CN101971796B - 无蛋白非程序细胞冻存液 - Google Patents
无蛋白非程序细胞冻存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101971796B CN101971796B CN201010183903XA CN201010183903A CN101971796B CN 101971796 B CN101971796 B CN 101971796B CN 201010183903X A CN201010183903X A CN 201010183903XA CN 201010183903 A CN201010183903 A CN 201010183903A CN 101971796 B CN101971796 B CN 101971796B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- storing liquid
- frozen
- cryopreservation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 130
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 63
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 17
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 15
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 12
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical class CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZCLAHGAZPPEVDX-UHFFFAOYSA-N D-panose Natural products OC1C(O)C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC1COC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 ZCLAHGAZPPEVDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 3
- ZCLAHGAZPPEVDX-MQHGYYCBSA-N panose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@@H]1CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZCLAHGAZPPEVDX-MQHGYYCBSA-N 0.000 claims description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 2
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 25
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 abstract description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 abstract 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 14
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 12
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 11
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 8
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 6
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 6
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 101150029234 Hes5 gene Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710124584 Probable DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-MRCIVHHJSA-N dextrin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-MRCIVHHJSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/12—Chemical aspects of preservation
- A01N1/122—Preservation or perfusion media
- A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N2300/00—Combinations or mixtures of active ingredients covered by classes A01N27/00 - A01N65/48 with other active or formulation relevant ingredients, e.g. specific carrier materials or surfactants, covered by classes A01N25/00 - A01N65/48
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为pH缓冲液。本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，无蛋白，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定性好；对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化；本发明的细胞冻存液，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中，直接置于-80℃的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率，操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞冻存液，特别涉及一种无蛋白的细胞冻存液。
背景技术
细胞，特别是干细胞等高价值的细胞，具有潜在的医用价值等其他价值，细胞保存技术是实现这些价值的基础。
常用的细胞保存方法有培养保存和冻存。培养保存，耗时耗力，程序繁琐，在培养的过程中，特别是长期继代培养时，细胞容易发生变异，细胞特性丧失，失去保存价值。因此，培养保存一般应用于易于培养，不易发生变异的细胞中，如部分瘤细胞。
细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，保存其细胞特性。这样保存的成本较低，可以在需要时将细胞复苏培养。与些同时，也避免了培养保存中因细胞污染而导致的细胞品种损失。
现有的细胞冻存液一般由DMSO、血清、细胞培养液组成，为即用型冻存液，需要现配现用，由于血清的成分不定，冻存液批次间稳定性差。血清待蛋白质的存在，使得这种细胞冻存液的保质期也较短，保存条件也较为苛刻。
细胞冻存液中蛋白的存在，对细胞特性有一定的影响，如血清中的一些成分会影响细胞(如神经干细胞NSC)、神经元细胞等特殊细胞的生长与分化。
在细胞治疗中，外源蛋白的存在，特别是未知蛋白的存在，会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。人们希望，至少在细胞治疗用细胞的冻存中不添加外源蛋白。而不添加外源蛋白的话，又难以保证冻存细胞的复苏率。
即使在细胞添加蛋白类保护剂，为保证细胞冻存的成功率，使用这些细胞冻存液冻存细胞时，还是要使用程序降温的方式，缓慢冰冻细胞。这种程序性降温用时长，需要购置昂贵的专用仪器，处理能力极其有限，仅能用于实验室的小批量处理，远不能满足大批量处理的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无蛋白非程序细胞冻存液。
本发明所采取的技术方案是：
无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为pH缓冲液。
优选的，冻存液中还添加有抗氧化剂0.1～0.4w/v％，细胞营养剂0.3～2.0w/v％。
细胞膜保护剂包括非还原性双糖、多糖、糖酐。
本发明的有益效果是：
本发明的细胞冻存液中，成分完全清楚，没有添加蛋白质类物质，所使用的各种用料，均为生物体可接受的，不会对基体造成损害，至少不会对基体造成未知的损害，特别适用于细胞治疗用细胞的冻存。
本发明的细胞冻存液，对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，实验表明，使用本发明的细胞冻存液冻存的间质干细胞(MSCs)的复苏率超过90％，皮层神经元细胞(CNCs)的复苏率超过75％，胚胎干细胞(ESCs)的复苏率超过也高达94％。在细胞冻存效果优异的同时，本发明的细胞冻存液对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化。
使用本发明的细胞冻存液，冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中，直接置于-80℃的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率。
本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定性好，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制，大大方便了操作。
附图说明
图1是SD大鼠间充质干细胞MSCs复苏后的生长曲线图；
图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；
图3是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；
图6是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；
图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
具体实施方式
本发明中使用的细胞膜保护剂、渗透性细胞膜内保护剂、细胞沉降稳定剂，既可以单独使用，也有可以根据需要混合使用。
本发明中使用的渗透性细胞膜内保护剂，包括二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、丙三醇等。
本发明中使用的细胞沉降稳定剂，包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉，用以防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。
本发明细胞冻存液中所使用的pH缓冲液，在于提供一个适合细胞生存的稳定pH，可以为常规的PBS缓冲液，缓冲液的pH值、Na+、K+含量可以根据具体的冻存细胞类型进行相应的调节。这种调节是本领域技术人员所熟知的。常用的pH缓冲液的pH为7.2～7.4，Na+含量为20～30mM，K+含量为110～130mM。
本发明细胞冻存液中使用的抗氧化剂，为常规的抗氧化剂，包括维生素C、谷胱甘肽等，抗氧化剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的抗氧化剂。
本发明细胞冻存液中使用的细胞营养剂，为常规的细胞营养剂，包括谷氨酰胺、丙酮酸钠等，用以补充细胞代谢时消耗的部分能量。细胞营养剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的细胞营养剂。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
以下实施例中，如无特别说明，百分比均指w/v％。
实施例1
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂1％，由蔗糖0.5％、高分子糖酐-500 0.5％组成，DMSO 8％，
细胞沉降稳定剂25％，由甲基纤维素4000 CP 15％、羟乙基淀粉10％组成，
抗氧化剂0.2％，由维生素C 0.1％、谷胱甘肽0.1％组成，
细胞营养剂1.0％，由谷氨酰胺0.4％、丙酮酸钠0.6％组成，
PBS缓冲液，余量。
实施例2
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂23％，由海藻糖11％、潘糖5％、中分子糖酐-70 7％组成，
渗透性细胞膜内保护剂5％，由丙二醇2％、丙三醇3％组成，
细胞沉降稳定剂8％，由可溶性淀粉5％、糊精3％组成，
谷胱甘肽0.3％，
谷氨酰胺0.3％
PBS缓冲液，余量。
实施例3
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂5％，由海藻糖2％、木糖3％组成，
渗透性细胞膜内保护剂13％，由DMSO 5％、丙二醇8％组成，
细胞沉降稳定剂20％，由甲基纤维素1500 CP 5％、羟乙基淀粉15％组成，
抗氧化剂0.1％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.5％，由丙酮酸钠组成，
pH缓冲液，余量。
实施例4
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂17％，由海藻糖组成，
渗透性细胞膜内保护剂16％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂2％，由甲基纤维素4000 CP组成，
抗氧化剂0.2％，由维生素C组成，
细胞营养剂0.8％，由谷氨酰胺0.1％、丙酮酸钠0.7％组成，
pH缓冲液，余量。
实施例5
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂10％，由海藻糖6.0％、蔗糖4.0％组成，
渗透性细胞膜内保护剂9％，由丙三醇组成，
细胞沉降稳定剂23％，由甲基纤维素400CP 18％、可溶性淀粉5％组成，
抗氧化剂0.4％，由维生素C 0.12％、谷胱甘肽0.28％组成，
细胞营养剂2％，由谷氨酰胺、丙酮酸钠各1.0％组成，
pH缓冲液，余量。
实施例6
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂14％，由棉子糖4％、木糖3％、潘糖7％组成，
渗透性细胞膜内保护剂1％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂13％，由甲基纤维素1500 CP 8％、羟乙基淀粉5％组成，
抗氧化剂0.1％，由维生素C组成，
细胞营养剂1.5％，由丙酮酸钠组成，
pH缓冲液，余量。
实施例7
细胞冻存液的组成如下：
细胞膜保护剂7％，由糖酐-40 1％、棉子糖3％、蔗糖3％组成；
渗透性细胞膜内保护剂10％，由DMSO组成，
细胞沉降稳定剂17％，由可溶性淀粉组成，
抗氧化剂0.26％，由谷胱甘肽组成，
细胞营养剂1.8％，由谷氨酰胺组成，
pH缓冲液，余量。
使用不同配比细胞膜保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表1所示。
表1、细胞膜保护剂配比-细胞复苏率比较表
表中，细胞膜保护剂为单独使用，从表中的数据可知，不同的用量对细胞的复苏率有一定的影响。细胞膜保护剂的用量在1.2％～27％之间，细胞复苏率都比较高，综合其他实验数据和冻存细胞品种考虑，本发明中，细胞膜保护剂的最佳用量为1～23％。
使用不同配比渗透性细胞膜内保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表2所示。
表2、渗透性细胞膜内保护剂配比-细胞复苏率比较表
从表中数据可知，渗透性细胞膜内保护剂的用量在3～13％之间，细胞的复苏率比较高，综合考虑，本发明的细胞冻存液中，渗透性细胞膜内保护剂的用量为1～16％。
使用不同配比细胞沉降稳定剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，检测其复苏率，结果如表3所示。
表3、细胞沉降稳定剂配比-细胞复苏率比较表
表中，甲基纤维素4000CP、羟乙基淀粉为单独使用。
由表中数据可知，细胞沉降稳定剂的用量在3～23％之间，细胞的复苏率比较高，综合考虑，本发明的细胞冻存液中，细胞沉降稳定剂的用量为2～25％。
实验数据
复苏率比较
使用本发明的细胞冻存液常规冻存液按程序/非程序冻存间质干细胞(MSCs)、皮层神经元细胞(CNCs)及胚胎干细胞(ESCs)，之后测试其细胞复苏率，结果如表4所示。
表4、不同冻存液/冻存方法-细胞复苏率比较表
从表中数据可知，使用常规冻存液程序冻存细胞，其冻存效果明显好于非程序冻存，而采用本发明的细胞冻存液非程序冻存，细胞复苏率明显高于常规冻存液程序冻存，可见，本发明的细胞冻存液，优势明显。
细胞增殖力比较
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后均接种1×105个细胞培养，培养7天，每天计算细胞数量，绘制其生长曲线，其生长曲线如图1所示。从图中可知，常规冻存液非程序冻存的细胞增殖速度差，常规冻存液程序冻存的细胞增殖速度较快，本发明细胞冻存液非程序冻存的细胞增殖速度最快，本发明细胞冻存液的效果最好。
不同细胞冻存液对细胞分化能力的影响
分别使用本发明细胞冻存液非程序冻存、常规冻存液程序冻存和常规冻存液非程序冻存SD大鼠间充质干细胞MSCs，复苏后传一代使用诱导液进行成骨诱导及成脂肪细胞诱导，诱导后对细胞进行染色观察。成骨诱导28d后的细胞使用茜素红染色；成脂诱导20d后的细胞使用油红O染色，细胞诱导结果如图3～8所示。图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；图3是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图。
图6是本发明细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图。
从图中可以看出，本发明的细胞冻存液对细胞的分化能力没有影响，效果明显好于常规细胞冻存液程序冻存。
Claims (4)
1.无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～23 w/v%、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16 w/v%、细胞沉降稳定剂2.0～25%，余量为pH缓冲液，其中，细胞膜保护剂选自海藻糖、蔗糖、棉子糖、木糖、潘糖、低分子糖酐-40、中分子糖酐-70、高分子糖酐-500；渗透性细胞膜内保护剂选自二甲基亚砜、丙二醇、丙三醇；细胞沉降稳定剂选自甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉。
2.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有抗氧化剂0.1～0.4 w/v%。
3.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：所述冻存液中还添加有细胞营养剂0.3～2.0 w/v%。
4.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于：pH缓冲液的pH为7.2～7.4。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010183903XA CN101971796B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 无蛋白非程序细胞冻存液 |
| US13/695,729 US20130062569A1 (en) | 2010-05-26 | 2010-07-31 | Protein-free solution for non-programmed cell cryopreservation |
| PCT/CN2010/075614 WO2011147118A1 (zh) | 2010-05-26 | 2010-07-31 | 无蛋白非程序细胞冻存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010183903XA CN101971796B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 无蛋白非程序细胞冻存液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101971796A CN101971796A (zh) | 2011-02-16 |
| CN101971796B true CN101971796B (zh) | 2013-04-17 |
Family
ID=43571732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010183903XA Active CN101971796B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 无蛋白非程序细胞冻存液 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20130062569A1 (zh) |
| CN (1) | CN101971796B (zh) |
| WO (1) | WO2011147118A1 (zh) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10159244B2 (en) | 2015-02-27 | 2018-12-25 | Lonza Walkersville, Inc. | Method for pooling hepatocytes |
| CN105165805A (zh) * | 2015-11-05 | 2015-12-23 | 南京三生生物技术有限公司 | 无蛋白液氮细胞冻存液及其制备方法 |
| WO2017159737A1 (ja) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | 一般社団法人家畜改良事業団 | 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法 |
| CN106177918A (zh) * | 2016-09-30 | 2016-12-07 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
| CN106993606A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-08-01 | 苏州新赛美生物科技有限公司 | 一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法 |
| CN107439536A (zh) * | 2017-08-17 | 2017-12-08 | 重庆斯德姆生物技术有限公司 | 一种耐储存的细胞冻存液 |
| CN107494521B (zh) * | 2017-10-09 | 2018-09-18 | 天津长和生物技术有限公司 | 细胞冻存液和细胞冻存方法 |
| CN107475189B (zh) * | 2017-10-12 | 2020-12-22 | 北京唐颐惠康生物医学技术有限公司 | 一种牙髓干细胞采集套装 |
| CN108576198A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-09-28 | 遵义盛林农业发展有限公司 | 一种蓝莓保鲜方法 |
| CN111690601A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-22 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法 |
| CN113519504A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-10-22 | 武汉普诺赛生命科技有限公司 | 一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液 |
| CN114223651B (zh) * | 2021-12-29 | 2023-07-28 | 松山湖材料实验室 | 冻存液及其制备方法与在人肾上皮细胞的应用 |
| CN114557337B (zh) * | 2022-02-21 | 2023-05-23 | 大连博格林生物科技有限公司 | 脐带间充质干细胞无蛋白非程序冻存液及其制备方法 |
| CN115777689B (zh) * | 2022-11-09 | 2024-10-22 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种无血清无蛋白非程序细胞冻存液 |
| CN116806812A (zh) * | 2023-06-08 | 2023-09-29 | 太仓超云生物信息咨询服务有限公司 | 一种无血清无dmso间充质干细胞冻存液及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1683522A (zh) * | 2005-03-04 | 2005-10-19 | 江西特康科技有限公司 | 全血质控物细胞生物活性保护剂及其制法 |
| CN1857312A (zh) * | 2006-03-28 | 2006-11-08 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4744907A (en) * | 1987-01-16 | 1988-05-17 | Interferon Sciences, Inc. | Blood cell separation |
| US5824331A (en) * | 1992-02-24 | 1998-10-20 | Encelle, Inc. | Bioartificial devices and cellular matrices therefor |
| EP1082006B1 (en) * | 1998-05-26 | 2006-02-01 | Lifecell Corporation | Cryopreservation of human red blood cells |
| US6713245B2 (en) * | 1998-07-06 | 2004-03-30 | Diacrin, Inc. | Methods for storing neural cells such that they are suitable for transplantation |
| ATE282955T1 (de) * | 2000-04-17 | 2004-12-15 | Organ Recovery Systems Inc | Neues aufwärmverfahren für cryokonservierte proben |
| EP1181865A1 (en) * | 2000-08-23 | 2002-02-27 | Universite Catholique De Louvain | Cryoprotective solutions |
| WO2004011616A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for cell preservation |
| US6921633B2 (en) * | 2002-11-18 | 2005-07-26 | Biolife Solutions Incorporated | Methods and compositions for the preservation of cells, tissues or organs in the vitreous state |
| US20070219131A1 (en) * | 2004-04-15 | 2007-09-20 | Ben-Sasson Shmuel A | Compositions capable of facilitating penetration across a biological barrier |
| CN1670193A (zh) * | 2005-02-05 | 2005-09-21 | 胡军祥 | 生物组织细胞玻璃化冻存液 |
| US7604929B2 (en) * | 2005-04-21 | 2009-10-20 | In Vitro Technologies, Inc. | Cellular compositions and methods for their preparation |
| AU2007258289B2 (en) * | 2006-06-12 | 2013-01-10 | The Jackson Laboratory | Sperm cryoprotective media |
| CN101333514B (zh) * | 2007-06-29 | 2010-10-27 | 上海市血液中心 | 一种红细胞快速冰箱冻存和解冻方法及其使用的冰冻保护液和洗涤液 |
| US20090130756A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-21 | Pioneer Surgical Orthobiologics,Inc. | Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles |
| CN101250499A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-08-27 | 中山大学 | 一种干细胞无毒冻存液 |
| CN102124098B (zh) * | 2008-06-27 | 2014-03-12 | 博傲沃德株式会社 | 细胞及组织的冷冻保存用组合物 |
| US20120128641A1 (en) * | 2009-07-20 | 2012-05-24 | The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital | Methods and compositions for improving the viability of cryopreserved cells |
-
2010
- 2010-05-26 CN CN201010183903XA patent/CN101971796B/zh active Active
- 2010-07-31 WO PCT/CN2010/075614 patent/WO2011147118A1/zh active Application Filing
- 2010-07-31 US US13/695,729 patent/US20130062569A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1683522A (zh) * | 2005-03-04 | 2005-10-19 | 江西特康科技有限公司 | 全血质控物细胞生物活性保护剂及其制法 |
| CN1857312A (zh) * | 2006-03-28 | 2006-11-08 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究;刘开彦等;《中国实验血液学杂质》;20041231;第12卷(第5期);671 * |
| 刘开彦等.二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究.《中国实验血液学杂质》.2004,第12卷(第5期),671. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101971796A (zh) | 2011-02-16 |
| US20130062569A1 (en) | 2013-03-14 |
| WO2011147118A1 (zh) | 2011-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101971796B (zh) | 无蛋白非程序细胞冻存液 | |
| US10815456B2 (en) | Composition, kit and method for cryopreserving cells | |
| CN101983562A (zh) | 一种非程序细胞冻存液 | |
| Baust et al. | Cryopreservation: An emerging paradigm change | |
| WO2006085082A1 (en) | A desiccated product | |
| Katkov et al. | Low-and high-temperature vitrification as a new approach to biostabilization of reproductive and progenitor cells | |
| Qadeer et al. | Efficiency of beetle (Dendroides canadensis) recombinant antifreeze protein for buffalo semen freezability and fertility | |
| Castillo-Martín et al. | Effects of vitrification on the expression of pluripotency, apoptotic and stress genes in in vitro-produced porcine blastocysts | |
| Chen et al. | Developmental competence and gene expression of immature oocytes following liquid helium vitrification in bovine | |
| Sun et al. | The protective effect of Leucosporidium-derived ice-binding protein (LeIBP) on bovine oocytes and embryos during vitrification | |
| Koh et al. | Effect of the antifreeze protein from the arctic yeast Leucosporidium sp. AY30 on cryopreservation of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum | |
| Wang et al. | Improvement of sperm cryo-survival of cynomolgus macaque (Macaca fascicularis) by commercial egg-yolk–free freezing medium with type III antifreeze protein | |
| Meyers | Dry storage of sperm: applications in primates and domestic animals | |
| Klooster et al. | Loss of fertilization potential of desiccated rhesus macaque spermatozoa following prolonged storage | |
| Quan et al. | Oocyte cryopreservation based in sheep: The current status and future perspective | |
| Akhtarshenas et al. | The protease inhibitor antipain has a beneficial synergistic effect with trehalose for ram semen cryopreservation | |
| CN114467915B (zh) | 一种原代肿瘤细胞和/或细胞球样体的冻存液 | |
| Arayatham et al. | Membrane-permeable trehalose improves the freezing ability and developmental competence of in-vitro matured feline oocytes | |
| Grenier-de March et al. | Cryopreservation of Prunus avium L. embryogenic tissues | |
| CN114752703A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸的冻干型检测试剂及其制备方法 | |
| Lowe et al. | Beneficial effects of Pluronic F-68 and artificial oxygen carriers on the post-thaw recovery of cryopreserved plant cells | |
| EP3035798B1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| WO2023064216A1 (en) | Composition comprising glass forming agent(s) for use as cryoprotectants and methods of making and using the same | |
| EP3578192B1 (en) | Polypeptide sperm stabiliser for semen used in artificial insemination | |
| De Castro et al. | Dextran vitrification media prevents mucin coat and zona pellucida damage in rabbit embryo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CYAGEN (SUZHOU) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC. Effective date: 20131105 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510663 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 215400 SUZHOU, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20131105 Address after: 215400 Suzhou, Jiangsu, Taicang Town, the people of the South Road, No. 162 Patentee after: Race (Suzhou) Biological Technology Co., Ltd. Address before: 510663, Guangdong City, Guangzhou Science City International Business Incubator D District 3 floor Patentee before: Race (Guangzhou) Biological Technology Co., Ltd. |