JP5938690B2 - 異常型ミトコンドリアｄｎａ、関連融合転写物およびそのハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents

Description

本発明は、ミトコンドリアゲノム解析の分野に関する。一態様では、本発明は、ミトコンドリアゲノム融合転写物およびそれとハイブリダイズするプローブの同定および使用に関する。

（ミトコンドリアゲノム）
ミトコンドリアゲノムは、核酸の小規模ではあるが重要な配列である。ミトコンドリアＤＮＡまたは「ｍｔＤＮＡ」は、３３億ｂｐという莫大な核ゲノム（ハプロイド）と対比して、１６，５６９核酸塩基対（ｂｐ）（Anderson et al., 1981；Andrews et al., 1999）の小ゲノムを含む。その遺伝子補体は、その核細胞メイトより実質的に小さい（０．０００５％）。しかしながら、個々の細胞は、特定の細胞機能によって、およそ１０３〜１０４個のミトコンドリアを保有する（Singh and Modica-Napolitano 2002）。情報伝達または化学的シグナル伝達は、一般的に、核およびミトコンドリアゲノム間で起こる（Sherratt et al., 1997）。さらに、特定の核構成成分がミトコンドリア配列の維持および安定性に関与する（Croteau et al., 1999）。一旦受精が起きると、卵細胞内のミトコンドリアのクローン拡大のため、所定の個体におけるｍｔＤＮＡゲノムは全て同一である。しかしながら、突然変異誘発性事象は、体細胞突然変異として反映される配列多様性を誘導し得る。これらの突然変異は、異形成として知られている状態で身体全体の異なる組織中に蓄積し得る。

（ミトコンドリアプロテオーム）
約３，０００個の核遺伝子がミトコンドリアを構築し、操作し、維持するために必要とされるが、ミトコンドリアゲノムによりコードされるのはこれらのうちの３７個のみであって、このことは、ミトコンドリアが核遺伝子座に重度に依存していることを示す。ミトコンドリアゲノムは、正しい翻訳を保証する、２つのｒＲＮＡと２２のｔＲＮＡを含めた２４の遺伝子の補体、ならびに電子伝達に不可欠である残り１３の遺伝子をコードする（図１参照）。ミトコンドリアゲノムは、ミトコンドリアゲノムにより供給される１３のポリペプチドのほかに、この生命機能に必要な酸化および還元反応を成し遂げるために７０の核コード化タンパク質に依存する。核およびミトコンドリアタンパク質はともに、ミトコンドリア内膜を及ぶ複合体を形成し、細胞代謝に必要とされる化学燃料であるアデノシン三リン酸またはＡＴＰの８０〜９０％を集合的に生成する。エネルギー産生のほかに、ミトコンドリアは、同様に他の代謝経路においても中心的役割を果たす。ミトコンドリアの重要な機能は、細胞死またはアポトーシスの媒介である（Green and Kroemer, 2005参照）。本質的に、ミトコンドリア外膜を、あるいはさらに、同様にミトコンドリア内膜を透過するシグナル経路が存在する。特定のミトコンドリアタンパク質が細胞基質に放出される場合、不可逆的細胞死が始動される。この工程は、いくつかのミトコンドリアタンパク質が有する多機能的役割を強調する。これらのマルチタスク型タンパク質は、同様に、代替的機能を有し得る他のミトコンドリアタンパク質が存在する、ということを示唆する。

（ミトコンドリア融合トランスクリプトーム）
ミトコンドリアゲノムは、それが環状の無イントロンＤＮＡ分子であるという点で異常型である。ゲノムは、特定長の配列と側面を接する反復モチーフが点在する。これらの反復間の配列は、十分に理解されていない状況下で欠失しがちである。ミトコンドリアゲノム中の反復の数を考えると、多数の考え得る欠失が存在する。最も良く知られた例は、４９７７の「共通欠失」である。この欠失は、いくつかの名を挙げられた症状および疾患と関連付けられてきており、老化に伴い頻度を増大すると考えられる（Dai et al., 2004；Ro et al., 2003；Barron et al., 2001；Lewis et al., 2000；Muller-Hocker, 1998；Porteous et al., 1998）（図４）。ミトコンドリアゲノムの分野における最新の見解は、ミトコンドリア欠失が、活性酸素種およびＵＶＲのような作用物質によるミトコンドリアゲノムに対する損傷の単なる有害副産物である、というものである（Krishnan et al 2008, Nature Genetics）。さらに、高レベルのｍｔＤＮＡ欠失は、細胞呼吸に必要な遺伝子配列を失う結果として、ＡＴＰの形態でエネルギーを産生する細胞の能力に重篤な結果を及ぼし得ると認識されているが、しかし、これらの欠失ミトコンドリア分子が下流経路の一構成成分であり、意図された機能的役割を有し、そしておそらくは出願人により予測されてきたようにミトコンドリアの認識遺伝子の代替的天然形態としてより適切である、とは予測されない。

ｍｔＤＮＡの配列動力学は、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡにおける突然変異は、しばしば、疾患発症の予備的指標である。例えば、ミトコンドリアゲノムにおける突然変異は前立腺中の腫瘍病巣の特徴である、ということが実証されている。この傾向は、腫瘍組織に隣接したおよび離れた正常に見える組織の両方にも広がる（Parr et al. 2006）。これは、ミトコンドリア突然変異が悪性形質転換経路において早期に起きる、ということを示唆する。

例えば、３．４ｋｂのミトコンドリア欠失の頻度は、良性前立腺組織と悪性前立腺組織とを区別するのに優れた有用性を有する（Maki et al. 2008）。

ミトコンドリア融合転写物は、最初に大豆で（Morgens et al 1984）、その後、稀な神経筋障害であるカーンズ・セイアー症候群を有する２名の患者（Nakase et al 1990）で、文献に以前に報告されている。重要であるのは、これらの転写物が如何なるヒト癌との関連を有することも見出されなかった（またはそれに関して研究されていなかった）ことである。

本発明は、異常型ミトコンドリアＤＮＡ、関連融合転写物およびそのハイブリダイゼーションプローブを提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、癌に関連した単離ミトコンドリア融合転写物が提供される。

本発明の一態様によれば、上記の融合転写物に対応し、配列番号３４〜４９および５２のいずれか１つで記述されるような配列を有するミトコンドリア融合タンパク質が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の融合転写物をコードする単離ｍｔＤＮＡが提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明のミトコンドリア融合転写物またはｍｔＤＮＡの少なくとも一部と相補的な核酸配列を有するハイブリダイゼーションプローブが提供される。

本発明の別の態様によれば、哺乳類における癌の検出方法であって、本発明のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的である核酸配列を有する少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブで哺乳類からの組織試料をハイブリダイズすることにより癌に関連した少なくとも１つのミトコンドリア融合転写物の存在に関して上記試料を検定することを包含する方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、哺乳類における癌の検出方法であって、本発明のｍｔＤＮＡの少なくとも一部と相補的である核酸配列を有する少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブで哺乳類からの組織試料をハイブリダイズすることにより癌に関連した少なくとも１つの異常型ｍｔＤＮＡの存在に関して上記試料を検定することを包含する方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、哺乳類における癌の存在を検出するための検定の実行用キットであって、本発明の融合転写物またはｍｔＤＮＡの少なくとも一部と相補的である少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含むキットが提供される。

本発明の別の態様によれば、癌に関連したものを同定するための１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリアＤＮＡを有するマイクロアレイからなるスクリーニングツールが提供される。

本発明の別の態様によれば、癌に関連したものを同定するためのミトコンドリア融合転写物に対応する１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリアＤＮＡを有するマイクロアレイからなるスクリーニングツールが提供される。

本発明の別の態様によれば、癌に関連したものを同定するための１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリア融合転写物を有する多重分枝ＤＮＡ検定からなるスクリーニングツールが提供される。

本発明の別の態様によれば、癌に関連したものを同定するためのミトコンドリア融合転写物に対応する１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリアＤＮＡを有する多重分枝ＤＮＡ検定からなるスクリーニングツールが提供される。

ミトコンドリアコード遺伝子を示す。 ３．４ｋｂ欠失の損失により引き起こされる前立腺試料におけるポリアデニル化融合転写物を示す。 ４９７７ｋｂ共通欠失の損失により引き起こされる前立腺試料におけるポリアデニル化融合転写物を示す。 ｍｔゲノムからの３．４ｋｂセグメントの損失により惹起される乳房試料におけるポリアデニル化融合転写物を示す。 図５ａおよび５ｂは、遺伝子のスプライシングの前後のミトコンドリアＤＮＡ領域の一例を示す。 図６ａ〜６ｇは、結腸直腸癌腫瘍の同定における本発明の転写物２、３、８、９、１０、１１および１２に関する結果を示す。 図７ａ〜７ｄは、肺癌腫瘍の同定における本発明の転写物６、８、１０および２０に関する結果を示す。 図８ａ〜８ｇは、黒色腫の同定における本発明の転写物６、１０、１１、１４、１５、１６および２０に関する結果を示す。 図９ａ〜９ｈは、卵巣癌の同定における本発明の転写物１、２、３、６、１１、１２、１５および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。 精巣癌の同定における本発明の転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０に関する結果を示す。

添付の図面を参照しながら、単なる例として本発明の実施形態をここで説明する。

本発明は、癌を予測し、診断および／またはモニタリングするのに有用な新規のミトコンドリア融合転写物および親突然変異化ｍｔＤＮＡ分子を提供する。本発明はさらに、融合転写物および関連ｍｔＤＮＡ分子の検出のためのハイブリダイゼーションプローブ、このようなプローブの使用を提供する。

〔定義〕
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書中で用いる場合、「異常」または「突然変異」は、融合転写物を生じる野生型ミトコンドリアＤＮＡにおける任意の修飾を包含し、例としては、挿入、転座、欠失、重複、組換え、再配列またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で定義される場合、「生物学的試料」は、当該分子が得られる細胞を含有する組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は、前立腺、乳房、結腸直腸、肺および皮膚のような組織に、あるいは血液、唾液、脳脊髄液、痰、尿、粘液、滑液、腹水、羊水等に由来し得る。生物学的試料は、外科検体または生検検体であり得る。生物学的試料は、供給源から得られる場合に直接的に、または試料の特性を修飾するための前処理後に用いられ得る。したがって、生物学的試料は、例えば、血液から血漿または血清を調製し、細胞を崩壊し、液体を濃縮し、妨害成分を不活性化し、試薬を付加するなどして、使用前に前処理され得る。

「連続」転写物は、両方のスプライスされた遺伝子の初めから末端まで、リーディングフレームを保持する融合転写物である。「末端」転写物は、第二スプライス化遺伝子の元の終止コドンの前に未熟終止コドンを生じる融合転写物である。

本明細書中で用いる場合、「ミトコンドリアＤＮＡ」または「ｍｔＤＮＡ」は、ミトコンドリア中に存在するＤＮＡである。

本明細書中で用いる場合、「ミトコンドリア融合転写物」または「融合転写物」という表現は、突然変異化ミトコンドリアＤＮＡ配列の転写の結果として産生されるＲＮＡ転写産物を指し、この場合、このような突然変異はミトコンドリア欠失およびその他の大規模ミトコンドリアＤＮＡ再配列を含み得る。

〔コンピューター解析および配列ターゲッティング〕
上記で考察したように、ミトコンドリア融合転写物は、大豆（Morgens et al 1984）、および稀な神経筋障害に罹患しているヒト（Nakase et al 1990）で、報告されている。しかしながら、ヒト癌と関連した融合転写物は記載されていない。

癌に関連したヒトミトコンドリアゲノムの大規模欠失のマッピングから得られた知識、高頻度のこれらの欠失についての観察、ならびに転写的に活性ナ突然変異化ｍｔＤＮＡ分子についての別の生物体および別の疾患型における証拠を用いて、このような欠失は、それが癌と関連する場合、ＤＮＡ分子、ならびに損傷および修復工程より以上に重要性を有し得る、と出願人は仮説を立てた。この仮説を試験するために、ミトコンドリアゲノムのコンピューター解析を、特に反復素子に関して実行し、これは、多数の考え得る欠失部位を示唆した。非隣接または非タンデム位置を有するミトコンドリア配列中の独特の反復を同定するこの初期工程後、次いで、フィルターを適用して、ＤＮＡ分子における欠失事象の開始時に、再閉環または再結紮してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する融合ＤＮＡ配列を産生する反復を同定した。次に、１)それらがヒトの自然の生物学的状態で存在したか、ならびに２)それらが悪性疾患との関連性を有したか否かを調べるためのターゲッティングのために、１８分子のサブセットを選択した。これらの検査からの結果を、本明細書で後述する。

〔ゲノム突然変異〕
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）動力学は、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡにおける突然変異は、しばしば、疾患発症の予備的指標であり、疾患開始に関連した危険因子を示すバイオマーカーとして振舞う。本発明によれば、ミトコンドリアゲノムにおける大規模再配列突然変異は、癌に関連した融合転写物の生成を生じる。したがって、このような転写物をコードするｍｔＤＮＡならびに癌の検出、診断およびモニタリングのためにそれに向けられるプローブの使用が提供される。

本発明の分子に用いるためのｍｔＤＮＡ分子は、天然突然変異体の単離により得られ得るし、あるいは本明細書中に記載される融合転写物のいずれかの相補的配列に基づき得る、と当業者は理解する。例示的ｍｔＤＮＡ配列および融合転写物は、出願人の米国優先権出願第６１／０４０，６１６号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。

（突然変異体ゲノム配列の検出）
本発明による突然変異体ｍｔＤＮＡ配列は、融合転写物の生成を引き起こす任意の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、挿入、転座、欠失、重複、組換え、再配列またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。修飾または変化はわずか２〜３塩基から数キロ塩基までサイズを大きく変え得るし、好ましくは修飾は、かなり多くの欠失またはその他の大規模ゲノム異常を生じる。

このような突然変異の存在を検出するためのＤＮＡの抽出は、当該技術分野で知られた方法を用いて行われ、その後、ミトコンドリアゲノムの全てのまたは１つの領域が増幅され、そして例としては、Current Protocols in Molecular Biologyに記載されたようなミトコンドリアゲノムのシーケンシングが挙げられる。代替的には、粗製組織ホモジネートが、当該特定断片の増幅を要しない技術と同様に用いられ得る。

突然変異の検出段階は、当業者に既知であるように、任意の技法から選択され得る。例えば、ｍｔＤＮＡの分析は、分枝ＤＮＡによる標的の選択、ｍｔＤＮＡのシーケンシング、ＰＣＲ、サザン、ノーザン、ウエスタン、サウス−ウエスタンブロットハイブリダイゼーションによるｍｔＤＮＡの増幅、ＨＰＬＣ変性、マイクロアレイ、バイオチップまたは遺伝子チップとのハイブリダイゼーション、分子マーカー分析、バイオセンサー、融解温度プロファイリングまたは上記のいずれかの組合せを包含し得る。

ミトコンドリアＤＮＡをシーケンシングするための任意の適切な手段が用いられ得る。好ましくは、ｍｔＤＮＡは、シーケンシングの前にＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲの方法は当該技術分野でよく知られており、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335に記載されたように実施され得る。ＰＣＲ産物は、直接シーケンシングされルカ、またはベクター中でクローン化され、これが次に、細菌宿主中に入れられる。ＤＮＡシーケンシング方法の例は、Brumley, R.L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19: 4121-4126およびLuckey, J.A., et al, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172に見出される。ＰＣＲとｍｔＤＮＡのシーケンシングの併用は、Hopgood, R, et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13: 82-92およびTanaka, M. et al, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421に記載されている。

種々のプライマーを調製するための適切な配列の選択方法も、当該技術分野で知られている。例えば、プライマーは、市販の装備、例えばApplied Biosystems USA Inc. （Foster City, California）、DuPont,（Wilmington, Del.）、またはMilligen（Bedford, Mass.）から入手可能なものを用いた慣用的固相合成を用いて調製され得る。

本発明の一態様によれば、候補ゲノム配列を確定するために、配列欠失の接合点が先ず同定される。配列欠失は、主に、５’および３’末端で欠失されるべき配列と側面を接する直接および間接的なそれぞれの素子により同定される。ゲノムからのヌクレオチドの一片の除去と、その後のゲノムの結紮は、新規の接合点の作製を引き起こす。

接合点の同定時に、スプライスされた遺伝子を同定するために、接合点と側面を接する遺伝子のヌクレオチドが確定される。典型的には、スプライス化遺伝子は、第一の遺伝子からの開始コドンと第二の遺伝子の終止コドンを含み、そして連続転写物、すなわち両スプライス化遺伝子の初めから末端まで、リーディングフレームを保持するものとして発現され得る。本明細書中に開示される配列番号２および配列番号１７により立証されるように、遺伝子配列内に含入される代替的開始または終止コドンが用いられ得る、ということも可能である。再配列化配列がスプライス部位で再連結される場合に、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することが発見されたいくつかの既知のミトコンドリア欠失を、表１に示す。

実験室で存在することが立証されている本発明の方法に用いるためのｍｔＤＮＡ分子の例を、以下に示す。これらのｍｔＤＮＡは、既知のミトコンドリアゲノム（配列番号１）の修飾を基礎にしており、融合または「ＦＵＳ」という名称を割り当てられており、この場合、Ａ：Ｂは第一スプライス化遺伝子の最終ミトコンドリアヌクレオチドと第二スプライス化遺伝子の第一ミトコンドリアヌクレオチドとの間の接合点を表わす。スプライス化遺伝子の同定は、括弧内に示され、その後に対応する配列識別名が示される。以下で提示される場合、（ＡｌｔＭｅｔ）および（ＯｒｉｇＭｅｔ）は、それぞれ、代替的および元の翻訳開始部位を指す。

ＦＵＳ８４６９：１３４４７（ＡｌｔＭｅｔ）（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット８〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット）（配列番号２）
ＦＵＳ１０７４４：１４１２４（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号３）
ＦＵＳ７９７４：１５４９６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＩＩ）〜シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号４）
ＦＵＳ７９９２：１５７３０（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＩＩ）〜シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号５）
ＦＵＳ８２１０：１５３３９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＩＩ）〜シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号６）
ＦＵＳ８８２８：１４８９６（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）〜シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号７）
ＦＵＳ１０６６５：１４８５６（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ（ＮＤ４Ｌ）〜シトクロムｂ（Ｃｙｔｂ））（配列番号８）
ＦＵＳ６０７５：１３７９９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号９）
ＦＵＳ６３２５：１３９８９（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１０）
ＦＵＳ７４３８：１３４７６（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１１）
ＦＵＳ７７７５：１３５３２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＩＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１２）
ＦＵＳ８２１３：１３９９１（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＩＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１３）
ＦＵＳ９１９１：１２９０９（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１４）
ＦＵＳ９５７４：１２９７２（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＩＩ（ＣＯＩＩＩ）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１５）
ＦＵＳ１０３６７：１２８２９（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３（ＮＤ３）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号１６）
ＦＵＳ８４６９：１３４４７（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット８〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット）（配列番号１７）
ＦＵＳ９１４４：１３８１６（ＡＴＰシンターゼＦ０サブユニット６（ＡＴＰアーゼ６）〜ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５））（配列番号５１）。

本発明は、癌を予測し、診断し、および／またはモニタリングするためのこれらの配列の変異体または断片の使用も提供する。

「変異体」は、本明細書中で用いる場合、本発明のｍｔＤＮＡ配列とは異なるが、しかしその不可欠な特性を保持する核酸を指す。一般的に、変異体は全体的に非常によく似ており、多くの領域では、選択ｍｔＤＮＡ配列と同一である。具体的には、本発明の変異体は、スプライス化遺伝子の接合点のヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、さらに、それに隣接する１つ以上のヌクレオチドを含み得る。本発明の一実施形態では、変異体配列は、本発明のｍｔＤＮＡまたはそれに対する相補的鎖のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

本発明において、「断片」は、開示されたゲノム配列中に含入されるものまたはそれと相補的な鎖の一部である短い核酸配列を指す。この部分は、スプライス化遺伝子の接合点を含むヌクレオチドのうちの少なくとも１つを包含し、さらに、それに隣接する１つ以上のヌクレオチドを含み得る。本発明の断片は、好ましくは、長さが少なくとも約１５ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも約１５０ｎｔである。例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」の断片は、上記のｍｔＤＮＡ配列のうちのいずれか１つの２０以上の連続塩基を含むよう意図される。この状況において、「約」は、特に列挙された値、いずれかの末端または両端で数（５、４、３、２または１）ヌクレオチド大きいか小さい値を含む。これらの断片は、例えば、本明細書中で考察されるような診断プローブおよびプライマー（これらに限定されない）としての用途を有する。もちろん、より大きな断片（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）も意図される。

したがって、本発明の具体的実施形態では、ｍｔＤＮＡ配列は、以下のものからなる群から選択される：
配列番号２（ＦＵＳ８４６９：１３４４７；ＡｌｔＭｅｔ）
配列番号３（ＦＵＳ１０７４４：１４１２４）
配列番号４（ＦＵＳ７９７４：１５４９６）
配列番号５（ＦＵＳ７９９２：１５７３０）
配列番号６（ＦＵＳ８２１０：１５３３９）
配列番号７（ＦＵＳ８８２８：１４８９６）
配列番号８（ＦＵＳ１０６６５：１４８５６）
配列番号９（ＦＵＳ６０７５：１３７９９）
配列番号１０（ＦＵＳ６３２５：１３９８９）
配列番号１１（ＦＵＳ７４３８：１３４７６）
配列番号１２（ＦＵＳ７７７５：１３５３２）
配列番号１３（ＦＵＳ８２１３：１３９９１）
配列番号１４（ＦＵＳ９１９１：１２９０９）
配列番号１５（ＦＵＳ９５７４：１２９７２）
配列番号１６（ＦＵＳ１０３６７：１２８２９）
配列番号１７（ＦＵＳ８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号５１（ＦＵＳ９１４４：１３８１６）、ならびに
その断片または変異体。

（プローブ）
本発明の別の態様は、本発明の異常型ｍｔＤＮＡ配列を認識し得るハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本明細書中で用いる場合、「プローブ」という用語は、標的領域中の配列とプローブ中の少なくとも１つの配列の相補性のため、標的核酸中の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、当該技術分野で既知の方法に従って標識され得る。

特定の疾患に関連する異常型ｍｔＤＮＡが一旦同定されれば、ｍｔＤＮＡと、例えばオリゴヌクレオチドの一アレイとのハイブリダイゼーションは特定突然変異を同定するために用いられ得るが、しかしながら、ハイブリダイゼーションの任意の既知の方法が用いられ得る。

本発明のプライマーを用いる場合、プローブは、本発明の例示的ｍｔＤＮＡ融合分子に対して直接的に、あるいはその断片または変異体に、生成され得る。例えば、配列番号２〜１７および５１で記述される配列、および表１に開示される配列は、当該融合配列を含む核酸配列を検出するプライマーまたはプローブを設計するために用いられ得る。当業者により理解されるように、これらの核酸分子とハイブリダイズするプライマーまたはプローブは、高緊縮ハイブリダイゼーション条件下または低緊縮条件下でそのようにし得るが、このような条件は当業者に既知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1-6.3.6に見出され得る。

本発明の具体的実施形態では、本発明のプローブは、スプライス化遺伝子の接合点を含む異常型ｍｔＤＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を含有する。この部分は、接合点Ａ：Ｂに関与するヌクレオチドのうちの少なくとも１つを包含し、さらに、それに隣接する１つ以上のヌクレオチドを含み得る。これに関しては、本発明は、接合点Ａ：Ｂに関与するかおよび／または隣接するヌクレオチドを用いてｍｔＤＮＡ分子を選択する任意の適切な標的機序を含む。

当該技術分野で知られた種々の型のプローブが、本発明により意図される。例えば、プローブは、標的ヌクレオチド配列とのその結合が一般的ＤＮＡ結合染料、例えば臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド等を用いて検出され得る。代替的には、プローブは、１つ以上の検出可能標識を組み入れ得る。検出可能標識は、その特性または特質が直接または間接的に検出され得る、そしてその標的配列とハイブリダイズするプローブの能力が影響を及ぼされないよう選択される分子または部分である。核酸配列の標識方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ausubel et al., (1997 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York参照）。

本発明のプローブとともに用いるのに適した標識としては、直接的に検出され得るもの、例えば放射性同位元素、蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微小粒子等が挙げられる。直接的に検出可能な標識は、標識の検出を可能にするために、基質、トリガー試薬、光等のような付加的構成成分を要し得る、と当業者は理解する。本発明は、間接的に検出される標識の使用も包含する。

本発明のプローブは、好ましくは長さが少なくとも約１５ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも約１５０ｎｔである。例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のプローブは、本発明のｍｔＤＮＡ配列と相補的である２０以上の連続塩基を含むよう意図される。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）も選択可能であり得る。

本発明のプローブは、生物学的試料中の核酸分子ともハイブリダイズし、それにより、本発明の方法を可能にする。したがって、本発明の一態様では、癌の検出に用いるためのハイブリダイゼーションプローブを提供し、この場合、プローブは異常型ｍｔＤＮＡ分子の少なくとも一部と相補的である。別の態様では、本発明は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌および／または黒色腫皮膚癌の検出のためのプローブ、ならびにこのようなプローブの使用（または使用方法）を提供する。

（検定）
生物学的試料中の異常型ｍｔＤＮＡのレベルの測定は、被験者における１つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングするための方法であって、１つ以上の生物学的試料を得ること、試料からｍｔＤＮＡを抽出すること、ならびに以下の：試料中の１つ以上の異常型ｍｔＤＮＡの量を定量し、そして検出された量を参照値と比較することにより異常型ｍｔＤＮＡに関して試料を検定することからなる方法を包含する。当業者に理解されるように、参照値は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、１つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、１つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および／または長期間に亘って採取された１つ以上の生物学的試料から収集されたｍｔＤＮＡデータと関連し得る。

一態様では、本発明は、哺乳類における癌の検出方法であって、上記の異常型ミトコンドリアＤＮＡの存在に関して、哺乳類からの組織試料を検定することを包含する方法を提供する。本発明は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブと試料をハイブリダイズすることにより、哺乳類からの組織試料を検定することを包含する方法も提供する。プローブは、本明細書中に記載されるように、本発明の突然変異体ミトコンドリアＤＮＡ配列に対して生成され得る。

別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、検定が、以下の：
ａ）少なくとも１つのプローブを相補的異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列とハイブリダイズさせるためにプローブのうちの少なくとも１つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ；
ｂ）少なくとも１つのプローブとハイブリダイズされるミトコンドリアＤＮＡの量を定量することにより、試料中の少なくとも１つの異常型ミトコンドリアＤＮＡ配列の量を定量するステップ；そして
ｃ）試料中のミトコンドリアＤＮＡの量を少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。

癌を予測し、診断し、またはモニタリングするための方法であって、下記のような診断的画像検定を含む方法も本発明に包含される。本発明の診断的検定は、高処理量法に容易に適合され得る。高処理量検定は、多数の試料を同時に処理するという利益を提供し、多数の試料をスクリーニングするために必要とされる時間を有意に低減する。したがって、本発明は、複数の試験試料中の標的ヌクレオチド配列を検出しおよび／または定量するための高処理量スクリーニングまたは検定における本発明のヌクレオチドの使用を意図する。

〔融合転写物〕
本発明はさらに、癌を予測し、診断し、および／またはモニタリングするための方法に有用な融合転写物および関連ハイブリダイゼーションプローブの同定を提供する。このような分子は、天然転写物の単離により、あるいは、本発明の方法に従って単離されるｍｔＤＮＡの組換え発現により得られる、と当業者は理解する。上記のように、このようなｍｔＤＮＡは、典型的には、第一遺伝子からの開始コドンおよび第二遺伝子の終止コドンを有するスプライス化遺伝子を含む。したがって、それらから得られる融合転写物は、スプライス化遺伝子に関連した接合点を含む。

（融合転写物の検出）
天然融合転写物は、生物学的試料から抽出され、当該技術分野で既知の任意の適切な方法に従って同定され得るし、あるいは実施例に記載される方法に従って実行され得る。本発明の一実施形態では、ポリ−Ａ尾部を有する転写物を標的にするオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、その後、標的転写物に対して意図されたプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、安定ポリアデニル化融合転写物が同定される。

以下の例示的融合転写物はこのような方法を用いて検出され、実施例に示されるような癌を予測し、診断し、および／またはモニタリングするのに有用であることが見出された。同様に、表１で同定されるＯＲＦ配列由来の融合転写物は、本発明の検定および方法に従って癌を予測し、診断し、および／またはモニタリングするのに有用であり得る。

配列番号１８（転写物１；８４６９：１３４４７；ＡｌｔＭｅｔ）
配列番号１９（転写物２；１０７４４：１４１２４）
配列番号２０（転写物３；７９７４：１５４９６）
配列番号２１（転写物４；７９９２：１５７３０）
配列番号２２（転写物５；８２１０：１５３３９）
配列番号２３（転写物６；８８２８：１４８９６）
配列番号２４（転写物７；１０６６５：１４８５６）
配列番号２５（転写物８；６０７５：１３７９９）
配列番号２６（転写物９；６３２５：１３９８９）
配列番号２７（転写物１０；７４３８：１３４７６）
配列番号２８（転写物１１；７７７５：１３５３２）
配列番号２９（転写物１２；８２１３：１３９９１）
配列番号３０（転写物１４；９１９１：１２９０９）
配列番号３１（転写物１５；９５７４：１２９７２）
配列番号３２（転写物１６；１０３６７：１２８２９）
配列番号３３（転写物２０；８４６９：１３４４７；ＯｒｉｇＭｅｔ）
配列番号５０（転写物１３；９１４４：１３８１６）。

さらに、本明細書中に記載されるものと同様の特質を有する融合転写物が、臨床腫瘍学の分野に用いるために意図される。

融合転写物は、当該技術分野で知られた組換え技法によっても産生され得る。典型的には、これは、当該ｍｔＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いた適切な宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入または感染を含む）を含む。

本明細書中で同定される融合転写物の変異体または断片も提供される。このような配列は、ゲノム変異体および断片に関して、または熟練技術者により適切に確定されるような、上記のサイズ制限および同一性％に密着し得る。

さらに、転写物１〜１６および２０に対応する推定タンパク質配列を、以下に列挙する。仮説的融合タンパク質をコードするこれらの配列は、本発明のさらなる一実施形態として提供される。

配列番号３４（転写物１）
配列番号３５（転写物２）
配列番号３６（転写物３）
配列番号３７（転写物４）
配列番号３８（転写物５）
配列番号３９（転写物６）
配列番号４０（転写物７）
配列番号４１（転写物８）
配列番号４２（転写物９）
配列番号４３（転写物１０）
配列番号４４（転写物１１）
配列番号４５（転写物１２）
配列番号４６（転写物１４）
配列番号４７（転写物１５）
配列番号４８（転写物１６）
配列番号４９（転写物２０）
配列番号５２（転写物１３）

（プローブ）
融合転写物が一旦特性化されれば、生物学的試料中の転写物を標的にするよう、プライマーまたはプローブが開発され得る。このようなプライマーおよびプローブは、（じょうきのような）任意の既知の方法を用いて、または以下で提供される実施例に記述されるように、調製され得る。プローブは、例えば、融合転写物のために、そして試料中の転写物の存在を検出するために用いられる検出技法、例えばPanomics（商標）によるQuantiGene２．０（商標）のために生成され得る。プライマーおよびプローブは、本発明の例示的融合転写物に対して直接的に、あるいはその断片または変異体に対して生成され得る。例えば、配列番号１８〜３３および５０で記述される配列、ならびに表１に開示される配列は、当該融合配列を含む核酸配列を検出するプローブを設計するために用いられ得る。

当業者に理解されるように、本発明の融合転写物とハイブリダイズするよう設計されるプローブは、スプライス化遺伝子の接合点を発現する転写物の少なくとも一部と相補的な配列を含有する。この部分は、発現接合点と相補的なヌクレオチドのうちの少なくとも１つを包含し、さらに、それに隣接する１つ以上の相補的ヌクレオチドを含み得る。これに関しては、本発明は、スプライス化遺伝子の接合点に関与し、隣接するヌクレオチドを用いる融合転写物を選択する任意の適切なターゲッティング機序を含む。

当該技術分野で知られた種々の型のプローブおよび方法が、転写物プローブの調製のために意図される。このような型および方法は、ゲノム配列の検出に関して上記されている。本発明の転写物プローブは、好ましくは長さが少なくとも約１５ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも約１５０ｎｔである。例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のプローブは、本発明のｍｔＤＮＡ配列と相補的である２０以上の連続塩基を含むよう意図される。もちろん、より大きなプローブ（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）も選択可能であり得る。

一態様では、本発明は、癌の検出に用いるためのハイブリダイゼーションプローブであって、上記のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的であるプローブを提供する。

別の態様では、本発明は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌または黒色腫皮膚癌の検出のためのプローブ、ならびにこのようなプローブの使用（または使用方法）を提供する。

（検定）
生物学的試料中のミトコンドリア融合転写物のレベルの測定は、被験者における１つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングするための方法であって、１つ以上の生物学的試料を得ること、試料からミトコンドリアＤＮＡを抽出すること、ならびに以下の：試料中の１つ以上の融合転写物の量を定量し、そして検出された量を参照値と比較することにより融合転写物に関して試料を検定することからなる方法を提供する。当業者に理解されるように、参照値は、癌を予測し、診断し、またはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、１つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、１つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および／または長期間に亘って採取された１つ以上の生物学的試料から収集された転写物データと関連し得る。

一態様では、本発明は、哺乳類における癌の検出方法であって、ミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを用いて上記試料をハイブリダイゼーションすることにより、本発明の少なくとも１つの融合転写物の存在に関して、上記哺乳類からの組織試料を検定することを包含する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、検定が、以下の：
ａ）少なくとも１つのプローブを相補的異常型ミトコンドリア融合転写物とハイブリダイズさせるために上記プローブのうちの少なくとも１つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ；
ｂ）少なくとも１つのプローブとハイブリダイズされる転写物の量を定量することにより、試料中の少なくとも１つのミトコンドリア融合転写物の量を定量するステップ；そして
ｃ）試料中のミトコンドリア融合転写物の量を少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。

上記のように、本発明の診断的検定は、本明細書中に記載されるような診断方法およびスクリーニングツールも包含し、高処理量法に容易に適合され得る。したがって本発明は、複数の試験試料中の標的ヌクレオチド配列を検出しおよび／または定量するための高処理量スクリーニングまたは検定における本発明の融合転写物および関連プローブの使用を意図する。

〔診断方法およびスクリーニングツール〕
特定の疾患を診断士、または特定のミトコンドリア突然変異を同定するための方法およびスクリーニングツールも、本明細書中で意図される。ハイブリダイゼーションの任意の既知の方法は、プローブ／プライマーベースの技法、例えばシングルプレックスおよびマルチプレックスの両方の分枝ＤＮＡおよびｑＰＣＲ（これらに限定されない）を含めたこのような方法を実行するために用いられ得る。野生型または突然変異化領域をマッチングするオリゴヌクレオチドプローブ、および対照プローブを有するアレイ技法も、用いられ得る。市販のアレイ、例えばマイクロアレイまたは遺伝子チップが適している。これらのアレイは、スライドまたはマイクロチップ上のプローブの数千のマッチドおよび対照ペアを胃含有し、非常に迅速に全ゲノムをシーケンシングし得る。ゲノムおよびＤＮＡ配列解析におけるマイクロアレイの使用を記載する再検討論文は、オンラインで入手可能である。

所定の生物学的状態と関連する標的を同定するよう意図されたスクリーニングツールは、特定の疾患または障害に関連した核酸の特定の配列を包含し得る。したがって、本発明の一実施形態によれば、１つ以上の癌に関連したものを同定するための１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリア融合転写物を有するマイクロアレイからなるスクリーニングツールが提供される。さらなる一実施形態では、１つ以上の癌に関連したものを同定するための１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリア融合転写物を有するマルチプレックス分枝ＤＮＡ検定からなるスクリーニングツールが提供される。本発明のさらに別の実施形態では、１つ以上の癌に関連したものを同定するためのミトコンドリア融合転写物に対応する１０’ｓ、１００’ｓまたは１０００’ｓのミトコンドリアＤＮＡを有するマルチプレックス分枝ＤＮＡ検定からなるスクリーニングツールが提供される。

臨床腫瘍学の分野に有用なアプローチも、本明細書中で意図され、例としては、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、造影磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）等のような診断的画像診断技法を包含し得る。これらの診断方法は、当業者によく知られており、癌の診断および予後に有用である。

〔診断的モニタリング〕
本発明の方法はさらに、１つ以上の検定の結果に基づいたモニタリングレジメまたは療法コースを推奨する工程を包含し得る。これにより、個別化医療、例えば、患者の癌の進行をモニタリングすることによる（例えば初期またはその後の突然変異がいつ起きたかを認識することによる）癌療法、あるいは治療（例えば、突然変異が安定化された時を認識することによる）を臨床医が実施できるようになる。

進行中の配列変異の境界についての知識に関して、前癌性状態または現存癌状態を診断するために情報が用いられ得る。さらに、長期に亘って継続的試料中の異常型ｍｔＤＮＡの量を定量することにより、癌状態の進行がモニタリングされ得る。例えば、野生型からの第一組の突然変異を検出するために一時点で患者の組織を検定することにより提供されるデータが、その後の検定から提供されるデータに対して比較されて、異常性の変化がおきているか否かを確定し得る。

癌の症候をまた発症していない個体に突然変異が見出される場合、突然変異は、癌状態を発症する遺伝的感受性を示し得る。疾患に対する感受性またはその存在の診断の確定は、さらに、もしあれば、患者の家族歴における癌状態の罹患率、ならびに他の危険因子の存在、例えば環境因子への曝露、ならびに患者の細胞が別の種類の突然変異も保有するか否かに関する情報に基づいて、定性的に評価され得る。

〔生物学的試料〕
本発明は、１つ以上の生物学的試料を獲得するかまたは収集することを含む診断的試験を提供する。本発明の状況において、「生物学的試料」は、ｍｔＤＮＡおよびｍｔＲＮＡが獲得され得る細胞を含有する組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は、皮膚、肺、乳房、前立腺、神経、筋肉、心臓、胃、結腸、直腸組織等（これらに限定されない）を含めた組織から、あるいは血液、唾液、脳脊髄液、痰、尿、粘液、滑液、腹水、羊水等から得られる。生物学的試料は、癌性または非癌性組織から得られ、外科検体または生検検体（これらに限定されない）であり得る。

一試料型は、一回で（すなわち、１つより多くの癌の検出のために）検定され得る、と当業者は理解する。さらに、例えば、長時間に亘る癌のモニタリングのために、一連の収集が必要とされる場合、所定の試料が、単独で、または試験期間全体を通して採取された他の試料とともに、診断され得る。この点で、生物学的試料は、１回だけ、あるいは週２回、月１回、半年に１回または年１回といったように規則的間隔で、採取され得る。

〔キット〕
本発明は、臨床環境において癌を検出するための診断／スクリーニングキットを提供する。このようなキットは、１つ以上の試料採取手段を、本発明による１つ以上のプローブと組合せて包含し得る。

キットは、任意に、診断検定を実行するために必要とされる試薬、例えば緩衝剤、塩、検出試薬等を包含し得る。他の構成成分、例えば生物学的試料の単離および／または処理のための緩衝液および溶液も、キットに包含され得る。キットの構成成分のうちの１つ以上が凍結乾燥され得るし、キットは、さらに、凍結乾燥構成成分の再構成に適した試薬を含み得る。

適切な場合、キットは、反応容器、混合容器、ならびに試験試薬の調製を促す他の構成成分も含有し得る。キットは、任意に、紙形態またはコンピューター読取形態で提供され得る使用のための使用説明書、例えばディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等も包含し得る。

本発明の一実施形態では、癌を診断するためのキットであって、試料採取手段および本発明のハイブリダイゼーションプローブを含むキットが提供される。

本発明の種々の態様を、以下の実施例を用いた例証により記載する。本明細書中で提供される実施例は、本発明のある具体的実施形態を例証するだけのものであって、如何なる点でも本発明の範囲を限定するよう意図されない。

＜実施例１：ミトコンドリア融合転写物の検出＞
ミトコンドリア４９７７「共通欠失」、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１７１１（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）で本出願人により以前に同定された３．４ｋｂ欠失は、前立腺組織においてオリゴ−ｄＴ選択により同定されるような活性転写物を有する独特のオープンリーディングフレームを生じる（図２および３）。乳房組織試料の検査も、３．４ｋｂ欠失に起因する安定なポリアデニル化融合転写物の存在を明示する（図４）。

〔欠失転写物検出のための逆転写酵素−ＰＣＲプロトコール〕
（ＲＮＡ単離ｃＤＮＡ合成）
メーカーの使用説明書に従って、Aurum（商標）総ＲＮＡ脂肪および繊維組織キット（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、急速凍結前立腺および乳房組織試料（腫瘍に隣接する悪性および正常組織の両方）から総ＲＮＡを単離した。この実験では、ゲノムＤＮＡ夾雑は回避されるべきものであったため、当該技術分野で一般に知られているような方法を用いて、ＤＮアーゼ処理段階を包含した。ＮＤ−１０００分光光度計（NanoDrop（登録商標） technologies）で、ＲＮＡの量および質を確定した。約１００ｇの出発物質から、総ＲＮＡ濃度は、１．８９〜２．１０の２６０／２８０比で１００から１０００ｎｇ／μＬまで変化した。ＲＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬに調整し、メーカーの使用説明書に従って、ＲＴ−ＰＣＲ用のSuperScript（商標）一次鎖合成系（Invitrogen）での一次鎖ＤＮＡ合成のために、各鋳型２μＬを用いた。安定ポリアデニル化融合転写物を同定するために、ポリ−Ａ尾部を有する転写物を標的にするオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。

（ＰＣＲ）
ＤＮＡエンジンOpticon（登録商標）２連続蛍光検出系（Bio-Rad, Hercules, CA）上でのｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Green Supermix（Bio-Rad, Hercules, CA）で５μＬの各ｃＤＮＡ鋳型を用いて、実時間ＰＣＲを実施した。４９７７ｂｐ欠失をターゲッティングするプライマー対は：８４１６Ｆ ５'−ＣＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣ−３'、１３６３７Ｒ ５'−ＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＡＡＧ−３'であり、ならびに３．４ｋｂ欠失に関するものは：ＮＤ４ＬＦ ５’−ＴＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＡＴＡＴＣＣＴＣ−３’、ＮＤ５Ｒ ５’−ＴＧＴＧＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧ−３’である。反応カクテルは、以下のものを含む：２×ＳＹＢＲ（登録商標）Green Supermix（１００ｍＭのＫＣｌ、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ］）、ｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、５０単位／ｍｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、ＳＹＢＲ（登録商標）Green１、２０ｎＭのフルオロセインおよび安定剤）、２５０ｎＭの各プライマー、およびｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲサイクルパラメーターを以下に示す：（１）９５℃、２分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）５５℃（４９７７ｂｐ欠失に関して）および６３℃（３．４ｋｂ欠失に関して）、３０秒間（４）７２℃、４５秒間、（５）プレート読取、その後、工程３〜５を３９サイクル、そして４℃で最終インキュベーション。サイクル閾値および融解曲線分析のほかに、増幅産物の具体的可視化のためにアガロースゲル上で試料を移動させた（図２〜４参照）。

図２は、ミトコンドリアゲノムからの３．４ｋｂの損失により引き起こされる前立腺試料中のポリアデニル化融合転写物を示すアガロースゲルである。図２に関する凡例：Ｂ−ブランク、レーン１〜６：ｃＤＮＡ中に検出される転写物；レーン７〜１２：レーン１〜６における試料に関する無逆転写酵素（ＲＴ）対照。

図３は、４９７７ｋｂ共通欠失の損失により引き起こされる前立腺試料中のポリアデニル化融合転写物を示す。図３に関する凡例：Ｂ−ブランク、レーン１〜６：ｃＤＮＡ中に検出される転写物；レーン７〜１２：レーン１〜６における試料に関する無ＲＴ対照。

図４は、ｍｔゲノムからの３．４ｋｂの損失により引き起こされる乳房試料中のポリアデニル化融合転写物を示す。図４に関する凡例：レーン２〜８：乳房ｃＤＮＡからの転写物；レーン９：陰性（水）対照；レーン２および３における試料に関する陰性無ＲＴ対照。

これらの結果は、安定ミトコンドリア融合転写物の存在を実証する。

＜実施例２：融合産物の同定およびターゲッティング＞
３．４ｋｂ欠失のような突然変異化ミトコンドリアゲノムに起因する新規の転写物の存在を検出し、さらに実証するために、種々のハイブリダイゼーションプローブを設計した。この目的のために、定量的遺伝子発現解析用のシングルプレックス分枝ＤＮＡプラットホーム（QuantiGene 2.0（商標）、Panomics（商標））を利用した。この実施例で列挙した特定の欠失および配列は、配列番号１で列挙される全ｍｔＤＮＡゲノムに関するそれらの相対的位置に基づいている。本実施例においてプローブが設計された４つの転写物の核酸配列は、本明細書中で以下のように同定される：転写物１（配列番号１８）、転写物２（配列番号１９）、転写物３（配列番号２０）および転写物４（配列番号２１）。

３．４ｋｂミトコンドリアゲノム欠失からの連続転写物の一例は、遺伝子ＮＤ４Ｌ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ）およびＮＤ５（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５）に伴って生じる。配列番号１９に対する相補的配列を有するプローブを用いて、転写物２を検出した。それぞれの素子は、ＮＤ４Ｌ中の位置１０７４５〜１０７５４、ＮＤ５中の１４１２４〜１４１３３で生じる。

３．４ｋｂ欠失は、ＮＤ４Ｌの３’末端、全ＮＤ４遺伝子、ｔＲＮＡヒスチジン、ｔＲＮＡセリン２、ｔＲＮＡロイシン２および大多数のＮＤ５の５’末端の除去を生じて（図５ａ参照）、１０７４４（ＮＤ４Ｌ）：１４１２４（ＮＤ５）の接合点に関してＮＤ４ＬおよびＮＤ５の遺伝子スプライスを生じる（図５ｂ）。配列番号３は、上記のように検出されるＲＮＡ転写物（配列番号１９）に対する相補的ＤＮＡ配列である。

同様に、転写物１は、位置８４６９：１３４４７に関連したＡＴＰアーゼ８およびＮＤ５間の融合転写物（配列番号１８）である。転写物３および４（それぞれ配列番号２０および２１）は、それぞれヌクレオチド位置７９７４：１５４９６および７９９２：１５７３０に関連したＣＯＩＩおよびＣｙｔｂ間の融合転写物である。表３は、本実施例に用いられる種々の配列間の関係の要約を示す。表３は、検出融合転写物、ならびに検出された融合転写物と相補的なＤＮＡ配列を含む。

＜実施例３：前立腺癌への適用＞
上記の４つの融合転写物、すなわち転写物１〜４を用いて、一患者からの２つの前立腺組織試料を分析して、新規の予測融合転写物の定量的差を査定した。実験結果を、以下の表２に示すが、この場合、「Ｈｏｍｏｇ １」は、一患者からの凍結前立腺腫瘍組織のホモジネートを指し、「Ｈｏｍｏｇ ２」は、その患者の当該腫瘍に隣接する凍結正常前立腺組織のホモジネートを指す。これらの試料を、２５．８ｍｇのＨｏｍｏｇ １および２８．９ｍｇのＨｏｍｏｇ ２で出発して、メーカーのプロトコール（QuantiGene（登録商標）Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue；およびQuantiGene（登録商標）2.0 Reagent System User Manual）に従って処理した（表５ａおよび５ｂに検定設定を示す）。

正常隣接前立腺組織に比して、前立腺癌組織中のミトコンドリア融合転写物の存在増大が明らかに実証される。融合転写物は正常組織中に存在するが、しかし非常に低いレベルである。標的転写物とのプローブのハイブリダイゼーションにより生成される相対発光強度単位（ＲＬＵ）は、各転写物の存在量と直接比例する。表２は、試料に関して得られた読取りの変動係数（ＣＶ）（パーセンテージで表される）も示す。ＣＶは、標準偏差を値の平均で割ったものである。癌組織中のこのような安定転写ミトコンドリア遺伝子産物の有意性は、疾患の進化および進行において密接な関係を有する。

＜実施例４：乳癌への適用＞
実施例３と同一プロトコールを用いて、しかし３．４ｋｂ ｍｔゲノム欠失に関連した新規の融合転写物である転写物２のみに集中して、乳房腫瘍の２つの試料およびその腫瘍に隣接する無腫瘍組織の２つの試料、ならびに前立腺腫瘍組織の３つの試料（１試料は隣接無腫瘍組織を含む）に関して、分析を実行した。本実施例に関する結果を、表４に示す。対応する正常組織切片を有する前立腺腫瘍組織は、腫瘍組織が、正常隣接組織の約２倍の量の融合転写物を有するという点で、実施例３で分析した前立腺試料と同様のパターンを実証した。乳房腫瘍試料は、隣接非腫瘍組織と比較した場合、融合転写物レベルの顕著な増大を実証した。実施例３で言及した実験において最も再現可能的に実施されるので、ホモジネートの１：１００希釈液をこの分析のために用いた。

したがって、上記の結果は、前立腺および乳房組織の両方の腫瘍の検出における本発明の転写物の適用を例証する。

＜実施例５：結腸直腸癌への適用＞
この試験は、結腸直腸癌を検出するに際しての本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。９例の対照（良性）組織試料（試料１〜９）および１０例の腫瘍（悪性）組織試料（試料１０〜１９）を含む合計１９の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした（QuantiGene（登録商標）Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue；およびQuantiGene（登録商標）2.0 Reagent System User Manual）。７つの標的転写物および１つのハウスキーピング転写物を、前記実施例に上記したような方法で調製した。転写物の特質を、以下のように要約する：

転写物２および３は、実施例３および４に関して上記されたものと同一である、ということに留意すべきである。

ＯＣＴブロックからの約２５ｍｇの組織を用いて、ホモジネートを調製し、転写物２および４に関しては１：１に、転写物１０および１１に関しては１：８に希釈した。Glomax（商標）多重検出系（Promega）で、相対的発光強度単位（ＲＬＵ）で転写物の量を測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定（無鋳型）を、同様に三重反復試験で実行した。分析は、試料に関するＲＬＵ値から下限を差し引くことにより、バックグラウンドを説明した。公式ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵ（式中、ａは標的融合転写物であり、ｈはハウスキーピング転写物である）を用いて、投入ＲＮＡを説明した。

データの分析は、以下の工程を包含した：
ａ）三重反復検定に関するＣＶ（変動係数）を確定する；≦１５％である場合は、許容可能である。

ｂ）標的融合転写物（ａ）およびハウスキーピング転写物（ｈ）の三重反復検定に関する平均ＲＬＵを確定する。

ｃ）バックグラウンドＲＬＵの三重反復値からの下限（ｌ）を確定する。

ｄ）（ａ）から下限（ｌ）を差し引く。

ｅ）ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵを算定する。

（結果の要約）
上記分析の結果を図６ａ〜６ｇ（試料番号に対するｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵのプロットを含む）に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線も示す。

転写物２：正常および悪性群（ｐ＞０．０９）の平均（ｐ＜０．１０）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような３．６１２９のカットオフ値の使用は、６０％の感受性および８９％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７３であるが、これは、適正な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物３：正常および悪性群（ｐ＝０．０３）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような４．０８１３のカットオフ値の使用は、６０％の感受性および７８％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７９であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物８：正常および悪性群（ｐ＝０．０６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−６．０９７５のカットオフ値の使用は、６０％の感受性および８９％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７６であるが、これは、適正な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物９：正常および悪性群（ｐ＝０．０６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−７．５５５５のカットオフ値の使用は、６０％の感受性および８９％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１０：正常および悪性群（ｐ＝０．０１）の平均（ｐ≦０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−３．８２７２のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および６７％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８４であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１１：正常および悪性群（ｐ＝０．０６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような３．１７５３のカットオフ値の使用は、７０％の感受性および７８％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１２：正常および悪性群（ｐ＝０．０６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような３．２６２６のカットオフ値の使用は、７０％の感受性および７８％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

（結論）
上記の結果は、結腸直腸癌の検出、ならびに正常結腸直腸組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物２、３、８、９、１０、１１および１２の有用性を例証する。上記のように、転写物２および３は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物２は、乳癌の検出において有用性があることも判明した。転写物１１は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも判明した。転写物８は、肺癌の検出において有用性があることも見出された。列挙したいくつかの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における結腸直腸癌の特性化の検出のためのツールとして用いられ得る。

＜実施例６：肺癌への適用＞
この試験は、肺癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。実施例５の場合と同様に、９例の対照（良性）組織試料（試料１〜９）および１０例の腫瘍（悪性）組織試料（試料１０〜１９）を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした（QuantiGene（登録商標）Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue；およびQuantiGene（登録商標）2.0 Reagent System User Manual）。ホモジネートを１：８に希釈し、４つの標的転写物および１つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax（商標）多重検出系（Promega）で、相対的発光強度単位（ＲＬＵ）で測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定（無鋳型）を、同様に三重反復試験で実行した。

以下の転写物を、この実施例のために調製した：

この実施例に用いた組織試料は、以下の特質を有した：

実施例５に記載した方法に従って、データの分析を実施した。結果を、図７ａ、７ｂ、７ｃおよび７ｄに示す。

（結果の要約）
転写物６：正常（良性）および悪性群（ｐ＝０．０６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−６．５６９１のカットオフ値の使用は、８０％の感受性および７１％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７７であるが、これは、適正な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物８：正常および悪性群の平均間の差は、統計的に有意ｐ＜０．０５である（ｐ＝０．０２）。ＲＯＣ曲線により実証されるような−９．６１６６のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および８６％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１０：正常および悪性群の平均間の差は、統計的に有意ｐ≦０．０１である（ｐ＝０．０１）。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１０．６７１７のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および８６％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８９であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物２０：正常および悪性群の平均間の差は、統計的に有意ｐ≦０．１である（ｐ＝０．１）。ＲＯＣ曲線により実証されるような２．５０７１のカットオフ値の使用は、７０％の感受性および７１％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７４であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

（結論）
実施例６からの結果は、肺癌腫瘍の検出における本発明の転写物６、８、１０および２０の有用性、ならびに悪性および正常肺組織間の区別を例証する。これら３つの転写物のいずれかを、臨床設定における肺癌の検出または特性化のために用い得る。

実施例７：黒色腫への適用
この試験は、黒色腫の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。この試験では、５例の対照（良性）組織試料および９例の悪性組織試料を含む合計１４の試料を用いた。全試料をホルマリン固定し、パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）。ＦＦＰＥ組織試料を切片にして試験管に入れ、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした（Quantigene（登録商標）2.0 Sample Processing Kit for FFPE Samples；およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual）。ホモジネートを１：４に希釈し、７つの標的転写物および１つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax（商標）多重検出系（Promega）で、相対的発光強度単位（ＲＬＵ）で測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定（無鋳型）を、同様に三重反復試験で実行した。

この実施例に用いた１４の組織試料は、以下の特質を有した：

以下の転写物を、この実施例のために調製した：

上記のように、転写物１０および１１は、実施例５でも用いられた。実施例５に記載した方法に従って、データの分析を実施した。結果を、図８ａ〜８ｇに示す。

（結果の要約）
転写物６：正常および悪性群（ｐ＝０．０１）の平均（ｐ≦０．０１）間に統計学的有意差が存在する。さらに、ＲＯＣ曲線により実証されるような−５．９５３１のカットオフ値の使用は、８９％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９６であるが、これは、非常に良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１０：正常および悪性群（ｐ＝０．０５）の平均（ｐ≦０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−４．７５７２のカットオフ値の使用は、８９％の感受性および４０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８２であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１１：正常および悪性群（ｐ＝０．０２）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。さらに、ＲＯＣ曲線により実証されるような１．６７６２のカットオフ値の使用は、７８％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８９であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１４：正常および悪性群（ｐ＝０．０５）の平均（ｐ≦０．０５）間に統計学的有意差が存在する。さらに、ＲＯＣ曲線により実証されるような−４．９１１８のカットオフ値の使用は、８９％の感受性および６０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８２であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１５：正常および悪性群（ｐ＝０．０７）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−７．３１０７のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および６７％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８０であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１６：正常および悪性群（ｐ＝０．０３）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。さらに、ＲＯＣ曲線により実証されるような−１０．５９６３のカットオフ値の使用は、８９％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８７８であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物２０：正常および悪性群（ｐ＝０．０４）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。さらに、ＲＯＣ曲線により実証されるような−８．３５４３のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８９であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

（結論）
実施例７からの結果は、悪性黒色腫の検出における本発明の転写物６、１０、１１、１４、１５、１６および２０の有用性を例証する。上記のように、転写物１０および１１は、結腸直腸癌を検出するのに有用性を有することも判明したが、一方、転写物６は肺癌の検出において有用性がある。疾患による転写物概要を、表６に示す。

＜実施例８：卵巣癌への適用＞
この試験は、卵巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。１０例の対照（良性）組織試料（試料１〜１０）および１０例の腫瘍（悪性）組織試料（試料１１〜２０）を含む合計２０の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした（Quantigene（登録商標）Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue；およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual）。８つの標的転写物および１つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で略記したように調製した。

この実施例に用いた２０の組織試料は、以下の特質を有した：

転写物の特質を、以下のように要約する：

転写物１、２、３、６、１１、１２、１５および２０は、実施例３〜７に関して上記したものと同一である、ということに留意すべきである。

約２５ｍｇの凍結組織を用いて、ホモジネートを調製し、１：４に希釈した。Glomax（商標）多重検出系（Promega）で、相対的発光強度単位（ＲＬＵ）で転写物の量を測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定（無鋳型）を、同様に三重反復試験で実行した。分析は、試料に関するＲＬＵ値から下限を差し引くことにより、バックグラウンドを説明した。公式ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵ（式中、ａは標的融合転写物であり、ｈはハウスキーピング転写物である）を用いて、投入ＲＮＡを説明した。

データの分析は、以下の工程を包含した：
ａ）三重反復検定に関するＣＶ（変動係数）を確定する；≦１５％である場合は、許容可能である。

ｂ）標的融合転写物（ａ）およびハウスキーピング転写物（ｈ）の三重反復検定に関する平均ＲＬＵを確定する。

ｃ）バックグラウンドＲＬＵの三重反復値からの下限（ｌ）を確定する。

ｄ）（ａ）から下限（ｌ）を差し引く。

ｅ）ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵを算定する。

（結果の要約）
上記分析の結果を図９ａ〜９ｈ（試料番号に対するｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵのプロットを含む）に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線も示す。

転写物１：正常および悪性群（ｐ＝０．００２）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１１．１５０３のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９１であるが、これは、非常に良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物２：正常および悪性群（ｐ＝０．００１）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．６９６２のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９６であるが、これは、非常に良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物３：正常および悪性群（ｐ＝０．０００）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．６７５４のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物６：正常および悪性群（ｐ＝０．００７）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−９．６４７９のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および７０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１１：正常および悪性群（ｐ＝０．０００）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１．３７９４のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および９０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９９であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１２：正常および悪性群（ｐ＝０．００１）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１．２３７９のカットオフ値の使用は、９０％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９６であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１５：正常および悪性群（ｐ＝０．０２３）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−８．６９２６のカットオフ値の使用は、７０％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８０であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物２０：正常および悪性群（ｐ＝０．０００）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．６５２１のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は０．７６であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

（結論）
上記の結果は、卵巣癌の検出における、ならびに正常卵巣組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物１、２、３、６、１１、１２、１５および２０の有用性を例証する。転写物１、２および３は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物６は、黒色腫および肺癌の検出において有用性があることも判明した。転写物１１は、黒色腫皮膚癌、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物１２は、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物１５は、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物２０は、結腸直腸癌、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した８つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における卵巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。

＜実施例９：精巣癌への適用＞
この試験は、精巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定しようとした。８例の対照（良性）組織試料（試料１〜８）および９例の腫瘍（悪性）組織試料（試料９〜１７）を含む合計１７の試料を調製した。悪性試料のうちの５例は非精上皮腫（試料９〜１３）であり、４例は精上皮腫（試料１４〜１７）であった。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした（Quantigene（登録商標）Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue；およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual）。１０の標的転写物および１つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で略記したように調製した。

この実施例に用いた１７の組織試料は、以下の特質を有した：

転写物の特質を、以下のように要約する：

転写物２、３、４、７、１１、１２、１５、１６および２０は、実施例３〜８に関して上記したものと同一である、ということに留意すべきである。

約２５ｍｇの凍結組織を用いて、ホモジネートを調製し、１：４に希釈した。Glomax（商標）多重検出系（Promega）で、相対的発光強度単位（ＲＬＵ）で転写物の量を測定した。全試料を、各転写物に関して三重反復試験で検定した。バックグラウンド測定（無鋳型）を、同様に三重反復試験で実行した。分析は、試料に関するＲＬＵ値から下限を差し引くことにより、バックグラウンドを説明した。公式ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵ（式中、ａは標的融合転写物であり、ｈはハウスキーピング転写物である）を用いて、投入ＲＮＡを説明した。

データの分析は、以下の工程を包含した：
ａ）三重反復検定に関するＣＶ（変動係数）を確定する；≦１５％である場合は、許容可能である。

ｂ）標的融合転写物（ａ）およびハウスキーピング転写物（ｈ）の三重反復検定に関する平均ＲＬＵを確定する。

ｃ）バックグラウンドＲＬＵの三重反復値からの下限（ｌ）を確定する。

ｄ）（ａ）から下限（ｌ）を差し引く。

ｅ）ｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵを算定する。

（結果の要約）
上記分析の結果を図１０〜１８（試料番号に対するｌｏｇ２ａＲＬＵ−ｌｏｇ２ｈＲＬＵのプロットを含む）に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線も示す。

いくつかの転写物は良性および悪性精巣組織間を区別するが、他のものは、腫瘍亜型の精上皮腫と非精上皮腫および／または良性精巣組織との間の区別を実証する。したがって、各クラスからの転写物を組合せると、精巣癌の検出だけでなく、精上皮腫または非精上皮腫の亜型への分類も助長される、と理解される。

転写物２：正常群および悪性精上皮腫群（ｐ＝０．０２）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．５６２１のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫（ｐ＝０．０２４）の平均（ｐ＜０．０５）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような２．１００６のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９０であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物３：正常群および悪性精上皮腫群（ｐ＝０．０１８）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．９６９のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８７．５％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９６９であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫（ｐ＝０．０１７）の平均（ｐ＜０．０５）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．８１８１のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物４：正常および悪性群（ｐ＝０．０３４）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−９．７６２８のカットオフ値の使用は、６７％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８３３であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１１：正常群および悪性精上皮腫群（ｐ＝０．０１６）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．７３２のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫（ｐ＝０．０１６）の平均（ｐ＜０．０５）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような０．９８８４のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９０であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１２：正常群および悪性精上皮腫群（ｐ＝０．０５６）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．５３６１のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８７．５％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９６９であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫（ｐ＝０．０４４）の平均（ｐ＜０．０５）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．６０３９のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８０％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１３：正常群および悪性群（ｐ＝０．０１９）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−９．８７５１のカットオフ値の使用は、８７．５％の感受性および７８％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８７５であるが、これは非常に良好な試験精度を示す。悪性非精上皮腫および良性群（ｐ＝０．０００）の平均（ｐ＜０．０１）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１３．９５１９のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８７．５％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９７５であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫群（ｐ＝０．００１）の平均（ｐ＜０．０１）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−１５．８５０１のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１５：正常および悪性群（ｐ＝０．０６５）の平均（ｐ＜０．１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−５．４９１６のカットオフ値の使用は、７５％の感受性および８９％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８３３であるが、これは、良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物１６：正常群および悪性群（精上皮腫および非精上皮腫の両方を含む）（ｐ＝０．０３７）の平均（ｐ＜０．０５）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−６．４４８のカットオフ値の使用は、８９％の感受性および７５％の特異性を生じ、曲線下面積は０．８０６であるが、これは、良好な試験精度を示す。正常および悪性精上皮腫（ｐ＝０．０３７）の平均（ｐ＜０．０５）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような−７．４５７５のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および８７．５％の特異性を生じ、曲線下面積は０．９３８であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

転写物２０：正常群および悪性精上皮腫群（ｐ＝０．００６）の平均（ｐ＜０．０１）間に統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．８３６４のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。悪性精上皮腫および悪性非精上皮腫（ｐ＝０．００４）の平均（ｐ＜０．０１）間にも統計学的有意差が存在する。ＲＯＣ曲線により実証されるような１．６０６５のカットオフ値の使用は、１００％の感受性および１００％の特異性を生じ、曲線下面積は１．００であるが、これは、優れた試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。

（結論）
上記の結果は、精巣癌および亜型精巣癌の検出における、ならびに正常精巣組織から悪性組織を区別するに際しての、転写物２、３、４、１１、１２、１３、１５、１６および２０の有用性を例証する。転写物２は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物３は、前立腺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物４は、前立腺癌および結腸直腸癌における有用性を有することも見出された。転写物１１は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物１２は、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物１５は、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも判明した。転写物１６は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも判明した。転写物２０は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した９つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における精巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。

一態様において、本発明は、組織試料中の癌の存在を確定するための検定を実行するためのキットを提供する。キットは、上記のような検定を実行するために必要とされる試薬を含む。特に、キットは、上記の転写物１〜１７および２０に対応する１つ以上のハイブリダイゼーションプローブを含有する１つ以上の容器を含む。理解されるように、検定を実行するための試薬は、任意の必要な緩衝剤、塩、検出試薬等を含む。さらに、キットは、例えばハイブリダイゼーションまたは核酸抽出により組織試料を調製するために必要とされる組織試料、試薬または材料を得るための、ならびに被験者検定（単数または複数）を実行するための任意の必要な試料収集装置、容器等を包含し得る。キットは、罹患または非罹患組織に関する許容可能な値を確定しまたは実証するための対照組織または試料も包含し得る。

ある具体的実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、添付の特許請求の範囲に略記されたような本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、本発明の種々の修正が成され得ることは当業者に明らかである。本明細書中で言及される文書（論文、マニュアル、特許出願等）は全て、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。

〔文献〕
特に以下の参考文献を、前記の説明中で引用した。これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される。

−表中の単位結果はＲＬＵ（相対的発光強度単位）である。
−バックグラウンドＧ１、Ｈ１
−空のウエルＧ２〜Ｇ８、Ｈ２〜Ｈ８

ホモジネート１−26 mgの組織を用いて、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）を含有する700μＬのＨ溶液中でホモジナイズした。Qiagen TissueRuptorを用いた。40μＬのホモジネート上清を用いた。 希釈用20、10および5 μＬ。

ホモジネート１＝腫瘍状前立腺からの腫瘍組織。

ホモジネート２−29 mgの組織を用いて、ＰＫを含有する700μＬのＨ溶液中でホモジナイズした。Qiagen TissueRuptorを用いた。40μＬのホモジネート上清を用いた。 希釈用20、10および5 μＬ。

ホモジネート２＝腫瘍状前立腺からの正常組織。

ＲＮＡ希釈液は、以下のように作製した。ＲＮＡは、Ambionからの正常前立腺からであった。二重反復試験で検定を実行した。

Claims (13)

1. 配列番号１８または３３に記載の配列を有し、前立腺癌または卵巣癌に関連した、単離ミトコンドリア融合転写物。
2. 請求項１に記載のミトコンドリア融合転写物に対応する、ミトコンドリア融合タンパク質。
3. 配列番号３４または４９に記載の配列を有する、請求項２記載のミトコンドリア融合タンパク質。
4. 請求項１に記載のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的な核酸配列を有し、前記一部はスプライス化遺伝子の接合点を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
5. 請求項１に記載のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的である核酸配列を有するハイブリダイゼーションプローブの、前立腺癌または卵巣癌に関連した少なくとも１つのミトコンドリア融合転写物の存在に関して哺乳類からの組織試料を検定するためのキットの製造における、使用であって、
   前記一部はスプライス化遺伝子の接合点を含む、使用。
6. 前記検定が、以下の：
   ａ）前記少なくとも１つのプローブを相補的ミトコンドリア融合転写物とハイブリダイズさせるために前記プローブのうちの少なくとも１つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行するステップ；
   ｂ）前記少なくとも１つのプローブとハイブリダイズされる前記転写物の量を定量することにより、前記試料中の少なくとも１つのミトコンドリア融合転写物の量を定量するステップ；および
   ｃ）前記試料中のミトコンドリア融合転写物の量を少なくとも１つの既知の参照値と比較するステップ
   を包含する、請求項５記載の使用。
7. 前記検定が診断的画像技法を用いて実行される請求項６記載の使用。
8. 前記診断的画像技法が高処理量マイクロアレイ分析を含む請求項７記載の使用。
9. 前記検定が分枝ＤＮＡ技法を用いて実行される、請求項６記載の使用。
10. 前記検定がＰＣＲを用いて実行される、請求項６記載の使用。
11. 哺乳類における前立腺癌または卵巣癌の存在を検出するための検定の実行用キットであって、
    請求項１に記載のミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補的である少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含み、前記一部はスプライス化遺伝子の接合点を含む、キット。
12. 請求項１に記載のミトコンドリア融合転写物を複数有するマイクロアレイからなる、前立腺癌または卵巣癌に関連したミトコンドリア融合転写物を同定するためのスクリーニングツール。
13. 多重分枝ＤＮＡ検定を含むスクリーニングツールであって、請求項１に記載の複数のミトコンドリア融合転写物が、前立腺癌または卵巣癌に関連したミトコンドリア融合転写物を同定するために用いられるスクリーニングツール。

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