JP6115921B2 - マルトトリオシル転移酵素及びその製造方法並びに用途 - Google Patents

Description

本発明はマルトトリオシル転移酵素及びその用途に関する。より詳細には、新規マルトトリオシル転移酵素及びその製造方法、食品の製造・加工における当該酵素の使用、当該酵素を産生する微生物などに関する。本出願は、２００９年７月１日に出願された日本国特許出願第２００９−１５６５６９号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。

現在、マルトトリオース生成アミラーゼとしては、ミクロバクテリウム インペリアル（Microbacterium imperiale）由来酵素、ストレプトマイセス グリセウス（Streptomyces griseus）由来酵素、バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）由来酵素、ネイトロノコッカス エスピー（Natronococcus sp.）由来酵素、ストレプトコッカス ボバイス（Streptococcus bovis）由来酵素が知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの中で糖転移反応について報告されているものは、ストレプトマイセス グリセウス由来酵素のみである。しかも、当該酵素は高基質濃度条件下（供与体基質と受容体基質の合計が19％、40％（w/v））でのみ糖転移反応を触媒し、低基質濃度（1％（w/v））では加水分解反応のみを触媒し、糖転移反応は触媒しない（非特許文献２、３）。また、耐熱性も低いため、食品加工用酵素として利用されていない。

一方、産業上利用されている糖転移酵素としては、例えば、イソマルトオリゴ糖製造或いはニゲロオリゴ糖製造に使用されているα-グルコシダーゼ、フラクトオリゴ糖製造或いはラクトスクロース製造に使用されているβ-フラクトフラノシダーゼ、ガラクトオリゴ糖製造に使用されているβ-ガラクトシダーゼ、パラチノース製造に使用されているα-グルコシルトランスフェラーゼ、シクロデキストリン製造或いはカップリングシュガー製造に使用されているシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、高分岐環状デキストリン製造に使用されているブランチングエンザイムが例として挙げられる。この中で、α-1,4結合を含む多糖、オリゴ糖に作用し、糖転移反応を触媒する酵素としては、α-グルコシダーゼ、ブランチングエンザイムを挙げることが出来る。しかしながら、α-グルコシダーゼは単糖の糖転移反応を、ブランチングエンザイムは4糖以上のオリゴ糖或いは多糖の糖転移反応を触媒しており、3糖類であるマルトトリオースを特異的に糖転移させる酵素は知られていない。

デンプンを含む加工食品において、デンプンの老化は保存性の低下をもたらす等、大きな問題点となっている。その原因の大部分は、デンプンに含まれるアミロース分子の老化、即ちアミロース分子の会合、それによる不溶化に起因している（非特許文献４）。そこで、デンプンを低分子化することにより、老化を抑制する研究が行われ、ある程度老化を抑制させることができるようになった。しかしながら、低分子化により本来のデンプンが持つ性質を失うという問題が生じた。さらに、これらの方法では、分解による還元力の増加により、タンパク質やアミノ酸などと混合して加熱したとき、これら物質との反応によって、デンプンが着色するため、その用途は制限されてきた（特許文献１）。このために、これらのデンプンを低分子化することなく老化を抑制する研究が行われている。例えば、デンプンのα-1,4結合を分解し、α-1,6結合を転移反応により合成する酵素であるブランチングエンザイムが研究されているが、耐熱性が低いなどの問題点が有り、食品加工用酵素として利用されるまでには至っていない。

特開２００１−２９４６０１号公報

「澱粉科学の事典」、朝倉書店、p.279-80(2003) 若生ら、澱粉科学、25(2）、p.155-61(1978) Usuiら、Carbohydr.Res. 250、57-66(1993) 岡田ら、澱粉科学、30(2）、p.223-230(1983) Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)

本発明は食品加工等に使用可能な条件下においてマルトトリオース単位の糖転移反応を触媒する新規な糖転移酵素及びその用途を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、ジオバチルス(Geobacillus）属に属する微生物が、所望の作用を有するマルトトリオシル転移酵素を生産することを見出した。また、本発明者らは当該マルトトリオシル転移酵素を単離・精製し、その酵素化学的性質を決定するとともに当該酵素をコードする遺伝子(以下、「本遺伝子」という)クローニングすることにも成功した。加えて本遺伝子及び本遺伝子の断片を適当な宿主に導入することにより、マルトトリオシル転移酵素の製造法も確立した。本発明は上記成果によって完成されたものであり、次の通りである。
［１］α-1,4グルコシド結合を有する多糖類及びオリゴ糖類に作用し、マルトトリオース単位を糖類に転移させる活性を有する酵素であって、マルトテトラオースを基質として作用させた場合、基質濃度が0.67％（w/v）〜70％（w/v）の全範囲において、マルトヘプタオース生成速度とマルトトリオース生成速度の比が９：１〜１０：０となる、マルトトリオシル転移酵素。
［２］マルトトリオシル転移酵素が、微生物由来の酵素である［１］に記載のマルトトリオシル転移酵素。
［３］マルトトリオシル転移酵素が、ジオバチルス属の微生物由来の酵素である、［１］に記載のマルトトリオシル転移酵素。
［４］ジオバチルス属の微生物がジオバチルス・エスピー APC9669（受託番号 NITE BP-770）である、［３］に記載のマルトトリオシル転移酵素。
［５］下記の酵素化学的性質を備えるマルトトリオシル転移酵素：
（1）作用：結合様式としてα-1,4グルコシド結合を有する多糖類及びオリゴ糖類に作用し、マルトトリオース単位を糖類に転移させる；
（2）基質特異性：可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースに作用し、α-サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリン、γ-サイクロデキストリン、マルトトリオース、マルトースには作用しない；
（3）分子量：約83,000（SDS-PAGE）。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載のマルトトリオシル転移酵素を有効成分とする酵素剤。
［７］ジオバチルス・エスピー APC9669（受託番号 NITE BP-770）又はその変異菌である、マルトトリオシル転移酵素産生能を有する微生物。
［８］配列番号８のアミノ酸配列、又はマルトトリオシル転移酵素活性を示すその断片からなる、マルトトリオシル転移酵素。
［９］配列番号６の配列を含むDNAによってコードされる、[８]に記載のマルトトリオシル転移酵素。
［１０］以下の(a)〜(e)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるマルトトリオシル転移酵素：
(a) 配列番号７又は８のアミノ酸配列をコードするDNA;
(b) 配列番号６の配列を含むDNA;
(c) 配列番号６の配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;
(d) 配列番号６の配列のDNA配列縮重体であるDNA;
(e) 配列番号６の配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含む配列からなり、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［１１］［１０］に記載のマルトトリオシル転移酵素遺伝子を含む組換えベクター。
［１２］発現ベクターである、［１１］に記載の組換えベクター。
［１３］[１０］に記載のマルトトリオシル転移酵素遺伝子が導入されている形質転換体。
［１４］［１１］又は［１２］に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
［１５］細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞である、［１３］又は［１４］に記載の形質転換体。
［１６］以下のステップ（1）及び（2）、又はステップ（i）及び（ii）を含んでなる、マルトトリオシル転移酵素の製造法：
（1）マルトトリオシル転移酵素産生能を有する、ジオバチルス属の微生物を培養するステップ；
（2）培養後の培養液及び／又は菌体より、マルトトリオシル転移酵素を回収するステップ。
（i）［１３］〜［１５］のいずれか一項に記載の形質転換体を前記マルトトリオシル転移酵素遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ii）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［１７］ジオバチルス属の微生物がジオバチルス・エスピー APC9669である、［１６］に記載の製造法。
［１８］α-1,4グルコシド結合を有する多糖類又はオリゴ糖類を含む食品を製造・加工するための、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の酵素又は［６］に記載の酵素剤の使用。
［１９］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の酵素又は［６］に記載の酵素剤の使用によって機能性が改善した食品又は食品材料。

ジオバチルス・エスピー APC9669由来のマルトトリオシル転移酵素の至適温度を示すグラフである。 ジオバチルス・エスピー APC9669由来のマルトトリオシル転移酵素の至適pHを示すグラフである。 ジオバチルス・エスピー APC9669由来のマルトトリオシル転移酵素の温度安定性を示すグラフである。 ジオバチルス・エスピー APC9669由来のマルトトリオシル転移酵素のpH安定性を示すグラフである。 マルトトリオシル転移酵素のSDS-PAGEの結果を示す図である。レーン1：分子量マーカー、レーン2：マルトトリオシル転移酵素。 パンのソフトネス維持効果の実験結果を示す図である。 大腸菌形質転換体の細胞破砕物の遠心上清のSDS-PAGEの結果を示す図である。レーンM：分子量マーカー、レーン1：大腸菌ベクター形質転換体の細胞破砕物の遠心上清、レーン2：マルトトリオシル転移酵素。

（用語）
本発明において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。

本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素（マルトトリオシル転移酵素）に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「マルトトリオシル転移酵素」と記載した場合は「単離された状態のマルトトリオシル転移酵素」を意味する。マルトトリオシル転移酵素の代わりに使用される用語「本酵素」についても同様である。

DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。

（マルトトリオシル転移酵素及びその生産菌）
本発明の第1の局面はマルトトリオシル転移酵素（以下、「本酵素」ともいう）及びその生産菌を提供する。後述の実施例に示す通り、本発明者らは鋭意検討の結果、ジオバチルス・エスピー APC9669がマルトトリオシル転移酵素を産生することを見出した。また、当該マルトトリオシル転移酵素を分離・生成することに成功するとともに、以下に示す通り、その酵素化学的性質を決定することに成功した。

（１）作用
本酵素はマルトトリオシル転移酵素であり、結合様式としてα-1,4グルコシド結合を有する多糖類及びオリゴ糖類に作用し、マルトトリオース単位を糖類に転移させる。

（２）基質特異性
本酵素は可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースに良好に作用する。これに対して、α-サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリン、γ-サイクロデキストリン、マルトトリオース、マルトースには作用しない。

（３）分子量
本酵素の分子量は約83,000（SDS-PAGEによる）である。

（４）至適温度
本酵素の至適温度は約50℃である。本酵素は約45℃〜約55℃において高い活性を示す。至適温度は、後述のマルトトリオシル転移酵素活性測定方法（10mmol/L MES緩衝液（pH6.5）中）による測定で算出された値である。

（５）至適pH
本酵素の至適pHは約7.5である。本酵素はpH約6.5〜約8.0において高い活性を示す。至適pHは、例えば、ユニバーサル緩衝液中で測定した結果を基に判断される。

（６）温度安定性
本酵素は65℃以下で安定した活性を示す。10mmol/L MES緩衝液（pH6.5）中、65℃の条件で30分間処理しても、本酵素は90％以上の活性を維持する。

（７）pH安定性
本酵素はpH5.0〜10.0という広いpH域で安定した活性を示す。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、40℃、30分間の処理後、85％以上の活性を維持する。

（８）等電点
本酵素の等電点は約4.5（アンフォライン含有電気泳動法による）である。

尚、後述の実施例に示す通り、ジオバチルス・エスピー APC9669が産生するマルトトリオシル転移酵素は、マルトテトラオースを基質として作用させた場合、基質濃度が0.67％（w/v）〜70％（w/v）の全範囲において、糖転移生成物であるマルトヘプタオースの生成速度と分解生成物であるマルトトリオースの生成速度の比が９：１〜１０：０になることが判明した。換言すると、広範な基質濃度範囲に亘って糖転移反応の速度の方が圧倒的に大きく、マルトヘプタオース生成速度とマルトトリオース生成速度の合計を100％とすると、前者が90％以上となった。尚、生成物のモル比を基準に速度を比較した。

以上のように、取得に成功した本酵素の性状の詳細が明らかとなった。その結果、本酵素が耐熱性に優れること、基質特異性に優れることが判明した。従って、本酵素は食品加工用途に適したものである。

本酵素は好ましくはジオバチルス・エスピーAPC9669（Geobacillus sp. APC9669）に由来するマルトトリオシル転移酵素である。ここでの「ジオバチルス・エスピーAPC9669に由来するマルトトリオシル転移酵素」とは、ジオバチルス・エスピーAPC9669（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するマルトトリオシル転移酵素、或いはジオバチルス・エスピーAPC9669（野生株であっても変異株であってもよい）のマルトトリオシル転移酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたマルトトリオシル転移酵素であることを意味する。従って、ジオバチルス・エスピーAPC9669より取得したマルトトリオシル転移酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組み換え体も、「ジオバチルス・エスピーAPC9669に由来するマルトトリオシル転移酵素」に該当する。

本酵素の由来であるジオバチルス・エスピーAPC9669のことを、説明の便宜上、本酵素の生産菌という。APC9669株は以下の通り所定の寄託機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：NITEバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）
寄託日（受領日）：2009年6月2日
受託番号：NITE BP-770

本発明のマルトトリオシル転移酵素は一態様において配列番号８のアミノ酸配列を含む。当該アミノ酸配列は配列番号７のアミノ酸配列からシグナルペプチド部分を除いたものである。尚、配列番号７のアミノ酸配列は、ジオバチルス・エスピーAPC9669からクローニングして得られた遺伝子の塩基配列（配列番号６）から推定されたアミノ酸配列である。ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号８に示すアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなり、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質（以下、「等価タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号８に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではマルトトリオシル転移酵素活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。「マルトトリオシル転移酵素活性を有する」とは、結合様式としてα-1,4グルコシド結合を有する多糖類及びオリゴ糖類に作用し、マルトトリオース単位を糖類に転移させる活性を意味するが、その活性の程度は、マルトトリオシル転移酵素としての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。

「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はマルトトリオシル転移酵素活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とはたとえば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列と例えば約70％以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。

好ましくは、マルトトリオシル転移酵素活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価タンパクを得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。

「等価タンパク質」が、付加的な性質を有していてもよい。かかる性質として、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を発揮するという性質、至適pHが異なるという性質などが挙げられる。

ここで、二つのアミノ酸配列の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。配列同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えば、同一性の高いアミノ酸配列を得ることが可能である。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくは例えばNCBIのウェブページを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。

本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。

上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の装飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

（マルトトリオシル転移酵素遺伝子）
本発明の第２の局面はマルトトリオシル転移酵素遺伝子に関する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号７又は８のアミノ酸配列をコードするDNAを含む。当該態様の具体例は、配列番号６の塩基配列からなるDNAである。

ところで、一般に、あるタンパク質をコードするDNAの一部に改変を施した場合において、改変後のDNAがコードするタンパク質が、改変前のDNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちDNA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号６の塩基配列と等価な塩基配列を有し、マルトトリオシル転移酵素活性をもつタンパク質をコードするDNA（以下、「等価DNA」ともいう）を提供する。ここでの「等価な塩基配列」とは、配列番号６に示す核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここではマルトトリオシル転移酵素活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。

等価DNAの具体例は、配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。

等価DNAの他の具体例として、配列番号６に示す塩基配列を基準として１若しくは複数（好ましくは１〜数個）の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような等価DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように、配列番号６に示す塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価DNAを得ることができる。
等価DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。

本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、ジオバチルス・エスピーAPC9669のゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或はジオバチルス・エスピーAPC9669の菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。

例えば、配列番号６の塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号７に示すアミノ酸配列や配列番号６の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。

以下、本発明の遺伝子の取得法の具体例を示す。まず、ジオバチルス・エスピーAPC9669から本酵素（マルトトリオシル転移酵素）を単離・精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製したマルトトリオシル転移酵素を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第256巻、第7990〜7997頁（1981）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン―シーケンサー476A、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製等〕に供する。タンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが有効である。

このようにして得られる部分アミノ酸配列情報を基にマルトトリオシル転移酵素遺伝子をクローニングする。例えば、ハイブリダイゼーション法又はPCRを利用してクローニングを行うことができる。ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Molecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）に記載の方法を用いることができる。

PCR法を利用する場合、以下の方法を用いることができる。まず、マルトトリオシル転移酵素を産生する微生物のゲノムDNAを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。PCR法は、PCRテクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレス社（Stocktonpress）、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅DNA断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外にマルトトリオシル転移酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的のマルトトリオシル転移酵素遺伝子の一部を取得することができる。得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによってマルトトリオシル転移酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。

後述の実施例では、ジオバチルス・エスピーAPC9669が産生するマルトトリオシル転移酵素をコードする遺伝子の配列をPCR法を利用して決定した。ジオバチルス・エスピーAPC9669由来のマルトトリオシル転移酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を配列番号６に示した。また、当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定した（配列番号７）。なお、配列番号７に示すアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号６に記載したもの以外に複数存在する。

全塩基配列が明らかにされたマルトトリオシル転移酵素遺伝子（配列番号６）の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることによって、他のマルトトリオシル転移酵素を産生する微生物のゲノムDNAライブラリーあるいはcDNAライブラリーから、配列番号６のマルトトリオシル転移酵素遺伝子と相同性の高いDNAを選別することができる。

同様に、PCR用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてPCR反応を行うことによって、上記マルトトリオシル転移酵素遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出し、さらにはその遺伝子全体を得ることもできる。

得られた遺伝子のタンパク質を製造し、そのマルトトリオシル転移酵素活性を測定することにより、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるか否かを確認することができる。また、得られた遺伝子の塩基配列（又はそれがコードするアミノ酸配列）を上記マルトトリオシル転移酵素遺伝子の塩基配列（又はそれがコードするアミノ酸配列）と比較することで遺伝子構造や相同性を調べ、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードするか否かを判定することにしてもよい。

一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことから、ランダム変異あるいは部位特異的変異の導入によって改変型マルトトリオシル転移酵素（1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つが施された遺伝子）を得ることが可能である。これにより、マルトトリオシル転移酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適pH、安定pH、基質特異性等の性質が異なるマルトトリオシル転移酵素をコードする遺伝子を得ることが可能となる。また、遺伝子工学的に改変型マルトトリオシル転移酵素を製造することが可能となる。

ここで、変異を導入する際の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌して行われる。特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。

ランダム変異を導入する方法を例示すると、DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第79巻、第1408〜1412頁（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕dNTP存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Gene）、第64巻、第313〜319頁（1988）〕、PCRを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの取り込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第224巻、第347〜353頁（1995）〕等である。

部位特異的変異を導入する方法を例示すると、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（gapped duplex）法、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12巻、第24号、第9441〜9456頁（1984）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第200巻、第81〜88頁（1992）、ジーン、第102巻、第67〜70頁（1991）〕、dut（dUTPase）とung（ウラシルDNA グリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第82巻、第488〜492頁（1985）〕、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド―ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber：ODA）法、ジーン、第152巻、第271〜275頁（1995）、特開平7-289262号公報〕、DNAの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、DNA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した2種類の変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法（米国特許第5,512,463号）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖DNAベクターと2種類のプライマーを用いたPCRによる方法〔ジーン、第103巻、第73〜77頁（1991）〕、アンバー変異を利用したPCRによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等である。

市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することもできる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G（宝酒造社製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（宝酒造社製）、ODA法を用いたMutan（登録商標）-ExpressKm（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用いることができ、また、PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）、Mutan（登録商標）-Super Express Km（宝酒造社製）等を用いることができる。

このように、本発明によりマルトトリオシル転移酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、マルトトリオシル転移酵素活性を有するタンパク質の安価で高純度な遺伝子工学的製造が可能となる。

（組換えベクター）
本発明のさらなる局面は本発明のマルトトリオシル転移酵素遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。

使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)等である。

本発明の組換えベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。

本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

（形質転換体）
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された宿主細胞（形質転換体）に関する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。

宿主細胞は、本発明のマルトトリオシル転移酵素が発現する限りにおいて特に限定されず、例えばBacillus subtillus、Bacillus likemiformis、Bacillus circulansなどのBacillus属細菌、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Leuconostoc、Bifidobacteriumなどの乳酸菌、Escherichia、Streptomycesなどのその他の細菌、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、などの酵母、Aspergillus oryzae、Aspergillus nigerなどのAspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属、Fusarium属などの糸状菌（真菌）などより選択される。

（マルトトリオシル転移酵素の製造法）
本発明の更なる局面はマルトトリオシル転移酵素の製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、本酵素（マルトトリオシル転移酵素）の生産能を有する、ジオバチルス属の微生物を培養するステップ（ステップ（1））及び培養後の培養液及び／又は菌体より、マルトトリオシル転移酵素を回収するステップ（ステップ（2））が行われる。

ステップ（1）におけるジオバチルス属の微生物は、本酵素の生産能を有する限り特に限定されない。例えば、上記のジオバチルス・エスピーAPC9669を用いることができる。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。

培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3〜10、好ましくは約7〜8程度に調整し、培養温度は通常約10〜80℃、好ましくは約30〜65℃程度で、1〜7日間、好ましくは2〜4日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。

以上の条件で培養した後、培養液又は菌体よりマルトトリオシル転移酵素を回収する（ステップ（2））。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。

他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。

尚、発現の確認や発現産物の確認は、マルトトリオシル転移酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、マルトトリオシル転移酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。

本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いてマルトトリオシル転移酵素を製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（i））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、マルトトリオシル転移酵素）を回収する（ステップ（ii））。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。

本酵素の精製度は特に限定されない。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。

（酵素剤）
本発明の酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

（マルトトリオシル転移酵素の用途）
本発明の更なる局面はマルトトリオシル転移酵素（本酵素）の用途として食品の製造・加工方法を提供する。本発明の製造・加工方法ではα-1,4グルコシド結合を有する多糖類及び／又はオリゴ糖類を含む食品又は食品原料に本酵素を作用させ、当該食品の機能性を改善する。食品の例としてはパン、米飯、餅を挙げることができる。食品原料の例としては各種デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖を含む原料を挙げることが出来る。原料の純度は特に限定されず、他の物質と混在した状態の原料に対して本酵素を作用させることにしてもよい。また、二種以上の原料に対して同時に本酵素を作用させることにしてもよい。

＜マルトトリオシル転移酵素活性測定方法＞
マルトトリオシル転移酵素の活性は以下の通り測定した。即ち、1％マルトテトラオース（林原生物化学研究所製）を含む10mmol/L MES緩衝液（pH6.5）2mLに酵素溶液0.5mLを添加して、40℃で60分間放置した。放置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。生成したグルコースをグルコース CII-テスト ワコー（和光純薬製）で定量した。本条件下、1分間に反応液2.5mL中に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1単位とした。

＜マルトトリオシル転移酵素活性確認方法＞
マルトトリオシル転移酵素の活性は上記＜マルトトリオシル転移酵素活性測定方法＞と共に、以下の通り確認した。即ち、10.3mmol/L マルトテトラオース（林原生物化学研究所製）を含む5mmol/L 酢酸緩衝液（pH6.0）985μLに1.0u/mL酵素溶液15μLを添加し、50℃で1,2,3時間放置した。放置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。冷却した反応液をカチオン樹脂、アニオン樹脂を用いて適宜脱塩し、HPLCにて反応液の分析を行った。HPLC装置は島津製作所製「Prominence UFLC」、カラムは三菱化学製「MCI GEL CK04S」、溶離液は水を流速0.4mL/分で、検出は示差屈折計で分析した。得られた基質及び生成物の面積％をモル量に換算し、消費速度及び生成速度を計算した。精製したマルトトリオシル転移酵素の場合、例えば生成速度比が7糖：3糖＝約92：約8となった。

１．ジオバチルス・エスピーAPC9669由来マルトトリオシル転移酵素の生産および精製
ジオバチルス・エスピーAPC9669を表１に示す組成の液体培地を用いて45℃、2日間振とう培養した。得られた培養上清液をUF膜（AIP-1013D、旭化成製）にて5倍に濃縮後、50％飽和濃度になるよう硫酸アンモニウムを添加した。沈殿画分を5mmol/L 塩化カルシウムを含む20mmol/L トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）に再度溶解し、続いて終濃度0.5mol/Lとなるように硫酸アンモニウムを添加した。生じた沈殿を遠心分離にて除去した後、0.5mol/L 硫酸アンモニウム及び5mmol/L 塩化カルシウムを含む20mmol/L トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）にて平衡化したHiLoad 26/10 Phenyl Sepharose HPカラム（GEヘルスケア製）に供し、0.5mol/Lから0mol/Lの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着したマルトトリオシル転移酵素タンパク質を溶離させた。

集めたマルトトリオシル転移酵素活性画分をUF膜にて濃縮後、5mmol/L 塩化カルシウムを含む20mmol/L トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）にバッファー交換を行った。バッファー交換サンプルを5mmol/L 塩化カルシウムを含む20mmol/L トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）にて平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose HPカラム（GEヘルスケア製）に供し、0mol/Lから1mol/LのNaCl直線濃度勾配により、吸着したマルトトリオシル転移酵素タンパク質を溶離させた。

さらに、集めたマルトトリオシル転移酵素活性画分をUF膜にて濃縮後、0.15MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.2）にバッファー交換した後、0.15MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pgカラム（GEヘルスケア製）に供し、同緩衝液で溶離した。マルトトリオシル転移酵素活性画分を集め、限外ろ過膜にて脱塩濃縮をし、精製酵素標品を得た。得られた本精製酵素は下記の諸性質の検討に供した。

なお、各段階における精製の結果を表２に示した。最終段階の比活性は粗酵素に比較して約41倍となった。図５に、精製工程における各ステップのサンプルを10-20％のグラジエントゲルにてSDS-PAGE（CBB染色）した結果を示す。本精製酵素標品（レーン2）はSDS-PAGEにおいて単一なタンパク質であることがわかる。

２．マルトトリオシル転移酵素の諸性質
（１）至適反応温度
上記マルトトリオシル転移酵素活性測定法に準じ、反応温度を30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及び75℃で反応させた。最高活性を示した温度での値を100％とした相対活性で示した。至適反応温度は50℃付近であった（図１）。

（２）至適反応pH
上記マルトトリオシル転移酵素活性測定法に準じ、各緩衝液（ユニバーサル緩衝液pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0）中、40℃、60分間の反応条件下で測定した。最大活性値を示したpHの値を100％とした相対活性で示した。至適反応pHは約7.5付近であった（図２）。

（３）温度安定性
6u/mLの酵素液を30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及び75℃の各温度下、10mmol/L MES緩衝液（pH6.5）中、30分間熱処理した後、残存活性を上記マルトトリオシル転移酵素活性測定法にて測定した。熱に対して未処理の活性を100％とした残存活性で示した。65℃、30分間の熱処理では、90％以上の残存活性を有しており、65℃まででは安定であった（図３）。

（４）pH安定性
6u/mLの酵素液を各緩衝液（ユニバーサル緩衝液pH3.0、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0）中、40℃で30分処理後、上記マルトトリオシル転移酵素活性測定法にて活性を測定した。pH5.0からpH10.0の範囲では、85％以上の残存活性を有しており、pH5.0からpH10.0の範囲では安定であった（図４）。

（５）SDS-PAGEによる分子量測定
SDS-PAGEはLaemmliらの方法に従い行った。なお、用いた分子量マーカーは、Low Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis（GEヘルスケア製）であり、標準タンパク質としてPhosphorylase b（97,000Da）、Albumin（66,000Da）、Ovalbumin（45,000Da）、Carbonic anhydrase（30,000Da）、Trypsin inhibitor（20,100Da）、α-Lactalbumin（14,400Da）を含んでいた。ゲル濃度10-20％のグラジエントゲル（和光純薬製）を用いて、20mA/ゲルで約80分間電気泳動を行い、分子量を求めた結果、分子量は約83kDaであった（図５）。

（６）等電点
アンホラインを用いた等電点集積（600V、4℃、48時間通電）により測定したところ、本酵素の等電点は約4.5であった。

（７）基質特異性
各基質に対するマルトトリオシル転移酵素活性を調べた。
ａ）マルトオリゴ糖に対する基質特異性
マルトオリゴ糖類については、以下の方法により基質特異性を調べた。10mmol/Lの各マルトオリゴ糖に対して0.002u/mLとなるようにの酵素を添加し、50℃、1、2、3時間放置した。放置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。冷却した反応液をカチオン樹脂、アニオン樹脂を用いて適宜脱塩し、HPLCにて反応液の分析を行った。HPLC装置は島津製作所製「Prominence UFLC」、カラムは三菱化学製「MCI GEL CK04S」、溶離液は水を流速0.4mL/分で、検出は示差屈折計で分析した。得られた基質及び生成物の面積％をモル量に換算し、消費速度及び生成速度を算出した。各マルトオリゴ糖に対する反応速度は以下のように算出した。マルトテトラオースに対する速度は、7糖生成速度と3糖生成速度の和とした。マルトペンタオースに対する速度は、8糖生成速度と3糖生成速度の和とした。マルトヘキサオースに対する速度は、3糖生成速度と9糖生成速度の差の1/2を求め、さらにその値と9糖生成速度の和とした。

マルトース、マルトトリオースに対しては反応生成物は認められなかった。マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースに対してはよく作用した。

ｂ）多糖類に対する基質特異性
シクロデキストリン、可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンについては、以下の方法により基質特異性を調べた。10mmol/Lの各マルトオリゴ糖に対して0.002u/mLとなるように酵素を添加し、0.1u/mLの酵素を50℃、0、1、2、3時間放置した。放置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。その液200μLに対して、リゾプス由来グルコアミラーゼ（和光純薬）を1.0単位0.03mgとなるように添加し、50℃で1晩静置した。静置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。冷却した反応液をカチオン樹脂、アニオン樹脂を用いて適宜脱塩し、HPLCにて反応液の分析を行った。HPLC装置は島津製作所製「Prominence UFLC」、カラムは三菱化学製「MCI GEL CK04S」、溶離液は水を流速0.4mL/分で、検出は示差屈折計で分析した。酵素（マルトトリオシル転移酵素）処理区に無処理区と比較して、3糖以上のピークに経時的な増加が認められた場合、生成物有り（＋）、増加が認められない場合、生成物無し（−）と判定した。

シクロデキストリンについては反応生成物が認められなかった。可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンについては、3糖以上のピークに経時的な増加が認められた。これらの多糖類は基質となることが分かった。グルコアミラーゼはα-1,4結合、α-1,6結合を加水分解することから、これらの結合様式以外でも糖転移生成物が生成していることが分かった。

（８）基質濃度が酵素反応生成物に及ぼす影響
基質濃度が酵素反応生成物に及ぼす影響について、マルトテトラオースを基質として調べた。0.67、1.0、3.0、10、30、70％（w/v）のマルトテトラオースに対して、3時間反応後のマルトテトラオース残存量が85％以上となるように酵素を添加し、50℃、1、2、3時間放置した。放置後、沸騰水浴中で5分間加熱した後、流水中で冷却した。冷却した反応液をカチオン樹脂、アニオン樹脂を用いて適宜脱塩し、HPLCにて反応液の分析を行った。HPLC装置は島津製作所製「Prominence UFLC」、カラムは三菱化学製「MCI GEL CK04S」、溶離液は水を流速0.4mL/分で、検出は示差屈折計で分析した。得られた基質及び生成物の面積％をモル量に換算し、生成速度を算出した。その結果、全ての基質濃度条件下（0.67〜70％（w/v））で糖転移反応が90％以上であった。

３．パンの製造
マルトトリオシル転移酵素をパン生地に添加してパンを製造した。山形パン用基本材料（強力粉260 g；砂糖13g；食塩5.2g；ショートニング10.4g；L-アスコルビン酸0.013g；冷水192g；ドライイースト3.1g）またはこの材料にマルトトリオシル転移酵素120uを添加したものを、ナショナル自動ホームベーカリーSD-BT150（松下産業株式会社パナソニック製）に供した。焼成後、パンを26℃で1時間放冷し、次いでこれを水分蒸発を防止するためにビニール袋に入れ、そして26℃で保存した。1または5日間保存した後、パンを2cmの厚さにスライスし、パンの中央部を直径47mmの円柱状にカットした。パンの硬さを、FUDOHレオメーターNRM-2002J（サン科学レオテック製）を使用して、圧縮スピード2mm/分で1.5cm圧縮した場合の最大荷重を測定した。結果を図６に示す。酵素無添加区及び酵素添加区について、それぞれ1日保存のパンの硬さを100％とした時の5日保存のパンの硬さを比較した。その結果、酵素添加区は125％となり、無添加区（207％）と比較して、パンの硬化が抑制されており、ソフトネスが維持されていた。

４．炊飯
米75gを水洗後、水150mL、またはこの材料にマルトトリオシル転移酵素40uを添加したものを2時間室温に静置して後、定法によりと炊飯して飯米を得た。得られた炊飯米を4℃で7日間保存した。保存前後の糊化度をBAP法で測定した。BAP法による糊化度は、酵素添加区は炊飯直後96.6％、7日後69.5％であった（表６）。それに対して、無添加区は炊飯直後95.3％、7日後59.7％であった。酵素添加区では糊化度の低下が抑制、即ち、デンプンの老化の進行が抑制された。

５．モチの製造
上新粉200gに水165gを加えて混合し、水蒸気で15分間蒸した。次いで、蒸したものをミキサー（キッチンエードKSM5（エフ・エム・アイ製））にとって撹拌しながら生地が約65℃になったところで、酵素添加区はマルトトリオシル転移酵素30uを添加・混合し、プラスチック製シャーレに詰めて成形し、放冷、15℃保存した。24時間保存した後、モチを10mmの厚さにスライスし、モチの中央部を直径25mmの円柱状に型抜きした。モチの硬さを、FUDOHレオメーターNRM-2002J（レオテック製）を使用して、圧縮スピード2mm/分で5mm圧縮した場合の最大荷重を測定した。酵素無添加区の24時間保存のモチの硬さを100％とした時のモチの硬さを比較した。また、モチのベタつきも確認した。その結果、酵素添加区は35％となり、モチの硬化が抑制されており、ソフトネスが維持されていた（表７）。また、モチのベタツキも無かった。

６．ジオバチルス・エスピーAPC9669由来のマルトトリオシル転移酵素をコードする遺伝子断片の取得
(a)染色体DNAの単離
ジオバチルス・エスピーAPC9669の菌体から斉藤・三浦の方法（非特許文献５）により染色体DNAを調製した。

(b)部分アミノ酸配列の決定
１．で得られたマルトトリオシル転移酵素の精製標品をアミノ酸配列解析に供し、10残基のN末端アミノ酸配列（配列番号１）及び内部ペプチドアミノ酸配列（配列番号２、３）を決定した。
(c)PCRによるDNAプローブの作製
N末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに2種の混合オリゴヌクレオチド（配列番号４、５）を合成し、PCRプライマーとした。これらのプライマーを用い、ジオバチルス・エスピーAPC9669の染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
＜PCR 反応液＞
10×PCR反応緩衝液（TaKaRa社) 5.0μl
dNTP混合液（それぞれ2.5 mM、TaKaRa社） 8.0μl
25mM MgCl₂ 5.0μl
50μM センス・プライマー 0.5μl
50μM アンチセンス・プライマー 0.5μl
蒸留水 29.5μl
染色体DNA溶液（100μg/ml） 1.0μl
LA Taq DNAポリメラーゼ（TaKaRa社） 0.5μl

＜PCR反応条件＞
ステージ1： 変性（95℃、5分） 1サイクル
ステージ2： 変性（95℃、1分） 30サイクル
アニール（50℃、1分）
伸長（72℃、1分）
ステージ3： 伸長（72℃、10分） 1サイクル

得られた約1.1 kbのDNA断片をpGEM-Teasy（Promega社）にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。本DNA断片を全長遺伝子クローニングのためのDNAプローブとした。

（d）遺伝子ライブラリーの作製
ジオバチルス・エスピーAPC9669の染色体DNAのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、EcoRI分解物中にプローブDNAとハイブリダイズする約5.2kbのシングルバンドが確認された。この約5.2kbのEcoRIDNA断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作製した。上記(a)で調製した染色体DNAのEcoRI処理を行った。染色体DNA50μg、10×H緩衝液40μl、蒸留水342.0μl、及びEcoRIを8.0μl混合し、37℃で15時間処理した。得られた分解物をEcoRI処理したpBluescript II KS+ベクター（Stratagene 社）にライゲーションし、遺伝子ライブラリーを得た。

（e）遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記（c）で得た1.1kbのDNA断片をDIG-High Prime（Roche社）を用いてラベルした。これをDNAプローブとして、（d）で得た遺伝子ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られたポジティブコロニーからプラスミドpBlue-SASを得た。

（f）塩基配列の決定
プラスミドpBlue-SASの塩基配列を定法に従って決定した。ジオバチルス・エスピーAPC9669由来マルトトリオシル転移酵素をコードする塩基配列（2304 bp）を配列番号６に示す。また、配列番号６によりコードされるアミノ酸配列（767アミノ酸）を配列番号７に示す。このアミノ酸配列中には、(b)で決定したN末端領域アミノ酸配列（配列番号１）及び内部アミノ酸配列（配列番号２、３）が見出された。尚、配列番号７のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列を配列番号８に示す。

７．ジオバチルス・エスピーAPC9669由来のマルトトリオシル転移酵素の大腸菌での発現
(a) マルトトリオシル転移酵素の大腸菌での発現プラスミドの構築
N末端領域アミノ酸配列及びC末端領域アミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに、2種のオリゴヌクレオチド（配列番号９、１０）を合成し、PCRプライマーとした。センス・プライマーにはSacI制限酵素認識部位を、アンチセンス・プライマーにはXbaI制限酵素認識部位を付加した。これらのプライマーと、マルトトリオシル転移酵素遺伝子を有する染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
＜PCR反応液＞
10×PCR反応緩衝液（TOYOBO社） 5.0μl
dNTP混合液（それぞれ2.5 mM、TOYOBO社） 5.0μl
10μM センス・プライマー 1.5μl
10μM アンチセンス・プライマー 1.5μl
25mM MgSO₄ 2.0μl
蒸留水 33.0μl
染色体DNA溶液（200μg/ml） 1.0μl
KOD -Plus- DNA ポリメラーゼ（TOYOBO社） 1.0μl
＜PCR反応条件＞
ステージ1： 変性（94℃、2分） 1サイクル
ステージ2： 変性（94℃、15秒） 30サイクル
アニール（50℃、30秒）
伸長（68℃、2分30秒）

得られたPCR産物を電気泳動にて確認後、エタノール沈殿により脱塩（84μl）した。続いて10μlの10×M緩衝液及びSacI 3μlとXbaI 3μlを加え、37℃で15時間酵素処理した。制限酵素処理液を電気泳動にて確認し、NucleoSpin ExtractII（日本ジェネティクス社）で精製後、予めSacIとXbaIで処理したベクターpCold II DNA（タカラバイオ社）にライゲーションして発現プラスミドpColdII-SASを得た。

(b) マルトトリオシル転移酵素の大腸菌での発現
発現プラスミドpColdII-SASを大腸菌JM109 Competent Cells（タカラバイオ社）に導入した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的のマルトトリオシル転移酵素遺伝子が挿入されたpColdII-SASを保有する菌株を選別した。また対照として発現ベクターpColdII DNAを有する大腸菌JM109の形質転換体も得た。これらの形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地1 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した（前培養）。続いて、前培養液300μlを100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地9 mlに植菌し、37℃、170rpmでO.D600=0.4-1.0に到達するまで培養した。15℃、30分放置後、0.1 M IPTGを9μl添加し、15℃、160rpmで24時間培養（本培養）、集菌した。菌体を1.0 mlの100mMトリス―塩酸緩衝液（pH 6.5）に縣濁し、φ0.1mmのガラスビーズを0.50g加え、マルチビーズショッカー（安井機械社）にて菌体を破砕した。破砕条件は、ON 120秒、OFF 60秒を 3.75 サイクル繰り返した。得られたCell free-extractを遠心分離に供し、可溶性成分を得た。

(c) マルトトリオシル転移酵素の発現確認
取得した可溶性成分をSDS-PAGEに供した。電気泳動装置としてPhastSystem（GE Healthcare 社）を、分離ゲルとしてPhastGel Homogeneous 7.5（GE Healthcare 社）を使用した。その結果、図７に示すように、pColdII-SASでは83kDa付近にマルトトリオシル転移酵素と考えられる有意なタンパク質の生産が確認された。対照であるpColdII DNAでは同様のタンパク質の生産が確認されなかったため、本タンパク質はマルトトリオシル転移酵素遺伝子の導入に因るものと考えられた(図７)。

また、同じサンプルについて上記マルトトリオシル転移酵素活性測定法に準じ活性測定を行った結果を以下の表８に示す。

対照と比べて明らかなマルトトリオシル転移酵素活性が検出され、目的のマルトトリオシル転移酵素の発現が確認された。

本発明のマルトトリオシル転移酵素は優れた耐熱性を示し、高温下での反応が望まれる用途に好適である。本発明のマルトトリオシル転移酵素を用いれば、雑菌汚染のおそれの少ない高温下で酵素反応を実施することができる。また、デンプン含有食品に作用させた場合、デンプン老化抑制効果が認められる。従って、本発明のマルトトリオシル転移酵素は食品加工等の用途に特に有用である。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

配列番号４、５、９、１０：人工配列の説明：プライマー

Claims (9)

1. 配列番号８のアミノ酸配列、又は該配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるマルトトリオシル転移酵素を有効成分とする酵素剤。
2. 以下の(a)又は(b)のDNAからなるマルトトリオシル転移酵素遺伝子：
   (a)配列番号８のアミノ酸配列をコードするDNA;
   (b)配列番号６の配列を含むDNA。
3. 請求項２に記載のマルトトリオシル転移酵素遺伝子を含む組換えベクター。
4. 発現ベクターである、請求項３に記載の組換えベクター。
5. 請求項２に記載のマルトトリオシル転移酵素遺伝子が導入されている形質転換体。
6. 請求項３又は４に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
7. 細菌細胞、酵母細胞又は真菌細胞である、請求項５又は６に記載の形質転換体。
8. α-1,4グルコシド結合を有する多糖類又はオリゴ糖類を含む食品を製造・加工するための、請求項１に記載の酵素剤の使用。
9. 請求項１に記載の酵素剤の使用によって、硬化が抑制されたパン、糊化度低下が抑制された米飯、又は硬化が抑制されたモチ。

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