JP5843113B2

JP5843113B2 - 含ケイ素置換基を導入した化合物、並びにそれを含む一重項酸素発生剤及び癌治療薬

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Publication number: JP5843113B2
Application number: JP2012531819A
Authority: JP
Inventors: 堀内　宏明; 宏明堀内; 正博穂坂; 平塚　浩士; 浩士平塚; 利行竹内; 荘一郎久新; 真太郎石田
Original assignee: Gunma University NUC
Current assignee: Gunma University NUC
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2011-08-24
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2031-08-24
Also published as: JPWO2012029609A1; WO2012029609A1

Description

本発明は含ケイ素置換基を導入した新規化合物に関する。本発明はまた、該化合物を含む一重項酸素発生剤および癌治療薬に関する。

癌は日本人の最大の死亡要因であり、その治療法の発展は世界中で強く望まれている。現在の主な治療法は外科手術による腫瘍組織の切除や、長期にわたる放射線治療あるいは抗癌剤治療などである。組織を切除してしまうと、機能を喪失あるいは機能の低下が問題となり、放射線治療や抗癌剤治療は長期療法であり、患者は長期間副作用などに苦しむ。そのため、患者のQuality of Life (QOL)が著しく低下する問題点がある。
この様な問題を解決するための新たな癌治療法として、光線力学療法(Photodynamic Therapy; PDT)が注目を集めている。この治療では、薬剤である光増感色素を一度注射し、可視光照射を行うのみであり、組織の温存が可能であり、患者への負担が低いメリットがある。この治療法の原理は以下の通りである。１．光増感色素を注射してから数時間待つと、光増感色素が腫瘍に集積する。２．腫瘍に選択的に赤色光を照射すると、集積した光増感色素が励起され、活性酸素種である一重項酸素が発生する。３．一重項酸素が周囲の癌細胞を攻撃し、死滅させる。

現在、いくつかの光増感色素が報告され（特許文献１，２、非特許文献１など）、認可され既に臨床応用されているものもあるが、光増感色素の性能は十分でなく、副作用である光線過敏症を防ぐために患者は治療後数週間は暗室での生活を強いられる。また、現段階では進行癌に対しては十分な効果が得られない。そのため、光増感色素のさらなる改良が求められている。
改良が求められている主な項目は、１．腫瘍への選択的集積性、２．細胞による光増感色素の取り込み効率、３．赤色光に対する光吸収効率、４．一重項酸素の生成効率である。本発明者らは、これまでに代表的な光増感色素であるポルフィリン誘導体にケイ素置換基を導入することにより、一重項酸素の生成効率が向上することを見いだし、特許出願を行った（特許文献３）。

特開２００２−５２３５０９号公報特開２００４−００２４３８号公報再表２００７／０２３７６６号公報

Coordination Chemistry Reviews, 248 (2004), p321-350

本発明は、現状ではまだ改良が望まれている光線力学療法の性能をさらに向上させることを課題とする。具体的には、一重項酸素の生成効率に加えて、腫瘍への選択的集積性と細胞による光増感色素の取り込み効率などを向上させることを課題とする。

本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、ポルフィリン類縁体やフタロシアニン誘導体などの化合物にケイ素を含む置換基とともにCOO^-基を導入することで、一重項酸素の発生効率が上昇するだけでなく、細胞への取り込み率および腫瘍組織への蓄積性も向上することを見出し、それにより、これらの化合物は癌治療などに有用な一重項酸素発生剤として好適に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記一般式（I）〜（IV）のいずれかで示される化合物。
（２）下記（I-1）、（II-1）または（III-1）で示される化合物。
（３）（１）または（２）の化合物を含む一重項酸素発生剤。
（４）（３）の一重項酸素発生剤を含む癌治療薬。
（５）癌治療のための一般式（I）〜（IV）のいずれかで示される化合物。
（６）一般式（I）〜（IV）のいずれかで示される化合物を患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
（７）一重項酸素を発生させるための一般式（I）〜（IV）のいずれかで示される化合物の使用。
（８）一般式（I）〜（IV）のいずれかで示される化合物に光を照射する工程を含む、一重項酸素の発生方法。

本発明の化合物は、１．一重項酸素の生成効率、２．細胞による取り込み効率、３．腫瘍への選択的集積生、の三つの性能が同時に向上しており、癌治療効果が著しく向上している。本発明の化合物は600〜800nmの可視光でも励起することができるため、人体への浸透距離も長く、深部においても一重項酸素を発生させることができるという利点も有している。

SiC₄とC₄の一重項酸素のスペクトル。担癌ヌードマウスにC₄（左）またはSiC₄（右）を投与した後に光照射を行った結果を示す図（写真）。 SiC₄を投与し、光照射した後の腫瘍サイズの経時変化を示す図。薬剤（C₄、SiC₄またはSiS₄）を含む培地で培養した癌細胞の蛍光像を示す図（写真）。薬剤（C₄、SiC₄またはSiS₄）を含む培地で培養した癌細胞に光照射を行った際の細胞生存率の変化を示す図。薬剤（C₄、SiC₄またはSiS₄）を静脈注射した担癌ヌードマウスの蛍光像（写真）。担癌ヌードマウスの癌組織、筋肉、血液におけるSiC₄化合物の濃度の経時変化を示す図。

以下に本発明を詳しく説明する。
本発明において、「一重項酸素発生剤」とは、光を照射することによって一重項酸素を発生しうる物質をいう。
本発明の一重項酸素発生剤は下記一般式（I）〜（IV）で表される化合物群から選ばれる１種類以上の化合物を含む。

一般式（I）において、R₁〜R₂₀の少なくとも１つ（好ましくは3個以上、より好ましくは3〜8個、特に好ましくは4〜8個）は下記（i）〜（ii）より独立して選ばれる置換基であり、R₁〜R₂₀の少なくとも１つ（好ましくは4個以上、より好ましくは4〜8個）は下記（a）の置換基である。
一般式（II）において、R₁〜R₂₄の少なくとも１つ（好ましくは3個以上、より好ましくは3〜8個、特に好ましくは4〜8個）は下記（i）〜（ii）より独立して選ばれる置換基であり、R₁〜R₂₄の少なくとも１つ（好ましくは4個以上、より好ましくは4〜8個）は下記（a）の置換基である。
一般式（III）において、R₁〜R₂₈の少なくとも１つ（好ましくは3個以上、より好ましくは3〜8個、特に好ましくは4〜8個）は下記（i）〜（ii）より独立して選ばれる置換基であり、R₁〜R₂₈の少なくとも１つ（好ましくは4個以上、より好ましくは4〜8個）は下記（a）の置換基である。
一般式（IV）において、R₁〜R₁₆の少なくとも１つ（好ましくは3個以上、より好ましくは3〜8個、特に好ましくは4〜8個）は下記（i）〜（ii）より独立して選ばれる置換基であり、R₁〜R₁₆の少なくとも１つ（好ましくは4個以上、より好ましくは4〜8個）は下記（a）の置換基である。
（i）と（ii）では、（i）がより好ましい。

一般式（i）〜（ii）において、Ra、Rb、Rcは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、トリメチルシリルより選ばれる置換基である。またnは1以上の整数であり、好ましくは１〜５の整数である。

一般式(a)においてRa、Rbは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、トリメチルシリルより選ばれる置換基である。またmは0以上の整数であり、好ましくは０〜５の整数である。
なお、COO^-はNa⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺などのイオンが配位していてもよいし、水素原子が結合していてもよい。
また、上記一般式（I）〜（IV）の化合物においては、Ｒ_n（ｎはそれぞれ１〜２０、１〜２４、１〜２８及び１〜１６の整数）の少なくとも１つが（i）〜（ii）より選ばれる置換基であり、少なくとも１つが（a）の置換基であればよく、それ以外のＲ_nは水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、トリメチルシリルより選ばれる置換基である。

上記一般式（I）で表される化合物は、例えば、後述の合成例１のようにして合成することができる。
上記一般式（II）で表される化合物は、例えば、後述の合成例２のようにして合成することができる。
上記一般式（III）で表される化合物は、例えば、後述の合成例３のようにして合成することができる。

なお、一般式（I）〜（III）で表される化合物においては、少なくとも１つのベンゼン環の３位と５位に（i）〜（ii）より独立して選ばれる置換基と（a）の置換基が導入されていることが特に好ましい。

上記一般式（IV）で表される化合物は、例えば、次のようにして合成することができる。

本発明の一重項酸素発生剤として特に好ましい形態としては、下記式（I-1）、（II-1）および（III-1）で表される化合物が挙げられる。

本発明の一重項酸素発生剤は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、上記一般式（I）〜（IV）から選択される化合物をそのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、注射剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、静脈投与等）に投与することができる。なお、一般式（I）〜（IV）の化合物は癌組織に蓄積しやすいため、単独で投与してもよいが、リポソームなどを用いた薬品輸送システム(DDS)の手法により、標的組織に到達しやすいような形で投与してもよい。
なお、一般式（I）〜（IV）の化合物は環の中心にＺｎ²⁺、Ｃｕ²⁺(II)、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺などの金属が結合したものを用いることもできる。

一般式（I）〜（IV）の化合物の製剤中の含有量は、製剤全体の約０.０１ないし約１００重量％である。一般式（I）〜（IV）の化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより異なり特に制限されないが、一般的に、一回の投与あたり、約０.１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇである。

薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。

一重項酸素を発生させて光線力学療法（photodynamic therapy）に用いるためには、一般式（I）〜（IV）を投与した後に、適当な波長の光を照射する。
照射時間は、患者の年齢や性別、疾患の種類や程度、光源と患部との距離などによって適宜選定される。波長は一重項酸素を発生させうる波長であれば特に制限されないが、光線力学療法を行う場合は６００〜８００ｎｍが好ましい。照射は体外から行ってもよいし、光ファイバーなどを標的組織近傍に挿入して行ってもよい。また、白血病患者から骨髄を取り出して、インビトロで一般式（I）〜（IV）の化合物による処理をし、処理された骨髄を患者に戻すというような態様も含む。

一重項酸素を発生させることにより細胞を破壊することができる。したがって、本発明の一重項酸素発生剤を適用することのできる疾患は、一重項酸素を発生させて細胞を破壊することによって治療されうるものであれば特に制限されないが、癌、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、自己免疫疾患およびＴ細胞仲介性免疫アレルギー、細菌の感染症、ウイルス感染、加齢性黄斑変性、にきびなどが例示される。このなかでは、癌が特に好ましい。癌の種類は特に制限されないが、肺癌、悪性リンパ腫(例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等)、消化器癌（例えば、胃癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等）、乳癌、卵巣癌、播種性多発性骨髄腫、膀胱癌、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病の急性転化を含む急性白血病等）、腎臓癌、および前立腺癌等が例示される。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

合成例１
＜5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンナトリウム塩の合成＞
5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンナトリウム塩（以下、SiC₄と呼ぶことがある）は以下の手順で合成した。
1,3,5-トリブロモベンゼンを乾燥ジエチルエーテル中、-78℃で等量のn-ブチルリチウムでリチオ化し、次いでクロロトリメチルシランと反応させたところ、95%の収率で3,5-ジブロモトリメチルシリルベンゼンが得られた。
次にこれを乾燥ジエチルエーテル中、-78 ℃で等量のn-ブチルリチウムでリチオ化し、次いでDMFと反応させたところ、45%の収率で3-ブロモ-5-トリメチルシリルベンズアルデヒドが得られた。
これを乾燥トルエンに溶かし、p-トルエンスルフォン酸存在化でエチレングリコールと反応させ、90%の収率で3-ブロモ-5-トリメチルシリルベンズアルデヒドエチレンアセタールを得た。
次にこれを乾燥THF中でマグネシウムと反応させた後、0 ℃で二酸化炭素と反応させ、40%の収率で3-カルボキシ-5-トリメチルシリルベンズアルデヒドエチレンアセタールを得た。これを塩酸で処理することにより、3-カルボキシ-5-トリメチルシリルベンズアルデヒドを得た。
次に、これをDMF中において炭酸カリウム存在下でヨウ化エチルと反応させ、3-カルボキシ-5-トリメチルシリルベンズアルデヒドエチルエステルを得た。
これをクロロホルム中でピロール、フッ化ホウ素エーテル錯体と反応させ、その後DDQで処理することにより、5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンエチルエステルを得た。
最後にこれを水酸化ナトリウムで処理することにより、5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンナトリウム塩を得た。

5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンの¹H NMRデータを以下に示す。
δH (300 MHz, CD₃CN) 9.40 (8H, s, pyrrole β-H), 9.35 (4H, s, ph-H), 9.19 (4H, s, ph-H) , 9.16 (4H, s, ph-H), 0.99 (36H, s, Me) and -2.29 (2H, s, N-H).

合成例２
＜5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)クロリンナトリウム塩の合成＞
5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンエチルエステルを乾燥ピリジン中でp-トルエンスルフォニルヒドラジドと炭酸カリウムで処理した後、クロラニルで処理することにより5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)クロリンエチルエステルを得た。これを水酸化ナトリウムで処理することにより、5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)クロリンナトリウム塩を得た。

合成例３
＜5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)バクテリオクロリンナトリウム塩の合成＞
5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)ポルフィリンエチルエステルを乾燥ピリジン中でp-トルエンスルフォニルヒドラジドと炭酸カリウムで処理することにより5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)バクテリオクロリンエチルエステルを得た。これを水酸化ナトリウムで処理することにより、5,10,15,20-テトラキス(3-カルボキシル-5-トリメチルシリルフェニル)バクテリオクロリンナトリウム塩を得た。

下記の実施例では下記の化合物C₄を比較対象として用いた。

実施例１
＜一重項酸素の発生＞
C₄およびSiC₄のそれぞれの化合物をエタノール中に吸光度０．１の濃度で溶解した後、YAG LASER（Lotis TII LS-2137U）を用いて３５５ｎｍの光を照射した。一重項酸素の測定には、近赤外用光電子倍増管(浜松ホトニクスR5509-42)を用いた自作の赤外発光測定装置を用いた。なお、測定は17回行い、その平均値を図１に示した。
その結果、λmax＝1270nmの位置に、化合物によって増感された一重項酸素のりん光スペクトルが測定された。SiC₄の一重項酸素生成の量子収率Φは０．７２であり、C₄の１．２９倍であった。これにより、C₄にSiを含む置換基を導入することにより一重項酸素の発生効率が上昇することがわかった。
なお、エタノール溶液中にアルゴンガス（Ar）を注入した場合は、りん光はほとんど発生せず、このことから、観察されたスペクトルは一重項酸素によるものであることが確かめられた。

実施例２
＜担癌動物における癌治療効果＞
癌細胞(SCC7：Shaojuan Zhang, Masahiro Hosaka, Toshitada Yoshihara, Kazuya Negishi, Yasuhiko Iida, Seiji Tobita, and Toshiyuki Takeuchi, Cancer Research, 2010, 70, 4490.)を植え付けたヌードマウスを用いて開発したケイ素置換基を有する治療薬SiC₄（100nmol）を静脈注射して4時間後に光線力学治療を行った（400-800 nm, 28 mW/cm², 30 min）ところ、6日後には腫瘍部位が消失し、かさぶたとなった（図２）。ケイ素置換基を持たない化合物C₄ではこのような変色はほとんど見られなかった。治療後の腫瘍サイズの経時変化を図３に示す。C₄では時間経過と共に腫瘍サイズは増大するが、SiC₄では腫瘍が消失した。この様に、ケイ素置換基の導入により治療薬としての性能が大きく向上した。

実施例３
＜癌細胞への取り込み評価＞
SiC₄あるいはC₄を15μM含む培地で12時間培養した癌細胞(U251)の蛍光イメージを図４に示す。SiC₄では強い蛍光が観測されたが、C₄ではほとんど蛍光は見られなかった。SiC₄の蛍光量子収率(0.054)はC₄のもの(0.046)とほぼ同じであることから、ケイ素置換基を導入することにより細胞による取り込み効率が著しく向上することがわかった。また、再表2007/023766号公報に記述した下記の化合物(SiS₄)と比較してもSiC₄の方が強い蛍光を示している。SiS₄の蛍光量子収率は0.059であり、SiC₄と同等の量子収率であるため、SiS₄より今回の化合物であるSiC₄の方が癌細胞に取り込まれやすいことがわかった。

実施例４
＜培養癌細胞に対する効果＞
癌細胞(U251: Masanori Aihara, Ken-ichi Sugawara, Seiji Torii, Masahiro Hosaka, Hideyuki Kurihara, Nobuhito Saito and Toshiyuki Takeuchi, Laboratory Investigation (2004) 84, 1581)を用いて培養細胞レベルにおいて薬剤の活性を評価したところ、ケイ素置換基を導入したSiC₄（15μM）ではわずかな光照射線量（8 J/cm²）でも癌細胞をほぼ100%死滅させることができたが、ケイ素置換基を持たないC₄では同程度の光照射を行っても癌細胞を殺すことはほとんどできなかった（図５）。この結果から、ケイ素置換基の導入により、一重項酸素の生成効率と細胞による取り込み効率の両方が向上し、薬剤の効率を高めていることがわかる。また、培養癌細胞に対するSiC₄の活性を、SiS₄と比較すると、SiC₄はSiS₄のおよそ6倍の活性を持つこともわかった。

実施例５
＜担癌動物における腫瘍集積性の評価＞
さらにケイ素置換基による薬剤の腫瘍集積性を明らかにするために、担癌ヌードマウスを用いて、薬剤の局在評価を行った(図６)。図６では腫瘍の部位を○で囲って示している。SiS₄（100nmol）をマウスの尾から静脈注射し、2時間後の蛍光イメージを図６下に示す。SiS₄は尾に留まっており、全身に輸送されないことがわかった。さらに投与から6時間後にはマウスが死亡してしまい、毒性があった。そのため、SiS₄は光線力学療法には用いることができないことが明らかになった。これに対しSiC₄やC₄では、静脈注射すると全身に行き渡り、毒性も無く、SiS₄が持つ問題点を解決できた。C₄とSiC₄を静脈注射から24時間後の蛍光イメージをそれぞれ図６上および中に示す。C₄では腫瘍部分からはほとんど薬剤による蛍光は観測されなかったが、SiC₄では腫瘍から強い蛍光が観測された。このことからケイ素置換基の導入により、腫瘍集積性も向上することがわかった。

また、図７には、担癌マウスにおける各組織へのSiC₄の集積性を定量評価した。その結果、投与後12時間において腫瘍中の濃度を1とすると、筋肉中の濃度は0.25、血液中の濃度は0.46であり、SiC₄は腫瘍に選択的に集まっていることがわかった。

以上の結果から、再表2007/023766号公報に記載されたSiS₄が持つ問題はスルホン酸基をカルボキシル基に変更することにより解決できた。さらに薬剤にケイ素置換基を導入することにより、一重項酸素の生成効率、細胞による取り込み効率、腫瘍集積性が向上し、癌の治療効果が向上することがわかった。

本発明の含ケイ素置換基を導入した化合物は癌の光治療などに用いられる光線力学療法（photodynamic therapy）に好適に用いることができる。

Claims

下記式一般式（I'）〜（III'）のいずれかで表される化合物。
一般式(I')においてRa、Rb、Rcは独立して水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチルより選ばれる置換基である。
下記化合物のいずれかである、請求項１に記載の化合物。
請求項１または２に記載の化合物を含む、一重項酸素発生剤。
請求項３に記載の一重項酸素発生剤を含む癌治療薬。