JP5528333B2 - β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 - Google Patents
β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5528333B2 JP5528333B2 JP2010510999A JP2010510999A JP5528333B2 JP 5528333 B2 JP5528333 B2 JP 5528333B2 JP 2010510999 A JP2010510999 A JP 2010510999A JP 2010510999 A JP2010510999 A JP 2010510999A JP 5528333 B2 JP5528333 B2 JP 5528333B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- amino acid
- acid sequence
- dna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 title claims description 147
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 100
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 72
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 72
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 64
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 241000006381 Bacillus flexus Species 0.000 claims description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 17
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 17
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 17
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 12
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 9
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 9
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 claims description 9
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 6
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N maltopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N 0.000 claims description 5
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 claims description 4
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 claims description 4
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N UNPD130147 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims description 4
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N malto-pentaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 claims description 4
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N alpha-maltoheptaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O BNABBHGYYMZMOA-AHIHXIOASA-N 0.000 claims description 3
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000006171 Britton–Robinson buffer Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 4
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.CC(O)=O WJGAPUXHSQQWQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N alpha-D-Glcp-(1->4)-alpha-D-Glcp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 125000003071 maltose group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N Cl.OP(O)(O)=O Chemical compound Cl.OP(O)(O)=O BYMMIQCVDHHYGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 dNTPs Substances 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102100023933 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N O6-alpha-D-Galactopyranosyl-D-galactose Natural products OCC1OC(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C(O)C1O AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940059913 ammonium carbonate Drugs 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940010556 ammonium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940044197 ammonium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 108010011219 dUTP pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRLZSZQAYHQXJP-UHFFFAOYSA-L dipotassium 2,3-dihydroxybutanedioate tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[K+].[K+].OC(C(O)C([O-])=O)C([O-])=O FRLZSZQAYHQXJP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N gentiobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-CQUJWQHSSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
- A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
- A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
- A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
- A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
- A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/22—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a beta-amylase, e.g. maltose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
ところで、近年、バイオエタノールの需要拡大によりトウモロコシの価格が高騰している。これを受けて作付けも大豆や小麦からトウモロコシへとシフトしている。このため大豆、小麦、大麦などが品薄となり価格が高騰し、β−アミラーゼの原料を確保することも困難な情勢となっている。
本発明は上記成果によって完成されたものであり、次の通りである。
[1] バチルス・フレクサス(Bacillus flexus)由来のβ−アミラーゼ。
[2] 下記の酵素化学的性質を備えるβ−アミラーゼ、
(1)作用:多糖類及びオリゴ糖類のα−1,4グルコシド結合に作用し、マルトースを遊離する、
(2)基質特異性:デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースに良好に作用し、プルラン、デキストラン、サイクロデキストリン、マルトトリオースには作用しない、
(3)至適温度:約55℃、
(4)至適pH:約8.0、
(5)温度安定性:55℃以下で安定である(pH 5.0、10分間)、
(6)pH安定性:pH 4〜9で安定である(30℃、3時間)、
(7)分子量:約60,000(SDS-PAGE)。
[3] 配列番号7に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有するβ−アミラーゼ。
[4] 等価なアミノ酸配列が、配列番号7に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列である、[3]に記載のβ−アミラーゼ。
[5] [1]〜[4]のいずれか一項に記載のβ−アミラーゼを有効成分とする酵素剤。
[6] 以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるβ−アミラーゼ遺伝子:
(A)配列番号7に示すアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号6に示す塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号6に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つβ−アミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[7] [6]に記載のβ−アミラーゼ遺伝子を含有する組換えベクター。
[8] [6]に記載のβ−アミラーゼ遺伝子が導入されている形質転換体。
[9] 以下のステップ(1)及び(2)、又はステップ(i)及び(ii)を含んでなる、β−アミラーゼの製造法:
(1)β−アミラーゼ産生能を有するバチルス・フレクサスを培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、β−アミラーゼを回収するステップ;
(i)[8]に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
[10] バチルス・フレクサスが、受託番号NITE BP-548で特定される菌株である、[9]に記載の製造法。
[11] 受託番号NITE BP-548で特定されるバチルス・フレクサス株。
[12] グルコースのα−1,4結合を主鎖とする多糖又はオリゴ糖にバチルス・フレクサス由来のβ−アミラーゼを作用させることを特徴とする、マルトースの生成法。
[13] β−アミラーゼが、[2]〜[4]のいずれか一項に記載したβ−アミラーゼである、[12]に記載の生成法。
本発明において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素(β−アミラーゼ)に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない(特に夾雑タンパク質を実質的に含まない)状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「β−アミラーゼ」と記載した場合は「単離された状態のβ−アミラーゼ」を意味する。β−アミラーゼの代わりに使用される用語「本酵素」についても同様である。
本発明の第1の局面はβ−アミラーゼ(以下、「本酵素」ともいう)及びその生産菌を提供する。後述の実施例に示す通り、本発明者らは鋭意検討の結果、バチルス・フレクサスが耐熱性β−アミラーゼを産生することを見出した。また、当該β−アミラーゼを分離・生成することに成功するとともに、以下に示す通り、その酵素化学的性質を決定することに成功した。
本酵素はβ−アミラーゼであり、多糖類及びオリゴ糖類のα−1,4グルコシド結合に作用し、マルトースを遊離する。グルコースはほとんど遊離しない。
本酵素は基質特異性に優れ、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースに対して良好に作用する。これに対して、プルラン、デキストラン、サイクロデキストリン、マルトトリオースには作用しない。
尚、可溶性デンプンを基質とした場合の活性を基準(100%)としたときの相対活性が50%以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断される。同様に相対活性が10%未満であれば、「本酵素が作用しない基質である」と判断される。本酵素はマルトトリオース及びサイクロデキストリン(α、β、又はγ)に対して実質的な作用を有しない。
尚、本酵素の反応性及び基質特異性は、後述の実施例に示す方法(β−アミラーゼ活性測定方法の欄)で測定・評価することができる。
本酵素の至適温度は約55℃である。本酵素は約50℃〜約60℃において高い活性を示す。至適温度は、後述のβ−アミラーゼ活性測定方法(0.1Mリン酸−塩酸緩衝液(pH5.0)中)による測定で算出された値である。
本酵素の至適pHは約8.0である。本酵素はpH約6.0〜約9.0において高い活性を示す。至適pHは、例えば、pH 2〜4のpH域についてはクエン酸緩衝液中で、pH 4〜11についてはブリットン−ロビンソン緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本酵素は、大豆由来のβ−アミラーゼに匹敵する優れた耐熱性を示す。10mM酢酸カルシウムを含む0.1M酢酸−塩酸緩衝液(pH5.0)中、55℃の条件で10分間処理しても本酵素は90%以上の活性を維持する。
本酵素はpH 4〜9という広いpH域で安定した活性を示す。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、30℃、3時間の処理後、最大活性の70%以上の活性を示す。至適pHは、例えば、pH 2〜4のpH域についてはクエン酸緩衝液中で、pH 4〜11についてはブリットン−ロビンソン緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本酵素の分子量は約60,000(SDS-PAGEによる)である。
寄託機関:NITEバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)
寄託日(受領日):2008年4月9日
受託番号:NITE BP-548
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本発明のポリペプチド分子に等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー(IGH Montpellier、フランス)またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ=12、ギャップペナルティ=4とすることができる。
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重=12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重=2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重=50、ギャップ長加重=3として決定することができる。
本発明の第2の局面は本酵素をコードする遺伝子、即ち新規なβ−アミラーゼ遺伝子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号7のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号6に示す塩基配列からなるDNAである。
等価DNAの更に他の例として、SNP(一塩基多型)に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
例えば、配列番号6に示す塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応(例えばPCR)を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号7に示されるアミノ酸配列や配列番号6に示される塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献:Gene,60(1), 115-127 (1987))。
本発明のさらなる局面は本発明の遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター(アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等)の形態をとり得る。
使用目的(クローニング、タンパク質の発現)に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター(M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体(pB325、pAT153、pUC8など)など)、酵母を宿主とするベクター(pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター(pAc、pVLなど)、哺乳類細胞を宿主とするベクター(pCDM8、pMT2PCなど)等である。
本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入(必要な場合)、プロモーターの挿入(必要な場合)等は標準的な組換えDNA技術(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法)を用いて行うことができる。
本発明は更に、本発明の遺伝子が導入された形質転換体に関する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。
宿主細胞としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる。動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。
本発明の更なる局面はβ−アミラーゼの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、本酵素(β−アミラーゼ)の生産能を有するバチルス・フレクサスを培養するステップ(ステップ(1))及び培養後の培養液及び/又は菌体より、β−アミラーゼを回収するステップ(ステップ(2))が行われる。
ステップ(1)におけるバチルス・フレクサスとして例えば上記のバチルス・フレクサスDSM1316、DSM1320、DSM1667、APC9451等を用いることができる。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程(菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。
尚、発現の確認や発現産物の確認は、β−アミラーゼに対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、β−アミラーゼ活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。
本発明の酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
本発明の更なる局面は、バチルス・フレクサス由来のβ−アミラーゼの用途として、マルトースを生成する方法を提供する。本発明の生成法では、グルコースのα−1,4結合を主鎖とする多糖又はオリゴ糖からなる基質に対してバチルス・フレクサス由来のβ−アミラーゼを作用させる。基質の例として可溶性デンプン、バレイショデンプン、コーンスターチ、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトオリゴ糖を挙げることができる。基質の純度は特に限定されない。従って、他の物質と混在した状態の基質に対してβ−アミラーゼを作用させることにしてもよい。また、二種以上の基質に対して同時にβ−アミラーゼを作用させることにしてもよい。
本発明の生成法は、バチルス・フレクサス由来のβ−アミラーゼを使用することを特徴とするが、好ましくは、β−アミラーゼとして上記本発明のβ−アミラーゼ(本酵素)を用いる。
本発明の生成法は例えばマルトース含有シロップやマルトース水飴の生産に利用される。パンの品質改良や餅・餅菓子の老化防止の手段としても本発明の生成法を利用可能である。
β−アミラーゼの活性は以下の通り測定した。即ち、1%可溶性デンプン及び10mM酢酸カルシウムを含む0.1Mリン酸-塩酸緩衝液(pH5.0)0.5mlに酵素溶液0.5mlを添加して、37℃、30分間インキュベートした後、DNS溶液(0.2% DNS, 80mM NaOH, 0.2M 酒石酸ナトリウムカリウム四水和物)2.5mlを加えて反応を停止する。反応停止後、5分間煮沸を行い、波長530nmにおける吸光度を測定する。波長530nmでの吸光度が1となる酵素量を1単位とする。
バチルス・フレクサスDSM1316、DSM1320、DSM1667、APC9451の4株について表1に示す組成の液体培地を用いて30℃、3日間振とう培養した。
バチルス・フレクサスAPC9451を表1に示す組成の液体培地を用いて30℃、3日間振とう培養した。得られた培養上清液をUF膜(AIP-0013、旭化成社製)にて4倍に濃縮後、60%飽和濃度になるよう硫酸アンモニウムを添加した。沈殿画分を20mM酢酸緩衝液(pH5.5)に再度溶解し、続いて20%飽和濃度になるよう硫酸アンモニウムを添加した。生じた沈殿を遠心にて除去した後、20%飽和濃度の硫酸アンモニウムを含む20mM酢酸緩衝液(pH5.5)にて平衡化したHiPrep Butyl 16/10 FFカラム(GEヘルスケア製)に供し、20%飽和濃度から0%飽和濃度の硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着したβ−アミラーゼタンパク質を溶離させた。
(1)至適反応温度
上記β−アミラーゼ活性測定法に準じ、反応温度を25℃、37℃、50℃、55℃、60℃、65℃及び70℃で反応させた。最高活性を示した温度での値を100%とした相対活性で示した。至適反応温度は55℃付近であった(図1)。
基質には1%可溶性デンプンを用い、各緩衝液(クエン酸緩衝液pH2、pH3、pH4、ブリットン−ロビンソン緩衝液pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11)中、37℃、10分間の反応条件下で測定した。最大活性値を示したpHの値を100%とした相対活性で示した。至適反応pHは約8.0付近であった(図2)。
20u/mlの酵素液を37℃、50℃、55℃、60℃、65℃及び70℃の各温度下、10mM酢酸カルシウムを含む0.1M 酢酸−塩酸緩衝液(pH5.0)中、10分間熱処理した後、残存活性を上記β−アミラーゼ活性測定法にて測定した。熱に対して未処理の活性を100%とした残存活性で示した。55℃、10分間の熱処理では、90%以上の残存活性を有しており、55℃まででは安定であった(図3)。
各緩衝液(クエン酸緩衝液pH2、pH3、pH4、ブリットン−ロビンソン緩衝液pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11)中、30℃で3時間処理後、上記β−アミラーゼ活性測定法にて活性を測定した。最大活性値を示したpHの値を100%とした相対活性で示した。至適反応pHは4〜9であった(図4)。
SDS-PAGEはLaemmliらの方法に従い行った。なお、用いた分子量マーカーは、Low Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis (GEヘルスケア)であり、標準タンパク質としてPhosphorylase b(97,000Da)、Albumin(66,000Da)、Ovalbumin(45,000Da)、Carbonic anhydrase(30,000Da)、Trypsin inhibitor(20,100Da)、α-Lactalbumin(14,400Da)を含んでいた。ゲル濃度10-20%のグラジエントゲル(Wako)を用いて、20mA/ゲルで約80分間電気泳動を行い、分子量を求めた結果、分子量は約60kDaであった(図5)。
アンホラインを用いた等電点集積(600V、4℃、48時間通電)により測定したところ、本酵素の等電点は9.7であった。
10mM酢酸カルシウムを含む0.1M 酢酸−塩酸緩衝液(pH5.0)中のβ−アミラーゼに1mMの各種金属イオンあるいは阻害剤をそれぞれ添加し、30℃、30分間処理した後、上記β−アミラーゼ活性測定法にて活性を測定した。その結果を表4に示した。無添加の場合を100%とした相対活性で示した。Cuイオン、ヨード酢酸、PCMB、SDSにより阻害を受けた。
各基質に対するβ−アミラーゼ活性を調べた。可溶性デンプンに対する活性を100%とした相対活性で示した。オリゴ糖類については、以下に示すマルトースの定量法によりマルトース生成量を調べた。0.5%の各マルトオリゴ糖に対して0.1u/mlの酵素を37℃、30分間反応させた後、HPLC(Aminex carbohydrate HPX-42A, BIO-RAD社)にてマルトースの定量を行った。可溶性デンプンを基質としたときのマルトース生成量を100%として各マルトオリゴ糖に対する相対活性をマルトース生成量から求めた。
結果を表5に示した。可溶性デンプンに対するマルトース生成量を100%とした相対活性で示した。サイクロデキストリン、プルラン、デキストランはほとんど分解されなかった。オリゴ糖については、マルトトリオースには作用せず、他のオリゴ糖にはよく作用した。
(a)染色体DNAの単離
1.で得られたバチルス・フレクサス(Bacillus flexus)の菌体から斉藤・三浦の方法(Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963) によりゲノムDNAを調製した。
1.で得られたβ−アミラーゼの精製標品をアミノ酸配列解析に供し、10残基のN末端アミノ酸配列(配列番号1)および内部ペプチドアミノ酸配列(配列番号2、3)を決定した。
N末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、2種の混合オリゴヌクレオチドを合成し、PCRプライマーとした(配列番号4、5)。これらのプライマーとバチルス・フレクサス(Bacillus flexus)の染色体DNAを鋳型として、以下の条件下、PCR反応を行なった。
10×PCR反応緩衝液(TaKaRa社) 5.0μl
dNTP混合液(それぞれ2.5 mM、TaKaRa社) 4.0μl
25mM MgCl2 5μl
100μM センス・プライマー 3.0μl
100μM アンチセンス・プライマー 3.0μl
蒸留水 28.5μl
染色体DNA溶液(140μg/ml) 1μl
LA Taq DNAポリメラーゼ(TaKaRa社) 0.5μl
ステージ1: 変性(94℃、5分) 1サイクル
ステージ2: 変性(94℃、30秒) 30サイクル
アニール(48℃、30秒)
伸長(72℃、1分)
バチルス・フレクサスの染色体DNAのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、KpnI分解物中にプローブDNAとハイブリダイズする約5.0 kbのシングルバンドが確認された。この約5.0 kbのKpnI DNA断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作製した。上記(a)で調製した染色体DNAのKpnI処理を行った。バチルス・フレクサスのゲノムDNA 28μg、10×L緩衝液3μl、蒸留水26μl、及びKpnIを1μl混合し、37℃で15時間処理した。得られた分解物をKpnI処理したpUC19(TaKaRa社)ベクターにライゲーションし、遺伝子ライブラリーを得た。
上記(c)で得た0.86 kbのDNA断片をDIG-High Prime(Roche社)を用いてラベルした。これをDNAプローブとして、(d)で得た遺伝子ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られたポジティブコロニーからプラスミドpUC19-BAFを得た。
プラスミドpUC19-BAFの塩基配列を定法に従って決定した。β−アミラーゼをコードする塩基配列(1638bp)を配列番号6に示す。また配列番号6によりコードされるアミノ酸配列(545 amino acid)を配列番号7に示す。このアミノ酸配列中には、(b)で決定したN末端領域アミノ酸配列(配列番号1)および内部アミノ酸配列(配列番号2、3)が見出された。
(a)β−アミラーゼの大腸菌での発現プラスミドの構築
N末端領域アミノ酸配列およびC末端領域アミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに、2種のオリゴヌクレオチド(配列番号8、9)を合成し、PCRプライマーとした。センス・プライマーにはNdeI制限酵素認識部位が、アンチセンス・プライマーにはXhoI制限酵素認識部位が付加されている。これらのプライマーとβ−アミラーゼ遺伝子を有するプラスミドpUC19-BAFを鋳型として、以下の条件下、PCR反応を行なった。
10×PCR反応緩衝液(TOYOBO社) 5.0μl
dNTP混合液(それぞれ2.5 mM、TOYOBO社) 5.0μl
10μM センス・プライマー 1.5μl
10μM アンチセンス・プライマー 1.5μl
25mM MgSO4 2μl
蒸留水 33μl
プラスミドpUC19-BAF溶液(83μg/ml) 1.0μl
KOD -Plus- DNAポリメラーゼ(TOYOBO社) 1.0μl
ステージ1: 変性(94℃、2分) 1サイクル
ステージ2: 変性(94℃、15秒) 30サイクル
アニール(60℃、30秒)
伸長(68℃、2分)
発現プラスミドpET-BAFを大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)に導入した。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的のβ−アミラーゼ遺伝子が挿入されたpET-BAFを保持する菌株を選別した。また対照として発現ベクターpET20(b)を有する大腸菌BL21(DE3)の形質転換体も得た。これらの形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地4mlで18℃、160rpmで47時間培養し、集菌した。菌体を0.5mlの20mM 酢酸緩衝液(pH5.5)に縣濁し、φ0.1mmのガラスビーズを0.25g加え、マルチビーズショッカー(安井機械社製)にて菌体を破砕した。破砕条件は、ON 30秒、OFF 30秒を3.5サイクル繰り返した。得られたCell free-extractを遠心分離に供し、可溶性成分を得た。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (10)
- バチルス・フレクサス(Bacillus flexus)由来のβ−アミラーゼであって、配列番号7に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列からなり、多糖類及びオリゴ糖類のα−1,4グルコシド結合に作用し、マルトースを遊離する作用を示す、β−アミラーゼ。
- 下記の酵素化学的性質を備え、配列番号7に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列からなる、β−アミラーゼ、
(1)作用:多糖類及びオリゴ糖類のα−1,4グルコシド結合に作用し、マルトースを遊離する、
(2)基質特異性:デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースに良好に作用し、プルラン、デキストラン、サイクロデキストリン、マルトトリオースには作用しない、
(3)至適温度:約55℃、
(4)至適pH:約8.0、
(5)温度安定性:55℃以下で安定である(pH 5.0、10分間)、
(6)pH安定性:pH 4〜9で安定である(30℃、3時間)、
(7)分子量:約60,000(SDS-PAGE)。 - 請求項1又は2に記載のβ−アミラーゼを有効成分とする酵素剤。
- 以下の(A)〜(D)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるβ−アミラーゼ遺伝子:
(A)配列番号7に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号6に示す塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号6に示す塩基配列を基準として1〜40塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、且つβ−アミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA:
(D)請求項1に記載のβ−アミラーゼをコードするDNA。 - 請求項4に記載のβ−アミラーゼ遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項4に記載のβ−アミラーゼ遺伝子が導入されている形質転換体。
- 以下のステップ(1)及び(2)、又はステップ(i)及び(ii)を含んでなる、β−アミラーゼの製造法:
(1)請求項1又は2に記載のβ−アミラーゼ産生能を有するバチルス・フレクサスを培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、β−アミラーゼを回収するステップ;
(i)請求項6に記載の形質転換体を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。 - バチルス・フレクサスが、受託番号NITE BP-548で特定される菌株である、請求項7に記載の製造法。
- 受託番号NITE BP-548で特定されるバチルス・フレクサス株。
- グルコースのα−1,4結合を主鎖とする多糖又はオリゴ糖に請求項1又は2に記載のβ−アミラーゼを作用させることを特徴とする、マルトースの生成法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010510999A JP5528333B2 (ja) | 2008-05-08 | 2009-04-21 | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008122278 | 2008-05-08 | ||
JP2008122278 | 2008-05-08 | ||
JP2010510999A JP5528333B2 (ja) | 2008-05-08 | 2009-04-21 | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
PCT/JP2009/001807 WO2009136471A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-04-21 | β-アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009136471A1 JPWO2009136471A1 (ja) | 2011-09-01 |
JP5528333B2 true JP5528333B2 (ja) | 2014-06-25 |
Family
ID=41264527
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010510999A Active JP5528333B2 (ja) | 2008-05-08 | 2009-04-21 | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8486682B2 (ja) |
EP (1) | EP2295563B1 (ja) |
JP (1) | JP5528333B2 (ja) |
CN (1) | CN102016033B (ja) |
DK (1) | DK2295563T3 (ja) |
ES (1) | ES2565843T3 (ja) |
PL (1) | PL2295563T3 (ja) |
WO (1) | WO2009136471A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5528333B2 (ja) * | 2008-05-08 | 2014-06-25 | 天野エンザイム株式会社 | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
KR20120052263A (ko) | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 아마노 엔자임 가부시키가이샤 | β?아밀라제를 이용한 식품의 개질 방법 |
JP5847606B2 (ja) * | 2012-01-31 | 2016-01-27 | ハウス食品グループ本社株式会社 | 食品試料中のアミラーゼ活性の分析法 |
CN102559564B (zh) * | 2012-03-06 | 2013-09-04 | 福州大学 | 一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法 |
CN103333825B (zh) * | 2013-06-24 | 2014-12-10 | 贵州珍酒酿酒有限公司 | 一种弯曲芽孢杆菌及其用途 |
WO2015021600A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | Danisco Us Inc. | Beta-amylase and methods of use |
CN105238717B (zh) * | 2015-10-21 | 2019-01-11 | 江南大学 | 一种高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌及其应用 |
CN109475130A (zh) * | 2016-07-15 | 2019-03-15 | 诺维信公司 | 改善扁平面包的可卷曲性 |
AU2018322748B2 (en) | 2017-08-29 | 2024-05-02 | Novozymes A/S | Baker's yeast expressing anti-staling/freshness amylases |
CA3076578A1 (en) | 2017-10-25 | 2019-05-02 | Basf Se | Beta-amylase enzymes |
WO2019126209A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Cellular Research, Inc. | Particles associated with oligonucleotides |
CN119120429A (zh) * | 2018-10-31 | 2024-12-13 | 天野酶制品株式会社 | 麦芽三糖生成淀粉酶 |
US11371076B2 (en) | 2019-01-16 | 2022-06-28 | Becton, Dickinson And Company | Polymerase chain reaction normalization through primer titration |
US20220220463A1 (en) | 2019-04-23 | 2022-07-14 | Basf Se | Beta-amylase variants |
CN113337444A (zh) * | 2021-06-26 | 2021-09-03 | 北京大学深圳研究院 | 一株弯曲芽孢杆菌及其产pha的应用 |
WO2024036189A2 (en) * | 2022-08-09 | 2024-02-15 | Xylogenics, Inc. | Strains of saccharomyces cerevisiae that exhibit an increased ability to hydrolyze polysaccharides and ferment resulting oligosaccharides into ethanol without supplemental glucoamylase and methods of making and using the same |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101153276A (zh) * | 2006-09-27 | 2008-04-02 | 吴襟 | 一种β-淀粉酶及其编码基因与生产方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK135983D0 (da) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
US5512463A (en) | 1991-04-26 | 1996-04-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis |
JP3743525B2 (ja) | 1994-03-02 | 2006-02-08 | タカラバイオ株式会社 | 部位特異的変異導入方法 |
JP3526326B2 (ja) | 1994-09-05 | 2004-05-10 | タカラバイオ株式会社 | 部位特異的変異導入方法 |
JPH08140685A (ja) | 1994-11-22 | 1996-06-04 | Takara Shuzo Co Ltd | 部位特異的変異導入方法 |
WO1998002535A1 (fr) | 1996-07-11 | 1998-01-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede pour effectuer une mutagenese dirigee |
CA2728285A1 (en) * | 2008-03-03 | 2009-09-11 | Joule Unlimited, Inc. | Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest |
JP5528333B2 (ja) * | 2008-05-08 | 2014-06-25 | 天野エンザイム株式会社 | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
KR20120052263A (ko) * | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 아마노 엔자임 가부시키가이샤 | β?아밀라제를 이용한 식품의 개질 방법 |
-
2009
- 2009-04-21 JP JP2010510999A patent/JP5528333B2/ja active Active
- 2009-04-21 CN CN200980116459.5A patent/CN102016033B/zh active Active
- 2009-04-21 ES ES09742596.1T patent/ES2565843T3/es active Active
- 2009-04-21 DK DK09742596.1T patent/DK2295563T3/en active
- 2009-04-21 PL PL09742596T patent/PL2295563T3/pl unknown
- 2009-04-21 WO PCT/JP2009/001807 patent/WO2009136471A1/ja active Application Filing
- 2009-04-21 EP EP09742596.1A patent/EP2295563B1/en active Active
- 2009-04-21 US US12/991,465 patent/US8486682B2/en active Active
-
2013
- 2013-06-17 US US13/919,305 patent/US9157074B2/en active Active
- 2013-06-17 US US13/919,248 patent/US9090886B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101153276A (zh) * | 2006-09-27 | 2008-04-02 | 吴襟 | 一种β-淀粉酶及其编码基因与生产方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6009027124; LEE, J. S. et al.: '"Cloning, expression, and carbon catabolite repression of the bamM gene encoding beta-amylase of Bac' APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL. Vol.56, No.1-2, 2001, p.205-211 * |
JPN6009027125; '"Beta-amylase (EC 3.2.1.2)."' [online] , 20080429, ACCESSION: A5JUT4, UniProt * |
JPN6009027126; ZHAO, J. et al.: '"Isolation and identification of an alkaliphilic Bacillus flexus XJU-3 and analysis of its alkaline' [online] , 20080830, PMID: 18720839, PubMed * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009136471A1 (ja) | 2009-11-12 |
US20110059491A1 (en) | 2011-03-10 |
US20140045222A1 (en) | 2014-02-13 |
DK2295563T3 (en) | 2016-04-11 |
JPWO2009136471A1 (ja) | 2011-09-01 |
EP2295563B1 (en) | 2016-01-13 |
ES2565843T3 (es) | 2016-04-07 |
CN102016033A (zh) | 2011-04-13 |
CN102016033B (zh) | 2014-05-07 |
US20130273632A1 (en) | 2013-10-17 |
US9157074B2 (en) | 2015-10-13 |
US9090886B2 (en) | 2015-07-28 |
EP2295563A1 (en) | 2011-03-16 |
PL2295563T3 (pl) | 2016-08-31 |
US8486682B2 (en) | 2013-07-16 |
EP2295563A4 (en) | 2012-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5528333B2 (ja) | β−アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 | |
EP2454942B1 (en) | Method for improvement of foods utilizing beta-amylase | |
JP6115921B2 (ja) | マルトトリオシル転移酵素及びその製造方法並びに用途 | |
US11142748B2 (en) | Saccharide oxidase, and production method for same and use of same | |
JP5719173B2 (ja) | タンナーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131023 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140326 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140415 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5528333 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |