JP5726525B2

JP5726525B2 - 細胞および組織の凍結保存用組成物

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Inventors: 和明松村; 一須賀井; 玄　丞烋; 丞烋玄
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Description

本発明は、ヒトを含む動物細胞および組織の凍結解凍障害を軽減可能な凍結保存剤に関する。また、皮膚、角膜、膵島、心臓弁など他の生体組織移植分野及び造血幹細胞、間葉系幹細胞、ES細胞、iPS細胞などの幹細胞を用いる再生医療分野においてもこの技術の需要は高まると予測される。

植物や動物の細胞、組織、あるいは食品などの水を含む物質を長期に保存するために０℃以下の温度で凍結保存法が日常的に用いられている。しかし、これら水を含有する物質を凍結すると、凍結中に水分子同士が、溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水分子のみからなる氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生することが知られている。

このような凍結濃縮を防止するため、様々な低分子化合物を添加する方法が行われている。例えば、細胞の凍結保存を行う場合に、凍結保存中に起こる細胞内の結晶化による細胞へのダメージを最小限に抑えるために、凍結保護剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセロール等を添加する方法が行われている。

すなわち、5〜20%のジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの凍結保存剤を含む培養液などの生理的溶液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に-80℃もしくは-196℃の極低温で凍結保存するのが一般的である。

そのなかで最も効果が高く、よく用いられているのがジメチルスルホキシドである。しかしジメチルスルホキシドが特に高い濃度では生理学的に有毒であり、凍結保存された細胞を注入された患者に高血圧、悪心、嘔吐を引き起こすことも知られている。ジメチルスルホキシドの毒性により解凍した細胞の培養時もしくは生体に注入した後の生存率や機能が低下する問題もある。

また、グリセリンなどのその他の凍結保存剤は効果が低いため、細胞を懸濁してしばらく室温もしくは冷蔵で放置してから凍結する必要や、プログラムフリーザーなどによる厳密な温度管理が必要とされる。また、凍結保護効果が低く、解凍後の機能が低下するなどの問題がある。

一方、ES細胞やiPS細胞などの幹細胞や精子、卵子、受精卵などでは例えばジメチルスルホキシド、アセトアミド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの高濃度の凍害保護物質を含有する急速凍結法（ガラス化法）が知られている。ガラス化法とは急激に低温にすることで細胞に含まれる水分をガラス状にし、氷晶形成による障害を避ける方法である。しかしながら、この際に用いられる高濃度の凍害防止剤の毒性が高いため、細胞や組織を損傷する可能性が高く、組織の凍結保護には限定的にしか用いられていない。

他方、医薬品や食品、ディスプレイ用の氷を製造する場合に、塩化ナトリウム等の塩類や、グルコース、トレハロース等の糖類を添加することも行われている。さらに、植物や魚類、昆虫などが産生する不凍蛋白質や不凍糖蛋白質の添加が知られている（特許文献3〜4）。

また、燃料電池においては、電気化学反応に伴って一方の電極で水が生じる。例えば、固体高分子型燃料電池では、カソード電極において水が生じる。また、生じた水の一部は、電解質膜を介してアノード側へと移動する。このように燃料電池内で生じた水、あるいは、燃料電池に供給されるガス中の水蒸気が燃料電池内で凝縮すると、燃料電池内におけるガス流れが妨げられる可能性がある。そして、電極へのガスの供給が妨げられることによって、電池性能が低下する可能性がある。このような、凝縮水がガス流れを妨げることに起因する不都合を防止するための構成として、燃料電池の内部、例えばガスセパレータの表面にタンパク質などの親水性塗膜を設けることによって、水の滞留を抑える構成が知られているが、低温条件下においては、液水が凍結することに起因する不都合が生じる場合があった。上記目的を達成するために、例えば、固体高分子電解質膜の表面層をなす硬化性樹脂に、高分子電解質ととともに、液水からの氷の結晶の成長を抑制する不凍タンパク質を添加する方法がある（特許文献5）が、これもコストが高いなどの問題がある。

特表平10-511402 特許第3694730号特開2005-126533 特開2003-250506 特開2008-041596

Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395, 1959 Polge C, Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666, 1949 Miszta-Lane H, Gill P, Mirbolooki M, Lakey JRT. Cell Preserv Technol 5,16-24, 2007 Ha SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY. Human Reproduction 20,1779-1786, 2005 Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al. INT J HEMATOL ≡87: 189-194 ;2008 Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer S. Toxicol in Vitro 20:265-271; 2006

急速冷凍法を含む現状の凍結保存法では、凍結解凍後の細胞・組織の完全な形での保存が困難であり、毒性の低い新たな凍結保存物質が待ち望まれている。また、ジメチルスルホキシドはHL-60細胞などの分化を誘導することがわかっており、保存に適しない細胞もある。一方、不凍蛋白質や不凍糖蛋白質は凍結濃縮を防止する効果には優れているものの、あまりにも高価（130万円/ｇ）で食品などへの応用には限界がある。

そこで本発明は、ジメチルスルホキシドに代わる、低毒性でさらに細胞組織の保護効果に優れた凍結保存剤を提供することを目的とする。また、本発明は、食品や医薬などの冷凍保存や凍結乾燥保存を行うにあたり、不凍蛋白質や不凍糖蛋白質と同等な凍結濃縮を防止する効果を有し、安価でしかも安全なものを提供しようとするものである。

本発明の凍結保存液は、アミノ基を側鎖にもつポリアミンを実質上1-50%を含み、その他組成は生理食塩水や培養液成分などの生理的溶液である。

様々なヒトを含む動物細胞、植物細胞を該保存液に浸漬して-80℃または液体窒素中もしくは液体窒素蒸気中で凍結保存することで毒性の高いジメチルスルホキシドなどの既存の凍結保存剤を使用せずに生存率、生理活性を維持したまま保存することが可能である。既存のジメチルスルホキシドやグリセリン、エチレングリコールなどの凍結保存剤を使用しないため、凍結する細胞に対する毒性が低く抑えられ、機能を維持したまま長期間凍結保存することが可能である。また、ウシ胎児血清、アルブミンなどのタンパク質成分を使用しないため感染症などの心配がなく、生物製剤によるロット間格差も影響しない。

ε-ポリ-L-リジンやポリアリルアミンなどのアミノ基を側鎖にもつポリアミンは、そのアミノ基により細胞膜親和性を持つため、細胞の保護効果があると考えられる。また、カルボキシル基を分子中に多数持つ高分子化合物は水との親和性が高く、細胞内の液体を凍結中に速やかに外に排出することを助けることから細胞の凍結保存時の保護効果があると期待される。これら両官能基を分子中に適度な割合で持つことでさらに優れた凍結時細胞保護効果が期待できる。そこで本発明においては側鎖にアミノ基などのカチオン性置換基をもつポリアミノ酸もしくはカルボキシル基などのアニオン性置換基を持つ高分子化合物、およびカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ高分子化合物の条件を鋭意検討することにより、有効性と安全性の高い凍結保存液を提供する。

また、本発明の凍結保存剤はDMSOに比べて毒性が低いため、解凍後の洗浄が不要で、そのまま培地に添加することですぐに培養を行うことができる。

本発明により、実験用培養細胞の凍結保存を安定的に行うことが可能となるだけでなく、膵島や幹細胞の様な機能性細胞やES細胞や間葉系幹細胞、iPS細胞などの幹細胞もその機能を失わずに保存することができるため、細胞移植の効率が向上すると期待される。

また、本発明の不凍結ポリアミノ酸を用いることにより、生理活性物質を含む含水物を凍結する際の、該生理活性物質の失活を抑制することもできる。さらに、本発明の不凍結ポリアミノ酸を用いることにより、水分子以外の成分を含む含水物を凍結又は凍結乾燥して得られる凍結物又は凍結乾燥物中における該成分の拡散を均質にすることもできる。凍結物としては、アイスクリーム、シャーベット、氷菓、ディスプレイ用の氷、冷凍スープ等が挙げられる。凍結乾燥物としては、凍結乾燥により製造される粉末状のフリーズドライ食品や医薬品等が挙げられる。

また、工業用の燃料電池を起動する際の液体の凍結に起因する起動性の低下を抑制する用途などにも適用可能である。

無水コハク酸により部分的にアミノ基をブロックしたε-ポリ-L-リジンを用いてL929細胞を凍結保存した場合の、アミノ基のブロック率と細胞生存率との関係を示すグラフである。アミノ基あたり63モル%の無水コハク酸を添加したε-ポリ-L-リジン（PLL無水コハク酸63%）を用いてL929細胞を凍結保存した場合の、この部分ブロック化ポリリジンの濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。 L929細胞を10%DMSO/ウシ胎児血清中にて凍結し、解凍後洗浄や希釈をせずにそのままプレート上に移して24時間培養した場合の様子を示す顕微鏡写真である。 L929細胞をPLL無水コハク酸63%の7.5%溶液中にて凍結し、解凍後洗浄や希釈をせずにそのままプレート上に移して24時間培養した場合の様子を示す顕微鏡写真である。 PLL無水コハク酸63%の7.5%溶液、及び、10%DMSO/ウシ胎児血清を凍結保存液として用いラット間葉系幹細胞（RMSC）を凍結保存後に、多分化能（骨、脂肪、軟骨への分化誘導）を評価した結果を示すグラフである。未凍結の場合、及び、非分化誘導系を併せて示す。スクロース30%の水溶液に無処理のPLL（ε-ポリ-L-リジン）および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸63%）を0.1-15%で添加し、氷再結晶抑制効果を観察した一連の顕微鏡写真である。無処理のPLL（ε-ポリ-L-リジン）の5%溶液、および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸63%）の5%溶液を凍結させた場合の、氷の結晶の形態を示す顕微鏡写真である。凍結解凍寒天ゲルの写真(1)である。左が無添加のもの、右がPLL無水コハク酸63%を5%添加したものを示す。凍結解凍寒天ゲルの写真(2)である。PLL無水コハク酸63%の添加量が、0%のもの（左）、1%のもの（中）、及び3%のもの（右）を示す。

本発明の凍結保存液は、生理的溶液に、ポリリジンなどの高分子化合物が1-50w/w%溶解されてなる。好ましくは2〜20w/w%、特に好ましくは3〜15w/w%、さらに好ましくは5〜10w/w%溶解されてなる。生理的溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞または組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（DMEM）を好ましいものとして挙げることができる。ポリリジンに代えて、またはポリリジンとともに、ポリアリルアミンを用いることもできる。また、これらに代えて、または、これらの少なくとも一方ととともに、アミノ化多糖類などの他のポリアミン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸およびアミノ化多糖類から選択される化合物を用いることができ、また、ポリアクリル酸などのポリカルボン酸の他、デキストラン、デキストリン、プルラン、キトサンからなる群から選択される多糖類を用いることもできる。これら高分子のうちでも、同一分子内にカチオン性置換基とアニオン性置換基の両方をもつ単量体が重合した形の高分子化合物、特には、ポリアミノ酸を好ましいものとして挙げることができる。すなわち、高分子化合物の繰り返し単位が、アミノ基及びカルボキシル基を共に有するのが特に好ましい。ポリリジンは、ε-ポリ-L-リジンもしくはε-ポリ-D-リジン、α-ポリ-L-リジン、α-ポリ-D-リジンのいずれであっても良い。凍結保護成分である高分子化合物は分子量が100〜100,000である。最も好ましい高分子種として、微生物または酵素により生産される数平均分子量がｂ1000〜2万、特には1000〜1万のε-ポリ-L-リジンを挙げることができる。ε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており（http://www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin/index.html）、重合度15〜35のものの他、重合度が２０以下のものの生産も試みられている（例えば、特開2003-171463、特開2005-318815）。数平均分子量または数平均重合度の測定は、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（AE-6920V型）を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパクマーカーを用いる。なお、ポリリジンは、加熱処理による高分子量化により分子量3万以上として用いることもできる。しかし、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に1級アミノ基のみを有しているが、後述するように無水カルボン酸を用いて部分的にアミド化することで、優れた混和性能ないし可溶化性能を発揮するものと考えられる。特には、無水ジカルボン酸などを反応させて部分的にカルボキシル化することで、優れた性能を発揮することができる。本発明でも用いる特に好ましい高分子種の他の例として、重量平均分子量が1000〜1000000、好ましくは1000〜2万のポリアリルアミンを挙げることができる。例えば、アリルアミン重合体（日東紡績(株)のPAA-03）の水溶液に無水酢酸または酢酸を添加したものや、部分メトキシカルボニル化アリルアミン重合体（日東紡績(株)のPAA-U5000）を挙げることができる。アリルアミン重合体は、ポリリジンの場合と同様、側鎖に1級アミノ基のみを有するが、単位分子量あたりの1級アミノ基の密度は大きく、後述のように部分的にカルボキシル化した場合、ポリリジンを部分的にカルボキシル化したと同様の作用を行うものと考えられる。

ポリアミンのアミノ基は、好ましくは、部分的に、無水カルボン酸によってカルボキシル化もしくはアセチル化されて、ブロックされる。この際、ポリアミンのアミノ基について、好ましくは50〜99モル%、特には50〜93%、より好ましくは50〜90モル%、さらに好ましくは55〜80モル%、最も好ましくは58〜76モル%をカルボキシル化またはアセチル化することでブロックする。なお、ポリアミンのアミノ基に対して52〜53モル%の無水カルボン酸を反応させることで約50%のアミノ基をブロックすることができる。また、100モル%の無水カルボン酸を反応させた場合、通常の反応条件で、90〜95%のアミノ基をブロックすることができる。ブロック率が上記の範囲を超えても、また、下回っても、凍結保存効果が小さくなる。ここで用いられる無水カルボン酸としては、無水酢酸、無水クエン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸、無水フマル酸、及び無水マレイン酸を挙げることができる。これらのうち、無水コハク酸及び無水酢酸を特に好ましいものとして挙げることができる。

しかし、ポリアミンのアミノ基がブロックされずフリーの状態にあるものを用いることもできる。すなわち、カルボキシル化およびアセチル化の度合いは0-100mol/mol%の範囲で有効である。本発明において、カルボキシル基が一部アミノ化されたポリカルボン酸も有効である。すなわちポリカルボン酸のカルボキシル基をジアミン、トリアミン、ポリアミンなどの化合物と反応させることにより一部アミノ化したものも有効である。用いるジアミンとしてはエチレンジアミン、アジポジヒドラジドなどのヒドラジドなどが挙げられる。これらアミノ化合物とカルボン酸との反応はカルボジイミドを用いた付加反応によるものである。この時のアミノ化の度合いは0-100mol/mol%の範囲で有効であるが、アミノ基をブロックする場合と同様に、好ましくは50〜99モル%、より好ましくは60〜97モル%のカルボキシル基が残り、その残余がアミノ化されるように反応を行う。例えば、数平均分子量1000〜300万のポリアクリル酸、特には、数平均分子量1000〜1万のポリアクリル酸を用い、そのカルボキシル基の1〜50モル%、好ましくは３〜40モル％をエチレンジアミン、ジヒドラジドなどのアミン種及びカルボジイミド等を用いてブロックする。一方、本発明の凍結保存剤には、ジメチルスルホキシドやグリセロール、エチレングリコール、トレハロースやスクロースなどの既存の凍結保護物質が0.1-50w/w%、特には0.3〜15w/w%共存していてもよい。細胞が凍結から解凍される際に酸化ストレスによるダメージを受けると言われており、抗酸化剤を添加することでさらなる有効性の向上が期待される。抗酸化剤は例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ビタミンＥ、ビタミンC、エピガロカテキンガレートなどのポリフェノール類またはグルタチオンなどが挙げられる。

本発明の凍結保存剤の浸透圧は200-1000mOsm/kgであり、より好ましくは300-700mOsm/kgであり、更に好ましいのは400-600mOsm/kgである。本発明の凍結保存剤は保存する対象が細胞に限らず組織に対しても適用することが可能である。本発明の凍結保存剤を用いて凍結保存が可能な細胞としては、培養用樹立細胞、ヒトを含む動物の受精卵および卵細胞を挙げることができる。また、精細胞、ES細胞、iPS細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、臍帯血細胞などの幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞などのヒトを含む動物細胞もしくは植物細胞を挙げることができる。本発明の凍結保存剤を用いて凍結保存が可能な組織・臓器としては、皮膚、神経、血管、軟骨、角膜、肝臓、腎臓、心臓、膵島などを挙げることができる。

なお、上記に説明したと同様の高分子化合物を、食品または医薬品の含水物に添加し、凍結濃縮を抑制し、含有成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物の製造に応用することができる。具体的には、ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物に対し、無水コハク酸、無水酢酸またはその他の上記無水カルボンさんを反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたものを用いることができる。この場合、生理的溶液中に溶解したものを用いる必要はなく、例えば先述のアイスクリームの含水原料組成物またはフリーズドライ食品を製造する際の含水原料組成物に、アミノ基を部分的にブロックしたポリリジンその他のポリアミノ酸またはアミノ化多糖類を、1〜15%の重量濃度となるように配合する。このようにして、凍結濃縮の抑制を実現することができる。無水コハク酸を用いた場合、アミノ基の50〜85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの（実際のブロック率が約48〜80モル％のもの）を用いるならば、凍結濃縮防止において優れた効果が得られた。

さらに、上記に説明したと同様の高分子化合物を工業用の燃料電池に添加して、起動時の液体の凍結に起因する起動性の低下を抑制する用途などにも適用可能である。具体的には、ε-ポリ-L-リジン、α-ポリ-L-リジン、ポリアルギニン、その他のポリアミノ酸、アミノ化多糖類、及びポリアリルアミンからなる群から選択される、アミノ基含有単位の重合体からなる高分子化合物に対し、無水コハク酸、無水酢酸またはその他の上記無水カルボン酸を反応させてカルボキシル化またはアセチル化することでブロックしたものを、燃料電池内部に露出する表面層の材料に添加して用いることができる。例えば、セパレーターや固体電解質膜の表面をなす塗膜の材料、特にはUV硬化性の樹脂液に、1〜15%の重量濃度となるように配合することができる。

以下、この発明の実施例及び比較例を示す。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１凍結保存溶液の調整＞
ε-ポリ-L-リジン（チッソ社製、分子量4000）は25%水溶液のものを、ポリアリルアミン（日東紡、分子量5000(PAA-05L)、15000(PAA-L)、60000(PAA-H)）は20%水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に対し、モル％で0-100%の無水コハク酸（和光純薬工業製）を添加することでアミノ基のブロック率の異なるポリアミンを作成した。それぞれのポリアミン溶液をダルベッコ改変培地（DMEM、シグマアルドリッチ製）に0-10w/w%となるように添加した。この際、pHが7.0-8.0の範囲内になるように１Nの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水溶液で中和した。また、溶液の浸透圧はWescor社製5520型蒸気圧法オズモメーターにて測定し、浸透圧の調整には10%塩化ナトリウム水溶液を用いた。

＜実施例2 培養細胞の凍結保存＞
1×10⁶個のL929, MG63, Caco-2細胞（大日本住友製薬）, colon26, HT1080, B16F1, KB細胞（ATCC）をクライオバイアル（Simport Plastics）中で各凍結保存液1mLに懸濁し、-80℃のフリーザー中で凍結保存を行った。1週間後、37℃の温浴中で速やかに融解し、DMEMで洗浄したのち、トリパンブルー染色により生死判定を行った。また、解凍した細胞は6wellカルチャーディッシュに1×10⁵個ずつ播種し、6時間後、24時間後のそれぞれの生存率をトリパンブルー染色により評価した。比較例としては一般的によく用いられている保存液である10%DMSO/ウシ胎児血清(FBS)を用いた。

図1に示すように、L929細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のモル数に対して50%以上のモル数の無水コハク酸を添加したポリリジン（PLL）の7.5%溶液を用いた場合、比較例のDMSO溶液を用いた場合に比べて播種後２４時間においてほぼ同じか、より良好な生存率を示した。なお、100モル%の無水コハク酸を添加したカルボキシル化ポリリジンについて、残留アミノ基含量をニンヒドリン法およびTNBS法で定量することにより、アミノ基のブロック率を求めたところ93%であった。また、ポリリジンのアミノ基に対して10モル%、27モル%、45モル%、52モル%、63モル%、及び、79モル%の無水コハク酸を添加した場合に、ブロック率は、それぞれ、10%、25%、43%、50%、60%、76%であった。したがって、図1から知られるように、50〜93%のブロック率について凍結保存効果が確認された他、ブロック率が60%のもの（63モル%の無水コハク酸添加）、及び76%のもの（79モル%の無水コハク酸添加）で、特に優れた凍結保存効果が見られた。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の45〜90モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）の水溶液を用いた場合にも、ほぼ同様に、無水コハク酸によるアミノ基ブロック率が増大するにつれて、より良好な生存率が得られた。

図2では、同じくL929細胞を凍結保存するにあたり、アミノ基のモル数に対して63%のモル数の無水コハク酸を添加したε-ポリ-L-リジン（図表中にPLL(0.63)と表示し、以下本文中にPLL無水コハク酸63%と表記）を用い、この部分ブロック化ポリリジンの濃度と細胞生存率との関係を示す。図2から知られるように、部分ブロック化ポリリジン（PLL無水コハク酸63%）の濃度が7.0%以上である場合に、DMSO溶液を用いた場合とほぼ同等か、より高い細胞生存率が得られた。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63〜85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）を用いた場合にも、同様の傾向を示した。

図１〜２にて最も良好な結果を示す領域は、凍結保存液の浸透圧を求めた場合に、400〜600mOsm/kgである。すなわち、浸透圧が400〜600mOsm/kgで最も高い保存効果が得られた。

一方、表1には、7.5%PLL無水コハク酸63%で保存したときのその他の細胞の保存効果を示す。表１の結果から知られるように、すべての細胞種においてDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）とほぼ同じかそれ以上の生存率を示した。なお、具体的なデータは示さないが、アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミンを用いた場合にも同様であった。

＜実施例3 毒性試験＞
L929細胞を用いた毒性試験を行った。10%ウシ胎児血清を含有したダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（DMEM）に懸濁させたL929細胞を、96wellマイクロプレートに1.0×10³cell/well播種し、37℃で72時間培養後、ε-ポリ-L-リジン、及び、種々の濃度の無水コハク酸を添加したポリリジンを、最終濃度0-10%となるように添加し、48時間後、未添加系をコントロールとして細胞の増殖が50%阻害される濃度をIC₅₀とし、MTT法で求めた。その結果を表2に示す。比較例はDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）とした。表2の結果から知られるように、PLL無水コハク酸58%、63%、79%のIC₅₀は、DMSO系の場合の２〜３倍であった。すなわち、上記実施例で用いた部分ブロック化ポリリジンの毒性は、従来一般的な凍結保存液の1/2〜1/3と判断された。特には、図１のデータにて細胞生存率が高かったPLL無水コハク酸63%と、PLL無水コハク酸58%とにおいて、IC₅₀の値が特に大きかった。

一方、L929細胞を含む凍結保存液を解凍後に、そのまま12wellプレートに播種し、37℃で24時間培養後に観察した。すなわち、PLL無水コハク酸63%の7.5%溶液、及び、10%DMSO/ウシ胎児血清の各凍結保存液にて、実施例２と同様にして凍結保存し解凍を行ったが、解凍後に希釈や洗浄をせずに、そのままプレート上に移して培養を行った。その結果、図3−１に示すようにDMSO系（10%DMSO/ウシ胎児血清）では明らかに細胞が丸くなり死んでいるのに対して、図３−２に示すように本発明の保存液ではディッシュに付着し、良好に生着していることが確認された。アミノ基を部分的にブロックしたポリアリルアミン（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63〜85モル％に相当する無水コハク酸を反応させたもの）でも同様の低毒性の結果を得た。

＜実施例4 間葉系幹細胞の保存＞
ラット間葉系幹細胞（RMSC）の凍結保存を行った。比較例の保存液は10%DMSO/ウシ胎児血清であり、実施例の保存液はPLL無水コハク酸63%の7.5%溶液（図４中に7.5%PLL(0.63)と表示）である。

表3にラット間葉系幹細胞（RMSC）の解凍後の生存率を示すが、本発明の凍結保存液でDMSO系とほぼ同じ生存率を示した。部分ブロック化ポリアリルアミンを用いた凍結保存液（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63〜85モル％に相当する無水コハク酸を反応させ、DMEM倍地に7.5%濃度となるように添加したもの）でも同様の高い生存率であった。

次に、実施例２と同様にして凍結保存後に解凍した後、分化誘導をかけることにより骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価したところ、図4に示すように未凍結系、DMSO系とほぼ同様に多分化能を維持していることが以下のように確認された。図4は、カラーの顕微鏡写真の画像データについて、光の3原色（ＲＧＢ）への色分解を行い、赤色（Ｒ）の色要素のみを示したものである。したがって、赤色部分が白色に表現され、青色部分が黒色に表現されている。骨分化能はカルシウムの沈着をアリザリンレッドS染色により評価した結果、いずれの場合も同じく赤く染色された。図4中の上段の写真を見た場合、非分化誘導系に比べて、分化誘導系がいずれも同様に淡いモノクロパターンに表現されているが、この淡いモノクロパターンいはカラー写真にて全体に赤味がかかっていることを示す。また、アルカリ性ホスファターゼ活性は非分化誘導系に比べ、いずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく高い値を示した。脂肪分化能は、細胞中の脂肪滴をオイルレッドOを用いて染色したところ、いずれの保存液で凍結した場合でも未凍結系と同じく赤く染色された脂肪滴（図４中段にて、径が数十μmの淡色の円形ないし楕円形パターンとして表された部分）が確認された。軟骨分化能に関しては、細胞塊中のプロテオグリカンをアルシアンブルーで染色したところ、いずれの保存液で凍結した系でも未凍結と同じく青く染まるプロテオグリカン（図4の下段にて濃い黒色部分として表された部分）が確認された。ポリアリルアミンから作成した凍結保存剤（分子量5000のアリルアミン重合体について、アミノ基の63〜85モル％に相当する無水コハク酸を反応させ、DMEM倍地に7.5%濃度となるように添加したもの）で凍結した場合でも同様に多分化能を維持していた。

＜実施例５臍帯血の保存＞
臍帯血は、血液抗凝固剤（EDTA2Na）を１０.５mg充填された７mLプラスチック製真空採血管（テルモ株式会社製、ベノジェクト２真空採血管）を使用してヒト臍帯より採取した。次いで、このように抗凝固剤を添加したヒト臍帯血中に、7.5%となるようにPLL無水コハク酸63%(7.5%PLL(0.63))を添加し、-80℃のフリーザー中で3ヶ月間凍結保存した。37℃の温浴中で速やかに融解し、希釈等を行わないままのヒト臍帯血を一部採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて測定した。ＣＤ３４造血幹細胞数をフローサイトメトリーを用いて、文献（A. Higuchi et al., J. Biomed. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004)）記載の常法により測定した。すなわち、ＣＤ３４造血幹細胞数は、Stem-Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、そのマニュアル（国際血液療法・移植学会 ISHAGEガイドライン）に従って行った。3ヶ月後においても、ＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された70％前後の細胞数が観察された。一方、１０％DMSO溶液で凍結保存したヒト臍帯血中のＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された２０％前後の細胞数であった。このように、ε-ポリ-L-リジンを添加した保存液でヒト臍帯血を保存すると、ＣＤ３４造血幹細胞を未分化の状態で長期間保存できることが明らかとなった。

このように、本発明の実施例の凍結保存液は、臍帯血の保存の効果においても際立って優れていることが知られた。

＜実施例６不凍タンパク活性＞
PLL（ε-ポリ-L-リジン）および無水コハク酸処理PLLの不凍タンパク質活性を調べた。すなわち、氷の再結晶を阻害する効果について調べた。不凍タンパクには種々の特殊な活性が知られており、氷の表面に吸着することなどにより、熱ヒステリシス、氷の再結晶成長抑制、氷晶の六方晶もしくはバイピラミッド状への形態変化を引き起こすことが知られている（特許文献3〜4）。

まず、スクロース30%の水溶液に無処理のPLL、PLL無水コハク酸20%, PLL無水コハク酸46%, PLL無水コハク酸50%, PLL無水コハク酸65%, PLL無水コハク酸76%, 及びPLL無水コハク酸84%を0.1-15%で添加した。これら無水コハク酸処理PLLにおける実際のアミノ基ブロック率を前述の方法で測定したところ、約0.20, 0.43, 0.48, 0.62, 0.73及び0.80であった。その溶液をガラスプレートに4μLのせ、さらにガラスプレートでカバーしてからリンカム社製10002L温度制御顕微鏡ステージにて-30℃まで急冷し氷結晶を作成した。その後ゆっくりと温度を上げていき-9℃で30分放置することにより氷結晶の成長を顕微鏡で観察した。その結果、図５の一連の顕微鏡写真が知られるように、PLL（ε-ポリ-L-リジン）のアミノ基に対しその50モル%以上のカルボキシル基を導入することによりPLLに氷再結晶抑制効果を付与できることが確認された。図５には、重量濃度が5%となるように添加した場合を示すが、PLL無水コハク酸50%（PLL(0.50)）〜PLL無水コハク酸84%（PLL(0.84)）は、1%〜15%までの濃度で氷再結晶抑制に有効であった。

次に同じ急冷プレートにてPLLの5%溶液の氷の結晶の形態、および無水コハク酸処理PLL（PLL無水コハク酸65%）の5%溶液の氷の結晶の形態をしらべた。すなわち、一旦-30℃まで急冷し、氷結晶を多数作成した後、視野に1つの直径10μm程度の氷結晶が存在する温度まで0.02℃/minで温度を上昇させる。その状態で安定してから今度は0.02℃/minで温度を降下させることで氷の成長時の形態を観察した。形態は図６の顕微鏡写真に示すように無水コハク酸で処理することにより六方晶を示すことがわかった。なお、このような六方晶の氷結晶は、無水コハク酸処理PLL（PLL(0.50)〜PLL(0.84)）の濃度が1%〜15%の範囲であるならば見られた。熱ヒステリシスとは、融点と氷晶成長開始温度の差のことで、不凍タンパク質の特徴として挙げられる。無水コハク酸処理PLLで最大0.1度の熱ヒステリシス効果が得られた。これらのことから、PLLのアミノ基に対しにカルボキシル基を50モル%以上導入することで不凍タンパク質の活性が得られることが確認された。

＜実施例７食品の保存＞
凍結濃縮防止（凍結融解寒天ゲル）；寒天末（１級試薬ナカライテスク（株）社製）にPLL無水コハク酸63%を添加して５%溶液を調整し、この溶液に赤色インクを添加しプラスチック容器に入れ−２０℃にて凍結した後、常温で解凍した。結果を図7の写真に示す。左が無添加のもの、右がPLL琥珀酸誘導体5%添加のものである。無添加のものは赤色の部分（不透明な上半部）と、透明な部分（ゲルを載せた箇所の右上に影を生じさせているが、ゲルの下方のペーパータオルのメッシュ模様が透けて見えている部分）とに、明らかに分離しているのが解かる。一方、PLL琥珀酸誘導体5%添加物は解凍ゲル全体が均一に赤色を呈し、凍結濃縮が防止できているのが知られた。

凍結乾燥寒天ゲル；寒天末（１級試薬ナカライテック（株）社製）にPLL無水コハク酸63%（実際のブロック率0.60）を0%、1%、3%添加してプラスチック容器に入れ-20℃にて凍結した後、真空度１torrで２〜３日間凍結乾燥を行い、凍結乾燥寒天を得た。得られた凍結乾燥物を図8の写真に示す。PLL琥珀酸誘導体の添加量が0%のもの（左）は凍結乾燥により体積が1/3程度に収縮している。しかし、PLL琥珀酸誘導体の添加量が1%のもの（中）と3%のもの（右）の凍結乾燥物は体積の収縮があまり生じていない。このことから、本発明の不凍ポリアミノ酸を含有し凍結乾燥することにより、効率よく、かつ品質を安定に保ち、被乾燥物を乾燥できた。

Claims

生理的溶液中に、数平均分子量１０００〜２万のポリ−Ｌ−リジン、または、重量平均分子量１０００〜2万のポリアリルアミンのアミノ基の５０〜９９モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたものを１〜５０ｗ／ｗ％溶解させたことを特徴とする細胞および組織の凍結保存用組成物。
前記高分子化合物のアミノ基の５０〜９３モル％について、無水カルボン酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたことを特徴とする請求項１に記載の凍結保存用組成物。
生理的溶液が、生理食塩水、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）、または、その他の細胞・組織用の培養液であることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結保存用組成物。
数平均分子量１０００〜２万のポリ−Ｌ−リジン、または、重量平均分子量１０００〜2万のポリアリルアミンに対し、そのアミノ基の５０〜９９モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたことを特徴とする、食品または医薬品の凍結保存用または凍結乾燥用の添加剤組成物。
数平均分子量１０００〜２万のポリ−Ｌ−リジン、または、重量平均分子量１０００〜2万のポリアリルアミンに対し、そのアミノ基の５０〜９９モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたものを、食品または医薬品の含水原料組成物に、１〜１５ｗ／ｗ％となるように配合し、この後、凍結、または、凍結及び凍結乾燥を行うことを特徴とする食品または医薬品の製造方法。