JP6160621B2 - ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩及びその結晶、これらの製造方法、並びに、組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩及びその結晶、これらの製造方法、並びに、組成物に関する。

ピロロキノリンキノンは式（２）で表される。

ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」又は「フリー体」ともいう。）は新しいビタミン（補酵素）等としての機能を有する可能性があることが知られており、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱが、近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、逆転写酵素阻害作用及びグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用など多くの生理活性を有することが明らかにされている。

これまでに、ピロロキノリンキノンにアルカリ金属イオンが１〜３つ付いた、モノアルカリ塩、ジアルカリ塩、及びトリアルカリ塩が知られている。これまでに報告されているＰＱＱのアルカリ塩は水溶性物質として知られているが、実際には溶解性は低く、また、フリー体の溶解性はさらに低いものである。これまでに結晶として構造決定されたアルカリ塩はジナトリウム塩（非特許文献１）である。同様にジナトリウム塩の結晶多形も知られている（特許文献１）。

これまでにＰＱＱはアルカリ性で分解すると考えられてきたため、アルカリ条件での結晶化物に対する構造については検討されていない（非特許文献２）。

国際公開第２０１１／００７６３３号公報

ＪＡＣＳ， １０３巻， ５５９９〜５６００頁（１９８１） ビタミン６７巻９号１９９３

上記のように、ピロロキノリンキノン及びその塩は、溶解性が低いため、高濃度の水溶液を作ることは難しい。しかしながら、水溶液は食品、医薬品分野で提供する際に最も使用されるため、ＰＱＱが高濃度で溶解し、析出しない水溶液が求められている。

また、ＰＱＱの分離精製を行う上でも溶解性が低いと、溶解させるために大量の溶媒（特に水）が必要になり、大きな装置が必要になる、また、廃液量が多くなる等の弊害を有している。

また、ピロロキノリンキノンはアスコルビン酸と反応することにより変色しやすいという問題がある。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、特別な試薬を必要とせず、溶媒に対する溶解性が高く、高濃度のピロロキノリンキノン水溶液を得ることができ、アスコルビン酸を併用しても変色し難く、さらに高品質で純度の高いピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩及びその結晶、これらの簡単な製造方法、並びに、組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、所定の構造を有するピロロキノリンキノンの塩であれば、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕
下記式（１）で表される、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩。
（式（１）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種である。）
〔２〕
前項〔１〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩を含む、結晶。
〔３〕
上記式（１）中のＭの少なくとも１つがＮａである、前項〔２〕に記載の結晶。
〔４〕
粉末Ｘ線回折においてＣｕ−Ｋαを用いた際に、２θのピークが、５．８９±０．４°，１１．７２±０．４°，１２．４３±０．４°，１３．５９±０．４°，１８．０９±０．４°，２３．９３±０．４°，２６．５０±０．４°，２９．４０±０．４°に現れる、前項〔２〕又は〔３〕に記載の結晶。
〔５〕
単結晶Ｘ線構造分析により測定される以下のディメンジョン：
単位格子寸法
ａ＝２１．６０７２（５）Å
ｂ＝６．８０４０１（１７）Å
ｃ＝３０．１０７０（７）Å
Ｖ＝４４２６．２０（１８）Å^３
を有する、前項〔２〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の結晶。
〔６〕
前項〔１〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩、及び／又は、前項〔２〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の結晶と、
アスコルビン酸と、
を含む、組成物。
〔７〕
ピロロキノリンキノン及び／又はピロロキノリンキノンアルカリ塩と、アルカリ金属化合物と、を強アルカリ性条件下で混合させる混合工程を有する、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
〔８〕
アルカリ金属化合物が水酸化ナトリウムである、前項〔７〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
〔９〕
前記混合工程における強アルカリ性条件が、ｐＨ１０〜１４である、前項〔７〕又は〔８〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
〔１０〕
前記混合工程後、得られるピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の貧溶媒を添加する析出工程をさらに有する、前項〔７〕〜〔９〕いずれか１項に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
〔１１〕
ピロロキノリンキノン及び／又はピロロキノリンキノンアルカリ塩と、アルカリ金属化合物と、を強アルカリ性条件下で混合させる混合工程を有する、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の結晶の製造方法。
〔１２〕
前項〔１〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩、前項〔２〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の結晶、及び／又は、前項〔６〕に記載の組成物を含む、食品。
〔１３〕
前項〔１〕に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩、前項〔２〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の結晶、及び／又は、前項〔６〕に記載の組成物を含む、化粧品。

本発明によれば、溶媒に対する溶解性が高く、高濃度のピロロキノリンキノン水溶液を得ることができ、アスコルビン酸を併用しても変色し難く、高品質で純度の高いピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩及びその結晶、これらの製造方法、並びに、組成物を提供することができる。

実施例１により得られたＰＱＱテトラナトリウム塩結晶組成物構造（ＯＲＴＥＰ）である。 実施例１により得られたＰＱＱテトラナトリウム塩結晶組成物構造（ＯＲＴＥＰ）である。 実施例１により得られたＰＱＱテトラナトリウム塩結晶組成物構造である。 実施例３により得られたＰＱＱテトラナトリウム塩の粉末Ｘ線回折結果である。 実施例４により得られたＰＱＱテトラナトリウム塩の粉末Ｘ線回折結果である。 参考例１により得られたＰＱＱナトリウム塩の粉末Ｘ線回折結果

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

〔ピロロキノリンキノンテトラナトリウム塩〕
本実施形態に係るピロロキノリンキノンテトラナトリウム塩（以下、「ＰＱＱテトラアルカリ塩」ともいう。）は、式（１）で表される。
（式（１）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種である。）

ＰＱＱテトラアルカリ塩の有するアルカリ金属Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種である。ＰＱＱテトラアルカリ塩に含まれるアルカリ金属の種類は１種であってもよく、又は２種以上であってもよい。このなかでも、アルカリ金属が１種であるＰＱＱテトラアルカリ塩が好ましい。アルカリ金属が１種であるＰＱＱテトラアルカリ塩は、ＰＱＱのフリー体から作製しやすい傾向にある。また、２種以上のアルカリ金属を含むＰＱＱテトラアルカリ金属も好ましい。２種以上のアルカリ金属を含むＰＱＱテトラアルカリ塩としては、特に限定されないが、例えば、ジナトリウム塩が市販されているため原料が入手しやすいので、ナトリウムとその他のアルカリ金属イオンを含むＰＱＱテトラアルカリ塩が好ましい。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩は、重量割合で５０質量％以下であれば、水、溶媒又はアルカリ金属化合物を含んでいてもよい。

〔結晶〕
本実施形態に係る結晶は、上記ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩を含む。このなかでも、上記式（１）中のＭの少なくとも１つがＮａであるピロロキノリンキノンテトラナトリウム塩が好ましく、上記式（１）中のＭの全てがＮａであるピロロキノリンキノンテトラナトリウム塩がより好ましい。

上記ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩は、純度、安定性の観点からから結晶であることが好ましい。ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩が結晶であるかどうかは顕微鏡、粉末Ｘ線回折（以下、ＸＲＤと略すことがある）、単結晶Ｘ線解析、及び／又は電子線回折等で確認することが可能である。

本実施形態に係るＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶は、粉末Ｘ線回折においてＣｕ−Ｋαを用いた際に、２θのピークが、５．８９±０．４°，１１．７２±０．４°，１２．４３±０．４°，１３．５９±０．４°，１８．０９±０．４°，２３．９３±０．４°，２６．５０±０．４°，２９．４０±０．４°に現れることが好ましい。

粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定は、例えば、下記の測定条件で行うことができる。その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。
（測定条件）
装置 ：株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００
Ｘ線 ：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅 ：０．０２０°

単結晶Ｘ線構造分析により測定される本実施形態に係るＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶は例えば以下のディメンジョンを有することが好ましい。
単位格子寸法
ａ＝２１．６０７２（５） Å
ｂ＝６．８０４０１（１７） Å
ｃ＝３０．１０７０（７） Å
Ｖ＝４４２６．２０（１８） Å^３

本実施形態に係るＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶の、単結晶Ｘ線構造分析における各ピークの相対強度は、下記表２の評価基準に従って、表１で表すことができる。

最大強度を有するピークに対するパーセンテージとして相対強度を算出する。

〔ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩及びその結晶の製造方法〕
本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩及びその結晶の製造方法は、ＰＱＱ、又は、ＰＱＱアルカリ塩（以下、まとめて「ＰＱＱ類」ともいう。）と、アルカリ金属化合物と、を強アルカリ性条件下で混合させる混合工程を有する。なお、混合工程は、溶媒存在下で行うことができる。

ＰＱＱ類とアルカリ金属化合物との混合割合は、ＰＱＱ類１モルに対して、アルカリ金属化合物３．５〜１００００モルが好ましく、４〜１０００モルがよりこのましく、４〜７００モルがさらに好ましい。混合割合が３．５モル以上であることにより、ＰＱＱ類がより溶解する傾向にある。また、混合割合が１００００モル以下であることにより、アルカリ性が高くなり過ぎず、実用上優れる傾向にある。

アルカリ金属化合物としてナトリウム化合物を用いる場合には、ＰＱＱ類とナトリウム化合物との混合割合は、ＰＱＱ類１モルに対して、ナトリウム化合物３．５〜１０００００モルが好ましく、４〜１０００モルがよりこのましく、４〜７００モルがさらに好ましい。混合割合が上記範囲内であることにより、ＰＱＱテトラアルカリ塩がより析出しやすい傾向にある。

混合工程後、溶解度を下げることで塩又は塩の結晶を析出させ、その後、溶媒を除去することができる。溶解度を下げる方法としては、具体的には、−２０〜２００℃で凍結乾燥、減圧乾燥、及び／又は加熱乾燥等の方法によって溶媒を除去する方法、貧溶媒を加えて塩又は塩の結晶を析出させる方法等が挙げられる。特に、ＰＱＱイオン１に対してナトリウムイオンが４の場合、析出し易いため好ましい。なお、溶解度を下げる条件、すなわち析出条件により、好ましい混合割合が変わることもある。

（ＰＱＱ類）
使用しうるＰＱＱ類としては、特に限定されないが、例えば、ＰＱＱのフリー体、ＰＱＱモノアルカリ塩、ＰＱＱジアルカリ塩、ＰＱＱトリアルカリ塩が挙げられる。このようなＰＱＱ類としては、特に限定されないが、具体的には、ＰＱＱの、ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、若しくはルビジュウムの塩、又はＰＱＱのアンモニウム塩が挙げられる。このなかでもより好ましくは、ＰＱＱの、フリー体、ナトリウム、カリウムの塩であり、最も手に入れやすいＰＱＱのナトリウム塩が特に好ましい。なお、塩としてはモノ、ジ、トリのどれでもよい。このなかでも、好ましくはジナトリウム塩である。ＰＱＱ類は、１種単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。このなかでもジナトリウム塩は安定性が高く、フリー体モノアルカリ体より溶解度が高いため、ＰＱＱテトラアルカリ塩をより効率よく得ることができる傾向にある。

これらのＰＱＱ類原料は有機化学的合成法及び発酵法などにより製造することが可能である。原料に用いるＰＱＱの塩は結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。

（アルカリ金属化合物）
使用するアルカリ金属化合物としては、特に限定されないが、例えば、
水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジューム、炭酸リチウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸ルビジューム、重炭酸リチウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸セシウム、重炭酸ルビジューム、リチウムアルコキシド、カリウムアルコキシド、ナトリウムアルコキシド、セシウムアルコキシド、ルビジュームアルコキシドである。このなかでも、より好ましくは水酸化ナトリウムである。安価である水酸化ナトリウムを用いることにより、毒性のないナトリウムイオンからなるＰＱＱテトラナトリウム塩をより効率よく得ることができる傾向にある。

混合工程において用いうる溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、グリセリン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジプロピレングリコール、メトキシプロピレングリコール、メトキシエチレングリコール、メトキシジプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコール等が挙げられる。このなかでも水又は水と他の溶媒との混合溶媒が好ましい。

混合工程における、強アルカリ性条件は、ｐＨ１０〜１４が好ましく、ｐＨ１２〜１４がより好ましく、ｐＨ１３〜１４がさらに好ましい。このｐＨは目安で、共存する塩等の影響で好ましいｐＨが変わる場合もある。ｐＨを調整する方法としては、特に限定されないが、例えば、混合工程における溶液に、酸又はアルカリを加えることが挙げられる。酸又はアルカリとしては、特に限定されないが、例えば、無機、有機、どちらでも使用できる。

アルカリとしては、特に限定されないが、例えば、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジュウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム、炭酸セシウム、炭酸ルビジュウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素セシウム、炭酸水素ルビジュウム、炭酸水素ナトリウム、コリン、テトラメチルアンモニウムヒドロキサイド等が挙げられる。

また、酸としては、特に限定されないが、例えば、リン酸、ホウ酸、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸等が挙げられる。

塩の形成を溶媒中で行う際の反応温度は、特に制限がないが、−２０〜１４０℃が好ましく、−１０〜９０℃がより好ましく、０〜７０℃がさらに好ましい。塩の形成を溶媒中で行う際に必要な時間は、混合速度、攪拌、温度、濃度等によって変化するが、１０分〜７日間が好ましく、３０分〜５日間がより好ましく、１時間〜３日間がさらに好ましい。ＰＱＱ類に対するナトリウム等のアルカリ金属化合物の付加が進み、アルカリ金属の付加数が増えるに従い、得られるＰＱＱアルカリ塩の水への溶解性は向上する。

水、または有機溶媒中で形成したＰＱＱテトラアルカリ塩は、乾燥、濃縮、温度低下、貧溶媒添加、塩析、又はｐＨ変化によって、析出等させて得ることができる。このなかでも、混合工程後、得られるＰＱＱテトラアルカリ塩の貧溶媒を添加する析出工程をさらに有することが好ましい。貧溶媒は使用する混合工程中の溶媒に応じて選択する必要がある。

貧溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水溶性有機溶媒を用いることができる。水溶性有機溶媒としては、特に限定されないが、具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、グリセリン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジプロピレングリコール、メトキシプロピレングリコール、メトキシエチレングリコール、メトキシジプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコール等が挙げられる。このなかでも、好ましくはアルコールである。ＰＱＱテトラアルカリ塩が溶媒に溶けた状態から、貧溶媒として水溶性有機溶媒を加えることで、ＰＱＱテトラアルカリ塩の溶解度を下げ、塩又は塩の結晶を析出させることができる。

なお、ＰＱＱテトラアルカリ塩は、ＰＱＱ類とナトリウム化合物を接触させてＰＱＱ類が溶けている溶媒に対してＰＱＱ類が溶けにくい溶媒（貧溶媒）を加えて溶解度を下げることでも作製することができる。

以下、入手しやすく、溶解性の高い塩の一例として、ＰＱＱテトラナトリウム塩の好ましい具体的な製造方法について説明する。

ＰＱＱジナトリウム塩を水に溶解させる。原料溶解時のｐＨは特に限定されない。使用しやすいのはｐＨ３から１４であることが望ましく、より好ましくは５から１３である。ｐＨ調整の為にアルカリ性のナトリウム化合物溶液を加えて調整してもよい。この時の温度は０から１４０℃であれはよく、この溶液にナトリウム化合物を加え、ｐＨを１０以上にすることで４ナトリウム塩を調製することができる。反応時間は特に制限がないが、５分から１週間ぐらいで行うことができる。スケールが小さい場合は短時間ですむが、大きな場合は長時間必要である。このときの温度は−２０から１４０℃で使用すれはよく、好ましくは０から８０℃である。反応した液は乾固、若しくは再結晶で塩を固体として得ることができる。本実施形態では必ずしも固体である必要はない。再結晶させる溶媒は水または有機溶媒中で行えばよい。得られた固体は常圧、減圧で乾燥すればよい。

また、入手しやすく、溶解性の高い塩の一例として、ＰＱＱテトラカリウム塩の好ましい具体的な別の製造方法について説明する。

ＰＱＱフリー体を水に懸濁させる。この時の温度は０から１４０℃であれはよく、この溶液に水酸化カリウム化合物を加え、テトラカリウム塩を調製することができる。反応時間は特に制限がないが、５分から１週間ぐらいで行うことができる。スケールが小さい場合は短時間ですむが、大きな場合は長時間必要である。このときの温度は−２０から１４０℃で使用すれはよく、好ましくは０から８０℃である。反応した液は乾固、若しくは再結晶で塩を固体として得ることができる。再結晶させる溶媒は水または有機溶媒中で行えばよい。得られた固体は常圧、減圧で乾燥すればよい。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩には目的物であるＰＱＱテトラアルカリ塩以外に原料のＰＱＱ類が混じっていても構わない。原料のＰＱＱ類を含むことにより、溶解度、溶解速度を制御することが容易となる傾向にある。ＰＱＱテトラアルカリ塩とＰＱＱ類との混合割合は目的に応じて設計することができる。ＰＱＱテトラアルカリ塩とＰＱＱ類との混合割合は、使用しやすいのは重量比でＰＱＱ類１に対して、ＰＱＱテトラアルカリ塩０．０１〜１００が好ましく、０．０２〜５０がより好ましく、０．０５〜２０がさらに好ましい。

〔組成物〕
本実施形態に係る組成物は、上記ＰＱＱテトラアルカリ塩、及び／又は、上記ＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶と、アスコルビン酸と、を含む。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩は、ヒト又は動物向けに医薬、化粧品、機能性食品、又は飼料等の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、或いは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。尚、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩の組成物には原料のＰＱＱ類が混じっていても構わない。混合されていることで溶解度、溶解速度を制御することが容易となる。混合割合は目的に応じて設計することができる。ＰＱＱテトラアルカリ塩とＰＱＱ類との混合割合は、使用しやすいのは重量比でＰＱＱ類１に対して、ＰＱＱテトラアルカリ塩０．０１〜１００が好ましく、０．０５〜２０がより好ましく、０．１〜１０がさらに好ましい。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩の組成物は、溶媒又はアルカリ化合物を含んでいてもよい。溶媒又はアルカリ化合物の含有量は、特に限定されないが、重量割合で、５０質量％以下が好ましく、０〜４０質量％がより好ましく、０〜３０質量％がさらに好ましい。

本実施形態に係るＰＱＱテトラアルカリ塩は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、コエンザイムＱ１０，ビタミンＢ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）又はビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α−カロテン、β−カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。

特にアスコルビン酸は混合した際に水が接触すると変質しやすいが、本実施形態のＰＱＱテトラアルカリ塩とアスコルビン酸を混合する場合は安定である。ＰＱＱテトラアルカリ塩とアスコルビン酸との混合比は、重量比で、ＰＱＱテトラアルカリ塩１に対してアスコルビン酸０．０１から２００が好ましい。この範囲より低い比では変質作用はより小さくなる傾向にある。

本実施形態に係る食品及び化粧品は、上記ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩、その結晶、及び／又は、上記組成物を含む。

以下、実施例及び比較例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。

使用する試薬は特に明記のないものについては、和光製を使用した。

（ＰＱＱ分析）
ＰＱＱは以下の装置を用いて同定した。
装置： 島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、Ｌｃ−２０Ａ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ｔｍｓ（５マイクロｍ）、１５０Ｘ４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．
測定温度：４０℃
検出 ：２６０ｎｍにおける吸光度
溶離液 ：１００ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４（３０／７０，ｐＨ５．１）
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ

（イオンクロマトグラフィー）
ＰＱＱアルカリ塩のカチオン分析はダイオネクス製のイオンクロマトグラフィーで分析した。
Ｎａイオンはホリバ社製ナトリウムイオンメーターで計測した。
（粉末Ｘ線回折測定条件）
装置 ：株式会社ＲＩＧＡＫＵ製ＲＩＮＴ２５００
Ｘ線 ：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅 ：０．０２０°

〔参考例：ＰＱＱジナトリウム塩、ＰＱＱトリナトリウム塩、及びＰＱＱフリー体の調製〕
原料のＰＱＱは特許第２６９２１６７号公報の培養法で得た。得られたカラム精製後、ｐＨ７で塩化ナトリウムを加えると赤い固体を得た。この固体を５０％エタノールで洗浄し、塩化ナトリウムを除去して、ＰＱＱトリナトリウム塩を得た。

ＰＱＱ２０ｇを含む含水ＰＱＱトリナトリウム塩の固体６０ｇをイオン交換水５００ｍＬとエタノール５００ｍＬの混合液に加えた。この時、固体は溶け切っていなかった。ここに室温下で塩酸を加え、溶液のｐＨを３．５にした。塩酸の添加は約２時間かけてゆっくり滴下して行った。その後、２日間攪拌した。濾過して含水ＰＱＱジナトリウム塩（Ｎａ_２ＰＱＱ）の結晶を収率９９ｍｏｌ％で得た。

このＰＱＱジナトリウム３ｇを水１Ｌに溶かし、塩酸を加えて溶液のｐＨ１にした。赤い固体が析出した。これを濾過し、２Ｎ塩酸で洗い、水洗した。減圧乾燥してＰＱＱフリー体を収率８５ｍｏｌ％で得た。以下の実験はこれらの原料を使用した。

〔実施例１：ＰＱＱテトラナトリウム塩（Ｎａ_４ＰＱＱ）〕
〔単結晶作製〕
ＰＱＱジナトリウム２ｇ／Ｌ水溶液５００μＬと２５％水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを混合した。この時、ｐＨは１３．４であった。この溶液を２ｍＬのチューブに入れ、ゆっくりとメタノール１０００μＬを加え、２層にした。この溶液を室温で置いたところ、４日後、赤色の結晶が析出した。この結晶を取り出し、単結晶Ｘ線構造解析装置（株式会社リガク社製ＶａｒｉＭａｘ ｗｉｔｈ ＲＡＰＩＤ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて下記の条件にて、単結晶Ｘ線構造解析を行った。
Ｘ線源 ：ＣｕＫ（λ＝１．５４１８７Å）
管電圧 ：４０ｋＶ
管電流 ：３０ｍＡ
測定温度 ：−１８０℃（吹付低温装置使用）
カメラ長 ：１２７．４ｍｍ
振動角 ：１０°
露光時間 ：２００ｓｅｃ／ｄｅｇ
全測定枚数 ：９０枚（３６０枚×３シリーズ）
全測定時間：５１時間５７分（読み取り・消去時間を含む）。

ピロロキノリンキノンテトラナトリウム塩結晶組成物構造を図１（ＯＲＴＥＰ）、図２（ＯＲＴＥＰ）、図３、及び表３に示す。また、表４に単結晶パラメーターを示す。なお、図３は、１つの結晶格子内に４つのＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶が存在することを示しておいる。また、図２（ｂ）は結晶格子内の２つのＰＱＱテトラナトリウム塩の配置状態を示しており、図１及び図２（ａ）は、結晶格子内に含まれる１つのＰＱＱテトラナトリウム塩の構造だけを示している。

ＰＱＱテトラナトリウム塩の結晶の原子座標
Ｂｅｑ：等価等方性温度因子
この結晶構造は粉末Ｘ線回折データに変換して、結晶構造も確認できる。Ｘ線構造解析ソフトＭｅｒｃｕｒｙを使用して単結晶で得られたデータを変換した。

この構造は単位格子内にＰＱＱ骨格４に対し、ナトリウム１６、水３４の割合で含む結晶であった。すなわち、ＰＱＱ骨格１あたり、ナトリウム４、水８．５に相当する。ＰＱＱ骨格のカルボン酸とイミダゾールの水素原子が抜け、ナトリウムとイオン結合していた。アルカリ条件においてもＰＱＱ構造は壊れていないことが分かった。

〔実施例２ メタノール添加再結晶〕
ＰＱＱジナトリウム０．２ｇを水１００ｍＬに加え、２５％水酸化ナトリウム水溶液４０ｇを混合した。この時のｐＨは１３．５であった。ここにメタノール６００ｍＬ加え、室温で２日置いておいたところ、赤い結晶が析出した。この溶液を濾過し、２−プロパノールで洗い、減圧乾燥した。赤い結晶０．１０ｇ得た。実施例２より、実施例１の結晶の合成はスケールを上げても可能であることが示された。

〔実施例３ エタノール添加再結晶 Ｎａ／ＰＱＱ＝４〕
ＰＱＱジナトリウム０．６９ｇを水１４ｍＬに加え、２５％水酸化ナトリウム水溶液１６．９ｇを混合した。この時のｐＨは１３．５であった。ここにエタノール３０ｍＬ加え、室温で１日置いておいたところ、赤い結晶が析出した。この溶液を濾過し、エタノールで洗い、減圧乾燥した。赤い結晶０．９８ｇを得た。図４に粉末Ｘ線回折結果を示す。図４に示す様に、２θピークとして５．８９°，１１．７２°，１２．４３°，１３．５９°，１８．０９°，２３．９３°，２６．５０°，２９．４０°，及び４３．７７°にピークが確認できた。このように得られた固体は結晶性物質であった。このピークより、実施例３により得られた結晶は実施例１の結晶とほぼ同じ構造をとっていることが分かった。

〔実施例４ 蒸発合成 Ｎａ／ＰＱＱ＝４〕
ＰＱＱジナトリウム０．３７ｇを１００ｍＬに加え、２５％水酸化ナトリウム水溶液０．３２ｇを混合し、室温で１時間攪拌した。この時のｐＨは１１であった。その後、エバポレーターで水を蒸発により除いて、０．４１ｇの茶色の固体を得た。図５に粉末Ｘ線回折結果を示す。図５に示す様に、２θピークとして５．８２°，１１．６７°，１２．３５°，１３．５２°，１６．３１°，１８．０１°，２３．８８°，２６．４４°，２９．３３°，２９．９９°，及び４３．７５°にピークが確認できた。このように得られた固体は結晶性物質であった。色は異なっているが、このピークより、実施例４により得られた結晶は実施例１の結晶とほぼ同じ構造をとっていることが分かった。

〔実施例５：ＰＱＱテトラリチウム塩（Ｌｉ_４ＰＱＱ）〕
ＰＱＱフリー体０．７２ｇを水５０ｍＬに加えた。ここに１ｍｏｌ／ｋｇに調製した水酸化リチウム水溶液を８ｇ加えたところ、懸濁液から均一な液に変わった。この際、溶液のｐＨは１１だった。この溶液を３００ｍＬのナスフラスコに入れ、エバポレーターで水をすべて飛ばした。さらに減圧乾燥器によって乾燥して黒色の固体０．７９ｇを得た。

イオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用してＬｉ／ＰＱＱを算出した結果４であることが分かった。液体クロマトグラフィーのチャートから分解物はなく、アルカリ性でも安定であることが分かった。なお、リチウムイオンはカルボン酸とイミダゾール環のプロトンと交換して塩を形成していた。

ＸＲＤ分析から２θ２１．２８°，３１．８２°，３３．４９°，３４．７９°，３４．８６°にピークを示す結晶性の物質であった。

〔実施例６：ＰＱＱジナトリウムジリチウム塩（Ｌｉ_２Ｎａ_２ＰＱＱ）〕
ＰＱＱジナトリウム０．３８ｇを水５０ｍＬに加えた。ここに１ｍｏｌ／ｋｇに調製した水酸化リチウム水溶液を２ｇ加えたところ、懸濁液から均一な液に変わった。この際、溶液のｐＨは１１だった。この溶液を３００ｍＬのナスフラスコに入れ、エバポレーターで水をすべて飛ばした。さらに減圧乾燥器によって乾燥して黒赤色の固体０．３８ｇを得た。

イオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用してＬｉ／ＰＱＱ、Ｎａ／ＰＱＱを算出した結果、Ｌｉ／ＰＱＱ＝２、Ｎａ／ＰＱＱ＝２であることが分かった。液体クロマトグラフィーのチャートから分解物はなく、アルカリ性でも安定であることが分かった。

ＸＲＤ分析から２θ３０．０２°，３１．８８°，３３．５５°，３６．９１°にピークを示す結晶性の物質であった。

〔実施例７：ＰＱＱテトラカリウム塩（Ｋ_４ＰＱＱ）〕
ＰＱＱフリー体０．７２ｇを水５０ｍＬに加えた。ここに１ｍｏｌ／ｋｇに調製した水酸化カリウム水溶液を８ｇ加えたところ、懸濁液から均一な液に変わった。この際、ｐＨは１１だった。この溶液を３００ｍＬのナスフラスコに入れ、エバポレーターで水をすべて飛ばした。さらに減圧乾燥器によって乾燥して黒色の固体０．８９ｇを得た。

イオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用してＫ／ＰＱＱを算出した結果、４であることが分かった。液体クロマトグラフィーのチャートから分解物はなく、アルカリ性でも安定であることが分かった。

ＸＲＤ分析から２θ２４．４９，２６．１１，２７．３８、２８．０４°にピークを示す結晶性の物質であった。

〔実施例８：ＰＱＱテトラナトリウム塩（Ｎａ_４ＰＱＱ）／ＰＱＱトリナトリウム塩（Ｎａ_３ＰＱＱ）〕
ＰＱＱジナトリウム０．７５ｇを水５０ｍＬに加え、２５ｗｔ％水酸化ナトリウム０．４８ｇを混合した。この溶液を３００ｍＬのナスフラスコに入れ、エバポレーターで水をすべて飛ばした。さらに減圧乾燥器によって乾燥して、固体０．８７ｇを得た。

イオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用してＮａ／ＰＱＱを算出した結果、テトラナトリウム塩とトリナトリウム塩が混在していることが分かった。液体クロマトグラフィーのチャートから分解物はなく、アルカリ性でも安定であることが分かった。

ＸＲＤ分析から２θ２６．４４に小さなピークを示すアモルファスの物質であった。

〔参考例１ 蒸発合成 Ｎａ／ＰＱＱ＝７〕
ＰＱＱジナトリウム０．３７ｇを１０ｍｌに加え、２５％水酸化ナトリウム水溶液０．８０ｇを混合し、室温で０．５時間攪拌した。その後、エバポレーターにより溶媒を除いて、黄緑色の析出固体０．８２ｇを得た。図６に粉末Ｘ線回折結果を示す。図６に示す様に、２θ５．７７，７．００，９．５２，２１．４４，２２．２５，３２．３５，３７．４８及び、その他多くのピークが確認できた。参考例１により得られた固体は結晶性物質であった。このピークより、参考例１により得られた固体が実施例１の結晶と異なる構造を有することが分かった。参考例１により得られた個体はＰＱＱテトラカリウム塩と過剰の水酸化カリウムが存在する状態であると考えられる。

〔参考例２ 過剰カリウムＰＱＱテトラカリウム塩(Ｋ_５ＰＱＱ)〕
ピロロキノリンキノンフリー体０．７２ｇを水５０ｍLに加えた。ここに１ｍｏｌ／ｋｇに調製した水酸化カリウム水溶液を１０ｇ加えたところ、懸濁液から均一な液に変わった。ｐＨは１１.５だった。この溶液を３００ｍｌのナスフラスコに入れ、エバポレーターで水をすべて飛ばした。さらに減圧乾燥器によって乾燥して黒色の固体１．０４ｇを得た。

イオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用してＫ／ＰＱＱを算出した結果、５であることが分かった。液体クロマトグラフィーのチャートから分解物はなく、得られた個体はアルカリ性でも安定であることが分かった。参考例２により得られた個体はＰＱＱテトラカリウム塩と過剰の水酸化カリウムが存在する状態であると考えられる。ＸＲＤ分析から２θ３０．２３°にピークを示すが、ピーク強度が弱く結晶性の低い物質であった。

〔比較例１：ＰＱＱジナトリウム塩（Ｎａ_２ＰＱＱ）及び比較例２：ＰＱＱトリナトリウム塩（Ｎａ_３ＰＱＱ）〕
比較例１のＰＱＱジナトリウム塩（Ｎａ_２ＰＱＱ）及び比較例２ＰＱＱトリナトリウム塩（Ｎａ_３ＰＱＱ）としては、参考例で作製したものを用いた。

〔アスコルビン酸との反応性試験〕
表５に示す各ＰＱＱ塩を１ｇ／Ｌになるように水に溶かした。この溶液１ｍＬに１００ｇ／Ｌアスコルビン酸水溶液０．５ｍＬ加え、２時間後、１日後、２日後の状態を観察した。

実施例と比較例との対比より、ＰＱＱテトラアルカリ塩はアスコルビン酸と混合した際に変色、析出物がなく、安定であることがわかった。なお、長期間ではＮａ_４ＰＱＱの溶解した溶液及びＫ_４ＰＱＱの溶解した溶液は色の変化は生じにくいことが分かった。

〔溶解性試験〕
表６に示す各ＰＱＱ塩５０ｍｇを過飽和になるように水０．５ｍＬ加えた。なお、この濃度で溶けてしまう場合は水を減らした。その後、溶液に対し室温２３℃で超音波をかけた。この溶液を遠心分離器にかけ、上澄みをリン酸バッファー（ｐＨ７．４ ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度が０〜１の範囲となるように希釈して、ＵＶ測定した。この吸収より溶解度を算出した。なお、ＵＶ測定には、ＨＩＴＡＣＨＩ製Ｕ−２０００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用した。その結果を表６に示す。

実施例と比較例との対比より、ＰＱＱが４個のカチオンを有すると溶解度は非常に大きくなり、ＰＱＱテトラアルカリ塩が溶解しやすいことがわかった。さらに、ＰＱＱテトラリチウム塩はＰＱＱテトラナトリウム塩より溶解しやすいことがわかった。

〔溶解速度試験〕
表７に示す各ＰＱＱ塩１ｍｇをアクリル製吸光度測定セルに加え、水２ｍＬを加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、ＵＶ測定には、ＨＩＴＡＣＨＩ製Ｕ−２０００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用した。全てのサンプルが溶けて均一になった吸光度を１００として以下に時間変化を示す。

実施例と比較例との対比より、ＰＱＱテトラナトリウム塩はＰＱＱジナトリウム塩と比べ溶解速度が速いことが分かった。また、ＰＱＱジナトリウム塩とＰＱＱテトラナトリウム塩を混合することで溶解速度を変えることができることも分かった。さらに詳細にみると混合物は１分後からの３０分後の溶解量の変化が１種類の塩を用いた場合より大きく、混合塩とすることにより時間的な溶解量の変化を制御できることが分かった。

〔比較例３ ｐＨ３．１でのエタノール再結晶〕
ＰＱＱジナトリウム２ｇを水９００ｍＬに溶かした、塩酸を使用してｐＨを３．１にした。ここにエタノールを９００ｍＬ加え、冷蔵庫で１晩置いた。赤い固体が析出していた。この固体をイオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用して分析した結果、Ｎａ／ＰＱＱは２でＰＱＱジナトリウム塩であった。回収率９８％であった。このｐＨではＰＱＱテトラナトリウム塩は得られなかった。

〔比較例４ ｐＨ７．５でのエタノール再結晶〕
ＰＱＱジナトリウム４ｇを水９００ｍＬに溶かした水酸化ナトリウムとリン酸を使用してｐＨを７．５にした。ここにエタノールを９００ｍＬ加え、冷蔵庫で１晩置いた。赤い固体が析出していた。この固体をイオンクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーを使用して分析した結果、Ｎａ／ＰＱＱは３でＰＱＱジナトリウム塩であった。回収率９５％であった。このｐＨではＰＱＱテトラナトリウム塩は得られなかった。

本出願は、２０１２年８月１７日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願（特願２０１２−１８１１０３）、及び２０１２年１１月２２日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願（特願２０１２−２５６４８５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

本発明のＰＱＱのテトラナトリウムアルカリ塩は、食品や医薬品、化粧品、飼料等の分野において産業上の利用可能性を有する。

Claims (9)

1. 下記式（３）で表される、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩を含む、結晶。
   （式（３）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種であり、Ｍの少なくとも１つがＮａである。）
2. 粉末Ｘ線回折においてＣｕ−Ｋαを用いた際に、２θのピークが、５．８９±０．４°，１１．７２±０．４°，１２．４３±０．４°，１３．５９±０．４°，１８．０９±０．４°，２３．９３±０．４°，２６．５０±０．４°，２９．４０±０．４°に現れる、請求項１に記載の結晶。
3. 単結晶Ｘ線構造分析により測定される以下のディメンジョン：
   単位格子寸法
   ａ＝２１．６０７２（５）Å
   ｂ＝６．８０４０１（１７）Å
   ｃ＝３０．１０７０（７）Å
   Ｖ＝４４２６．２０（１８）Å^３
   を有する、請求項１又は２に記載の結晶。
4. 下記式（１）で表される、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩
   （式（１）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種である。）
   及び／又は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶と、
   アスコルビン酸と、
   を含む、組成物。
5. ピロロキノリンキノン及び／又はピロロキノリンキノンアルカリ塩と、水酸化ナトリウムと、を強アルカリ性条件下で混合させる混合工程を有する、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
6. 前記混合工程における強アルカリ性条件が、ｐＨ１０〜１４である、請求項５に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
7. 前記混合工程後、得られるピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の貧溶媒を添加する析出工程をさらに有する、請求項５又は６に記載のピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩の製造方法。
8. 下記式（３）で表される、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩
   （式（３）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種であり、Ｍの少なくとも１つがＮａである。）
   、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶、及び／又は、請求項４に記載の組成物を含む、食品。
9. 下記式（３）で表される、ピロロキノリンキノンテトラアルカリ塩
   （式（３）中、Ｍは、各々独立に、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ、Ｒｂ、及びＣｓからなる群より選ばれる１種であり、Ｍの少なくとも１つがＮａである。）
   、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結晶、及び／又は、請求項４に記載の組成物を含む、化粧品。