JP6117993B2 - 肥満細胞−特異的アポトーシス−誘導用ペプチド及びその用途 - Google Patents

Description

本特許出願は、２０１３年０５月１３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−００５３７７９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。

本発明は、肥満細胞−特異的アポトーシス−誘導用ペプチド及びその用途に関する。

一般的に、アレルギーとして知られる過敏反応は、抗原に対する非正常な免疫反応と呼ばれる。Ｇｅｌｌ＆Ｃｏｏｍｂｓ分類法によって、大きく４種に分けられるが、ＩｇＥによって媒介された過敏反応がＩ型、抗体によって媒介された過敏反応がＩＩ型、免疫複合体によって媒介された過敏反応がＩＩＩ型、そして、抗原提示細胞とＴ細胞との間の相互作用によって媒介された過敏反応がＩＶ型である。周囲でよく見られるアレルギー疾患は、ほとんどＩ型過敏反応によって発生する疾患であって、アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性皮膚炎などがこれに属する。よく知られたアレルゲン（抗原）としては、堅果類、卵類のような食品及び花粉、家ホコリダニ、また一部医薬品などがある。このようなアレルゲン流入時に、ＩｇＥと結合後、肥満細胞のＩｇＥ受容体であるＦｃｅＲＩのαサブユニットに付き、β及びγサブユニットと複合体を形成して、受容体の信号伝達がなされる。この過程を通じて肥満細胞の脱顆粒が誘導され、かゆみ症や炎症反応を誘発する媒介因子であるヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、β−ヘキソサミニダーゼ（ｂｅｔａ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなどの分泌が活性化される。このような因子の作用は、Ｂ細胞のＩｇＥ生産を活性化させてアレルギー反応を悪化させる要因となる。実際に、アレルギー患者の場合、血中ＩｇＥ数値が高く観察される特徴があって、アレルゲンの流入に容易に過敏反応を起こすと知られている（非特許文献１）。

Ｉ型過敏反応が観察される領域によって疾患が分類されるが、鼻腔の粘膜で発生する場合、アレルギー性鼻炎で表われ、気道粘膜や気管支で発生する場合、喘息で表われ、皮膚で発生した過敏反応は、アトピー性皮膚炎で観察される。

２０１０年に報告された国民健康・栄養調査結果（国民健康・栄養調査、大韓民国保健福祉部）によれば、国内１歳以上のアトピー性皮膚炎の有病率は、６．１％であり、２０１１年の青少年健康形態オンライン調査（青少年健康形態オンライン調査、大韓民国保健福祉部）では、１３〜１８歳の青少年のアトピー性皮膚炎有病率が、２３．１％に集計された。一般的なアレルゲン、ＩｇＥ刺激によって病変が現れ始め、肥満細胞の脱顆粒によって分泌されたヒスタミンの刺激で表われるかゆみ症によって患者が患部を掻くようになり、皮膚常在菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などの流入が２次でなされる。このような外部抗原の流入で患部に追加的な炎症反応が表われて、病状を悪化させると知られている（非特許文献２）。

アトピー性皮膚炎の治療剤としては、免疫抑制効果を通じて消炎作用を示すステロイド剤と肥満細胞からヒスタミンの遊離を防ぐ抗ヒスタミン剤、そして、抗生剤などがある。しかし、ステロイド製剤の場合、長期間使用時に、塗った部位に毛が生えるか、皮膚が薄くなり、細菌感染が生じる副作用が表われ、使用中止時に、急速に症状が悪化するという短所がある。抗ヒスタミン剤の場合にも、長期間使用時に、不眠、不安、食欲減退などの副作用が報告され、抗生剤長期使用時にも、抗生剤耐性のような副作用が発生する。したがって、より効果的でありながらも、副作用を最小化することができる治療剤の開発が要求されている趨勢である。

体内タンパク質の場合、生体親和性が高くて副作用を最小化することができる長所がある。しかし、タンパク質自体を治療剤に使うには、低い安定性と高い生産単価とが短所として作用する。このような体内タンパク質内の特定有効部位のみを用いるペプチド製剤の場合、その効能は同一でありながら、安定性と生産単価とに対する問題点を改善することができる長所がある。したがって、本研究者は、肥満細胞の活性化を抑制することができる体内タンパク質由来ペプチドの抗アレルギー効果を活用した研究を行った。

セマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ）は、セマドメイン（ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる共通したシステインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈｄｏｍａｉｎ）を有するセマフォリン系のタンパク質である。セマフォリンタンパク質は、神経系発達過程で反発性軸索突起誘導因子として初めて知られた。クラス３に属するセマフォリンは、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）としてＳｅｍａ３ＡからＳｅｍａ３Ｆまでの６種が存在し、プレキシンＡ（Ｐｌｅｘｉｎ Ａ）受容体及びニューロピリン（Ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ）受容体と受容体複合体を形成して信号を伝達する。初期に知られたように、セマフォリン３Ａは、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−敏感性ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）の収縮を誘導するか、活性化されたＴ細胞及び樹枝状細胞から発現されて、Ｔ細胞成長やサイトカインの分泌を調節する役割を果たす。

本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，５（３）：１７０−１７４（２０１３） Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ．，Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３３（２０１２）

本発明者らは、セマフォリン３Ａと同じ機能又は類似した機能を保持しながらも、天然のセマフォリン３Ａタンパク質よりも活性及び安定性に優れた物質を開発するために努力してきた。その結果、多くのペプチド候補物質のうちから生理活性（例えば、肥満細胞−特異的アポトーシス誘導、肥満細胞の活性抑制、ＦｃεＲＩタンパク質のシグナル抑制効果など）に優れたセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを選別することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、配列表の配列番号１からなるペプチドを提供することである。

本発明の他の目的は、Ｔｈ２媒介性免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、肥満細胞−誘発炎症疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、肥満細胞−誘発炎症疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｔｈ２媒介性免疫疾患の予防又は治療方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、肥満細胞−誘発炎症疾患の予防又は治療方法を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一様態によれば、本発明は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。

本発明者らは、セマフォリン３Ａと同じ機能又は類似した機能を保持しながらも、天然のセマフォリン３Ａタンパク質よりも活性及び安定性に優れた物質を開発するために努力してきた。その結果、多くのペプチド候補物質のうちから生理活性（例えば、肥満細胞−特異的アポトーシス誘導、肥満細胞の活性抑制、ＦｃεＲＩタンパク質のシグナル抑制効果など）に優れたセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを選別した。

セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ）は、５００個のアミノ酸残基で構成されたセマフォリンドメインを含有する細胞外ドメインを特徴とする分泌及び膜結合タンパク質を含む巨大なタンパク質ファミリーである。これらのうち、セマフォリン３Ａは、クラス３セマフォリンファミリーに属する分泌タンパク質であって、神経の軸索突起の案内の役割だけではなく、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎｓ）及びプレキシン（ｐｌｅｘｉｎｓ、ＰＬＸＮｓ）受容体を通じて、細胞−忌避指示（ｃｅｌｌ−ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ ｃｕｅｓ）を媒介することによって、細胞移動、形態発生（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び組織再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を含む発生過程を調節するなど多様な細胞内機能を行うと知られている。構造的に、セマフォリン内に存在するセマドメインは、タンパク質相互作用モジュールであって、軸索誘導（ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ）過程の間の機能に重要であり、肝細胞成長因子受容体、性タンパク質及びウイルスタンパク質にも存在する。前記セマドメインは、保存性の高い一連のシステイン残基と特徴化され、これらの間（４個）のジスルフィド結合を通じて構造的にタンパク質を安定化させる。

一方、セマフォリン３Ａ遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）は、非正常な骨及び軟骨発達を誘導し、セマフォリン３Ａ−関連シグナリング分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）［セマフォリン３Ａ、ニューロピリン−１、及びプレキシンＰＬＸＮＡ１及びＰＬＸＮＡ２］の発現が内軟骨性骨化で報告されたが、これは、骨格発達及び神経分布でこれらの潜在的な役割を意味する。

本発明者らは、ヒトセマフォリン３Ａの機能と関連のある部位を基にして、前述した特性を示す多数のセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを合成した。さらに詳しく説明すれば、セマフォリン３Ａタンパク質の多くの部位を任意的に部分合成して、受容体タンパク質に対する結合可能部位を１次探索した後、この予測された部位のアミノ酸配列を最適化して、本発明のペプチドを選別的に製造し、これら候補ペプチドのうちから最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることによって、本発明の配列表の配列番号１のペプチドを製造した。

本発明の一具現例によれば、本発明の配列表の配列番号１のペプチドは、ヒトセマフォリン３Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ、ＮＰ＿００６０７１；配列表の配列番号２）から由来し、これは、表１に例示されている。

本発明のペプチドは、天然ヒトセマフォリン３Ａの機能（例えば、抗アレルギー活性）を有するだけではなく、肥満細胞−特異的アポトーシス誘導及び肥満細胞の活性抑制を効果的に表わした（参考：図２Ａ〜図２Ｃ及び図３Ａ〜図３Ｂ）。また、本発明のペプチドは、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を抑制させた（参考：図４Ａ〜図４Ｃ）。

本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ）−特異的アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する。

本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、肥満細胞によって分泌されるヒスタミンの量を減少させ、細胞内β−ヘキソサミニダーゼ活性を抑制する。

本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、ＦｃεＲＩシグナリングを抑制する。前記ＦｃεＲＩシグナリングの抑制は、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成抑制を通じて行われ、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成抑制は、ＥＲＫ１／２、ｐ３８又はＬｙｎのリン酸化阻害を通じて確認することができる。

本明細書において用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線状の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。

本発明のペプチドは、その自体として天然のセマフォリン３Ａタンパク質よりも安定性に優れるが、アミノ酸の変形によって安定性がさらに向上する。

本発明によれば、本発明のペプチドは、天然のセマフォリン３Ａタンパク質に比べて非常に優れた熱安定性を有する。天然セマフォリン３Ａタンパク質は、製造の難点及び高い生産コストだけではなく、温度及び長期保管時に、低い安定性を有する。しかし、本発明のペプチドは、非常に安価に大量合成が可能であり、高温などで物理化学的に安定するために、生理活性の低下を最大限に防止し、体内外での残存期間を増加させることによって、さらに向上した治療効果を有する（参考：図５）。したがって、本発明のペプチドは、医薬品、医薬部外品及び化粧品のような長期間貯蔵が要求される製品に有利に適用可能である。

本発明の一具現例によれば、ペプチドのＮ−末端又はＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ_２）、アザイド（−ＮＨＮＨ_２）などに変形されうる。

本発明の好ましい実現例によれば、上記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、 フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)から構成された群より選択される保護基が結合されている。

上述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語「安定性」とは、「インビボ」 安定性だけでなく、保存安定性(例えば、常温保存安定性)も意味する。上述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

本発明の他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含むＴｈ２媒介性免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、上述した本発明のセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを有効成分として含むので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の一具現例によれば、本発明のＴｈ２媒介性免疫疾患は、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｙ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性結膜炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｊｕｎｔｉｖｉｔｉｓ）、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、血管浮腫（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｄｅｍａ）、食品アレルギー、物理的アレルギー、過敏性肺臓炎、職業性アレルギー疾患及び薬物アレルギーを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の一具現例によれば、本発明の自己免疫疾患は、Ｌｙｎキナーゼ媒介性経路の活性化を通じて誘発され、前記Ｌｙｎキナーゼ媒介性経路の活性化は、Ｌｙｎキナーゼのリン酸化の増加を通じて触発される。

本発明の一具現例によれば、本発明の自己免疫疾患は、肥満、高脂血症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び代謝症候群を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む肥満細胞−誘発炎症疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、上述した本発明のセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを有効成分として含むので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物は、肥満細胞−特異的アポトーシスを誘発する。

本発明の一具現例によれば、本発明の肥満細胞−誘発炎症疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、間質性膀胱炎（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、肥満、多発性硬化症、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＡＤ）、関節炎及び炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物は、(ａ)上述した本発明のセマフォリン３Ａ-タンパク質の活性を示す ペプチドの薬剤学的有効量；及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物として用いられることができる。

本明細書において用語「薬剤学的有効量」とは、上述したセマフォリン３Ａ 関連ペプチドの効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキトロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。 本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合する薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当たり、０．０００５〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明のセマフォリン３Ａ 関連 のペプチドの化粧品学的有効量、及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。

本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の化粧品学的効能を達成するに十分な量を意味する。

本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これらに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形に製造することができる。

本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが利用できる。

本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、又はポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような噴霧剤をさらに含むことができる。

本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラガカントなどが利用できる。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の他に、化粧品組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の工程を含む肥満細胞−誘発炎症疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する：（ａ）セマフォリン３Ａ−エンコーディングヌクレオチド配列を含む細胞に試験物質を処理する工程；及び（ｂ）前記細胞内セマフォリン３Ａタンパク質の発現又は活性を分析する工程であって、前記試験物質が、前記セマフォリン３Ａタンパク質を過剰発現させるか、又は前記セマフォリン３Ａタンパク質の活性を増加させてＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を抑制させれば、肥満細胞−誘発炎症疾患治療剤と判断される工程。

本発明の方法は、前述した本発明のセマフォリン３Ａ−由来のペプチドを含むセマフォリン３Ａタンパク質を含むために、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の方法によれば、まず、セマフォリン３Ａ−エンコーディングヌクレオチド配列を含む細胞に分析しようとする試験物質を接触させる。本発明のターゲットのヌクレオチド配列を含む細胞は、特に制限されるものではないが、セマフォリン３Ａタンパク質の過剰発現は、肥満細胞のアポトーシスを誘導することができるので、除外させることが望ましい。本発明のスクリーニング方法を言及しながら使われる用語“試験物質”は、セマフォリン３Ａ遺伝子又はタンパク質の活性に影響を及ぼすか否かを、又はセマフォリン３Ａタンパク質によるＦｃεＲＩ受容体の複合体形成抑制の有無を検査するために、スクリーニングで利用される未知の物質を意味する。前記試験物質は、化学物質、ペプチド及び天然抽出物を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法によって分析される試験物質は、単一化合物又は化合物の混合物（例えば、細胞又は組織培養物）である。試験物質は、合成又は天然化合物のライブラリーから得られる。このような化合物のライブラリーを得る方法は、当業者に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ），Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ），Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ），Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）で商業的に購入可能であり、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）で商業的に購入可能である。試験物質は、当業者に公知の多様な組合わせライブラリー方法によって得られ、例えば、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが要求される合成ライブラリー方法、“１−ビーズ１−化合物”ライブラリー方法、そして、親和性クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー方法によって得られる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４などに開示されている。

引き続き、試験物質が処理された細胞で、本発明のターゲット（例えば、セマフォリン３Ａ）の発現量及び活性を測定する。発現量及び活性の測定は、下記に記載したように実施し、測定の結果、本発明のマーカーのヌクレオチド配列の発現又は活性が増加する場合、又は過剰発現されたセマフォリン３ＡによるＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を抑制する場合には、前記試験物質は、肥満細胞−誘発炎症疾患の改善又は治療用物質と判定されうる。

本発明の一具現例によれば、前述した工程（ｂ）で、セマフォリン３Ａの活性分析は、過剰発現されたセマフォリン３ＡによるＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を測定して実施し、より具体的には、前記ＦｃεＲＩ受容体の複合体抑制は、ＥＲＫ１／２、ｐ３８又はＬｙｎのリン酸化阻害を通じて確認することができる。

本発明のスクリーニング方法は、多様な方式で行うことができ、特に当業界に公知され た多様な結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって高速（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）方式で行うことができる。

本発明の試験物質又はセマフォリン３Ａ遺伝子又はタンパク質抗原又は候補抗体は、検出可能な標識で標識化することができる。例えば、前記検出可能な標識は、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光標識（例えば、クマリン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ロダミン６Ｇ、ロダミンＢ、ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｄａｂｓｙｌ及びＦＡＭ）、発光標識、化学発光標識、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識又は金属標識（例えば、金及び銀）である。

検出可能に標識化されたセマフォリン３Ａ遺伝子、タンパク質又は試験物質を利用する場合、セマフォリン３Ａ遺伝子又は蛋白質抗原と試験物質の結合は、標識から出るシグナルを検出して分析することができる。例えば、標識としてアルカリンホスファターゼが利用される場合は、ＢＣＩＰ（ｂｒｏｍｏｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質を利用してシグナルを検出する。標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合は、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レソルフィンベンジルエーテル、ルミノール、Ａｍｐｌｅｘレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍ ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙ ｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）及びナフトール／ピロニンのような基質を利用してシグナルを検出する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する工程を含むＴｈ２媒介性免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する工程を含む自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する工程を含む肥満細胞−誘発炎症疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明の方法は、前述した組成物を用いるために、これらの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を回避するために、その記載を省略する。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明のペプチドは、天然のセマフォリン３Ａの機能と同一又は類似した機能を行えるだけではなく、小さなサイズによって皮膚透過度が非常に優れている。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、肥満細胞−特異的アポトーシスを誘導するだけではなく、肥満細胞の活性を抑制（例えば、ヒスタミンの分泌量の減少及びβ−ヘキソサミニダーゼ活性抑制）する。
（ｉｉｉ）また、本発明のペプチドは、ＦｃεＲＩシグナリング、より具体的には、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を抑制させ、これは、ＥＲＫ１／２、ｐ３８又はＬｙｎのリン酸化阻害で表われる。
（ｉｖ）したがって、本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬部外品及び化粧品に非常に有用に適用可能である。

図１は、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１ペプチドの高性能液相クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。 図２Ａは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した肥満細胞の死滅促進効果を示す柔細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）結果を示すグラフである。 図２Ｂは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した肥満細胞の死滅促進効果を示すＢｃｌ２ウェスタンブロッティング結果を示す図である。 図２Ｃは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、表われる肥満細胞の死滅促進効果が細胞特異的な反応であるということを示す角質細胞及び線維芽細胞に対する細胞毒性実験結果を示すグラフである。 図３Ａは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、肥満細胞からの減少したヒスタミン分泌を示すＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。 図３Ｂは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、肥満細胞からの減少したβ−ヘキソサミニダーゼ分泌を示す活性実験結果を示すグラフである。 図４Ａは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、肥満細胞のＩｇＥ受容体シグナル阻害を示すＥＲＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化レベル確認実験結果であって、密度計測器（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）を通じてバンド強度を数値化したグラフ結果が提示された図である。 図４Ｂは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、肥満細胞のＩｇＥ受容体シグナル阻害を示す受容体関連タンパク質Ｌｙｎのリン酸化レベル確認実験結果を示す図である。 図４Ｃは、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した時、表われる肥満細胞のＩｇＥ受容体シグナル阻害が受容体複合体形成抑制によるものであることを示す免疫沈降法分析結果を示す図である。 図５は、本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドの熱安定性結果を示すグラフである。

以下、実施例を通じて、本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

合成例１：Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号１）の合成
クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ ｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ ｒｅｓｉｎ，Ｎｏｖａ ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍＬを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬを入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。反応器に１０ｍＬのジクロロメタン溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍＬ入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍＬを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、さらに１０分間反応を維持した後、溶液を除去してそれぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＣＴＬ Ｒｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍＬのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ ＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護された樹脂がある反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去してＤＭＦ溶液で３回５分ずつ攪拌した後、除去した。反応樹脂を少量取ってカイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に２回脱保護反応させて Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＣＴＬ Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再度カイザー試験を行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分間ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍＬを入れた後、常温でたまに振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングして樹脂をろ過し、樹脂を少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍＬの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分乾燥して、精製前 ＮＨ_２−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ ペプチド−１を０．８５ｇ合成した（収率：８９．９％）。分子量測定器を用いて測定したとき、分子量１５３１．８（理論値：１５３１．７９５）を得ることができた。

試験例１：合成ペプチドを活用した活性化された肥満細胞死滅効果の確認
合成例１によって製造された配列表の配列番号１のペプチドの抗アレルギー効果を確認するために、活性化された肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）に対するペプチドの細胞死滅効果を実験した。

まず、ＲＢＬ−２Ｈ３ラット肥満細胞株（韓国細胞株銀行、韓国）を組織培養用フラスコ（ＳＰＬ，Ｋｏｒｅａ）を用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で培養した。培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これをＤＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、６ウェル組織培養用プレート（ＳＰＬ，Ｋｏｒｅａ）に、各ウェル当たり、１×１０^５細胞になるように入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、同じ培養液で培地を交換した後、活性条件実験の場合、ＩｇＥ及びＨＳＡを処理し、標準を取るための空試料と本発明のペプチドとを１０％蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度で７２時間の間に、前記と同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。アネキシンＶ−ＰＩ染色キット（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＩ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ；ＢＤ ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いて細胞を染色させた後、柔細胞測定器であるＦＡＣＳを用いてＦＬ１及びＦＬ２強度を測定した。細胞死滅中であるアネキシンＶ−陽性細胞の数をカウンティングした（参考：図２Ａ）。細胞死滅効果を追加確認するために、前記の実験と同じ条件で処理した細胞を得て、プロアポトーシス性タンパク質（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＢｃｌ２の発現量をウェスタンブロッティングで確認した（参考：図２Ｂ）。

一方、細胞死滅効果が肥満細胞−特異的反応であるか否かを確認するために、ヒト角質細胞株であるＨａＣａＴ細胞とマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３細胞とを用いて細胞毒性実験を実施した。９６ウェル組織培養用プレートに各ウェル当たり、５×１０^３細胞になるように入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、同じ培養液で培地を交換した後、標準を取るための空試料と合成ペプチドとを１０％蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度で７２時間の間に、前記と同一条件で培養した。培養が完了した後、１／１０体積（ｖｏｌｕｍｅ）でＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）を処理し、４時間さらに培養させて、生成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）をＤＭＳＯで溶かして５４０ｎｍで分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて吸光度を測定した（参考：図２Ｃ）。

図２Ａは、ペプチド処理後の死滅進行中である肥満細胞の数を測定したＦＡＣＳ結果を示す。図２Ａから確認できるように、本発明のペプチドは、非活性化状態や活性化状態の肥満細胞いずれも（１０μｇ／ｍＬ処理群）でアネキシンＶ−陽性細胞の数を増加させて、細胞死滅を効果的に誘導することを確認することができた。

図２Ｂは、ペプチド処理後の細胞内プロアポトーシス性タンパク質であるＢｃｌ２の発現量をウェスタンブロッティングで確認した結果である。図２Ｂから分かるように、本発明のペプチドは、非活性化状態や活性化状態の肥満細胞いずれもで細胞死滅を誘導させてＢｃｌ２の発現量を阻害させることを確認することができた。

図２Ｃは、ペプチド処理後のヒト角質細胞株であるＨａＣａＴ細胞及びマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する細胞毒性実験結果を示す。図２Ｃから確認できるように、本発明のペプチドは、肥満細胞以外の他の皮膚細胞に対しては細胞毒性を示していない。

前述した試験例１の結果を総合して見れば、本発明のペプチドは、肥満細胞−特異的細胞死滅を誘導する活性を有し、前記活性は、非活性化状態とＩｇＥ（ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）及びＨＳＡ（アレルゲン；ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）処理による活性化状態いずれもで確認されるが、活性化された状態の肥満細胞でより顕著であるということが分かる。

試験例２：合成ペプチドの肥満細胞の活性抑制効能の確認
１６時間の間にＩｇＥ処理（１μｇ／ｍＬ）によって敏感化されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞培養で従来の培養培地を除去し、タイロード緩衝液（ｔｙｒｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）に交換後、合成例１で合成したペプチド（１及び１０μｇ／ｍＬ）、そして、陽性対照群であるケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、４０μＭ；ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）を処理し、２０分間培養した。以後、アレルゲンとして使ったＨＳＡを１μｇ／ｍＬの濃度で処理して、１時間培養した。その結果、肥満細胞から分泌されるヒスタミンの量を測定するために、細胞培養液を回収し、ヒスタミンＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で確認した（参考：図３Ａ）。また、β−ヘキソサミニダーゼの活性を測定するために、基質であるｐ−ＮＡＧ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ；ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）と反応させた後、発色の程度を４０５ｎｍで分光光度計で吸光度を測定した（参考：図３Ｂ）。

図３Ａは、ペプチド処理後、肥満細胞から分泌されるヒスタミンの量を測定した結果である。図３Ａから分かるように、ＩｇＥとＨＳＡ刺激によって増加したヒスタミンの分泌量を減少させる陽性対照群であるケルセチンの活性を確認し、本発明のペプチド処理群の場合も、濃度−依存的にヒスタミンの分泌量を減少させる活性を有した。前述した抑制活性（又は、傾向）は、β−ヘキソサミニダーゼ活性テストでも同様に確認することができた（参考：図３Ｂ）。

前述した試験例２の結果を総合して見れば、本発明のペプチドは、肥満細胞の活性化によって分泌されるヒスタミン及びβ−ヘキソサミニダーゼに対する阻害効果を有し、これは、以後の炎症反応及びかゆみ症に対する抑制効果に繋がるということを意味する。

試験例３：合成ペプチドのＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩシグナリング抑制効果の確認
合成例１によって製造されたペプチドの肥満細胞の活性抑制機作を確認するために、肥満細胞刺激源であるＩｇＥが結合する受容体であるＦｃεＲＩタンパク質のシグナル抑制効果を調査した。６０ｍｍサイズの培養用プレート（ＳＰＬ，Ｋｏｒｅａ）に１．５×１０^６細胞になるように入れ、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。以後、細胞にＩｇＥ（１μｇ／ｍＬ）を２４時間処理して敏感化させ、標準を取るための空試料と合成ペプチドとを１０％蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１０μｇ／ｍＬの濃度で２０分間処理し、アレルゲンであるＨＳＡを１μｇ／ｍＬの濃度で５分又は３０分間処理して細胞を刺激した。あらゆる処理が終わった細胞をトリプシン処理で収得した後、ＦｃεＲＩシグナリングに関与する分子であるＥＲＫ１／２、ｐ３８及びＬｙｎのリン酸化程度をウェスタンブロッティングで確認した（参考：図４Ａ及び図４Ｂ）。

また、本発明のペプチドによるＦｃεＲＩシグナリング抑制効果が、ＩｇＥ受容体であるＦｃｅＲＩのサブチェーン結合抑制を通じて起こるか否かを確認するために、同じ実験条件でＨＳＡ刺激を１０分間処理した後、得られた細胞でＩｇＥ抗体を用いた免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を実施した。免疫沈降法を用いて一次的に分離した後、ＦｃｅＲＩγサブチェーン（ｇａｍｍａ ｓｕｂｃｈａｉｎ）抗体でウェスタンブロッティングを実施して、ＩｇＥに結合されたγサブチェーンのタンパク質量を確認した（参考：図４Ｃ）。

図４Ａは、ペプチド処理後、肥満細胞表面に発現されるＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩのシグナルタンパク質のリン酸化レベルを観察した結果である。図４Ａから分かるように、本発明のペプチドは、ＦｃεＲＩシグナルタンパク質であるＥＲＫ１／２及びｐ３８のリン酸化レベルを阻害する効能を示した。また、他のシグナルタンパク質であるＬｙｎのリン酸化レベルも、ペプチド処理群で濃度−依存的に顕著に阻害されていることを確認した（参考：図４Ｂ）。

図４Ｃは、ペプチド処理後、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のサブチェーン間の結合を観察した結果である。ＩｇＥ受容体は、α、β、γサブチェーンで構成された複合体で構成されているが、そのうち、ＩｇＥの結合がαサブチェーンでなされば、β、γサブチェーンが集まる形態で複合体が形成されると知られている。これにより、本発明のペプチドによるＦｃεＲＩ受容体の複合体形成抑制活性を確認するために、ＩｇＥ抗体を使った免疫沈降法を実施した後、γサブチェーンに対するウェスタンブロッティングを実施した。その結果、本発明のペプチドは、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を顕著に抑制する活性を有するということを確認した。

前述した試験例３の結果を総合して見れば、本発明のペプチドは、肥満細胞表面に存在して細胞活性に関与するＦｃεＲＩ受容体の複合体形成を抑制することによって、ＦｃεＲＩシグナリングを遮断する効能を示す。

試験例４：製造されたペプチドの熱安定性
合成例１を通じて製造されたペプチドとＮＩＢＳＣ（ＵＫ）で購入した標準フォーム成長因子（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ）とを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のリン酸緩衝溶液で製造した。準備された溶液を１ｍＬずつガラスバイアルに入れた後、３７℃で静置した。３７℃に静置された溶液を０、５、１０、２０、３０、５０、そして、７０日目にサンプリングして、日付別に遠心分離して変性されたペプチドやタンパク質を除去し、上澄み液を取ってＨＰＬＣを用いて定量を行った（参考：図５）。

実施例１：ナノ化ペプチドの製造
上記合成例にて得たペプチド５０ｍｇをそれぞれ正確に秤量した後、蒸留水５００ｍＬで十分に攪拌して溶解した。配合体溶液をレシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）０．３ｍＬ、エタノール５０ｍＬを混合した後、総量が１Ｌになるように蒸留水で定容し、マイクロフルイダイザで高圧を用いて乳化させて、サイズ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで単独あるいは複合的に化粧品製造用に使用された。

剤形例１：柔軟化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。

剤形例２：保湿クリーム
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる保湿クリームを、通常の栄養クリームの製造方法によって製造した。

剤形例３：保湿化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる保湿化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。

剤形例４：エッセンス
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、通常のエッセンスの製造方法によって製造した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。

本発明は、肥満細胞−特異的アポトーシス−誘導用ペプチド及びその用途に関連する分野に適用されうる。

Claims (15)

1. 配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチドを有効成分として含むＴｈ２媒介性免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
2. 前記ペプチドが、ヒトＳｅｍａ３Ａ（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ）タンパク質由来のものである請求項１に記載の薬剤学的組成物。
3. 前記ペプチドが、肥満細胞−特異的アポトーシスを誘導する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
4. 前記ペプチドが、肥満細胞によって分泌されるヒスタミンの量を減少させる活性を有する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
5. 前記ペプチドが、細胞内β−ヘキソサミニダーゼ活性を抑制する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
6. 前記ペプチドが、ＦｃεＲＩシグナリングの抑制を誘発する請求項１に記載の薬剤学的組成物。
7. 前記ＦｃεＲＩシグナリングの抑制が、ＦｃεＲＩ受容体の複合体形成抑制を通じて行われる請求項６に記載の薬剤学的組成物。
8. 前記ＦｃεＲＩシグナリングの抑制が、ＥＲＫ１／２、ｐ３８又はＬｙｎのリン酸化を阻害する請求項６に記載の薬剤学的組成物。
9. 前記ペプチドのＮ−又はＣ−末端が、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基をさらに含む請求項１に記載の薬剤学的組成物。
10. 前記Ｔｈ２媒介性免疫疾患が、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、じんま疹、血管浮腫、食品アレルギー、物理的アレルギー、過敏性肺臓炎、職業性アレルギー疾患、又は薬物アレルギーである請求項１に記載の薬剤学的組成物。
11. 配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチドを有効成分として含むＬｙｎキナーゼ媒介性経路の活性化を通じて誘発される自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
12. 前記Ｌｙｎキナーゼ媒介性経路の活性化が、Ｌｙｎキナーゼのリン酸化の増加を通じて触発される請求項１１に記載の薬剤学的組成物。
13. 前記自己免疫疾患が、肥満、高脂血症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、又は代謝症候群である請求項１１に記載の薬剤学的組成物。
14. 配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とするペプチドを有効成分として含む、喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、間質性膀胱炎、肥満、多発性硬化症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、関節炎又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である肥満細胞−誘発炎症疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
15. 前記薬剤学的組成物が、肥満細胞−特異的アポトーシスを誘発する請求項１４に記載の薬剤学的組成物。