JP5891719B2 - 細胞断面解析装置、細胞断面解析方法、及び細胞断面解析プログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞断面解析技術に関し、特に、剥離細胞の断面画像解析により剥離細胞を検出する技術に関する。

再生医療分野等において、皮膚などの自己の細胞を増殖させて人体に移植する場合、あるいは、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの幹細胞を心筋など特定の機能に分化させた細胞を人体に移植する場合等において、角膜、皮膚等の平面状の組織については、シャーレ等の培養皿を用いて、細胞をシート状に増殖させて移植する方法が進められている。この方法では、培養皿に細胞を播種して一定期間培養し、シート状に形成された細胞群をシャーレの底板などの基板から剥離して移植などに利用する。

基板からの細胞群の剥離を促進する方法として、細胞剥離性を有する薬剤を用いて細胞群を剥離する方法、温度条件により細胞接着性が変化する温度応答性ポリマーにより被覆された基板表面にて細胞を培養したのち温度コントロールにより細胞群を剥離する方法（下記特許文献１）等が知られている。薬剤や温度コントロールなどによる剥離刺激を加えて細胞群を剥離する場合に、基板から剥離せず接着したままの細胞が一定の割合以上に多いと、形成されたシート形状が破壊され移植に使用できなくなる。従って、品質管理上、細胞培養用基板の表面の、剥離刺激が加えられた際の細胞の剥離性能を非侵襲的に計測し管理することが求められている。
そのために、細胞の側面方向からみた断面の解析、いわゆる断面解析が重要となる。

培養細胞の断面方向の状態を物理的に観察する方法として、顕微鏡を倒立させてシャーレを側面方向から観察する方法や、超小型水中カメラをシャ−レに沈め側面方向から観察する方法等が考えられる。前者は通常の円形シャーレでは実現困難なため、観察時のみ薄型の特殊な方形シャーレを準備して移し替える必要があり、培養細胞に侵襲を加えてしまうという問題がある。一方、後者の超小型水中カメラでは、現状では、顕微鏡並みの高倍率の画像を得ることが困難である。

このように、培養皿を側面方向から撮影する方法を実現することは難しいため、Ｚ軸方向に培養皿をスライスして複数フレーム撮影し、画像再構成により培養皿を仮想的に側面方向から観察した断面像を間接的に作成する方法が考えられる。

このような方法を実現するための基礎技術として、光学顕微鏡の焦点を制御して深さ方向の段差計測を行う手法は、下記のように実現されている。
（１）一般的な光学顕微鏡を用いたＺ方向計測手法
特許文献２「微細パターンの段差測定装置」
この方法は、一般的な光学顕微鏡を用いて、撮影ポイントごとに焦点制御を行うことにより、電子デバイスの加工段差の３次元計測を行う方法の提案である。
（２） 特許文献３「カラー共焦点顕微鏡」
段差測定に適した３次元計測用顕微鏡の提案である。
光学顕微鏡で焦点制御を行うと画像のボケが生じるため、光源をビーム状に絞り２次元的に走査しながら、３次元方向の段差計測を高精度に行う方法が提案されている。
（３）特許文献４「共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いた撮影手法」
死角に存在する対象物を取得する方法として、光の屈折効果を活用し共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いた撮影手法が提案されている。
（４）特許文献５「光学像再構成装置」
一般的な光学顕微鏡を用いて、焦点制御を行いながら、複数枚の画像を撮影して断面像を得る手法で、試料対象物の死角部分の形状を取得するため、試料を管状の容器に収納し、回転させながらマルチスライス撮影を行う手法が提案されている。
（５）特許文献６「共焦点レーザー走査型顕微鏡及びその光学的断層像表示方法」
レーザー走査型顕微鏡を用いて、対物レンズを培養液中に浸入させ、培養液と試料との光学的な屈折率を考慮して、取得される画素単位の断面像に対して補正を加える手法を提案。１次元走査線ごとに断面像をリアルタイムに取得できる。

特許第３４４１５３０号公報 特開平８−１９４７３７号公報 特許第４０６５１２９号公報 特開平７−１９９０７３号公報 特開平６−２５９５３３号公報 特開平７−１９９０７３号公報

ところで、特許文献２に記載の技術では、取得される各スライス画像のいずれも、ピントがボケた状態になるため、断面画像の映像化の用途には適用することが困難であった。

特許文献３は、特許文献２を改善したものであり、共焦点レーザ走査型顕微鏡が提案されているが、光学顕微鏡に比べ高価であり、光学顕微鏡のように透過光源を用いて、対象物の死角になる裏側のスライス像を容易に取得できないという問題がある。

特許文献４は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いた撮影手法が提案されているが、通常の細胞観察用の光学顕微鏡で取得される透過画像とはかなり異なるという問題がある。

特許文献５では、剥離細胞のように浮遊している対象物に対しては適用できない。また、光学顕微鏡を用いた断層像の取得方法が提案されているが、試料を円筒形の容器に固定させ容器を回転させながら撮像するため、培養細胞には適用できない。

特許文献６では、走査型でない通常の光学顕微鏡では画素単位の補正を行うことが難しいため、適用することが困難である。また、培養液に対して侵襲を加える必要があり、非侵襲的な分析が難しいという問題がある。

通常の光学顕微鏡を用いて通常の培養皿を深さ方向にマルチスライス撮影し断面方向の画像を仮想的に構築できるようにするためには、以下の課題がある。
（１）収集されるスライス画像の殆どのピントがボケる。フォーカスが合っている合焦状態にある箇所は一部であり、大部分がフォーカスが合っておらず、画像が不鮮明になる。
（２）被写界深度の影響によるＺ方向の分解能が低下する。フォーカス面が不鮮明であるだけでなく、Ｚ軸上下の像も映り込んでしまう。
（３）対象物の対物レンズと反対方向の像が死角になる。対象物の裏側の形状や対象物の裏側に重なって存在する別の対象物を観察できない。
本発明は、上記の課題を解決し、細胞の断面を高精度に観測すること目的とする。

上記課題（１）に対しては、シャープネス補正を加えて画像処理により鮮鋭化する方法を提案する。

上記課題（２）に対しては、各スライス画像に対して、上下に隣接するスライス画像の成分を所定量だけ画像処理により減算する方法を提案する。

上記課題（３）に対しては、各スライス面を透過光源により撮像し、各スライス画像に対して、裏側に隣接するスライス画像の成分を所定量だけ画像処理により強調させる方法を提案する。即ち、透過光源を用いて光学顕微鏡の焦点を制御して深さ方向を変化させたマルチスライス撮影を行い、取得した各スライス画像に対して鮮鋭化の画像処理を加えて、焦点ボケの改善を行う。

更に、隣接スライス画像間で差分強調処理を加え、被写界深度の影響によるＺ方向の分解能低下の問題を改善させ、死角に入った不鮮明な画像を強調させる。このようにして補正されたマルチスライス画像より指定された位置の水平面または垂直面の断層画像を構築するための画素を抽出する。

本発明の一観点によれば、細胞と液体とを含む系を第１の方向に移動させながら顕微鏡で焦点を合わせて観察し、鉛直方向の位置が異なる複数の合焦画像を、前記第１の方向と交差する第２の方向と前記第１の方向及び第２の方向と交差する第３の方向とにより画定される複数の２次元平面画像として撮像する撮像機構と、前記撮像機構により撮像された前記複数の合焦画像のそれぞれに対して画像を鮮鋭化する補正処理を行う画像補正部と、前記画像補正部により補正された後の前記複数の合焦画像に基づいて、前記２次元平面上の任意の点を通り、前記第２の方向又は前記第３の方向のいずれかの断面を、前記複数の合焦画像をつなぎ合わせるように再構成し疑似断面画像を生成する画像処理部と、を有することを特徴とする細胞断面解析装置が提供される。

前記撮像機構により取得されたマルチスライス画像について、鮮鋭化の補正を行った後に、マルチスライス画像を移動方向につなぎ合わせることで、より鮮明で精度の良い疑似断面画像を得ることができる。

前記撮像機構は、前記合焦画像を所定の時間間隔で繰り返し撮像して複数の動画像を取得し、前記画像処理部は、前記複数の動画像に基づいて疑似断面動画像を生成することが好ましい。マルチスライス画像としては、合焦画像を所定の時間間隔で撮影を繰り返すことにより得られた動画像を用いることで、より精度の良い疑似断面動画像を得ることができる。

前記画像補正部は、前記複数の合焦画像を鮮鋭化する処理として、アンシャープマスクに基づくアルゴリズムにより、前記複数の合焦画像よりも焦点がぼけた焦点ぼけ画像を作成し、前記複数の合焦画像と、対応する前記焦点ぼけ画像との差分画像を所定の割合だけ各々加算することにより補正を行うことが好ましい。
差分画像を考慮することで、より鮮明な画像を得ることができる。

前記画像補正部は、前記鮮鋭化する処理に加え、前記複数の合焦画像に対して、前記鉛直方向の第１の方向又は前記第１の方向と反対の方向に１フレーム分だけ隣接する静止画または動画のフレームとの差分画像を各々作成し、前記各静止画または各動画のフレームに対して当該静止画または動画のフレームに対応する差分画像を所定の割合だけ加算することにより補正を行っても良い。

第１の方向において１つ前の画像、１つ後の画像との差分を現在の画像に加算・減算することで、写り込み等の影響を抑制することができる。

前記撮像機構は、前記液体として培養液を入れる培養皿の底板表面に対して焦点があったＺ１位置と、前記培養皿中の培養液面に対して焦点があったＺ２位置とを設定し、光学顕微鏡により焦点を前記Ｚ１位置と前記Ｚ２位置との範囲で所定の間隔で複数の個所に移動させながらＺ方向の位置が異なる複数の画像を撮像することを特徴とする。

例えば操作部により指定された前記２次元平面上の任意の点を含む平面であって前記第２の方向と前記第１の方向により形成される平面又は前記第３の方向と前記第１の方向により形成される平面で切った少なくともいずれかの前記疑似断面画像を、前記２次元平面の画像と対応させて表示画面に表示させる表示制御部を有するようにすると良い。疑似断面画像と平面画像との位置を対応付けて表示することで、よりわかりやすい細胞の解析が可能となる。

本発明の他の観点によれば、細胞と液体とを含む系を第１の方向に相対的に移動させながら顕微鏡で焦点を合わせて観察し、前記第１の方向の位置が異なる複数の合焦画像を、前記第１の方向と交差する第２の方向と前記第１の方向及び前記第２の方向と交差する第３の方向とにより画定される複数の２次元平面画像として撮像する撮像ステップと、前記撮像機構により撮像された前記複数の合焦画像のそれぞれに対して画像を鮮鋭化する補正処理を行う画像補正ステップと、前記画像補正部により補正された後の前記複数の合焦画像に基づいて、前記２次元平面上の任意の点を通り、前記第２の方向又は前記第３の方向のいずれかの断面を、前記複数の合焦画像をつなぎ合わせるように再構成し疑似断面画像を生成する画像処理ステップと、を有することを特徴とする細胞断面解析方法が提供される。「細胞と液体とを含む系を第１の方向に相対的に移動させながら顕微鏡で焦点を合わせて」とは、系と顕微鏡とのうち少なくともいずれか一方を移動させることを意味する。

本発明は、上記に記載の細胞断面画像解析方法をコンピュータに実行させるための細胞断面解析プログラムであっても良く、当該プログラムを記録するコンピュータ読み込み可能な記録媒体であっても良い。

本発明によれば、物理的に横方向から観察困難な細胞の断面を疑似断面画像を生成することにより疑似的に観察することができる。

また、細胞断面画像の作成精度の向上によって、細胞培養容器内の細胞が接着細胞であるか剥離細胞であるかを判定し、細胞接着表面の細胞剥離性能の評価が簡単になる。

本発明の第１の実施の形態による細胞断面画像の解析技術の対象の一例を示す図である。 本実施の形態による細胞画像解析技術の原理を示す図であり、マルチディメンジョナル細胞断面解析法の概要を示す図である。 マルチディメンジョナル細胞断面解析法の原理図であり、図２に対応する図である。 本実施の形態による断面画像解析システムの一構成例を示す図であり、図２に示す構成に加えて、必要な構成を合わせて示す図である。 本実施の形態による断面画像解析装置の一構成例を示す機能ブロック図であり、図４に示す構成のうち解析機構を中心にした構成を示す図である。 本実施の形態による断面画像解析システムにおける処理に流れを示すフローチャート図である。 シャープネス補正（アンシャープネスマスク）により、さらに、ボケを増す処理を行う処理の流れを示すフローチャート図である。 シャープネス補正（アンシャープネスマスク）により、さらに、ボケを増す処理を行う処理の流れを示すフローチャート図である。 シャープネス補正（アンシャープネスマスク）により、さらに、ボケを増す処理を行う処理の流れを示すフローチャート図である。 ステップＳ６のＺ方向隣接画像との差分強調処理の流れの詳細を示すフローチャート図である。 各静止画に対する差分強調処理の詳細な流れを示すフローチャート図である。 補正前の顕微鏡画像の一例を示す図であり、Ｚ＝１から６２までの画像を示す図である。 図１２に対応する補正後の画像を示す図である。 図１３に示す補正後の平面画像（Ｚ＝３０）と、水平方向の直線Ｌ１と垂直方向の直線Ｌ２で切った断面構造とを、中央部及び、上記画像処理に基づいて得た解析断面画像を下辺及び右辺に示した図である。 本発明の第２の実施の形態によるマルチディメンジョナル細胞断面解析法の原理図であり、図３に対応する図である。 本実施の形態によるマルチディメンジョナル細胞断面解析法の処理の流れを示すフローチャート図である。

以下に、本実施の形態における用語について定義する。
本発明において「細胞と液体とを含む系」とは、細胞と細胞の周囲の連続相である液体などの流体とを含む系を指す。当該系の細胞には、液体中に遊離した状態で存在する細胞、すなわち遊離細胞と、系内での位置が固定された細胞、すなわち固定細胞とが含まれ得る。「細胞と液体とを含む系」とは、典型的には、細胞培養器具に収容された、細胞と培養液とを含む細胞-培養液系である。細胞-培養液系では、細胞培養器具表面に接着した状態で存在する細胞が固定細胞に相当し、培養液中に遊離した状態で存在する細胞が遊離細胞に相当する。本発明の一実施形態では、細胞-培養液系として、細胞培養器具中で細胞を培養液とともに培養したのち、該器具の細胞接着表面から細胞を剥離するための剥離刺激を付与した状態のものを使用することができる。

細胞培養器具は、細胞及び培養液を保持することが可能な部分を有する任意の形状であることができる。典型的には皿形状の細胞培養器具、細胞及び培養液を収容することが可能な凹部が複数連結したマルチウェルプレート、板形状又はフィルム形状の細胞培養器具、表面に凹部が形成された板形状又はフィルム形状の細胞培養器具等が挙げられる。

細胞培養器具の細胞及び培養液を保持することが可能な部分の少なくとも一部、典型的には底部の表面が細胞接着表面を形成する。

細胞培養器具を構成する材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミック類等の材料が挙げられるが、細胞培養及び細胞の観察が可能な材料である限りこれらには限定されない。例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等で構成することができる。

尚、細胞を含む液滴などの培養液自体を用いて、一般的な意味での容器を用いずに評価を行うことも可能である。尚、細胞と液体とを含む系とを含む系を保持可能な器具であれば、どのような形態でも良く、容器の代わりに液滴が保持されるような構成であれば良い。

本明細書において細胞剥離性能を評価しようとする細胞接着表面は、評価の目的に応じた処理がされていればよい。典型的には、細胞接着表面は、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー等の、所定の刺激により細胞接着性を変化させて細胞を剥離することが可能な物質により被覆されている。細胞剥離性能を評価しようとする表面は「剥離」という視点に限らず、例えば、親水性ポリマーにより被覆して細胞接着性を低下させ、細胞が接着しないように制御された表面であってもよい。

温度応答性ポリマーは細胞培養に使用可能なもののなかから試験の目的に応じて適宜選択することができる。典型的な温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。

ｐＨ応答性ポリマーおよびイオン応答性ポリマーは、細胞培養に使用可能なもののなかから試験の目的に応じて適宜選択することができる。

剥離刺激としては、細胞接着表面の被覆に上記物質を用いた場合は、使用する物質応じて温度変化、ｐＨ変化、イオン濃度変化等の所定の剥離刺激を採用することができる。

剥離刺激は、評価の目的に応じて更に他の刺激を採用することもできる。例えば細胞剥離薬剤による化学的な刺激、培養液の流動による機械的な刺激等の中から適宜選択することができる。

本発明により解析される細胞の種類は特に限定されず、試験の目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞を用いた試験において本発明の技術を適用することができる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。胚性幹細胞を使用することもできる。

本実施の形態では、動画の一例としてビデオカメラで撮影した映像を利用した場合について説明する。もちろん、動画として静止画を連続的に、又は、断続的に撮影するようにしても良く、画像の種類を限定するものではない。動画は、ビデオカメラなどで撮影されたものであってもよいし、一定時間おきにスチルカメラなどで画像を取得するようなものであってもよい。

以下の実施の形態では、細胞培養器具として細胞と培養液とを入れた培養皿を用い、細胞中の剥離細胞（基板剥離細胞）を画像処理により検出する技術を例にして説明する。

以下に、本発明の実施の形態による細胞画像解析技術、特に剥離細胞の検出のための細胞画像解析装置について、図面を参照しながら説明を行う。

本明細書において、疑似断面画像とは、本実施の形態による細胞断面解析処理により得られた画像を指す。直接断面を観察した画像ではないが、後述するように、ほぼ断面画像に近い画像が得られるため、ここでは、疑似断面画像と書する。

図１は、本発明の第１の実施の形態による細胞断面画像の解析技術の対象の一例を示す図である。図１に示すように、温度を低下させた後においては、所定の細胞群が培養液とともに培養されている培養皿１内の培養液３内において、所定の細胞群のうち、接着細胞７は、基板、例えば培養皿１の底板１ｂに接着しており、剥離細胞５は、培養液３中に浮遊しているが、培養液３の摩擦力により培養液３中に静止している。

培養皿１の側面から細胞の断面を観察することにより、剥離細胞５と接着細胞７とを区別することができる。この状態で観察する技術としては、培養皿中に例えば超小型水中カメラをもぐらせて側面より近接撮影する方法もある。しかしながら、この方法では、細胞観察に必要な倍率が得にくい上に、特別な装置を用いて側面から特別な技術で観測する必要があるため、実用的でない。

また、顕微鏡の鏡筒を倒立させ培養皿を側面方向から撮影する方法もあるが、円形のシャーレ越しでは実際上、観察が困難である。

図２は、本実施の形態による細胞画像解析技術の原理を示す図であり、マルチディメンジョナル細胞断面解析法の概要を示す図である。この方法は、顕微鏡の焦点制御によるマルチスライス撮影を行うことにより、断面解析を行うものである。図２に示すように、ＸＹＺステージ１１上に、培養液３内に細胞５、７が入っている細胞培養皿１を載せて、上から透過光源１５からの光を照射し、下から対物レンズ１７を有する光学顕微鏡で細胞を観察する。

ここで、焦点を培養皿の底板１ｂ上面の位置から培養液の水面３ａの位置まで、水面３ａの法線方向であるＺ方向の異なる位置である焦点面１からＮ（Ｎは２以上の整数）まで、光学顕微鏡による観察面をデジタルビデオカメラなどにより撮影する。ここでは、少なくとも１からＮまでの複数の静止画を取得する。そして、取得した複数の静止画を基に、静止画中の指定された位置の水平方向および垂直方向の深さ方向の断面画像を作成する。

そのために、光学顕微鏡により、培養皿１に対して所定の倍率に拡大して観察する。この際、光学顕微鏡において、例えば、焦点面１から焦点面ＮまでをＮ−１等分した間隔で複数の個所に移動させながら焦点を合わせ、Ｚ方向の位置が異なる複数の合焦静止画を撮像する。ここで、Ｚ方向に移動させる範囲は、底板１ｂの上面から培養液３の水面３ａまでの間であり、少なくとも、細胞が含まれる範囲内である。Ｚ方向は第１の方向、Ｘ方向は第２の方向、Ｙ方向は第３の方向とすると、第１の方向と第２の方向とは直交し、第１の方向と第３の方向とも直交し、第２の方向と第３の方向とも直交する。

図３は、マルチディメンジョナル細胞断面解析法の原理図であり、図２に対応する図である。上記合焦静止画におけるＮ＝５とし、Ｘ−Ｙ平面に広がる１から５までの撮像スライス像が得られている。この撮像スライス像は、以下の式で表される。

x=0,…,Xs-1; y=0,…,Ys-1; z=0,…,Zs-1; c=0,1,2(RGB)

ここで、撮像スライス像を、符号Ｓ１で示すＸ−Ｚ平面で切ったＸ方向の再構成断面像は、以下の式で表される。

一方、撮像スライス像を、符号Ｓ２で示すＹ−Ｚ平面で切ったＹ方向の再構成断面像は、以下の式で表される。

以上の原理に基づいて、Ｘ方向、Ｙ方向などの所望の断面像を再構成することができる。

Ｎを大きくすることで、より高精細な断面画像を再構成して疑似断面画像を求めることができる。

図４は、本実施の形態による断面画像解析システムの一構成例を示す図であり、図２に示す構成に加えて、必要な構成を合わせて示す図である。

図４に示すように、断面画像解析システムＡは、培養皿１をＸ−Ｙ−Ｚ方向に移動可能とするＸＹＺステージ１１と、培養皿１中の細胞に光を照射する位置に設けられた透過光源１５と、透過光源が照射された細胞を観察できる位置に対物レンズ１７が設けられた動画撮像ビデオカメラ２３と、を有している。動画撮像ビデオカメラ２３は、静止画を撮影するデジタルスチルカメラで置き換えることができる。

さらに、ＸＹＺステージ１１の移動制御及び位置制御を行うＸＹＺステージコントローラ兼オートフォーカス・ユニット２１と、動画撮影ビデオカメラ２３の撮影した動画データを記憶するビデオ・フレームメモリ２５と、ＸＹＺステージコントローラ兼オートフォーカス・ユニット２１、ビデオ・フレームメモリ２５等を制御する制御用パーソナルコンピュータ２７と、画像を観察できるビデオ・モニター３１と、を有している。
尚、ここでは、細胞を下から撮影するシステムについて説明したが、上から撮影するようにしても良い。

図５は、本実施の形態による断面画像解析装置の一構成例を示す機能ブロック図であり、図４に示す構成のうち解析機構を中心にした構成を示す図である。図５に示すように、本実施の形態による断面画像解析装置は、細胞を観察する顕微鏡５１と、顕微鏡の観察画像を撮影する撮像部５３と、培養皿又は顕微鏡の対物レンズを移動させる移動機構５５と、移動機構により移動させて撮影した画像の補正処理を行う、第１の画像補正部であるシャープネス補正部５７と、第２の画像補正部である差分強調処理部６１と、断面画像を再構成して疑似断面画像を求める断面画像再構成部６２と、断面画像表示処理部６３と、出力部６５と、操作部６７と、メモリ６８と、を有している。顕微鏡５１と、撮像部５３と、移動機構５５とにより、撮像機構５０が構成される。

顕微鏡５１は、光学顕微鏡であり、拡大機能と合焦機能とを備えている。撮像部５３は、例えば、図４の動画撮像ビデオカメラであり、移動機構５５は、ＸＹＺステージコントローラ２１及びオートフォーカス・ユニット２１である。第１の画像補正部であるシャープネス補正部５７、第２の画像補正部である差分強調処理部６１と、断面画像再構成部６２と、断面画像表示処理部６３と、が、制御用パーソナルコンピュータ２７内の制御プログラムによる制御処理部に対応する。また、出力部６５は、ビデオ・モニター３１或いはプリンタなどに対応し、操作部６７は、マウス、キーボードなどに相当する。メモリ６８は、ハードディスクなどの記憶媒体であり、得られたデータ等を記憶する。

図６は、本実施の形態による断面画像解析システムにおける処理に流れを示すフローチャート図である。処理内容は、顕微鏡本体における処理、画像処理及び断面像の対話型表示を含む。まず、ステップＳ１において、顕微鏡５１のセットアップを行う。より具体的には、培養皿内の細胞が観察できるように、適切な視野・位置にフォーカスが設定される。ステップＳ２において、撮像部５３の静止画撮影と、撮影した画像のメモリ６８或いは記憶媒体への記憶が行われる。

ステップＳ３において、移動機構５５によりＸＹＺステージの段階的な移動を行う。ステップＳ１において、焦点面が底板１ｂ表面に初期設定されているため、底板１ｂ表面から水面３ａ方向に移動させる。ステップＳ４において、焦点面が水面内であるか否かを判定する。この判定は、Ｚ方向の位置情報に基づいて行うことができる。ステップＳ４において、Ｙｅｓの場合には、ステップＳ２に戻り、次の撮影を行う。最終的に、ステップＳ４で、焦点面が水面を超えた場合には（Ｎｏ）、ステップＳ５に進む。このように、培養皿１において、底板１ｂ表面に対して焦点があったＺ１位置と、培養皿１中の水面３ａに対して焦点があったＺ２位置とを設定し、顕微鏡５１により、焦点をＺ１位置とＺ２位置との範囲で所定の間隔で複数の個所に移動させながらＺ方向の位置が異なる複数の静止画を撮像する。
ステップＳ５において、シャープネス補正部５７が、アンシャープマスクを用いて鮮鋭度を補正する。

図７から図９までは、シャープネス補正（アンシャープネスマスク）により、さらに、ボケを増す処理を行う処理の流れを示すフローチャート図である。図７において、ステップＳ５−１で、補正対象のボクセル画像群を準備する。すなわち、

ステップＳ５−２において、ｚ＝０とする。ステップＳ５−３において、Ｉｍａｇｅ（ｚ，ｘ，ｙ，ｃ）を基に、焦点ボケ画像Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ，ｃ）を作成する。

ステップＳ５−４において、原画像Ｉｍａｇｅ（ｚ，ｘ，ｙ，ｃ）と焦点ボケ画像Ｉｍａｇｅ２（ｘ，ｙ，ｃ）との差分画像を原画像に加算することでシャープネス補正を行う。ステップＳ５−５において、ｚを１だけインクリメントし、ステップＳ５−６において、ｚとＺｓ−１とを比較し、ｚの方が小さければ、ステップＳ５−３に戻り処理を継続し、ｚがＺｓ以上になれば、処理を終了する（Ｅｎｄ： ステップＳ５−７）。ここで、Ｚｓは底面１ｂと水面３ａとの距離である。

図８は、焦点ボケ画像の作成処理（ステップＳ５−３）の流れを示すフローチャート図である。まず、ステップＳ５−３−１でｙ＝０とし、ステップＳ５−３−２でｘ＝０とし、ステップＳ５−３−３でｃ＝０とする。ｃ＝０は、ＲＧＢのうち例えばＲである。次いで、ステップＳ５−３−４で、Ｊ＝−ｒ、ｖｓ＝０、ｗｓ＝０とする。

ステップＳ５−３−５において、ｉ＝−ｒとする。ここで、ｒは、ボケ半径であり、例えば１画素などの単位で表される。

次いで、ステップＳ５−３−６において、

次いで、ステップＳ５−３−７において、ｉを１だけインクリメントし、ステップＳ５−３−８において、ｉとｒとを比較する。ここで、ｉがｒ以下であれば、ステップＳ５−３−６に戻り、ｉがｒよりも大きければステップＳ５−３−９に進み、ｊを１だけインクリメントする。次いで、ステップＳ５−３−１０において、ｊとｒとを比較し、ｊがｒ以下であればステップＳ５−３−５に戻り、ｊがｒよりも大きければ、ステップＳ５−３−１１において、以下の演算を行う。

次いで、ステップＳ５−３−１２において、ｃを１だけインクリメントし、ステップＳ５−３−１３において、ｃと２とを比較し、ｃが２以上であればステップＳ５−３−４に戻り、ｃが２以下であれば、ステップＳ５−３−１４において、ｘを１だけインクリメントする。次いで、ステップＳ５−３−１５において、ｘとＸｓとを比較し、ｘがＸｓよりも小さければステップＳ５−３−３に戻り、ｘがＸｓ以上であればステップＳ５−３−１６に進み、ｙを１だけインクリメントする。次いで、ステップＳ５−３−１７において、ｙとＹｓとを比較し、ｙがＹｓよりも小さければ、ステップＳ５−３−２に戻り、ｙがＹｓ以上であれば、処理を終了する（Ｅｎｄ）。以上の処理により、焦点がぼけた画像を作成することができる。

この鮮鋭化する処理として、アンシャープマスクに基づくアルゴリズムにより、始めに各静止画より焦点がぼけた焦点ぼけ画像を各々作成する。

次いで、各静止画に対して当該静止画と対応する焦点ぼけ画像との差分画像を所定の割合だけ各々加算することにより各補正画像または各補正動画像を作成する。

図６に戻り、ステップＳ６において、Ｚ方向隣接画素の差分強調処理を行う。
各静止画に対してＺ方向に＋１だけ隣接する静止画との差分画像を各々作成し、各静止画に対して当該静止画に対応する差分画像を所定の割合だけ加算する。

図９は、焦点ぼけ画像と原画像との差分画像の加算処理（ステップＳ５−４）の流れを示すフローチャート図である。
まず、ステップＳ５−４−１においてｙ＝０とし、ステップＳ５−４−２においてｘ＝０とし、ステップＳ５−４−３においてｃ＝０とする。次いで、ステップＳ５−４−４において、差分ｄを求める。

ステップＳ５−４−５において、ｄの絶対値とＳｌとを比較する。ここで、Ｓｌは、加算処理のしきい値であり、例えば“０”である。ここで、ｄの絶対値がＳｌ以上であればステップＳ５−４−６へ、ｄの絶対値がＳｌよりも小さければステップＳ５−４−７へ進む。ステップＳ５−４−６では、以下の処理を行う。

ここで、Ｓｖは、加算処理レベル（実数値）であり、例えば１．０である。

次いで、ステップＳ５−４−７において、ｃを１だけインクリメントし、ステップＳ５−４−８でｃと２とを比較する。ｃが２よりも大きければ、ステップＳ５−４−４に戻り、ｃが２以下であれば、ステップＳ５−４−９に進む。次いで、ステップＳ５−４−１０において、ｘとＸｓとを比較する。ｘがＸｓよりも小さければ、ステップＳ５−４−３に戻り、ｘがＸｓ以上であればステップＳ５−４−１１に進み、ｙを１だけインクリメントする。次いで、ステップＳ５−４−１２において、ｙとＹｓとを比較し、ｙがＹｓよりも小さければステップＳ５−４−２に戻り、ｙがＹｓ以上であれば、処理を終了する（ステップＳ５−４−１３： Ｅｎｄ）。以上の処理により、シャープな画像を得ることができる。

次に、ステップＳ６の詳細について、説明する。
ここでは、画像処理手段が、鮮鋭化する処理に加え、各静止画または各動画のフレームに対してＺ方向に＋１だけ隣接する静止画の差分画像を各々作成し、各静止画に対して当該静止画に対応する差分画像を所定の割合だけ加算することにより補正画像を作成するようにする。尚、上記の処理の代わりに、各静止画に対してＺ方向に−１だけ隣接する静止画との差分画像を各々作成し、各静止画に対して当該静止画に対応する差分画像を所定の割合だけ加算することにより補正画像作成するようにしても良い。

図１０は、ステップＳ６のＺ方向隣接画像との差分強調処理の流れの詳細を示すフローチャート図である。ステップＳ６−１において、補正対象ボクセル画像である、Image(z,x,y,c)と、そのコピーボクセル画像である、Image2(z,x,y,c)とを定義し、z=0,…,Zs-1; x=0,…,Xs-1; y=0,…,Ys-1; c=0,1,2 (RGB)とする。

ステップＳ６−２において、ｚ＝１とする。ステップＳ６−３において、対象画像Image2(z,x,y,c)と隣接画像Image2(z-1,x,y,c)との差分画像と、対象画像Image2(z,x,y,c)とｚ方向の隣接画像Image2(z+1,x,y,c)との差分画像を原現画像Image(z,x,y,c)に加算する。ステップＳ６−４において、ｚを１だけインクリメントし、ステップＳ６−５において、ｚとＺｓ−１とを比較し、前者が小さい場合には、ステップＳ６−３に戻り、ｚがＺｓ−１以上である場合には、処理を終了する（ステップＳ６−６）。以上により、ｚ方向に１つ前の画像と１つ後の画像との差分を求めて、対象画像に加算することで、画像における写り込みの影響を低減することができる。

図１１は、各静止画に対する差分強調処理の詳細な流れを示すフローチャート図である。まず、ステップＳ６−３−１において、ｙ＝０とし、ステップＳ６−３−２において、ｘ＝０とする。さらに、ステップＳ６−３−３において、ｃ＝０とする。ステップＳ６−３−４において、以下の演算を行う。

ここで、Ｓｂ、Ｓｆは、加算ｎｓよりレベルであり、実数値、例えば１．０である。

次いで、ステップＳ６−３−５において、ｃを１だけインクリメントする。ステップＳ６−３において、ｃと２とを比較し、ｃが２よりも大きければステップＳ６−３−４に戻り、ｃが２以下であればステップＳ６−３−７に進み、ｘを１だけインクリメントする。ステップＳ６−３−８において、ｘとＸｓとを比較し、ｘがＸｓよりも小さい場合には、ステップＳ６−３−３に戻り、ｘがＸｓ以上であれば、ステップＳ６−３−９においてｙを１だけインクリメントする。

次いで、ステップＳ６−３−１０において、ｙとＹｓとを比較し、ｙがＹｓよりも小さければ、ステップＳ６−３−２に戻り、ｙがＹｓ以上であれば、処理を終了する（ステップＳ６−３−１１）。
以上の処理により、各静止画像に対する差分を強調する処理を行うことができる。

次いで、再び図６に戻り、ステップＳ７以降において、断面像の対話型表示処理を行う。まず、ステップＳ７において、画面上の断面像の表示位置の指定を行う。次いで、ステップＳ８において、Ｘ・Ｙ各方向の再構成画像としてステップＳ６で得られた補正後の画像をＺ方向につなぎ合わせるようにして疑似断面画像を作成する。次いで、ステップＳ９において、ステップＳ８において作成したＸ・Ｙ各方向の再構成画像として疑似断面画像を出力部６５に出力する。ステップＳ１０において、別の位置を表示させたい場合には（Ｙｅｓ）ステップＳ７に戻り、表示させない場合には（Ｎｏ）、ステップＳ１１において、処理を終了する（Ｅｎｄ）。

ステップＳ９において、ステップＳ８において作成したＸ・Ｙ各方向の再構成画像として疑似断面画像を出力部６５に出力するために記複数のＺ方向の位置が異なる補正画像、選択された１点のＺ位置に対応する補正画像を画面上に表示し、画面上の任意の１点をＸＹ表示位置として指示できるようにするＸＹ表示位置部として、図５の操作部６７、具体的には、マウスなどを用いることができる。

上記の各処理を行った後の画像の例について示す。図１２は、補正前の顕微鏡画像の一例を示す図であり、Ｚ＝１から６２までの画像を示す図である。図１３は、図１２に対応する補正後の画像を示す図であり、ここで、図１１のＳｂ＝Ｓｆ＝０．５である。Ｚ＝３０で合焦していることがわかる。図１２の補正前と図１３の補正後の平面画像を比較すると、補正後の画像は、Ｚについてより広い範囲で、細胞の輪郭を明りょうに得ることができることがわかる。

図１４は、図１３に示す補正後の平面画像（Ｚ＝３０）と、水平方向の直線Ｌ１と垂直方向の直線Ｌ２で切った断面構造とを、中央部及び、上記画像処理に基づいて得た解析断面画像を下辺及び右辺に示した図である。解析断面画像は、実際の断面画像とは異なるが、本実施の形態による画像処理を行うことで、断面構造を反映した疑似断面構造を得ることができることがわかる。

図１４の下辺には、Ｃｈ１からＣｈ７と明示した７個の細胞の疑似断面構造が明瞭に映っている。水平方向に引かれた白線Ｌ３は底板１ｂ表面に対応し、Ｃｈ１、Ｃｈ２、Ｃｈ３、Ｃｈ５、Ｃｈ７は細胞の裾野が白線Ｌ３まで延びているため、底板１ｂ表面に接着していると判断できる。
これに対して、Ｃｈ４とＣｈ６は細胞の裾野が白線Ｌ３に届いておらず、浮遊（剥離）していると判断できる。

同様に、図１４の右辺には、Ｃｖ１からＣｖ５と明示した５個の細胞の疑似断面構造が明瞭に映っている。垂直方向に引かれた白線Ｌ４は、底板１ｂ表面に対応し、Ｃｖ１、Ｃｖ２、Ｃｖ３は細胞の裾野が白線Ｌ４まで延びているので底板１ｂ表面に接着していると判断できるのに対し、Ｃｖ４とＣｖ５は細胞の裾野が白線Ｌ４に届いておらず、浮遊（剥離）していると判断できる。

尚、細胞の疑似断面構造において、上端または下端の裾野が放射状に広がっているのは、光の回折（細胞本体の映り込み）によるものであり、上端または下端では補正に使用するための隣接フレームが十分に存在しないため、前述の差分強調処理で補正（削除）しきれていないことに起因する。

図１４に示す画像では、水平方向の直線Ｌ１と垂直方向の直線Ｌ２とを、例えばマウスで移動させることで、任意の位置における疑似断面構造を得ることができる。

次に、本発明の第２の実施の形態によるマルチディメンジョナル細胞断面解析法について説明する。本実施の形態では、複数の静止画を所定の時間が経過するまで繰り返し取得し、時系列に取得された複数の動画を基に、動画像中の指定された位置の水平方向および垂直方向の深さ方向の断面画像を作成する。

図１５は、本実施の形態によるマルチディメンジョナル細胞断面解析法の原理図であり、図３に対応する図である。本実施の形態では、光学顕微鏡により、焦点を所定の間隔で複数の個所に移動させながらＺ方向の位置が異なる複数の静止画を所定の時間間隔で所定の時間経過するまで繰り返し撮像し、複数の動画像を取得する。図１５では、図３と異なり、タイムプラスの撮影が行われる。このタイムプラスの撮像スライス像は、以下の式で表される。

ここで、撮像スライス像を、符号Ｓ１１で示すＸ−Ｚ平面で切ったＸ方向の再構成断面動画像は、以下の式で表される。

一方、撮像スライス像を、符号Ｓ１２で示すＹ−Ｚ平面で切ったＹ方向の再構成断面動画像は、以下の式で表される。

以上の原理に基づいて、Ｘ方向、Ｙ方向などの所望の断面動画像を再構成し疑似断面画像を求めることができる。

図１６は、本実施の形態によるマルチディメンジョナル細胞断面解析法の処理の流れを示すフローチャート図である。

まず、ステップＳ２１において、顕微鏡５１をセットアップし、視野を設定し、計時を開始する。次いで、ステップＳ２２において、基板位置（底板１ｂ）に焦点を設定する。ステップＳ２３において、撮像部５３により静止画を撮影し、メモリ６８に記録する。次いで、ステップＳ２４において、ＸＹＺステージ１１のステップ移動を行い、ステップＳ２５で、焦点面が水面３ａ内であるか否かを判定する。水面内であれば（Ｙｅｓ）、ステップＳ２３に戻り、水面を超えた場合には（Ｎｏ）ステップＳ２６に進み、指定時間だけ待ってから撮影回数をインクリメントする。ステップＳ２７において、撮影時間が上限を超えたか否かを判定し、上限に至っていない場合には（撮影時間＜上限）、ステップＳ２２に戻る。上限を超えていれば、すなわち、撮影時間が上限に達していれば、ステップＳ２８に進む。ここで、撮影時間の上限とは、Ｚステージを移動させながらの撮影での撮影時間が焦点面が水面から出る直前の撮影時間を指す。
次いで、ステップＳ２８，２９において、図６のステップＳ５、Ｓ６と同様の処理を行う。

以降において、断面像の対話型表示処理を行う。まず、ステップＳ３０において、画面上の断面像の表示位置の指定を行う。次いで、ステップＳ３１において、Ｘ・Ｙ各方向の再構成動画像として疑似断面動画像を作成する。次いで、ステップＳ３２において、ステップＳ３１において作成したＸ・Ｙ各方向の再構成動画像を出力部６５に出力する。ステップＳ３３において、別の位置を表示させたい場合には（Ｙｅｓ）ステップＳ３０に戻り、表示させない場合には（Ｎｏ）、処理を終了する（Ｅｎｄ）。

これにより、複数のＺ方向の位置が異なる補正動画像よりＸＹ表示位置のＸ座標に対応する全ての画素を抽出して２次元のＹＺ動画像を作成するとともに、ＸＹ表示位置のＹ座標に対応する全ての画素を抽出して２次元のＸＺ動画像を作成し、２つの２次元のＹＺ動画像又はＸＺ動画像を画面に表示させることができる。

以上に説明したように、本実施の形態によれば、特別な装置を用いることなく、培養液中の剥離細胞と接着細胞との疑似断面画像を求めることができる。
従って、剥離細胞と接着細胞との識別を簡単に行うことができるという利点がある。

上記の実施の形態において、添付図面に図示されている構成等については、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を発揮する範囲内で適宜変更することが可能である。その他、本発明の目的の範囲を逸脱しない限りにおいて適宜変更して実施することが可能である。上記細胞画像処理方法をコンピュータに実行させるためのプログラム、当該プログラムを記録するコンピュータ読み取り可能な記録媒体であっても良い。

本発明は、剥離細胞の検出のための画像処理装置として利用可能である。

Ａ…断面画像解析システム、１…培養皿、１ｂ…底板、３…培養液、５…剥離細胞、７…接着細胞、１１…ＸＹＺステージ、１５…透過光源、１７…対物レンズ、１７…光学顕微鏡、２１…ＸＹＺステージコントローラ、オートフォーカス・ユニット、２３…ビデオカメラ、２５…ビデオ・フレームメモリ、２７…制御用パソコン、３１…モニター、５０…撮像機構、５１…顕微鏡、５３…撮像部、５５…移動機構、５７…画像補正部１（シャープネス補正部）、６１…画像補正部２（差分強調処理部）、６２…画像処理部（断面画像再構成部）、６３…断面画像表示処理部、６５…出力部、６７…操作部、６８…メモリ。

Claims (8)

1. 底板を有する細胞培養器具内の細胞と液体とを含む系を底板に対して水平方向の第１の方向に移動させながら顕微鏡で焦点を合わせて観察し、鉛直方向の位置が異なる複数の合焦画像を、前記第１の方向と交差する底板に対して水平方向の第２の方向と前記第１の方向及び第２の方向と交差する底板に対して垂直方向の第３の方向とにより画定される複数の２次元平面画像として撮像する撮像機構と、
   前記撮像機構により撮像された前記複数の合焦画像のそれぞれに対して画像を鮮鋭化する補正処理を行う画像補正部と、
   前記画像補正部により補正された後の前記複数の合焦画像に基づいて、前記２次元平面上の任意の点を通り、前記第２の方向又は前記第３の方向のいずれかの断面を、前記複数の合焦画像をつなぎ合わせるように再構成し疑似断面画像を生成する画像処理部と、を有し、
   前記疑似断面画像に基づいて、前記第３の方向の位置が異なる、前記鮮鋭化する補正処理を行った画像と、鮮鋭化する補正処理を行う前の平面画像とを比較して、細胞の裾野が前記底板の表面に対応する線まで延びているか否かにより、接着細胞であるか剥離細胞であるかを判定することを特徴とする細胞断面解析装置。
2. 前記撮像機構は、
   前記合焦画像を所定の時間間隔で繰り返し撮像して複数の動画像を取得し、
   前記画像処理部は、前記複数の動画像に基づいて疑似断面動画像を生成することを特徴とする請求項１に記載の細胞断面解析装置。
3. 前記画像補正部は、前記複数の合焦画像を鮮鋭化する処理として、アンシャープマスクに基づくアルゴリズムにより、前記複数の合焦画像よりも焦点がぼけた焦点ぼけ画像を作成し、前記複数の合焦画像と、対応する前記焦点ぼけ画像との差分画像を所定の割合だけ各々加算することにより補正を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞断面解析装置。
4. 前記画像補正部は、
   前記鮮鋭化する処理に加え、前記複数の合焦画像に対して、前記鉛直方向の第１の方向又は前記第１の方向と反対の方向に１フレーム分だけ隣接する静止画または動画のフレームとの差分画像を各々作成し、前記各静止画または各動画のフレームに対して当該静止画または動画のフレームに対応する差分画像を所定の割合だけ加算することにより補正を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞断面解析装置。
5. 前記撮像機構は、
   前記液体として培養液を入れる前記細胞培養器具の前記底板の表面に対して焦点があったＺ１位置と、前記細胞培養器具中の培養液面に対して焦点があったＺ２位置とを設定し、光学顕微鏡により焦点を前記Ｚ１位置と前記Ｚ２位置との範囲で所定の間隔で複数の個所に移動させながらＺ方向の位置が異なる複数の画像を撮像し、
   前記画像補正部による補正の対象画像とＺ方向の第１の隣接画像との差分画像と、前記対象画像とＺ方向の前記第１の隣接画像と反対側の第２の隣接画像との差分画像と、を原画像に加算することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の細胞断面解析装置。
6. 指定された前記２次元平面上の任意の点を含む平面であって前記第２の方向と前記第１の方向により形成される平面又は前記第３の方向と前記第１の方向により形成される平面で切った少なくともいずれかの前記疑似断面画像を、前記２次元平面の画像と対応させて表示画面に表示させる表示制御部を有することを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項に記載の細胞断面解析装置。
7. 底板を有する細胞培養器具内の細胞と液体とを含む系を底板に対して水平方向の第１の方向に相対的に移動させながら顕微鏡で焦点を合わせて観察し、前記第１の方向の位置が異なる複数の合焦画像を、前記第１の方向と交差する底板に対して水平方向の第２の方向と前記第１の方向及び前記第２の方向と交差する底板に対して垂直方向の第３の方向とにより画定される複数の２次元平面画像として撮像する撮像ステップと、
   撮像機構により撮像された前記複数の合焦画像のそれぞれに対して画像を鮮鋭化する補正処理を行う画像補正ステップと、
   画像補正部により補正された後の前記複数の合焦画像に基づいて、前記２次元平面上の任意の点を通り、前記第２の方向又は前記第３の方向のいずれかの断面を、前記複数の合焦画像をつなぎ合わせるように再構成し疑似断面画像を生成する画像処理ステップとを有し、
   前記疑似断面画像に基づいて、前記第３の方向の位置が異なる、前記鮮鋭化する補正処理を行った画像と、鮮鋭化する補正処理を行う前の平面画像とを比較して、細胞の裾野が前記底板の表面に対応する線まで延びているか否かにより、接着画像であるか剥離画像であるかを判定することを特徴とする細胞断面解析方法。
8. 請求項７に記載の細胞断面解析方法をコンピュータに実行させるための細胞断面解析プログラム。

Images