JP6020164B2

JP6020164B2 - 核酸の検出方法

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Publication number: JP6020164B2
Application number: JP2012510059A
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Inventors: 外川　直之; 直之外川
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Publication date: 2016-11-02
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Description

本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸の検出方法等に関する。詳しくは、スポットゲルの分子ふるい効果を活用したゲル保持型ＤＮＡマイクロアレイを利用したオンチップでのＰＣＲ反応による核酸の特異的検出方法等に関する。

ＤＮＡマイクロアレイは、固定化されたＤＮＡをプローブとして、検体核酸とハイブリダイゼーション反応を行うツールである。
近年、そのようなＤＮＡマイクロアレイを用いて、検体核酸中の特定の塩基配列の検出を行い、疾患関連遺伝子の探索や臨床診断などの分野における実用化が進みつつある。
ＤＮＡマイクロアレイとしては、例えば、２次元表面上にフォトリソグラフィーを用いてプローブを逐次的に合成されたＤＮＡマイクロアレイ（特許文献１参照）、予め合成されたプローブが２次元表面上にスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイ（特許文献２参照）、樹脂板等の基板に複数の溝又は貫通孔が形成され、それらの溝又は孔の内部にＤＮＡを含むゲルが保持されたＤＮＡマイクロアレイ（特許文献３参照）、平面基盤上にＤＮＡ等を含むゲルのスポットが配置されたＤＮＡマイクロアレイ（特許文献４参照）等が知られている。本発明者らの一部も中空繊維の中空部にゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交叉する方向で切断することにより得られるＤＮＡマイクロアレイを開発している（特許文献５参照）。

従来のＤＮＡマイクロアレイの使用方法では、検体中に存在する標的核酸は通常微量であるため、予めＴ７増幅法やＰＣＲ法等により標的核酸を増幅する必要があった。また、ハイブリダイゼーション反応には一晩かかる場合もある。よって、反応から検出までをより簡略化する必要があると考えられていた。

標的核酸を検出するまでの時間を短縮するために、ＤＮＡマイクロアレイ上でＰＣＲ反応を行う多くの技術が開示されている。例えば、非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させたＤＮＡマイクロアレイにて固相ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によるＤＮＡ増幅を行う技術が開示されている。

また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）を用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ様環境下における熱安定性が評価されている。

さらに具体的なアプリケーションの例としては、非特許文献３〜４に示すような迅速な微生物同定手法、一塩基多型の検出手法の開発が試みられている。

しかしながら、これらの手法には未だいくつかの課題が残されている。特に、基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイ上でのＰＣＲ反応の代表的な課題としては、下記１）〜３）の点などが挙げられる。
１）熱サイクル処理時（ＰＣＲ反応時）に、固定化されたプライマーが外れてしまう。
２）基板表面上でＰＣＲ反応を行うと核酸の伸長反応効率が低い。
３）ＰＣＲ反応時に非特異的な検出が起こることがある。
これらの課題に対しては、いくつかの解決策が考えられているが、基板上へ特殊な化学修飾を必要とし通常のヌクレオチドを使用できない（置換ヌクレオチドを用いる）など、実用性が低いものであった（特許文献６〜９参照）。

また、これとは別に、基板表面上に核酸を固定化せず、ゲルパッドを利用したＤＮＡマイクロアレイ技術も開示されている。ＤＮＡマイクロアレイ上のゲルパッド内で増幅反応および個別塩基の伸長による検出反応が可能であることが知られている（非特許文献５参照）。
ゲルを使用したＤＮＡマイクロアレイ（特許文献３〜５参照）は、２次元表面にプローブが固定されたＤＮＡマイクロアレイに比べて、一区画に固定化できるプローブ量が増加する。よって、ハイブリダイゼーション効率（ハイブリダイゼーションに供した核酸に対してプローブと結合した核酸の割合）が優れたＤＮＡマイクロアレイといえる。

上記ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイは、検査の対象となる試料（以下、検体）がゲルの多孔質構造中で十分に拡散し、ゲル中のプローブと反応することにより、高いハイブリダイゼーション効率を達成することができる。しかしながら、これまでに知られているゲルＤＮＡマイクロアレイでは、ゲルの多孔質構造中を検体が十分に拡散できず、ゲル表面しか検査に使用されていない場合もあった。

ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくし、検体の拡散を向上させる等の目的で、ゲルを構成するモノマーの種類やモノマー濃度の検討が行われている（特許文献１０及び非特許文献６〜９参照）。例えば、非特許文献６には、８質量％のアクリルアミドゲルを使用する方法が記載され、非特許文献７及び８には、５質量％のメタクリルアミドゲルを使用することにより最大５００塩基長のＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることができたことが記載されている。また、特許文献１０には、ＤＮＡマイクロアレイに使用する好適なゲルとして、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを２〜７質量％含むゲルを使用することにより、高いハイブリダイゼーション効率が得られることが記載されている。さらに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのような感温性ゲルを利用する方法も知られている（非特許文献９参照）。

米国特許第5405783号明細書米国特許第5601980号明細書特開2000-60554号公報米国特許第6682893号明細書特開2000-270877号公報特開2006-230335号公報特開2007-330104号公報特開2007-222010号公報特開2009-219358号公報特許第3654894号公報

Adessi, Celine et al, "Solid phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms", Nucleic Acids Res., 2000, Vol. 20, No. 20, e87 Fixe, F. et al., "Functionalization of poly(methyl methacrylate)(PMMA) as a substrate for DNA microarrays", Nucleic Acids Res., Jan. 2004 Georg, M. et al., "Microarray-Based Identification of Bacteria in Clinical Samples by Solid-Phase PCR Amplification of 23S Ribosomal DNA Sequences", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2004, p. 1048-1057 Martin H. et al., "Detection of Single Base Alterations in Genomic DNA by Solid Phase Polymerase Chain Reaction on Oligonucleotide Microarrays", Analytical Biochemistry, 299, 24-30, 2001 Svetlana D. et al., "Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers", Nucleic Acides Res., 1999, Vol. 27, No. 18, e19 Gennady Yershov et al., "DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918, May 1996 A. Yu. Rubina et al., "Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production", Analytical Biochemistry, Vol. 325, pp. 92-106, 2004 Dmitry A. Khodakov et al., "An oligonucleotide microarray for multiplex realtime PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV", BioTechniques, Vol. 44, No. 2, pp. 241-248, 2008 迫原修治ら，化学工学会第69年会 I316：「DNAチップ構築のための感温性多孔質ゲルの応用」

ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくし検体の拡散を向上させたゲル利用ＤＮＡマイクロアレイは、基板上にプローブが固定化されたＤＮＡマイクロアレイと比較して感度が高く、熱的にも安定性が高い（プローブが熱により固定化している部位から解離してしまわない）ものであった。特に、遺伝子発現解析用ＤＮＡマイクロアレイとして有用であった。
しかしながら、遺伝子発現解析では、あらかじめ増幅、精製しておいたＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイ上のプローブにハイブリダイゼーションさせればよいが、ＤＮＡマイクロアレイ上でのＰＣＲ反応を実施する場合には、実際にアレイを浸漬した液相、アレイ表面、アレイ内部などにおいて予期せぬ反応が起こることもあり、特異性の面で、基板上にプローブが固定化されたＤＮＡマイクロアレイと同様の問題を生じていた。特に、アレイ上でＰＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応を同時に行うためには、これまで以上に特異性の高いＤＮＡマイクロアレイを用いる必要があった。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ゲルの分子ふるい効果とプローブの特異性の両方を利用したＤＮＡマイクロアレイを用いることで、より一層特異性の高い核酸検出を行うことができることを見出した。
すなわち、ゲル利用型ＤＮＡマイクロアレイ上で、ＰＣＲ等の核酸増幅方法による核酸増幅反応とハイブリダイゼーション反応とを同時に行うことにより、目的の核酸検出の特異性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）下記の工程を含む、核酸の検出方法。
（ａ）プローブが固定化されたゲルと、核酸増幅の鋳型となる核酸並びに核酸増幅用プライマーセット、ヌクレオチド単体及びＤＮＡ伸長酵素を含む反応溶液とを接触させる工程、
（ｂ）上記ゲル及び反応溶液に、核酸増幅反応を行うための熱サイクル処理を加える工程、
（ｃ）増幅された核酸断片のうち、特定の塩基長の核酸断片を選別する工程、及び
（ｄ）選別された核酸断片を検出する工程。

当該検出方法において、プローブが固定化されたゲルは、例えば、ゲル濃度が異なる複数種のゲルを使用することができる。また、当該ゲルは、例えば、基板中のウェル又は貫通孔に保持されたものであってもよく、置換（メタ）アクリルアミド誘導体及び／又はアガロース誘導体を含むものであってもよい。さらに、当該ゲルは、検出対象とする核酸の大きさ（塩基長）にあわせて適切に設定したゲル濃度ものであることが好ましく、例えば、ゲル濃度が２質量％超、５質量％未満であるものが挙げられる。
また当該検出方法においては、例えば、プローブが固定化されたゲルと反応溶液との接触表面積（S(μm²)）に対する当該ゲルの体積（V(μm³)）の比率（すなわち、Vの値をSの値で除した値（V/S））を、５０以上とすることができる。

（２）ゲル濃度が異なる複数種のゲルが担持され、且つ、当該ゲルはプローブが固定化されたものである、マイクロアレイ。
（３）下記の工程を含む、請求項７記載のマイクロアレイの製造方法。
（ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を作製する工程、
（ｂ）プローブを含む、モノマー濃度が異なる複数種のゲル前駆体溶液を、中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程、
（ｃ）前記中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応（共重合反応）させ、プローブを含むゲル状物（プローブ固定化ゲル）を中空繊維の中空部に保持する工程、及び
（ｄ）中空繊維束を繊維の長手方向に対して交叉する方向で切断して薄片化する工程。

本発明によれば、ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイ上での核酸増幅反応（ＰＣＲ等）において、検出目的以外の核酸の非特異検出を効率的に排除し、目的の核酸の検出特異性をより一層向上させることができる（特に擬陽性を低減することができる）核酸の検出方法、及び当該検出方法に用いるマイクロアレイを提供することができる。当該検出方法においては、ゲル濃度（ゲルの多孔質構造）を増幅させる目的の核酸（検出対象の核酸）の大きさ（塩基長）に合わせて適切に設定することにより、ゲルの分子ふるい効果を向上させることができ、より特異性の高い検出方法を提供できる。本発明の検出方法等は、大量の検体を処理する用途に適したものであり、実用性、有用性に優れたものである。

飽和環状ポリオレフィン製薄型９６ウェルプレートに搭載された貫通孔型ＤＮＡマイクロアレイを示す図である。飽和環状ポリオレフィン製薄型９６ウェルプレートを市販のサーマルサイクラー（ライフテック社製、GeneAmp 9700）にセットしたときの状態を示す図である。反応ウェル内（反応液内）での検出対象ＤＮＡの増幅反応（増幅反応初期）の模式図である。貫通孔型アレイスポットゲル内への増幅産物の選択的拡散を示す模式図である。スポットゲル内でのＰＣＲ反応の模式図である。中空繊維束（中空繊維配列体）の製造用の配列固定治具を示す概略図である。ＤＮＡマイクロアレイの各スポットのゲル濃度とプローブ搭載位置を示した概略図である。サイズが異なる増幅産物の電気泳動図とそれら増幅産物がプローブとハイブリダイズしうる位置を示した模式図である。１２３ｂｐの増幅産物について分子ふるいの効果を調べた結果を示す図である。４１３ｂｐの増幅産物について分子ふるいの効果を調べた結果を示す図である。８２７ｂｐの増幅産物と１１９１ｂｐの増幅産物との混合物について分子ふるいの効果を調べた結果を示す図である。比較例１で用いた平板状アレイ上のスポットへの増幅産物の非選択的拡散を示す模式図である。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１１−０２７５８８号明細書（2011年2月10日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

本発明は、スポットゲルの特性（分子ふるい効果）とプローブの特異性との相乗効果を活用したＤＮＡマイクロアレイ、及び当該ＤＮＡマイクロアレイ上で核酸増幅反応（ＰＣＲ等）とハイブリダイゼーション反応とを同時に行うことによる核酸の特異的検出方法に関するものである。スポットゲルは、１種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体やアガロース誘導体、架橋剤及び所定のプローブを含むゲル前駆体を共重合して得られるゲルである。

なお、明細書中、「ＤＮＡマイクロアレイ」という場合、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のみを固定化したマイクロアレイを指すのではなく、「プローブ」を固定化したマイクロアレイを意味する。また、「マイクロアレイ上での反応」という場合、「マイクロアレイと反応溶液を含む反応系全体での反応」を意味し、ゲルを利用したアレイでのゲル表面やゲル内部のみでの反応は、特に意味しないものとする。
以下に、本発明に用いるＤＮＡマイクロアレイの製造方法の一実施形態を説明する。

１．ゲルを利用したＤＮＡマイクロアレイの製造方法
＜ゲルに固定化するプローブ＞

本発明において、「プローブ」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類を示し、場合によりタンパク質、脂質等を含む。これらのプローブは、合成市販品又は生細胞等から得ることができる。例えば、生細胞からのＤＮＡの抽出は、Blinらの方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出は、Favaloroらの方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)）等により実施することができる。特に本発明においては、ＤＮＡマイクロアレイのゲル表面及びゲル内部で核酸の伸長反応が起こるため、「プローブ」はプライマーとしての機能も同時に有するものである。

また、プローブとして用いる核酸は、鎖状及び環状のいずれの形状のものであってもよく、限定はされないが、例えば、プラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ（ウイルスの場合等）等が挙げられる。また、制限酵素若しくは化学的に修飾したまたは切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。

後述するように、プローブは、置換（メタ）アクリルアミド誘導体やアガロース誘導体、及び架橋剤との共重合反応により、ゲルの網目構造に固定される。よって、プローブには、共重合反応可能な不飽和官能基が導入されていることが好ましい（以下、修飾プローブという）。不飽和官能基としては、例えば、（メタ）アクリルアミド基、グリシジル基等が挙げられる。不飽和官能基は、プローブ・プライマーの機能を損なわない限り、いずれの部位に導入されていても良い。たとえば、プローブが核酸の場合、不飽和官能基は核酸の末端及び鎖中のいずれに導入されていても良いが、核酸の鎖の末端に導入されていることが好ましい。修飾プローブは、公知の方法により製造でき、例えば、国際公開第02/062817号に記載のごとく製造することができる。

＜ＤＮＡマイクロアレイに保持されるゲル＞
ＤＮＡマイクロアレイを使用する際には反応系全体に核酸増幅反応（ＰＣＲ等）を行うための熱サイクル処理を加える。そのためゲルは、熱によって、化学的、物理的変化を起こして液相反応液へプローブを溶出しない、融解しない、検出時に検出できないほど形状が変化しないものであれば問題ない。具体的には、ＰＣＲ反応を実施する際に、反応系全体が９４℃前後の温度に達するが、このときゲル自体の融解やゲルに固定されたプローブの溶出がおこらなければ問題ない。
ゲルの作製に用いる単量体（モノマー）は、例えば「置換（メタ）アクリルアミド誘導体」を用いることができる。当該誘導体は、下記一般式（Ｉ）で示される化合物をいう。

［一般式（Ｉ）中、Ｒ_１及びＲ_２は、互いに独立して、水素原子又は飽和アルキル基を示す。］
一般式（Ｉ）で示される置換（メタ）アクリルアミド誘導体としては、限定はされないが、例えば、メタクリルアミド（ｍｅｔａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−メチルアクリルアミド（Ｎ−ｍｅｔｈｌｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−エチルアクリルアミド（Ｎ−Ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−Ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）等が挙げられる。

ゲルの組成は、特に限定はされないが、例えば、上記の置換（メタ）アクリルアミド誘導体に加えて、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体も用いることができ、さらには、置換（メタ）アクリルアミド誘導体の１種類または２種類以上とメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を共重合したゲルも用いることができる。その他、例えば、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール及びポリエチレングリコール、並びにこれらの誘導体等を含んだゲル、またはこれらを架橋剤により架橋したゲルを用いることができる。

架橋剤とは、エチレン性不飽和結合を２個以上有する多官能性単量体である。例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアリル（１，２−ヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−シスタミン−ビスアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ポリエチレングリコールジメタクリレート等である。好ましくはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが用いられる。

次に、共重合反応について説明する。
共重合反応の際に使用する修飾プローブは、ゲルの作製に用いる単量体の合計モル数に対して1/10以下のモル数で使用することが好ましいが、前述の熱サイクル処理時の耐性の条件をクリアできる範囲であれば特に制限はされない。

共重合反応に使用する架橋剤の量は、ゲルの作製に用いる単量体（置換（メタ）アクリルアミド誘導体等）の合計に対し、モル比（単量体：架橋剤）で８:２〜５００：１の範囲であることが好ましい。当該モル比が８：２より大きくなるとゲルネットワークが不均一化し、白濁が生じやすく、モル比が５００：１以下になるとゲルとしての構造が保てなくなってしまうおそれがある。

重合開始剤は、重合反応の際にプローブの分解が顕著に生じないものであればよく、限定はされないが、好ましい重合開始剤は、２，２’−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕ジハイドロクロライド、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、ＫＰＳ（過硫酸カリウム）等である。また重合開始剤としてＡＰＳまたはＫＰＳを用いた場合、重合促進剤としてＴＥＭＥＤ（テトラメチレンジアミン）を使用することも可能である。

重合反応の際の反応温度は、限定はされないが、アゾ系の重合開始剤を用いた場合には４０℃以上が好ましい。またＡＰＳ、ＫＰＳを単独で用いた場合には５０℃以上が好ましい。ＡＰＳ、ＫＰＳにＴＥＭＥＤを使用した場合には室温〜３０℃の範囲が好ましい。

＜ゲル濃度の設定＞
上記共重合反応により形成されるゲル中のポリマー濃度（ゲル濃度）は、ゲルの組成や、検出しようとする核酸のサイズ（塩基長）に対応して適宜調整及び設定することができる。本発明においては、同一アレイ上に複数のゲルの区画（スポット）を設けることもでき、その場合は、同一アレイ上にゲル濃度が異なる複数種のスポットゲルを搭載することができる。
具体的なゲル濃度は、特に限定はされないが、２質量％超かつ５質量％未満であることが好ましく、より好ましくは２．５〜４．５質量％、さらに好ましくは２．５〜４質量％、特に好ましくは２．８〜３．８質量％である。ゲル濃度が当該範囲内である場合は、５０塩基以上かつ３０００塩基未満の塩基長の核酸を特異的に検出する場合に好ましく、より好ましくは５０〜２０００塩基、さらに好ましくは１００〜２０００塩基、さらにより好ましくは１００〜１５００塩基、特に好ましくは１００〜１２００塩基、最も好ましくは１００〜１０００塩基である。また、上記ゲル濃度の範囲は、ゲルを構成する単量体に、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを含む場合に、特に好適である。

＜プローブ固定化ゲルを搭載した基材の作製＞
本発明の核酸検出方法に用いる、プローブ固定化ゲルは、鋳型核酸等を含む反応溶液と接触させて核酸増幅反応（ＰＣＲ等）を行うことができれば、どのような形態でもよく、限定はされないが、基本的には、何らかの基材に搭載されている形態であることが好ましい。
例えば、ゲルを管状体の中空部に充填することによりゲル保持管状体を作製することもできる。その管状体は、例えば特開平3-47097号公報に記載のごとく、遺伝子変異の検出等のツールとして使用できる。管状体の中空部へのゲルの保持は、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する要領で実施可能である。

また、ゲル濃度が異なる複数種のゲル（プローブ固定化ゲル）が担持されたマイクロアレイを作製することもできる。例えば、平面基板上に、重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液（モノマー濃度が異なる複数種のゲル前駆体溶液）を、予め定めた区画にスポッティングすることにより、ＤＮＡマイクロアレイを製造することができる（特表平6-507486号公報、米国特許第5,770,721号明細書参照）。上記基板において、各区画が溝（ウェルを含む）又は貫通孔により形成されている場合は、それら溝又は貫通孔に、重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施することにより、上記基板中の溝又は貫通孔にプローブ固定化ゲルが保持された（搭載された）ＤＮＡマイクロアレイを作製することができる（特開2000-60554号公報参照）。

さらには、プローブ固定化ゲルを保持した管状体を複数本、集束し、該集束物を管状体の長手方向に対して交叉する方向で切断して薄片化することを繰り返すことにより、ＤＮＡマイクロアレイを作製することができる（国際公開第00/53736号参照）。他方、先に複数の管状体を集束させた後、その集束物の各中空部にゲルを保持してから、上記切断及び薄片化をしても良い。その場合、下記（１）〜（４）の工程を順次行うことによりＤＮＡマイクロアレイが製造できる。

（１）複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程。
（２）集束物の各管状体の中空部に、ゲル作製に用いる単量体、架橋剤及びプローブを含む溶液を充填する工程。
（３）中空部内で共重合反応する工程。
（４）集束物の長手方向と交叉する方向で切断する工程。

管状体としては、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。特に、加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。ここで、管状体として中空繊維を用いる場合のマイクロアレイの製造方法としては、具体的には、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う方法が例示できる。
（ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を作製する工程、
（ｂ）プローブを含む、モノマー濃度が異なる複数種のゲル前駆体溶液を、中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程、
（ｃ）前記中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応（共重合反応）させ、プローブを含むゲル状物（プローブ固定化ゲル）を中空繊維の中空部に保持する工程、及び
（ｄ）中空繊維束を繊維の長手方向に対して交叉する方向で切断して薄片化する工程。
以上のようにして、多数の中空繊維を配列させた中空部に、プローブ（プローブ核酸等）が固定化されたゲルを保持したＤＮＡマイクロアレイを作製することができる。

＜ＤＮＡマイクロアレイの使用方法＞
引き続き、前述したＤＮＡマイクロアレイの使用方法について以下に説明する。
ＤＮＡマイクロアレイの作製後は、以下の（ａ）〜（ｄ）の手順に従って核酸の検出を行うことができる。
（ａ）前述したプローブ固定化ゲルと、検体（核酸増幅の鋳型となる核酸）並びに核酸増幅用プライマーセット、ヌクレオチド単体及びＤＮＡ伸長酵素を含む反応溶液とを接触させる工程。当該工程において、プローブ固定化ゲルは、ＤＮＡマイクロアレイ等の基材に保持された状態であってもよいし、当該基材等に保持されていない状態であってもよい。
（ｂ）上記ゲル及び反応溶液に、核酸増幅反応（ＰＣＲ等）を行うための所定の熱サイクル処理を加える工程。当該工程において、上記ゲルがＤＮＡマイクロアレイ等の基材に保持された状態におけるゲルである場合は、熱サイクル処理を加える対象は、通常、反応溶液と接触させたＤＮＡマイクロアレイ等の全体（ひいては反応系全体）となる。
（ｃ）増幅された核酸断片のうち、特定の塩基長の核酸断片を選別する工程。当該工程でいう特定の塩基長の核酸断片の選別は、ゲル濃度に依存したプローブ固定化ゲルの分子ふるい効果による核酸断片の選別を意味する。よって、当該選別は、核酸増幅反応後に、プローブ固定化ゲルの特性によりなされる工程である。
（ｄ）選別された核酸断片を検出する工程。
以下、上記核酸検出の方法について詳細に説明する。

＜核酸増幅の鋳型となる核酸（検体）＞
反応溶液に含まれる核酸増幅の鋳型となる核酸は、具体的には検体として使用するものである。
まず、核酸が含有した液体を用意する。この溶液は熱サイクル処理時に反応が阻害されなければ、精製されていてもいなくとも構わない。精製する場合は生物試料等を採取し核酸を抽出する。生体成分から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用し得る。ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。必要があれば更にＤＮＡもしくはＲＮＡに分離精製する。より具体的には、例えばある特定の生物のゲノムＤＮＡ、または転写産物（ｍＲＮＡ）もしくはこれを逆転写したｃＤＮＡ、１種類以上の生物のゲノムＤＮＡ混合物、転写産物（ｍＲＮＡ）の混合物等を含む。さらにこれらに対し酵素処理を行ったものや化学物質の作用を行ったものも含む。

これらの核酸を鋳型にして、核酸増幅反応により、ある領域の核酸断片を増幅させる、または、ある特定の生物にしか含まれない核酸断片を増幅させる、もしくは特定の遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ）を定量する等を行うことができる。核酸の増幅方法としてはＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＰＡＬＳＡＲ法など様々な方法があり、なかでもＰＣＲ法が好ましいが、核酸の検出上特に問題が生じなければいずれの方法も核酸増幅反応に用いることができる。

＜核酸増幅用プライマーセット＞
通常、検出しようとする核酸配列（核酸断片）はあらかじめ決定しておく。すなわち、この時点で検出しようとする核酸の鎖長と領域を決定しておき、その鎖長の核酸が通過できるゲルの組成・濃度もあらかじめ決めておく。核酸増幅用のプライマーセットは液相の反応液に混合しておくこともＤＮＡマイクロアレイのスポットにプローブとともに固定しておくこともできる。プローブ（プライマーとしても機能する）となるオリゴヌクレオチドの塩基配列が、増幅させる配列（プライマーセットで挟まれる領域）の内部に含まれるようにプライマーセッットを決定する。プライマーは通常、２０〜５０ヌクレオチド程度の長さで設定し、増幅させる遺伝子領域１つに対して通常フォワードプライマーとリバースプライマーの２種（１組）、もしくはそれ以上（１組以上）のプライマーを必要とする。

本発明を実施するためには、この１組以上のプライマーを混在させておき、その増幅産物とハイブリダイゼーションする特異的な塩基配列を有する１種類以上のプローブが、固定化されていることが必要である。
ここで、１組のプライマーに対して複数の遺伝子領域を増幅させることができるような配列を選択するとより反応系が簡単になる。具体的には、例えば、複数の生物の１６ＳｒＲＮＡの配列を比較し、共通した領域にプライマー（１組）を設計し、生物種ごとにそのプライマーで挟まれる内部に個々の生物種を検出するためのプローブを設計する場合等が挙げられる。
さらに、後の検出が容易になるように、使用するプライマーセットはあらかじめその末端を蛍光物質（ｃｙ３、ｃｙ５等）やビオチンなどであらかじめ標識しておくとよい。標識方法は特に限定されず、増幅反応において著しく反応が阻害されるなどの現象がみられなければ、どのような方法でもよい。

＜ヌクレオチド単体＞
ヌクレオチド単体は、通常の増幅反応で用いるデオキシヌクレオチド三リン酸等が挙げられる。これもプライマーセットと同様、後の検出が容易になるような誘導体を用いることも可能であるが、増幅反応を阻害しないものを使用することが好ましい。

＜ＤＮＡ伸長酵素、その他＞
ＤＮＡ伸長酵素は、通常のＰＣＲ法に用いられるものと同様に、耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。
使用可能な具体的な酵素やキットとしては、Hot StarTaq DNA Polymerase（QIAGEN社製）、PrimeStarMax DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社）、SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社）、KOD-Plus-Neo（東洋紡社）、KAPA2G FastHotStartPCRキット（日本ジェネティックス（株）社）等が挙げられる。

＜熱サイクル処理＞
検体（検体核酸）を含む反応溶液を、ＤＮＡマイクロアレイ等に保持されたプローブ固定化ゲルに接触させた後、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うための所定の熱サイクル処理を、当該ＤＮＡマイクロアレイ等を含む反応系全体に加える。ここで、プローブ固定化ゲルに反応溶液を接触させることとは、反応溶液にプローブ固定化ゲル（すなわち当該ゲルが保持されたＤＮＡマイクロアレイ等）を浸漬することでもよいし、プローブ固定化ゲル（あるいは当該ゲルが保持されたＤＮＡマイクロアレイ等）に反応溶液を供給することでもよく、限定はされない。
ここで、本発明においては、個々の区画のプローブ固定化ゲルにおける、当該ゲルと反応溶液との接触表面積（反応溶液に接触する当該ゲルの表面積）（S(μm²)）は、当該ゲルの体積（V(μm³））に対して大きすぎないことが好ましく、大きすぎる場合はゲルの分子ふるい効果（ゲル自身が核酸分子のサイズを選別する効果）が十分に発揮されないおそれがある。例えば、前掲の非特許文献６（Gennady Yershov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918, May 1996）や非特許文献７（A. Yu. Rubina et al., Analytical Biochemistry, Vol. 325, pp. 92-106, 2004）に記載の技術においては、ゲルの形状をより扁平にして拡散効率を高くする（反応溶液に対する接触面積を極力増加させ、ゲルの網目構造を大きくする）ことがなされているが、これによりハイブリダイゼーションに要する時間は短縮できるものの、ハイブリダイズする核酸分子がゲル中で短時間で飽和に達してしまうため、ゲルの分子ふるい効果は殆ど発揮されない。これに対し、本発明は、ゲルと反応溶液との接触表面積（S(μm²)）に対する当該ゲルの体積（V(μm³））の比率（すなわち、Vの値をSの値で除した値（V/S））が、限定はされないが、例えば５０以上であり、好ましくは７５以上、より好ましくは１００以上、さらに好ましくは１２５以上である。V/Sの値が当該範囲内となるように、プローブ固定化ゲルの形状を設計する、特に基板への保持形態（搭載形態）を設計することにより、ゲルの分子ふるい効果を十分に発揮させることができ、ひいては目的の塩基長の核酸の検出特異性をより高めることができる。
なお、ＤＮＡマイクロアレイ等と反応溶液の両方を入れる容器としては、一度に多数のサンプルを処理できること、ＤＮＡマイクロアレイ等が入る程度の大きさのウェルをもつこと等を考えると、例えば９６ウェルプレート形状のものでその寸法はＳＢＳ基準に準拠したものが好ましい。９６ウェルプレートの各ウェルは、角型、丸型のどちらでもよい。

また、ウェルプレートの底面は熱伝導性を維持するため、ヒートシンクと接する下面の高低差が限りなく０に近く、厚みは薄いものが好ましい。また、耐熱性としては１０３℃以上で変形が起こらなければ特に問題は無い。このような条件を満たすウェルプレートの底部の厚みは、限定はされないが、０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍのものが好ましく、より好ましくは０．１ｍｍ〜０．４ｍｍ、更に好ましくは０．１５ｍｍ〜０．３５ｍｍである。当該厚みが上限値を超えると熱伝導性が悪くなる恐れがあり、下限値未満では底部にウェルプレートにゆがみを生じる恐れがある。

ウェルプレートは、反応後に光学的な手法による検出を行うことを考慮すると、底面は透明性が高いほうが好ましい。他方、上面は封止のために蓋又はシールを用いることが好ましい。蓋又はシールの材質は反応系に悪影響を及ぼさないものであれば良い。また、適用する反応に際して与えられる温度で変形や不純物溶出等を生じない程度の耐熱性および耐薬品性等を有するものであればよい。上面から光学的測定器で測定する場合は、例えば、リアルタイムＰＣＲ用に販売されている粘着シール等を用いることができる。

ウェルプレートの材質としては熱可塑性樹脂が好ましく、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより検出時のバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；等を用いることができる。これらの中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、ウェルプレートの材質として好ましく用いられる。市販の９６ウェルプレートとしては、例えば、Aurora Biotechnologies社の96-IQプレート等を用いることができる。

本検出方法で行う熱サイクル処理の温度制御の方法について説明する。当該温度制御は、例えば、任意の温度に調節された熱板（ヒートブロック）にウェルプレートの底面を接触させることにより、反応溶液の温度を制御することが可能である。別の態様としては、複数の熱板（ヒートブロック）を各々所定の温度状態に予め制御しておき、その上をウェルプレートが順次移動していくという方法により、格段に速く反応溶液の温度調整を行うことも可能となる。また、熱板（ヒートブロック）はウェルプレートの下方のみでなく上方からも接触させることで、より短時間で反応溶液の温度調節・温度制御をすることができる。

本検出方法の熱サイクル処理に用いる温度制御装置は、市販のサーマルサイクラーを用いることもできるが、ウェルプレートをそのままセットできるものが好ましい。例えば、GeneAmp 9600やGeneAmp 9700（ライフテック社）、T Professionalシリーズ（バイオメトラ社）などを用いることができるが、熱伝導性、蓋の形状について問題が生じなければどのような型式のものであってもよい。また、ＤＮＡマイクロアレイや反応液を入れるウェルプレートがサーマルサイクラーに入らない深さ（厚み）である場合には、上面部分を削り、深さを浅くして厚みを薄くしたウェルプレートを用いることもできる。

＜増幅産物の検出方法＞
増幅産物（増幅され且つゲルの分子ふるい効果により選別された核酸断片）の検出方法としては、例えば、蛍光物質や発光物質を標識基質として使用し、発色測定や蛍光強度測定による方法、あるいは目視による方法を用いることができる。具体的には、フルオロイメージングアナライザーやＣＣＤカメラ等を用いて増幅産物の有無及び定量を行うことができる。また、望ましくは、近年多用されつつあるＰＣＲ反応随時定量装置（Real Time PCR装置）等を用いて、スポットごとに蛍光量を経時的にモニタリングすることで、より信頼性の高い核酸の定量ができる。さらに、酵素反応を利用する又は利用しない発色試薬等を用いてゲル上で発色を行うこともできる。このような場合は、目視でＤＮＡマイクロアレイ上の検出スポットの位置を判定することや、光学スキャナーでスキャンすることが可能である。

本発明におけるＤＮＡマイクロアレイの使用方法の一実施形態を、図１及び図２に示す。図１左上は、７ｍｍ角のＤＮＡマイクロアレイ、図１右は、角型９６ウェルプレートに７ｍｍ角のＤＮＡマイクロアレイが９６枚収納されている図である。また図２は、これをサーマルサイクラーに収納した図である。サーマルサイクラーで熱サイクル処理を行った後、ウェルプレートを取り出して、その上面または下面からＣＣＤカメラで即座に検出することが可能である。

引き続き、本発明の核酸の検出方法の原理について説明する。ゲル利用ＤＮＡマイクロアレイをウェルプレートのウェルに入れ、その後、ウェル内に反応溶液を加えて、反応溶液にＤＮＡマイクロアレイを接触または浸漬させ、その後、熱サイクル処理を行うことによりＰＣＲ等の核酸増幅反応を実施することができる。
当該反応は、ＤＮＡマイクロアレイ及び反応液全体を、あらかじめ最適化された各温度で、「変性→アニーリング→複製」の３段階、または「変性→アニーリング・複製」の２段階の熱サイクル処理による反応を繰り返すことにより行う。

図３に示したように、熱サイクル処理の初期段階では、主に液相（反応溶液中）において核酸増幅反応（ＰＣＲ）が起こる。これと同時に、一部の増幅産物（標的となる核酸断片）が、スポットゲルに固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズする。この際、ゲノムＤＮＡのような大きなサイズの核酸や、非特異的に増幅した核酸のうちゲル内部に拡散できないような大きなサイズのものは排除されており、次の段階に進むことができない（図４）。また、スポットのゲル濃度は、前述の通り、検出目的の核酸のサイズ（塩基長）に対応して、すなわちゲルの内部に拡散させるべき核酸の大きさを考慮して設定されている。
続いて、反応溶液中に含まれているＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡを鋳型としてプローブＤＮＡの伸長反応が起こる。当該伸長反応により、液相中のプライマーＤＮＡがハイブリダイゼーションできる領域ができる（図５右上及び右下）。

その後、加熱することにより２本鎖ＤＮＡが解離すると同時に、伸長したプローブ（プライマー）末端に液相中からのプライマーがアニールし、逆側の鎖の増幅反応が進行する。逆側の鎖は、プローブ配列の３’末端部分までしか鋳型がないため中途半端な長さで合成が終了するが、その後の加熱により一部液相中へ拡散し、核酸増幅反応（ＰＣＲ）の鋳型、プライマーとしての役割も果たすことができる（図５下）。
このようなステップを繰り返し行うことで、ＤＮＡ増幅及びゲルに固定化したプローブＤＮＡの伸長、増幅産物（増幅核酸断片）のハイブリダイゼーション、液相中での核酸増幅反応（ＰＣＲ）が同時に進行する。
はじめに液相中に入れておくプライマーの末端を蛍光物質等で標識しておけば、検出時にこの標識の有無を検出する、または定量することにより標的ＤＮＡの検出、定量を行うことができる。

特に本発明においては、図４に示したように核酸増幅反応（ＰＣＲ）時に予期せぬ増幅産物が生じても、ゲルの分子ふるい効果によって目的のサイズ以上の核酸がゲル内部に拡散しにくくハイブリダイゼーションしにくいため、バックグラウンドの低減及び特異性の向上が図られている。本発明のＤＮＡマイクロアレイは核酸の有無を判定する場合において、明確な検出結果が得られやすいという特長を有する。
以上においては、一実施形態として特にＰＣＲ法を例に挙げて説明したが、ＳＮＰ検出用の反応系でより適した核酸増幅方法であれば、ＰＣＲ法に限らず適用することも可能である。

本発明の核酸の検出方法は、例えば一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析、マイクロサテライト解析、染色体異常解析(ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization)、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡ探索などの遺伝子解析用基本ツールへの適用；これらツールを使用した臓器・疾患別遺伝子発現解析チップ、変異原性試験キット（環境ホルモン）、遺伝子組換え食品検査キット、ミトコンドリア遺伝子配列解析キット、親子鑑定・犯罪捜査のための解析キット、先天性疾患解析キット、染色体・遺伝子異常解析キット、遺伝子診断（着床前・出生前）キット、薬物反応関連遺伝子多型解析キット、脂質代謝関連遺伝子多型解析キット、耳鼻科・眼科領域遺伝子多型解析キットなどの用途別カスタムチップへの適用；ガン予後予測チップ、医薬品開発（臨床・創薬）用チップ、健康食品開発用チップなどの診断・臨床用カスタムチップへの適用；微生物限度試験や食品飲料水中の微生物検査などの薬品・食品製造工程、及びう蝕・歯周病関連菌の検出、日和見感染菌の検出などの歯科領域の臨床検査、および食品工場・厨房施設環境検査、飲料・公衆浴場、井戸水などの水質検査における環境検査、および感染症・食中毒の予防、会社従業員の衛生管理などの保健衛生、および耐性菌を含む一般細菌同定、肝炎ウイルス、ヘリコバクターピロリ、肝炎クラミジア菌、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエストナイルウイルス、ノロウイルス（生カキ由来の食中毒）、インフルエンザウイルス、真菌・カビなどの臨床検査などの微生物同定検査キットへの適用などが挙げられる。

以下に、実施例を挙げて本発具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．ゲル保持ＤＮＡマイクロアレイの作製（複数のゲル濃度が異なるスポットを有するＤＮＡマイクロアレイの作製）
ＤＮＡマイクロアレイを以下のようにして製造した。
1-1．プローブの調製
まず、プローブとなる配列番号１記載のオリゴヌクレオチドを調製した。この際、オリゴヌクレオチドの５’末端にアミノヘキシル基が導入されたオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、そのオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、さらにＨＰＬＣで精製、分取することにより、下記の配列番号１で示される塩基配列を有する５’末端ビニル化オリゴヌクレオチド（プローブ（プライマーとしても機能する））を取得した。

5’-AGGAKGTTGGCTTAGAAGCAGCCA-3’ （配列番号１）
（省略記号Kは、グアニン(G)又はチミン塩(T)を表す。）

このオリゴヌクレオチドはセレウス菌の２３ＳリボソーマルＤＮＡ配列（２３ＳリボソーマルＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列）の一部分とハイブリダイズすることができる。

1-2．中空繊維束薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）の製造
図６に示す配列固定器具を利用して、中空繊維束を製造した。なお、図６中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。

図６を参照して、直径０．３２ｍｍの孔１１が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列横各９列で合計１０８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２１、２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維３１（三菱エンジニアリングプラスチック社製、カーボンブラック１質量％添加）を１本ずつ、通過させた。

Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を、板状物４１で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。

次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）製、ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで、多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。

ゲル前駆体重合性溶液として、下記表１に示す質量％、濃度で混合した溶液を調製した。核酸プローブとしては、前述の配列番号１で示されるオリゴヌクレオチド１種類を用い、ゲル前駆体重合性溶液は５種類調製した。プローブを搭載しない箇所については核酸プローブの代わりに水を使用した。各スポットとゲル濃度、プローブ配置図を図７に示した。図７中、薄い色から濃い色で色分けしている区域はゲル濃度の違いを示す。また「Ｐ」で示した箇所には核酸プローブが固定化され、「Ｂ」で示した箇所はゲルのみで核酸プローブを含んでいない。

次に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部に核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を５０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。

次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向で適当な枚数だけスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を３００枚得た（図１左上参照）。
個々の区画のプローブ固定化ゲルにおける、ゲルと反応溶液との接触表面積（S(μm²)）に対する当該ゲルの体積（V(μm³））の比率（すなわち、Vの値をSの値で除した値（V/S））は、本実施例では図１左下に示したように、１２５であった。

２．ゲルの分子ふるい効果を利用した特異性向上の確認
2-1．鎖長サイズが異なるテンプレートＤＮＡの作製
住商ファーマインターナショナル株式会社のＡＴＣＣ分譲サービスを利用して、セレウス菌のゲノムＤＮＡを購入し（受託番号：ＡＴＣＣ１４５７９)、ＰＣＲ反応のテンプレートに用いた。
マイクロアレイに搭載させたプローブ配列（すなわち、5’-AGGAKGTTGGCTTAGAAGCAGCCA-3’ （配列番号１））と、セレウス菌の２３ＳリボソーマルＤＮＡ配列（２３ＳリボソーマルＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列）由来の塩基配列とを内部に含む、４種の塩基長の核酸断片が得られるように、上記テンプレートに対する４組のプライマーを設計した。
以下に、設計した４組のプライマーセット（フォワード(F)プライマー及びリバース(R)プライマー）を示した。

「123bpのＰＣＲ産物を得るためのプライマー」
・Fプライマー(i)
PrimerFP123bp_cereus：5’-GTATTAAGTGGAAAAGGATGTGGAGTTGC-3’（配列番号２）
・Rプライマー(i)
PrimerRP123bp_cereus：5’-CCGGTACATTTTCGGCGCAGAGTC-3’（配列番号３）

「413bpのＰＣＲ産物を得るためのプライマー」
・Fプライマー(ii)
PrimerFP413bp_cereus: 5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（配列番号４）
・Rプライマー(ii)
PrimerRP413bp_cereus : 5’-AGCCTTCCTCAGGAAACCTTAGGCA-3’（配列番号５）

「827bpのＰＣＲ産物を得るためのプライマー」
・Fプライマー(iii)
PrimerFP827bp_cereus: 5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（配列番号６）
・Rプライマー(iii)
PrimerRP827bp_cereus: 5’-TTCACTGCGGCTTTCCGTTAAGAAAGCA-3’（配列番号７）

「1191bpのＰＣＲ産物を得るためのプライマー」
・Fプライマー(iv)
PrimerFP1191bp_cereus: 5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（配列番号８）
・Rプライマー(iv)
PrimerRP1191bp_cereus: 5’-CCGCCTATCCTGTACAAACTGTACCAA-3’（配列番号９）

セレウス菌の２３ＳリボソーマルＤＮＡ配列（２３ＳリボソーマルＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列）は、米国生物工学情報センター、NCBI; National Center for Biotechnology Informationにより提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）においてAccession No.: AJ310099.1として登録）を利用した。以下に、セレウス菌の２３ＳリボソーマルＤＮＡ配列（２３ＳリボソーマルＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列；配列番号１０）の塩基配列を示す。当該塩基配列中、二重下線を付けた塩基配列はプローブ（配列番号１）とハイブリダイゼーション可能な配列である（二本鎖であるため逆鎖（相補鎖）がハイブリダイゼーションする）。

「Bacillus cereus AJ310099.1 23S rRNA gene」（配列番号１０）：
CACGGTGGATGCCTTGACACTAGGAGTCGATGAAGGACGGGACTAACGCCGATATGCTTCGGGGAGCTGTAAGTAAGCTTTGATCCGAAGATTTCCGAATGGGGAAACCCACTATACGTAATGGTATGGTATCCTTACCTGAATACATAGGGTATGGAAGACAGACCCAGGGAACTGAAACATCTAAGTACCTGGAGGAAGAGAAAGCAAATGCGATTTCCTGAGTAGCGGCGAGCGAAACGGAATCTAGCCCAAACCAAGAGGCTTGCCTCTTGGGGTTGTAGGACATTCTATACGGAGTTACAAAGGAACGAGGTAGACGAAGCGACCTGGAAAGGTCCGTCGTAGAGGGTAACAACCCCGTAGTCGAAACTTCGTTCTCTCTTGAATGTATCCTGAGTACGGCGGAACACGTGAAATTCCGTCGGAATCTGGGAGGACCATCTCCCAAGGCTAAATACTCCCTAGTGATCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGCACCCCGGAAGGGGAGTGAAAGAGATCCTGAAACCGTGTGCCTACAAATAGTCAGAGCCCGTTAATGGGTGATGGCGTGCCTTTTGTAGAATGAACCGGCGAGTTACGATCCCGTGCAAGGTTAAGTTGAAGAGACGGAGCCGCAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGGGCGTTTAGTACGTGGTCGTAGACCCGAAACCAGGTGATCTACCCATGTCCAGGGTGAAGTTCAGGTAACACTGAATGGAGGCCCGAACCCACGCACGTTGAAAAGTGCGGGGATGAGGTGTGGGTAGCGGAGAAATTCCAATCGAACCTGGAGATAGCTGGTTCTCCCCGAAATAGCTTTAGGGCTAGCCTTAAGTGTAAGAGTCTTGGAGGTAGAGCACTGATTGAACTAGGGGTCCTCATCGGATTACCGAATTCAGTCAAACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAGGAGTCAGACTGCGAGTGATAAGATCCGTAGTCAAGAGGGAAACAGCCCAGATCGCCAGCTAAGGTCCCAAAGTGTGTATTAAGTGGAAAAGGATGTGGAGTTGCTTAGACAACTAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGCCACCATTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTAGTCGAGTGACTCTGCGCCGAAAATGTACCGGGGCTAAATACACCACCGAAGCTGCGAATTGATACCAATGGTATCAGTGGTAGGGGAGCGTTCTAAGTGCAGTGAAGTCAGACCGGAAGGACTGGTGGAGCGCTTAGAAGTGAGAATGCCGGTATGAGTAGCGAAAGACGGGTGAGAATCCCGTCCACCGAATGCCTAAGGTTTCCTGAGGAAGGCTCGTCCGCTCAGGGTTAGTCAGGACCTAAGCCGAGGCCGACAGGCGTAGGCGATGGACAACAGGTTGATATTCCTGTACCACCTCTTTATCGTTTGAGCAATGGAGGGACGCAGAAGGATAGAAGAAGCGTGCGATTGGTTGTGCACGTCCAAGCAGTTAGGCTGATAAGTAGGCAAATCCGCTTATCGTGAAGGCTGAGCTGTGATGGGGAAGCTCCTTATGGAGCGAAGTCTTTGATTCCCCGCTGCCAAGAAAAGCTTCTAGCGAGATAAAAGGTGCCTGTACCGCAAACCGACACAGGTAGGCGAGGAGAGAATCCTAAGGTGTGCGAGAGAACTCTGGTTAAGGAACTCGGCAAAATGACCCCGTAACTTCGGGAGAAGGGGTGCTTTCTTAACGGAAAGCCGCAGTGAATAGGCCCAAGCGACTGTTTAGCAAAAACACAGGTCTCTGCGAAGCCGTAAGGCGAAGTATAGGGGCTGACACCTGCCCGGTGCTGGAAGGTTAAGGAGAGGGGTTAGCGTAAGCGAAGCTCTGAACTGAAGCCCCAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGGTAAGTTCCGACCCGCACGAAAGGTGTAACGATTTGGGCACTGTCTCAACCAGAGACTCGGTGAAATTATAGTACCTGTGAAGATGCAGGTTACCCGCGACAGGACGGAAAGACCCCGTGGAGCTTTACTGTAGCCTGATATTGAATTTTGGTACAGTTTGTACAGGATAGGCGGGAGCCATTGAAACCGGAGCGCTAGCTTCGGTGGAGGCGCTGGTGGGATACCGCCCTGACTGTATTGAAATTCTAACCTACGGGTCTTATCGACCCGGGAGACAGTGTCAGGTGGGCAGTTTGACTGGGGCGGTCGCCTCCTAAAGTGTAACGGAGGCGCCCAAAGGTTCCCTCAGAATGGTTGGAAATCATTCGTAGAGTGCAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCTACAAGTCGAGCAGGGACGAAAGTCGGGCTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAAAAGCTACCCCGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTCCACATCGACGGGGAGGTTTGGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTGTTCGCCCATTAAAGCGGTACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCTATCCGTCGTGGGCGTAGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAGAGGACCGGGATGGACGCACCGCTGGTGTACCAGTTGTTCTGCCAAGGGCATAGCTGGGTAGCTATGTGCGGAAGGGATAAGTGCTGAAAGCATCTAAGCATGAAG

＜ＰＣＲ反応＞
セレウス菌ゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／μＬをテンプレートとし、前記４組のプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはAmpDirectキット（島津製作所）を用いた。

＜ＰＣＲ反応液組成＞
セレウス菌ゲノムDNA溶液（50ng/μL） 1μL
Fプライマー(i)〜(iv)（20μM） 0.5μL
Rプライマー(i)〜(iv)（20μM） 0.5μL
2×AmpDirect buffer 50μL
BioTaq（AmpDirectキット付属） 1μL
MilliQ水 47μL
合計 100μL

PCR反応にはGeneAmp 9600サーマルサイクラーを用いた。温度条件を以下に示した。

＜ＰＣＲ反応温度条件＞
95℃ 10分間
（94℃ 30秒、64℃ 1分、72℃ 30秒）×35サイクル
72℃ 1分間
4℃ 反応終了後維持

反応後にキアゲン社のMinElute PCR purification kitを用いて精製し、14μLで溶出した。その後、アジレント社のバイオアナライザーを用いて電気泳動を実施したところ目的の大きさのPCR産物を確認することができた。図８に電気泳動結果と各産物の内部のプローブ配列に対応する位置の模式図を示した。図８中、レーンLはサイズマーカーであり、レーン１〜４は、それぞれ順に、１２３ｂｐ、４１３ｂｐ、８２７ｂｐ及び１１９１ｂｐのPCR産物である。
得られたPCR産物の吸光度を測定して濃度を計算し、すべて5fmol/μLに濃度を調整した。

2-2．ゲルを保持したＤＮＡマイクロアレイでのＰＣＲ反応
中空繊維を利用したゲル保持ＤＮＡマイクロアレイ（図１左も参照）を、切削加工により８ｍｍの厚みにしたAurora Biotechnologies社の96-IQプレートのウェルの１つに入れ、さらに、以下の組成のＰＣＲ反応液１００μＬを加えた。

＜ＰＣＲ反応液組成＞
123bp PCR産物溶液（5fmol/μL） 1μL
5’末端cy5標識Fプライマー(i)（20μM）0.5μL
5’末端cy5標識Rプライマー(i)（20μM）0.5μL
2×AmpDirect buffer 50μL
BioTaq（AmpDirectキット付属） 1μL
MilliQ水 47μL
合計 100μL

反応液を加えたのち、リアルタイムＰＣＲ用の粘着シール（ABI PRISM Optical Adhesive Covers、アプライドバイオシステムズ社 #4311971）で上部をシールし、反応液が漏れないようにした。
引き続き、サーマルサイクラーGeneAmp 9700（０．２ｍＬブロック）に９６ウェルプレートをセットした。セットする際は、当該ウェルプレートの底面と同じ大きさ（１１．５×７．５ｃｍ）の０．８ｍｍ厚アルミ板を置き、その上に当該ウェルプレートを置いた。さらに、Microseal ‘P+’シーリングパッド（バイオ・ラッド社製）をのせ、位置がずれないようにゆっくりと蓋をスライドさせてレバーを下げ、上から押された状態が維持されるようにした。

サーマルサイクラーのプログラムは、以下のとおりの温度設定で設定し、反応系全体が熱サイクル処理されるようにした。合計40サイクルの熱サイクルプログラムを実施した。

＜熱サイクル処理＞
94℃ 7分間
（92℃ 30秒、60℃ 1分、72℃ 1分）×20サイクル
（92℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒）×20サイクル
4℃ 反応終了後維持

ＰＣＲ反応終了後、装置からウェルプレートを取り出し、ＰＣＲ反応液全量をピペッティングにより除き、キアゲン社のMinElute PCR purification kitを用いて精製し14μLで溶出した。濃度を測定したところ156nmol/μLであった。
DNAマイクロアレイは、TN buffer ２００μで２回ピペッティングによりすすいだ後、粘着シールをして５０℃、２０分間放置した。その後、TN buffer ２００μＬ全量をピペッティングにより除き、TN buffer ２００μＬで２回ピペッティングによりすすいだ後、全量を除き、TN buffer １００μＬを加えて検出操作へ進んだ。
検出操作は、冷却ＣＣＤカメラ方式のＤＮＡマイクロアレイ自動検出装置を用いた。ＤＮＡマイクロアレイをウェル上部から露光時間１秒間で撮像し、各スポットにおけるｃｙ５の蛍光シグナルを検出した。その検出結果を図９に示した。

スポットの蛍光強度をスポット内の蛍光強度の中央値として定量化したところ、ゲル濃度依存的な蛍光強度を示した。図９のグラフ中、右端のB-Medはブランクスポットの蛍光強度である。ブランクスポットの蛍光強度＋ブランクスポットの標準偏差の2倍をカットオフ値として、検出できているかどうか判定した。その結果１２３ｂｐではかろうじてすべてのゲル濃度のスポットで検出できていると判断された。しかしながら２質量％ゲルではスポットからの脱落、ゲルの形状不良により、蛍光強度に大きなバラツキが観察された。

この結果より、ゲルの分子ふるい効果を利用して、検出しようとする核酸の大きさに対応したゲル濃度に設定したスポットを配置することにより、ゲル濃度依存的に蛍光強度が低下しておりサイズによる選択が観察された。
プローブでの核酸の選別、ゲル濃度依存的な核酸サイズの選別という二重の作用により、平板状のアレイと比較し、更に特異的な検出が可能なＤＮＡマイクロアレイを提供できることが分かった。

実施例１の2-2．項（ゲルを保持したＤＮＡマイクロアレイでのＰＣＲ反応）において、ＰＣＲ反応液組成を以下の組成に変更する以外は、実施例１と同様の操作を実施した。

＜ＰＣＲ反応液組成＞
413bp PCR産物溶液（5fmol/μL） 1μL
5’末端cy5標識Fプライマー(ii)（20μM） 0.5μL
5’末端cy5標識Rプライマー(ii)（20μM） 0.5μL
2×AmpDirect buffer 50μL
BioTaq（AmpDirectキット付属） 1μL
MilliQ水 47μL
合計 100μL

実施例１と同様に、ＰＣＲ反応終了後、装置からウェルプレートを取り出し、ＰＣＲ反応液全量をピペッティングにより除き、キアゲン社のMinElute PCR purification kitを用いて精製し14μLで溶出した。濃度を測定したところ４０１nmol/μLであった。
実施例１と同様に、各スポットにおけるｃｙ５の蛍光シグナルを検出し、その検出結果を図１０に示した。
スポットの蛍光強度をスポット内の蛍光強度の中央値として定量化したところ、ゲル濃度依存的な蛍光強度を示した。実施例１と同様、ブランクスポットの蛍光強度＋ブランクスポットの標準偏差の2倍をカットオフ値として、検出できているかどうか判定した。その結果、４１３ｂｐでは１０質量％ゲル濃度のスポットでは検出できないと判断されたが、２．８質量％及び３．８質量％のゲルスポットで良好に検出できることが示された。また、２質量％ゲルではスポットからの脱落、ゲルの形状不良により、蛍光強度に大きなバラツキが観察された。

＜ＰＣＲ反応液組成＞
827bp PCR産物溶液（5fmol/μL） 1μL
1191bp PCR産物溶液（5fmol/μL） 1μL
5’末端cy5標識Fプライマー(iii)（20μM） 0.5μL
5’末端cy5標識Rプライマー(iii)（20μM） 0.5μL
5’末端cy5標識Fプライマー(iv)（20μM） 0.5μL
5’末端cy5標識Rプライマー(iv)（20μM） 0.5μL
2×AmpDirect buffer 50μL
BioTaq（AmpDirectキット付属） 1μL
MilliQ水 47μL
合計 100μL

実施例１と同様に、ＰＣＲ反応終了後、装置からウェルプレートを取り出し、ＰＣＲ反応液全量をピペッティングにより除き、キアゲン社のMinElute PCR purification kitを用いて精製し14μLで溶出した。濃度を測定したところ８２７bpの産物が１４７．７nmol/μL、1191bpの産物が７０．６nmol/μL（電気泳動のバンドから換算した）であった。
実施例１と同様に、各スポットにおけるｃｙ５の蛍光シグナルを検出し、その検出結果を図１１に示した。

スポットの蛍光強度をスポット内の蛍光強度の中央値として定量化したところ、ゲル濃度依存的な蛍光強度を示した。実施例１と同様、ブランクスポットの蛍光強度＋ブランクスポットの標準偏差の2倍をカットオフ値として、検出できているかどうか判定した。その結果、８２７bp及び１１９１bpの混合物では、３．８質量％〜１０質量％ゲル濃度のスポットでは検出できないと判断されたが、２．８質量％ゲルでは良好に検出できることが示された。２質量％ゲルでは実施例１及び２と同様、スポットからの脱落が観察された。また、蛍光強度にバラツキが観察された。

〔比較例１〕
市販のハイドロゲルコーティングスライド（CodeLink（登録商標） Activated Microarray Slides（Surmodics, Inc. #DN01-0025））を７ｍｍ角に切断し、この上にオリゴＤＮＡをスポットして平板状のＤＮＡアレイを作製した（図１２）。アレイの作製方法は特開2006-174788号公報の実施例１の方法に従って作製した。

作製したアレイは、実施例１と同様に角型９６ウェルプレートのウェル内に入れ、ＰＣＲ反応液１００μＬに浸漬してＰＣＲ反応を実施した。
実施例１及び２と同様の方法により、個別のサイズごと（１２３、４１３、８２７、１１９１ｂｐ）にPCR反応実験を実施し、各スポットにおけるｃｙ５の蛍光シグナルを検出した。その検出結果（スポット内の蛍光強度の中央値）を下記表２に示した。

基板表面上にプローブ（プライマーとしても機能する）を固定したアレイにおいては、分子ふるい効果がないため、どのサイズのテンプレートを用いても同程度のシグナル強度が検出された。すなわち、仮にゲノムＤＮＡやサイズの大きな非特異的増幅産物が生成・混入している場合、これらの非特異的なハイブリダイゼーションの影響を受けやすい状態にあると考えられた。

本発明の核酸の検出方法、及び当該検出方法に用いるＤＮＡマイクロアレイ等は、例えば、大量の検体を処理する用途に適したものであり、実用性及び有用性に優れたものである。

１１孔
２１多孔板
３１中空繊維
４１板状物

受託番号：ＡＴＣＣ１４５７９

配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA

Claims

下記の工程：
（ａ）プローブが固定化された、ゲル濃度が異なる複数種のゲルと、核酸増幅の鋳型となる核酸並びに核酸増幅用プライマーセット、ヌクレオチド単体及びＤＮＡ伸長酵素を含む反応溶液とを接触させる工程、
（ｂ）接触させた上記ゲル及び反応溶液の全体に、核酸増幅反応を行うための熱サイクル処理を加える工程、
（ｃ）増幅された核酸断片のうち、特定の塩基長の核酸断片を選別する工程（ここで、当該特定の塩基長の核酸断片の選別は、異なるゲル濃度に依存したプローブ固定化ゲルの分子ふるい効果によりなされる。）、及び
（ｄ）選別された核酸断片を検出する工程
を含む、核酸の検出方法であって、
前記プローブが固定化されたゲルは、基板中の貫通孔に保持されたものであり、
前記プローブが固定化されたゲルと前記反応溶液との接触表面積（S(μm ² )）に対する当該ゲルの体積（V(μm ³ )）の比率（V/S）が５０以上であり、
前記プローブが固定化されたゲルのゲル濃度が、２質量％超、５質量％未満である、
前記方法。
プローブが固定化されたゲルが、置換（メタ）アクリルアミド誘導体及び／又はアガロース誘導体を含むものである、請求項１記載の方法。