明にも寄与する。

Claims (16)

1. ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
2. 前記ＣＸＣＬ７遺伝子の機能の欠損又は抑制が、ＣＸＣＬ７遺伝子又はその発現制御領域における一部若しくは全部の欠失、挿入、付加、若しくは置換によるものである請求項１に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
3. 前記ＣＸＣＬ７遺伝子が、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である請求項１又は２に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
4. 前記ｍｉＲＮＡ−３４０の発現の亢進がｍｉＲＮＡ−３４０の導入によるものである請求項１に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
5. 前記ｍｉＲＮＡ−３４０が、配列番号６で表されるＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドである請求項１又は２に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物。
6. ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ３４０の発現が亢進されていることを特徴とする糖尿病モデル非ヒト動物。
7. ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする脊柱靱帯骨化症モデル細胞。
8. 平行線維性結合組織の細胞である請求項７に記載の脊柱靱帯骨化症モデル細胞。
9. ＣＸＣＬ７遺伝子の機能が欠損又は抑制されている、或いはｍｉＲＮＡ−３４０の発現が亢進されていることを特徴とする糖尿病モデル細胞。
10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物に、該脊柱靱帯骨化症モデル非ヒト動物より得られる細胞に、或いは請求項７又は８に記載の脊柱靱帯骨化症モデル細胞に被験物質を投与することを特徴とする脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
11. 前記被験物質を投与した後に、病変部の骨形態を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する、請求項１０に記載の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
12. 前記被験物質を投与した後に、ｍｉＲＮＡ−３４０の発現を指標として前記被験物質の予防剤又は治療剤としての効果を判断する、請求項１０又は１１に記載の脊柱靱帯骨化症の予防剤又は治療剤のスクリーニング方法。
13. 生体試料中のｍｉＲＮＡ−３４０を検出することを特徴とする脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法。
14. ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを用いる請求項１３に記載の脊柱靱帯骨化症病変細胞の検出方法。
15. ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得るプローブを含むことを特徴とする脊柱靱帯骨化症診断用キット。
16. ｍｉＲＮＡ−３４０とハイブリダイズし得る核酸、又は該核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする脊柱靱帯骨化症治療剤。