JP6042800B2 - トマトシドａの抽出方法 - Google Patents

Description

本発明は、トマト種子由来サポニンであるトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有する、脂質異常症に関連する疾患の予防又は治療用組成物及びその製造方法に関する。本発明はまた、トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有するコレステロール上昇抑制剤、トリグリセリド上昇抑制剤及び肝中コレステロール蓄積抑制剤に関する。

近年日本人の食生活の欧米化の結果として、コレステロールや脂質を過剰に摂取する人が増え、生体内のコレステロールやトリグリセリドが上昇して脂質異常症及びこれに関連した各種疾病を引き起こす原因になっている。

平成１８年国民健康調査の概要によると、このような脂質異常症が疑われる人は日本国内で少なくとも約１４１０万人と推計されている。脂質異常症は動脈硬化性疾患など、多様な疾患を引き起こす原因となる。例えば動脈硬化性疾患のうち、特に心筋梗塞を中心とした心血管系疾患と、脳梗塞・脳卒中を中心とした脳血管障害による死亡は、がんと並んで大きな位置を占め、日本人の死因の約３０％に及んでいる。その危険性は、急速な高齢化社会への移行によってさらに高まることが予想される。日本国内のみならず世界的にも有効な予防法、治療法の確立が急務である。

このような状況に対して薬物療法のみならず、食事内容や運動を中心とする生活習慣の是正が推奨されており、これまでにコレステロール低下作用又はコレステロール上昇抑制作用を有する食品成分として、食物繊維、植物ステロール、サポニン、リン脂質、大豆タンパク質等が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。

一方、トマトは、野菜の中で最も多く栽培されており、世界中で広く食され、人々の健康増進に高く貢献している野菜である。トマトには、例えば食物繊維（セルロース、ペクチン等）等、多くの種類の機能的な栄養成分が含まれ、長年にわたってその研究が進められてきた。

トマトに含まれる代表的なカロテノイド類であるリコピンは、強い抗酸化活性を有することが知られ、前立腺がん、すい臓がん、肺がんの発症リスクの低下、肝機能の正常化、心筋梗塞予防、白内障予防等の効果が報告されている。また、トマト果皮に存在するポリフェノールの一種であるナリンゲニンカルコンが花粉症などの鼻アレルギーに代表されるＩ型アレルギーを抑制するという報告がある（例えば、非特許文献２、３参照）。

トマトに含まれる成分として、微量ではあるが未熟トマト果実中にα−トマチンと呼ばれるアルカロイド配糖体の存在が知られている。α−トマチンにはステロイド系配糖体であるトマチジンにキシロース１分子、グルコース２分子、ガラクトース１分子が結合しており、その濃度は果実の成熟とともに減少する。α−トマチンは、コレステロールと不溶性複合体を形成する特性があり、ハムスターへの給餌試験では悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール値を減少させるという報告がある（例えば、非特許文献４参照）。

従来提案されているトマト由来の脂質代謝改善剤として、特許文献１は、トマト果実収穫後のトマト地上部（茎・葉など）から得られたトマチジンを有効成分として含む、動脈硬化の予防・治療剤、血中コレステロール低下剤及びマクロファージの泡沫化阻害剤を開示する。特許文献２は、リコピンを含まず、水不溶性粒子状物質を含まない、水溶性トマト抽出物又はそのフラクションの、血漿トリグリセリド濃度低下作用について開示する。

また、サポニンの一種であるトマトシドＡは、トマト種子（種子を含むゼリー部）に非常に多く存在する成分であり（例えば、非特許文献６参照）、界面活性作用を有することが知られている（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、これまでにトマト種子に含まれる成分による生理活性に関する報告はない。

特開２００９−２０９０９９号公報 特表２００８−５３００７６号公報

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（２０１０）１１、４５−４８ 日本食品保蔵科学会誌（２００７）３３、３、１４３−１５７ 日本食品保蔵科学会誌（２００７）３３、４、２２３−２３２ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（２０００）３８、５４９−５５３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）５６、１１４３２−１１４４０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）５７、３７８６−３７９１

本発明は、高コレステロール血症又は高トリグリセリド血症のような脂質異常症及びこれに関連する疾患を予防又は治療するための組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、コレステロール上昇抑制剤、トリグリセリド上昇抑制剤及び肝中コレステロール蓄積抑制剤のいずれか１以上を提供することも目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、トマトジュース、トマトピューレ、トマトペーストなどに用いるトマト果実の搾汁液を製造する際に発生する搾汁粕から分離したトマトシドＡがコレステロールやトリグリセリト等の血中脂質濃度の上昇を抑制し、肝臓中のコレステロールの蓄積を抑制する作用を有することを発見した。また、このトマトシドＡを含むトマト加工飲食品は、風味が損なわれることなく、上記の作用がより強化された食品となることを見出した。また、トマトシドＡを含む組成物をトマト搾汁粕から容易に効率よく分離する方法を見出した。

本発明者らによる前記の知見に基づく本発明は以下の通りである：
［１］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有するコレステロール上昇抑制剤；
［２］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有するトリグリセリド上昇抑制剤；
［３］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有する肝中コレステロール蓄積抑制剤；
［４］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有する、脂質異常症に関連する疾患の予防又は治療用組成物；
［５］前記トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の含有量が、０．００１〜８０重量％である、［１］〜［４］のいずれかに記載の剤又は組成物；
［６］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の剤又は組成物を配合したトマト加工飲食品であって、前記トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の含有量が、０．００１〜８０重量％である、トマト加工飲食品；
［７］トマト種子を含むトマト果実由来物を、抽出溶媒として１０体積％以上９０体積％未満の有機溶媒を用いて抽出する工程を含む、トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含む組成物の製造方法；並びに
［８］前記有機溶媒が、エタノール溶媒である、［７］に記載の製造方法。

さらに、本発明は、以下の方法にも関する：
［９］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、コレステロール上昇抑制方法；
［１０］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、トリグリセリド上昇抑制方法；
［１１］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、肝中コレステロール蓄積抑制方法；及び
［１２］トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、脂質異常症に関連する疾患の予防又は治療方法。

本発明により、高コレステロール血症又は高トリグリセリド血症のような脂質異常症及びこれに関連する疾患を予防又は治療するための組成物並びにコレステロール上昇抑制剤、トリグリセリド上昇抑制剤、及び肝中コレステロール蓄積抑制剤のいずれか１以上を提供することができる。特に該組成物及び剤を、飲食品（特にトマト加工飲食品）に配合することにより、風味が損なわれず摂取しやすく、しかもトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を単独で摂取するよりも効能のよりすぐれたな飲食品も提供することができる。さらに、本発明によれば、該組成物及び剤をトマト搾汁粕より容易に効率よく分離することができる。

以下、本発明を具体的に説明する。本発明の組成物及び剤（以下、単に「本発明の組成物」ともいう）の有効成分であるトマトシドＡ（トマトサイドＡ、ｔｏｍａｔｏｓｉｄｅＡ）は、以下の構造を有する化合物である。

トマトシドＡは、サポニンの一種であり、トマト種子に多く含まれることが知られる水に難溶性の化合物である。本発明の組成物における有効成分であるトマトシドＡの生理学的に許容される塩としては上記の構造を有する化合物のナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、所望の作用を有し、生理学的に許容される塩であれば特に限定されない。以下、トマトシドＡ及び／又はその生理学的に許容される塩を、単に「トマトシドＡ」ともいう。

トマトシドＡとしては、化学的に合成したものを用いてもよいが、より簡便には、トマト種子を含むトマト果実由来物を、抽出溶媒として１０体積％以上９０体積％未満の有機溶媒を用いて抽出する工程を含む方法により、トマトシドＡを含む組成物を得ることができる。以下にその方法を詳述する。

原料となるトマト果実由来物は、トマト種子を含むものであれば特に限定されないが、トマトの品種や成熟度によって、種子の形状、数量が異なることを考慮することが好ましい。トマト果実の搾汁液を得る過程において得られる搾汁粕は、一般的に廃棄されるか、家畜飼料となるが、この搾汁粕を用いれば、廃棄原料を有効利用でき、しかも高濃度のトマトシドＡを含む組成物を容易に効率よく得ることができるため好ましい。トマトジュース、トマトピューレ、トマトペーストなどに用いるトマト果実の搾汁液は、常法により、トマト果実を洗浄し、破砕したのち予備加熱を行い、次いで、これを搾汁して得られる。この搾汁の過程において、果実の約１〜５％が搾汁粕として発生する。搾汁粕は主として果皮と種子から構成されており、この中には水溶性食物繊維であるペクチンや不溶性食物繊維であるセルロース、ヘミセルロースなどの繊維質が豊富に含まれるだけでなく、ポリフェノール類やサポニン類も残存している。

上記のトマト果実由来物を、抽出溶媒を用いて、例えば後述の実施例に記載のように、当業者に公知の手法を用いて抽出する。抽出効率を高めるため、トマト果実由来物は乾燥品であることが好ましい。抽出溶媒としては、食品添加物の抽出溶剤となり得る有機溶媒であれば特に限定されず、例えば、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエテン、１−ブタノール、２−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、プロピレングリコール、ヘキサン、水、メタノール等から選択される１又は複数の有機溶媒を用いることができる。これらのうち好ましくは、エタノール（１０体積％以上９０体積％未満）、メタノール（１０体積％以上９０体積％未満）、１−ブタノール（３０体積％以上９０体積％未満）及びヘキサン（５体積％７０体積％未満）から選択される有機溶媒を用いることができ、最も好ましくはエタノールを用いることができる。例えば、抽出溶媒として、１０体積％以上９０体積％未満のエタノール溶媒を用いることができ、好ましくは３０体積％以上７０体積％以下のエタノール溶媒を用いることができ、より好ましくは７０体積％程度のエタノール溶媒を用いることができる。なお、７０体積％のエタノール溶媒とは、エタノールと水の体積比７：３の混合物を指す。

抽出溶媒のｐＨは、トマトシドＡが抽出される限り特に制限されないが、抽出効率の観点から、強酸性ではないことが望ましく、ｐＨ４以上が好ましく、ｐＨ５以上がより好ましい。

抽出時の温度は、トマトシドＡが抽出される限り特に制限されないが、抽出効率の観点から、０℃以上５５℃未満が好ましく、５℃以上４０℃以下がより好ましい。作業容易性の観点から、室温程度の２５℃前後で抽出を行うことが特に好ましい。

抽出時間は、トマトシドＡが抽出される限り特に制限されないが、抽出効率及び作業容易性の観点から、３０分以上が好ましく、１時間以上２時間以下がより好ましい。抽出は、静置抽出及び撹拌抽出のいずれの方法でも行うことができるが、抽出効率の観点から、好ましくは撹拌抽出を行う。

抽出回数は、トマトシドＡが抽出される限り特に制限されず、例えば１〜３回程度の抽出を行うことができるが、７０体積％のエタノール溶媒を抽出溶媒とし、室温で１時間抽出した場合、１〜２回の抽出で十分な抽出をすることができる。

抽出後、濾過により残渣を除去して得られた抽出液は、常法により、減圧下での濃縮や、凍結乾燥を行い、トマトシドＡを含む組成物を得ることができる。このようにして得られた組成物は、トマトシドＡの他、原料となるトマト果実由来物に含まれるポリフェノール類やトマトシドＡ以外のサポニン類も含有し得る。得られた組成物は必要に応じて、例えばクロマトグラフィー等によりさらに精製を行ってもよい。得られた組成物にトマトシドＡが含まれているかは、例えば標準品を用いたＨＰＬＣ等、常法により確認することができる。得られた組成物は、そのまま本発明の組成物としてもよいし、そのまま又は精製物を下記の医薬品及び飲食品に配合してもよい。

トマトシドＡは、後述の実施例に記載の通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコレステロール吸着活性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏで、コレステロール負荷による血中脂質濃度の上昇抑制作用（特に、血清総コレステロール上昇抑制作用、血清非ＨＤＬコレステロール上昇抑制作用及び血清トリグリセライド上昇抑制作用）や、コレステロール負荷によって引き起こされた高コレステロール血症を改善する作用を有する。この作用は、従来コレステロール低下作用が知られる大豆サポニンと比較しても高い効果である。また、上記の作用に伴い、動脈硬化のリスクを軽減する作用も有する。さらに、コレステロール負荷による肝臓へのコレステロール蓄積を予防する作用も有する。
従って、トマトシドＡを含有する組成物は、コレステロール上昇抑制剤（特に血中コレステロール上昇抑制剤）、トリグリセリド上昇抑制剤又は肝中コレステロール蓄積抑制剤として用いることができる。なお、本明細書中において、特に記載のない限り「コレステロール」とは「血中コレステロール」を意味する。また、トマトシドＡを含有する組成物を、脂質異常症に関連する疾患、例えば高コレステロール血症又は高トリグリセリド血症に関連する疾患の予防又は治療用組成物や、脂質異常症に関連する状態の予防又は改善用組成物として、用いることができる。これらの剤及び組成物を、そのまま、ヒトを含む動物等に投与することができるほか、医薬品（医薬組成物）及び飲食品に配合して利用することができる。

さらに、上記のトマトシドＡの作用に基づき、トマトシドＡの有効量を投与する工程を含む、コレステロール上昇抑制方法、トリグリセリド上昇抑制方法、肝中コレステロール蓄積抑制方法、及び脂質異常症に関連する疾患の予防又は治療方法を提供することもできる。

脂質異常症に関連する疾患及び状態としては、例えば、高コレステロール血症に関連する疾患、高ＬＤＬコレステロール血症に関連する疾患、高トリグリセリド血症に関連する疾患等が挙げられる。より具体的には、動脈硬化症、動脈硬化性疾患である狭心症、心筋梗塞等の虚血性心疾患、脳梗塞、脳卒中脳血栓、脳出血、クモ膜下出血等の脳血管疾患、膵炎等が挙げられる。

上記の作用を有する本発明の組成物を、例えば高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、高トリグリセリド血症等の脂質異常症に対する効果が知られている他の食品や有効成分と併用して投与することにより、相加効果又は相乗効果を得ることもできる。このような食品や有効成分としては、例えば、各種食物繊維(低分子アルギン酸ナトリウム、サイリウム、ペクチン、小麦ふすま、リグニン等)、茶カテキン、キトサン、各種植物ステロール、各種サポニン（大豆サポニン、アルファルファサポニン、ユッカサポニン、薬用人参サポニン、ヒヨコマメサポニン等）、各種リン脂質、大豆タンパク質、キャベツ又はブロッコリー由来の天然アミノ酸、各種脂肪酸（１３−ｏｘｏ−９，１１−オクタデカジエン酸等）等が挙げられる。

本発明の組成物並びにこれを配合した飲食品及び医薬品は、有効成分であるトマトシドＡを、乾燥重量で好ましくは０．００１〜８０重量％、より好ましくは０．００５〜６０重量％、特に好ましくは０．００５〜０．６重量％含有する。トマトシドＡ含有量が少なすぎると、所望の効果を得られないことがある。また、本発明の組成物を特に飲食品に配合する場合、トマトシドＡ含有量の増加に伴い苦味が増す場合もあることも考慮してトマトシドＡを配合することが好ましい。

本発明の組成物を医薬品に配合する場合、薬学的に許容可能な賦形剤を添加して医薬製剤とすることができる。医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、チュアブル、トローチ等の経口剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤等の外用剤、注射剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、坐剤等の剤型であることができる。好ましい剤型は、経口剤である。

本発明の組成物の投与量は、対象疾患及び状態、疾患の程度、対象者の年齢、体重等に応じて適宜設定することができるが、通常成人一日当たりトマトシドＡを乾燥物換算で例えば０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは例えば０．４〜２００ｍｇ／ｋｇ体重程度投与することができる。投与は単回投与でも数回に分けた投与でもよい。

本発明の組成物の投与経路は、特に限定されないが、簡便には経口投与により投与することができる。

摂取容易性の観点から、好ましくは本発明の組成物を飲食品に配合することができる。飲食品としては、サプリメント、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、機能性食品、健康補助食品、通常の飲食品等が挙げられる。形状としては、ジュース、清涼飲料、ドリンク剤、茶等の液状、ビスケット、タブレット、顆粒粉末、粉末、カプセル等の固形、ペースト、ゼリー、スープ、調味料、ドレッシング等の半流動状が例示される。これらの飲食品は、いずれも当業者に公知の手法を用いて、トマトシドＡを添加して製造することができる。

上記の飲食品は、血中コレステロール上昇抑制作用、血中トリグリセリド上昇抑制作用、肝中コレステロール蓄積抑制作用、脂質異常症予防作用、脂質異常症改善作用、生活習慣病予防作用、生活習慣病改善作用等の作用を有する旨の表示を付した飲食品であってもよい。

上記の飲食品の摂取量は、用途に応じて適宜調整することができるが、例えばトマトシドＡを乾燥物換算で０．１〜２００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１５０ｍｇ／日、より好ましくは２０〜１００ｍｇ／日程度摂取することができる。摂取量が多いほど所望の効果を得やすい。摂取回数は特に制限されないが、好ましくは１日１〜３回であり、必要に応じて摂取回数を増減してもよい。

特に本発明の組成物をトマト加工飲食品に配合した場合、トマトシドＡを添加しても、トマト感やコク味が損なわれず、トマトシドＡを添加しないトマト加工飲食品と比較して風味の損なわれないトマト加工飲食品となる。また、トマトシドＡを配合したトマト加工飲食品は、トマトシドＡのみを投与した場合と比較して、より高い血中コレステロール上昇抑制作用を有する。これは、トマト加工飲食品にもともと含まれる多数の有効成分（例えば、リコピン、α−トマチン、エスクレオサイドＡ及びＢ、食物繊維（セルロース、ペクチン等）、各種ポリフェノール等）とトマトシドＡとの相方の効果によるものと考えられる。トマト加工飲食品にもともと含まれる多数の有効成分のうち一部は、コレステロールに吸着して腸管からの再吸収を阻害することにより、血中コレステロールの上昇を抑制する作用を有すると推測される。トマトシドＡをトマト加工飲食品に配合した場合、トマトシドＡ自体の作用とこれらの有効成分の作用によって、より高いコレステロール上昇抑制作用を示すと考えられる。

従って、本発明の組成物は、好ましくはトマト加工飲食品に配合することができる。トマト加工飲食品の例としては、トマトジュース、トマトミックスジュース、トマトケチャップ、トマトソース、チリソース、トマト果汁飲料、固形トマト、トマトピューレ、トマトペースト、トマトスープ等が挙げられる。これらのトマト加工飲食品は、通常のトマト加工飲食品の製造法（レシピなど）に従い、トマトシドＡを含む本発明の組成物を添加してそれぞれ通常の製法に従って調製される。なお、一般的にトマト加工飲食品は、製造過程で種子が除去され、トマトシドＡはほとんど検出されない。例えば、後述の実施例１−１に記載のＨＰＬＣ法でトマトジュース中のトマトシドＡ含有量を測定した場合、検出限界以下であったことを本発明者らは確認している。また、さらに高感度の分析法（ＬＣ／ＭＳ）による測定も行ったところ、トマトジュース中のトマトシドＡ含有量は０．０００５重量％以下であると考えられた。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何ら制限されるものではない。

［実施例１］
（トマト搾汁粕からのトマトシドＡの抽出）
１−１．抽出溶媒の検討
完熟した加工用トマト果実をブラシ洗浄し、チョッパーで破砕した後、間接式のチューブ型加熱器にて予備加熱を行い、これをパルパーフィニッシャーにて搾汁して搾汁液を得た。搾汁過程で発生した搾汁粕を凍結乾燥し、さらに粉砕してトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物を得た。得られた乾燥物２０ｇに、表１に示す各抽出溶媒１，０００ｍＬを加え、２５℃の温度条件下にて２時間撹拌抽出した後、濾過した。得られた抽出液を減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ抽出物を得た。抽出溶媒としては、１０体積％エタノール（水とエタノールの体積比９：１の混合物）、３０体積％エタノール（水とエタノールの体積比７：３の混合物）、５０体積％エタノール（水とエタノールの体積比５：５の混合物）、７０体積％エタノール（水とエタノールの体積比３：７の混合物）、９０体積％エタノール（水とエタノールの体積比１：９の混合物）、０．１％酢酸添加した７０体積％エタノール（水、エタノール、酢酸の体積比３：７：０．０１の混合物）、１％酢酸添加した７０体積％エタノール（水、エタノール、酢酸の体積比３：７：０．１の混合物）を用いたときの各抽出物のトマトシドＡの相対濃度を表１中に併記した。相対濃度は以下に記載の方法で算出した。

相対濃度の算出方法：得られた各抽出液を、常法により、減圧下で濃縮し、逆相系固層抽出カラム(Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ製)に吸着させた後、水洗浄し、次いでメタノールで溶出させた。得られたメタノール溶出液を再度減圧下で濃縮した試料溶液をフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、逆相系カラム（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、資生堂製）を装着した高速液体クロマトグラフ（型式ＳＣＬ−１０ＡＶＰ、島津製作所製）を用いて、カラム温度３５℃でグラディエント法により分析した。移動相Ａ液は蒸留水、Ｂ液はアセトニトリル溶液とし、試料注入量は１０μＬ、検出は蒸発光散乱検出器（型式ＥＬＳＤ−ＬＴII、島津製作所製）により行った。測定後、最も高い抽出効率を示した７０体積％エタノールによる抽出濃縮物のトマトシドＡ含量を１００として、各抽出条件のトマトシドＡの相対濃度を算出した。

表１に示した結果から、トマト種子サポニントマトシドＡは、３０〜７０体積％エタノールを抽出溶媒としたときに十分な抽出効果が得られることが明らかになった。なお、抽出溶媒として用いた水とエタノールの混合液自体のｐＨ測定は困難であったが、抽出溶媒を減圧濃縮してエタノールを除去した後の「濃縮液」のｐＨは：抽出物試料１〜４で用いた抽出溶媒についてｐＨ４．３；抽出物試料５で用いた抽出溶媒についてｐＨ４．２；抽出物試料６で用いた抽出溶媒についてｐＨ３．４；抽出物試料７で用いた抽出溶媒についてｐＨ２．８であった。濃縮液のｐＨよりも抽出溶媒のｐＨが高くなることを考慮すれば、抽出溶媒のｐＨは強酸性ではないことが望ましく、ｐＨ４以上が好ましく、ｐＨ５以上がより好ましいと考えられた。また、上記「相対濃度の算出方法」におけるＨＰＬＣにおいて、予め作成した既知濃度のトマトシドＡ標準溶液と比較することにより、トマトシドＡ濃度を算出したところ、７０体積％エタノールを抽出溶媒としたときに得られる抽出物（未乾燥処理）のトマトシドＡ濃度は、１．３重量％であった。同様の手法を用いて市販のトマトジュース中のトマトシドＡ含有量を測定したところ検出限界以下であったため、ＬＣ／ＭＳ法を用いて測定を行った結果、市販のトマトジュース中のトマトシドＡ含有量は０．０００５重量％以下であると考えられた。

１−２．抽出温度の検討
上記１−１で得られたトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物２０ｇに、抽出溶媒として７０体積％エタノール１，０００ｍＬを加え、表２の温度条件下にて２時間撹拌抽出し、濾過した。減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ粗抽出物を得た。各抽出物のトマトシドＡの相対濃度を上記１−１と同様の手法で測定し、表２中に併記した。トマトシドＡは、７０体積％エタノールを抽出溶媒として、室温から４０℃程度で最も効率のよい抽出が可能であることが明らかになった。

１−３．抽出時間の検討
上記１−１で得られたトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物２０ｇに、抽出溶媒として７０体積％エタノール１，０００ｍＬを加え、２５℃にて表３の時間条件で撹拌抽出し、濾過した。減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ粗抽出物を得た。各抽出物のトマトシドＡの相対濃度を表３中に併記した。トマト種子サポニントマトシドＡは、７０体積％エタノールを抽出溶媒として、室温条件で１時間以上撹拌抽出することで十分な抽出効果が得られることが明らかになった。

１−４．抽出回数の検討
上記１−１で得られたトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物２０ｇに、抽出溶媒として７０体積％エタノール１，０００ｍＬを加え、２５℃にて２時間撹拌抽出し、濾過した。濾過後の残渣について、さらに同様の抽出処理を２回行い、得られた全３回の抽出液を各々減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ粗抽出物を得た。各抽出物のトマトシドＡの相対濃度を表４中に記した。トマト種子サポニントマトシドＡは、７０体積％エタノールを抽出溶媒として、室温条件で再抽出を含めて２回の処理で、十分な抽出効果が得られることが明らかになった。

１−５トマトシドＡ含有調製物の製造
上記１−１〜１−４の結果に基づいて最適化した抽出条件で、トマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物からトマトシドＡ含有調製物を製造した。上記１−１で得られたトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物２０ｇに、抽出溶媒として７０体積％エタノール１０００ｍＬを加え、室温下にて２時間撹拌抽出した後、濾過した。濾過後の残渣について、さらに同様の抽出処理を１回行い、得られた全２回の抽出液を合わせて減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を逆相系カラムクロマトグラフィー(ＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ、ＹＭＣ製)に吸着させ、水、４０体積％メタノール、７０体積％メタノール、１００体積％メタノールで順次溶出して得た溶出画分を凍結乾燥して、トマトシドＡを６０重量％含有するトマトシドＡ含有調製物を得た。

［実施例２］
（トマトシドＡ含有トマトジュースの官能評価）
実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含有する調製物を、表５に示す量（トマトシドＡ添加量に換算して０ｍｇ〜２０ｍｇ／１００ｇ）添加したトマトジュース（食塩無添加）を作成し、トマト感、コク味及び苦味に関してパネリスト８名による官能評価を行った。トマトシドＡを添加しないトマトジュース（対照）のトマト感、コク及び苦味の強さを７段階中４としたときの、各トマトジュースのトマト感、コク及び苦味の強さを７段階で評価し、パネリスト８名の評価の平均を算出した。結果を表５に示す。トマトシドＡを添加しても、トマトジュースのトマト感やコク味は損なわれず、トマトシドＡを添加しないトマトジュースと比較して遜色ないトマト加工飲食品となった。

［実施例３］
（トマトシドＡ含有組成物のコレステロール吸着能）
ｉｎ ｖｉｔｒｏの系でトマトシドＡのコレステロール吸着能を測定した。実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含有する調製物を表６に示す用量でｐＨ７．５のリン酸緩衝液１ｍＬに分散させ、これに０．５重量％コレステロール（特級コレステロール、和光純薬工業製）のエタノール溶液０．０１ｍＬを添加し、良く撹拌した後、３７℃で２時間加温した。これを１０，０００回転、１５分間遠心分離し、上清液のコレステロール含量を測定してトマトシドＡ調製物のコレステロール吸着能を求めた。対照として、ｐＨ７．５リン酸緩衝液、及び表６に示す用量の大豆サポニン（一級サポニン、大豆製、和光純薬工業製）を用いた。結果を表６に併記した。トマトシドＡ調製物は、従来コレステロール低下作用が知られている大豆サポニンと同様に、用量に依存したコレステロール吸着活性を示した。また、トマトシドＡ精製物を用いて同様にコレステロール吸着能を測定したところ、上記の調製物と同様、コレステロール吸着活性を示した。

［実施例４］
（マウスへのトマトシドＡ含有組成物の長期投与１）
ＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）にコレステロール（特級コレステロール、和光純薬工業製）とコール酸ナトリウム（コール酸ナトリウム、和光純薬工業製）を添加した試験飼料を以下の表７に記載の配合で作製し、さらに実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含む調製物を添加した混餌食（トマトシドＡに換算して０．３３〜１．０重量％配合）をマウスに投与したときの血中脂質濃度に対する効果を確認した。対象として、大豆サポニンを添加した混餌食をマウスに投与した。

５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（日本クレア社生産）２４匹を、ＭＦ粉末飼料で１週間予備飼育した後、各群６匹の対照群１、投与群２〜４の４群に分けた。対照群１、及び投与群２〜４をそれぞれ表７に示した試験飼料で３週間飼育した。飼料は自由摂取により投与した。

試験飼料の投与開始前（０日後）並びに開始後３、７、１０、１４及び２１日後に採血を行い、血清の総コレステロールを測定した。また、投与開始２１日後に血清ＨＤＬコレステロールと血清中性脂質を測定した。測定は、コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬコレステロールテストワコー、トリグリセライドテストワコー（和光純薬社製）をそれぞれの使用説明書に従って使用して行った。非ＨＤＬコレステロール値は、総コレステロール−ＨＤＬコレステロールの値を算出して求めた。動脈硬化指数は、（総コレステロール−ＨＤＬコレステロール）／ＨＤＬコレステロールの値を算出して求めた。血清総コレステロールの測定結果を表８に、非ＨＤＬコレステロールの測定結果を表９に、血清トリグリセライドの測定結果を表１０に、動脈硬化指数の測定結果を表１１に、それぞれ示す。

表８に示すように、トマトシドＡを６０重量％含む調製物を混餌した試験群３及び試験群４の血清総コレステロールは、対照群１及び大豆サポニンを混餌した試験群２に比べて低い値を示した。
表９に示すように、非ＨＤＬコレステロール値についても試験群３及び試験群４が対照群１及び試験群２に比べて低い値を示した。なお、表９の結果から、大豆サポニンの投与（試験群２）は非ＨＤＬコレステロール量に影響を及ぼさなかったと考えられた。
表１０に示すように、血清中性脂質についても試験群３及び試験群４が対照群１及び試験群２に比べて低い値を示した。
さらに表１１に示すように、動脈硬化指数についても、試験群３及び試験群４が、対照群１と比べて有意に低い値を示し、試験群２と比べても低い値を示した。

これらの結果から、トマトシドＡは、コレステロール負荷による血中脂質濃度の上昇を抑制する作用を有し、さらにこの作用に伴い、動脈硬化指数低下作用（動脈硬化のリスクを軽減する作用）も有することが明らかとなった。また、その作用は、従来コレステロール低下作用が知られる大豆サポニンと比較して非常に高いことが明らかになった。

［実施例５］
（トマトシドＡ及び／又はトマトジュース組成物のコレステロール吸着能）
ｉｎ ｖｉｔｒｏの系でトマトシドＡとトマトジュースの組成物によるコレステロール吸着能を測定した。実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含有する調製物、及び市販の食塩無添加トマトジュースを凍結乾燥して得たトマトジュース乾燥粉末を、それぞれ表１２に示す用量でｐＨ７．５のリン酸緩衝液１ｍＬに分散させ、これに０．５重量％コレステロール（特級コレステロール、和光純薬工業製）のエタノール溶液０．０１ｍＬを添加し、良く撹拌した後、３７℃で２時間加温した。これを１０，０００回転、１５分間遠心分離し、上清液のコレステロール含量を測定してトマトシドＡ調製物のコレステロール吸着能を求めた。
対照としてｐＨ７．５リン酸緩衝液を用いた。結果を表１２に併記した。
トマトシドＡ調製物とトマトジュース乾燥粉末を混合した場合に、トマトシドＡ調製物単独の場合と比較してコレステロール吸着活性が向上した。トマトジュース乾燥粉末に含まれる、食物繊維(セルロース、ペクチン)や、トマトシドＡとは異なるサポニンが、トマトシドＡと同時にコレステロールを吸着したと考えられた。

［実施例６］
（トマトシドＡ及び／又はトマトジュース組成物のマウスへの長期投与）
ＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）にコレステロール(特級コレステロール、和光純薬工業製)とコール酸ナトリウム(コール酸ナトリウム、和光純薬工業製)を添加した試験飼料を以下の表１３に示す通り作製し、さらに実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含む調製物、及び市販の食塩無添加トマトジュースを凍結乾燥して得たトマトジュース乾燥粉末を、それぞれ表１３に示す用量で添加した混餌食をマウスに投与したときの血中脂質に対する効果を確認した。

５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（日本クレア社生産）２４匹を、ＭＦ粉末飼料で１週間予備飼育した後、各群５匹の対照群５及び試験群６〜８の４群に分けた。対照群５及び試験群６〜８をそれぞれ表１３に示した試験飼料で２週間飼育した。飼料は自由摂取により投与した。試験飼料の投与開始前（０日後）及び開始後３、９及び１４日後に採血を行い、血清の総コレステロールを測定した。測定はコレステロールＥテストワコー（和光純薬社製）を用いて行った。

血清総コレステロールの測定結果を表１４に示す。トマトシドＡを６０重量％含む調製物を０．０３４重量％（トマトシドＡに換算して０．０２重量％）混餌した試験群６、及びトマトジュース乾燥粉末を５重量％混餌した試験群７の血清総コレステロールは、対照群５に比べて低い値を示した。また、トマトシドＡを６０重量％含む調製物を０．０３４重量％（トマトシドＡに換算して０．０２重量％）とトマトジュース凍結粉末５重量％を同時に混餌した試験群８の血清総コレステロールは、投与開始９及び１４日後のいずれにおいても、対照群５、試験群６及び７に比べて低い値を示した。トマトシドＡ調製物及びトマトジュース凍結粉末は、コレステロール負荷による血中脂質濃度の上昇を抑制する作用を有し、トマトシドＡ調製物とトマトジュース凍結粉末を混合して投与することにより、トマトシドＡ調製物単独及びトマトジュース乾燥粉末単独の場合と比べて強力な作用を示すことが明らかとなった。

［実施例７］
（マウスへのトマトシドＡ含有組成物の長期投与２）
ＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）にコレステロール（特級コレステロール、和光純薬工業製）とコール酸ナトリウム（コール酸ナトリウム、和光純薬工業製）を添加した試験飼料を以下の表１５に記載の配合で作製してマウスに投与して、高コレステロール血症マウスとし、続いて実施例１−５で得られたトマトシドＡを６０重量％含む調製物を試験飼料に添加した混餌食（トマトシドＡに換算して０．１重量％配合）をマウスに投与したときの血中脂質濃度に対する効果を確認した。

６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（日本クレア社生産）１５匹を、ＭＦ粉末飼料で３日間予備飼育した後、表１５に示した高コレステロール試験飼料で１週間飼育して、高コレステロール血症モデルマウスを作製した。このマウスを一群当たりの平均血清コレステロールが均一になるように１群５匹の対照群９、対照群１０及び試験群１１に分け、各群についてそれぞれ表１６に示した試験飼料で３週間飼育した。飼料は自由摂取により投与した。

試験飼料の投与開始前（０日後）並びに開始後７、１４及び２１日後に採血を行い、血清の総コレステロールを測定した。また、投与開始０及び２１日後に血清ＨＤＬコレステロールを測定した。投与開始２１日後に各マウスの肝臓を摘出して、肝臓中の総脂質をＦｏｌｃｈ法により抽出し、総コレステロールを測定した。測定は、コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬコレステロールテストワコー及びトリグリセライドＥテストワコー（和光純薬社製）をそれぞれの使用説明書に従って使用して行った。非ＨＤＬコレステロール値は、総コレステロール−ＨＤＬコレステロールの値を算出して求めた。動脈硬化指数は、（総コレステロール−ＨＤＬコレステロール）／ＨＤＬコレステロールの値を算出して求めた。血清総コレステロールの測定結果を表１７に、非ＨＤＬコレステロールの測定結果を表１８に、動脈硬化指数の測定結果を表１９に、肝臓総コレステロールの測定結果を表２０に、それぞれ示す。

表１７に示すように、トマトシドＡを６０重量％含む調製物を混餌した試験群１１の血清総コレステロールは、投与開始前の値より低下し、投与開始２１日後には有意に低い値を示した。また、高コレステロール飼料から通常飼料に移行させた対照群１０の血清コレステロールと同等の値となった。表１８に示すように、投与開始２１日後の非ＨＤＬコレステロール値は、対照群１０及び試験群１１が、対照群９に比べて有意に低い値を示した。また、総コレステロールに占めるＨＤＬコレステロール比は、対照群１０及び試験群１１が、対照群９に比べて高い値を示した。さらに表１９に示すように、動脈硬化指数も、対照群１０及び試験群１１が、対照群９と比べて有意に低い値であった。

これらの結果から、トマトシドＡは、コレステロール負荷によって引き起こされた高コレステロール血症を改善し、動脈硬化のリスクを軽減する作用を有することが明らかとなった。

表２０に示すように、トマトシドＡを６０重量％含む調製物を混餌した試験群１１の肝中コレステロール蓄積量は、対照群９と比較して有意に低い値を示した。この結果から、トマトシドＡは、コレステロール負荷による肝臓へのコレステロールの蓄積を予防する作用を有することが明らかとなった。

［実施例８］
（トマトシドＡを含有するトマト加工飲食品の製造）
以下にトマトシドＡを原料の一部として使用するトマト加工飲食品の製造例を示す。

製造例１．トマトジュース
シーズンパックトマトジュースの製造方法には、トマト洗浄、選別、破砕、加熱、搾汁、調合、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程があり、この調合工程で、搾汁したトマトジュースにトマトシドＡを添加して調合し、有塩の場合のみ食塩が加えられ、窒素ガスを混合して減圧脱気して、溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、１２１℃、約１分の加熱殺菌をして、９０℃まで冷却され、缶に充填される。また、濃縮還元品の製造法は、開けだし工程で、トマト濃縮物を開けだし、規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈する。その後、トマトシドＡを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。

２．野菜ミックスジュース
搾汁したトマトジュース、あるいは、トマト濃縮物を規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈して得たトマトジュースに、各種野菜汁及びトマトシドＡを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。

３．トマトソース
以下の表に示す全原材料を混合して、窒素ガスを混合して減圧脱気して溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、２号缶に充填し、１１０℃、３０分のレトルト殺菌をする。

本発明のトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を有効成分とする組成物は、高コレステロール血症又は高トリグリセリド血症のような脂質異常症及びこれに関連する疾患を予防又は治療するために利用することができる。また、コレステロール上昇抑制剤、トリグリセリド上昇抑制剤及び肝中コレステロール蓄積抑制剤として利用することができる。本発明は、医薬品、飲食品等の分野で有用である。該組成物及び剤を食品（特にトマト加工飲食品）に添加することにより、風味が損なわれず摂取しやすく、トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を単独で摂取するよりも効能のよりすぐれた飲食品となり得るため、対象者への負担なく該組成物及び剤を継続摂取することが可能となる。さらに、本発明によれば、該組成物及び剤をトマト搾汁粕より容易に効率よく分離することができるため、廃棄物の有効利用が可能である。

本出願は、２０１１年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１１−３４７５０号に基づく優先権を主張するものであり、この内容はここに参照として組み込まれる。

Claims (2)

1. トマト種子を含むトマト果実由来物を、抽出溶媒として７０体積％のエタノール溶媒を用いて抽出する工程を含む、トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩の抽出方法であって、
   前記エタノール溶媒が、水とエタノールの混合物であり、
   前記抽出工程が、５℃以上４０℃以下の温度で１時間以上行われる、方法。
2. 前記抽出工程が、１時間以上２時間以下行われる、請求項１に記載の方法。