JP5719309B2 - 哺乳動物細胞培養用の栄養補助剤及び使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、全体として、抗体等の組換えタンパク質の生産用の細胞培養において使用する培地補助剤に関する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養は、しばしば、治療用抗体等の治療薬として使用するためのタンパク質を生産するために使用される。当該細胞培養用の増殖培地は、歴史的に動物起源の補助剤を含んでいたが、当該補助剤は、近年、ヒトの異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）と関連付けられる、牛海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病）等の伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）と関連付けられている。例えば、クリーランドら（Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２００７年、第６９巻：ｐ．３４５、を参照。結果として生じた、このような汚染に対する懸念を考慮すれば、医薬品の製造のためには、動物由来の成分を含まない生産培地を使用することが好ましい。

大豆加水分解物等のタンパク質加水分解物も、生産性を高めるために細胞培養培地で補助剤として使用されてきた。しかしながら、当該加水分解物の品質は、ロットごとに異なることがあり得、生産される製品の量及び品質の双方に影響を与える。

従って、厄介な汚染物質を導入しかねない動物由来成分を添加しない、ＣＨＯ細胞培養での治療用タンパク質を生産する改良方法に対する要求が存在する。好ましくは、当該方法は、ＣＨＯ細胞培養からの治療用ポリペプチドの高レベルの発現をも支援するだろう。

本発明は、本明細書で「ＳＰ栄養補給剤」と呼ぶ、本明細書で「ＳＰ栄養補給剤」と呼ぶ、動物成分及びタンパク質加水分解物を欠く、修正２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づいた栄養補助剤濃縮液、並びに治療用ポリペプチドを生産するＣＨＯ細胞培養用の本補助剤の使用方法を提供することによって、これらの及びそれ以上の要求に応じる。一実施態様において、治療用ポリペプチドは抗体、又はその抗原結合性フラグメントである。一実施態様において、治療用ポリペプチドは、ＩｇＧ抗体、又はその抗原結合性フラグメントである。幾つかの実施態様において、治療用抗体は、ヒトＩＬ−２３ｐ１９に特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である。

一実施態様において、本発明の栄養補助剤の生産物は、ビタミンＥ及び／又は亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_４）を含んでいる。他の実施態様において、ビタミンＥは、約３０．２ｍｇ／Ｌの濃度で補助剤濃縮液中に存在する。他の実施態様において、亜セレン酸ナトリウムは、約０．３ｍｇ／Ｌの濃度で補助剤濃縮液中に存在する。更なる態様では、栄養補助剤濃縮液の生産物は、表３に収載した成分を含んでいる。

他の側面において、本発明は、治療用タンパク質を生産するために、本発明の補助剤を使用する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、細胞培養に供給される栄養量が細胞の増殖速度及び栄養消費量に基づく予測栄養補給原理（ｆｏｒｗａｒｄ−ｆｅｅｄｉｎｇ ｒａｔｏｎａｌｅ）と関連している。種々の実施態様において、本発明の栄養補助剤は、生産中に、一回以上の機会、例えば一連の２回以上の、例えば３、５及び１０日目の急速栄養補給（ｂｏｌｕｓ ｆｅｅｄｄｉｎｇ）において細胞培養に添加される。他の実施態様において、本発明の補助剤は、対数増殖期の初期、対数増殖期の後期及び定常期の間に添加される。種々の実施態様において、培養は、１、２、３、４、５回又はそれ以上、栄養補給される。更に他の実施態様において、補助剤は、経時的に成分の安定した濃度を保証するために、毎日、又は連続又は半連続の基準に基づいて添加することがでいる。種々の実施態様において、本発明は、適切な増殖期間後の培養からのタンパク質の回収を含み、ここで当該回収は、培養培地（上清）、細胞（例えば、細胞溶解によって）、又は双方からすることができる。

一実施態様において、本発明の栄養補助の生産物の一以上の成分は、別々に培養に添加されるが、例えば、１、２、３又はそれ以上の成分を残りの成分の混合物とは別に添加してもよい。一実施態様において、チロシン及び／又はシステインは、他の栄養成分の混合物とは別に添加される。

他の側面において、本発明は、タンパク質の生産のための培養中の哺乳動物細胞に栄養補給する方法であって、一生産工程の間に少なくとも１回、ビタミンＥ及び／又は亜セレン酸ナトリウムを培養培地に添加することを含む方法を提供する。種々の実施態様において、培養は、ビタミンＥによって終濃度約２ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ又は６ｍｇ／Ｌに栄養補給される。種々の他の実施態様において、培養は、亜セレン酸ナトリウムによって終濃度約０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０４ｍｇ／Ｌ又は０．０６ｍｇ／Ｌに栄養補給される。

幾つかの実施態様において、本発明の方法及び栄養補助剤は、少なくとも大豆加水分解物等の植物性加水分解物で栄養補給された増殖培地によって達成されるのと同じ高さのレベル（力価）での、治療用タンパク質の生産を支援する。種々の実施対応において、本発明の栄養補給剤及び方法は、基礎栄養補給剤（グルコース及びグルタミンのみ）より約１．２、１．４、１．６、１．８又は２．０倍又はそれ以上高い力価での、治療用モノクローナル抗体の生産を支援する。

幾つかの実施態様において、本発明の方法及び培地は、大豆加水分解物を含む栄養補給培地で達成されるのと少なくとも同じ純粋さの、治療用タンパク質の生産を支援する。幾つかの実施態様において、純度は、プロテインＡクロマトグラフィーによる抗体の精製後に評価される。純度は、例えば、逆相ＨＰＬＣ又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）で測定することができる。

一実施態様において、培養温度を、生産中、例えば、生産の３、４又は５日目に、３７℃から３４℃に変化させる。

一実施態様において、本発明の補助剤は、２０Ｘ濃縮液として調製されており、生産工程において終濃度１．３３Ｘ、２．６６Ｘ及び／又は４Ｘとなるように添加される。他の実施態様において、本補助剤は、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ濃縮液又はそれ以上として調製され、使用される。更に他の実施態様において、本補助剤は、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ濃縮液又はそれ以上として調製され、使用される。

図１Ａは、生産の間に培養がどのように栄養補給されたかに（及び栄養補給された場合に）応じて、市販の基礎培地を使用して増殖した、三つの抗体生産細胞株に対する相対的な力価の強化を示している。細胞株によって生産される抗体を、本明細書では抗体Ａ（空のバー）、Ｂ（斜線バー）及びＣ（塗り潰しバー）と呼ぶ。全ての細胞を明示した通りの栄養補給を有する市販の基礎培地で培養した。使用した基礎培地は、動物成分不含、ＨＥＰＥＳ添加、Ｌ−グルタミン無添加、液状、ろ過滅菌、細胞培養試験済、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）添加（抗体Ａ及びＣを生産する細胞用）又はＡＴＡ無添加（抗体Ｂ、及び以下に記載する抗体Ｄ、Ｅ及びＦを生産する細胞用）のシグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｃ５４６７ ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＡＣＦ ＣＨＯ培地であった。図１Ａ及び１Ｂの全ての培養は、３７℃で行った。培養は、大豆加水分解物、市販の栄養培地濃縮液、又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給した。市販の栄養培地は、シグマＣ１６１５ ＣＨＯ 栄養バイオリアクター補助剤（Ｓｉｇｍａ Ｃ１６１５ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製、セントルイス、ミズーリ州、米国）であった。抗体力価は、逆相ＨＰＬＣによって測定した。 図１Ｂは、データが大豆加水分解物及びＳＰ栄養補給剤の両者によって栄養補給された細胞に対するものである以外は、図１Ａに示されたのと同じデータを示している。 図２Ａ−２Ｄは、種々の抗体に対する相対的な力価強化を示している。図２Ａ及び２Ｂは、２Ｌブラウンバイオリアクター（図２Ａ）及び振盪フラスコ（図２Ｂ）の双方において、培養を大豆加水分解物か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したかに応じた、抗体Ｄに対する相対力価強化を示している。図２Ｃは、培養を大豆加水分解物で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｅを発現する二つのクローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。図２Ｄは、培養を大豆加水分解で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｆを発現する１０の異なる選抜クローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。明らかなように、相対力価は、大豆加水分解物で栄養補給した培養に対する力価に対し規準化している。 図２Ａ−２Ｄは、種々の抗体に対する相対的な力価強化を示している。図２Ａ及び２Ｂは、２Ｌブラウンバイオリアクター（図２Ａ）及び振盪フラスコ（図２Ｂ）の双方において、培養を大豆加水分解物か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したかに応じた、抗体Ｄに対する相対力価強化を示している。図２Ｃは、培養を大豆加水分解物で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｅを発現する二つのクローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。図２Ｄは、培養を大豆加水分解で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｆを発現する１０の異なる選抜クローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。明らかなように、相対力価は、大豆加水分解物で栄養補給した培養に対する力価に対し規準化している。 図２Ａ−２Ｄは、種々の抗体に対する相対的な力価強化を示している。図２Ａ及び２Ｂは、２Ｌブラウンバイオリアクター（図２Ａ）及び振盪フラスコ（図２Ｂ）の双方において、培養を大豆加水分解物か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したかに応じた、抗体Ｄに対する相対力価強化を示している。図２Ｃは、培養を大豆加水分解物で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｅを発現する二つのクローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。図２Ｄは、培養を大豆加水分解で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｆを発現する１０の異なる選抜クローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。明らかなように、相対力価は、大豆加水分解物で栄養補給した培養に対する力価に対し規準化している。 図２Ａ−２Ｄは、種々の抗体に対する相対的な力価強化を示している。図２Ａ及び２Ｂは、２Ｌブラウンバイオリアクター（図２Ａ）及び振盪フラスコ（図２Ｂ）の双方において、培養を大豆加水分解物か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したかに応じた、抗体Ｄに対する相対力価強化を示している。図２Ｃは、培養を大豆加水分解物で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｅを発現する二つのクローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。図２Ｄは、培養を大豆加水分解で栄養補給した基礎栄養補給剤か又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給したそれを使用して培養したかに応じた、抗体Ｆを発現する１０の異なる選抜クローンに対する振盪フラスコにおける相対力価強化を示している。明らかなように、相対力価は、大豆加水分解物で栄養補給した培養に対する力価に対し規準化している。 図３は、培養を大豆加水分解物、ＳＰ栄養補給剤、又は双方で栄養補給したかに応じた、３７℃（点刻バー）又は３４℃（空白バー）で増殖した抗体産生細胞株に対する相対力価を示している。本実験で使用した細胞株は、抗体Ａを生産する。３７℃で増殖した培養の方が、全ての条件においてより低い力価を有した。データは、大豆加水分解物で栄養補給し３７℃で増殖した培養に対し規準化している。 図４は、モノクローナル抗体産生細胞株におけるアポトーシスの、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のフローサイトメトリー分析を示している。本実験で使用した細胞株は抗体Ｄを生産する。培養は、大豆加水分解物又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給した。試料を、０、６、１３及び１９日目に採取し、アネキシンＶ（ｘ軸）及びヨウ化プロピジウム（ｙ軸）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。 図５は、大豆加水分解物又はＳＰ栄養補給剤で栄養補給した、モノクローナル抗体産生細胞株（抗体Ｄ生産）のフローサイトメトリー解析を示している。０、６、１３又は１９日目に細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抗ヒトＦｃ抗体で染色した。ルクールら（Ｌｅｃｏｅｕｒ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１９９７年、第２０９巻：ｐ．１１１。前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）プロフィールからの細胞サイズ及び粒度に基づいてヴァイアブルゲートを調整した。ヒストグラムは、ＦＩＴＣ強度の範囲に亘る指定されたＦＩＴＣ強度を発現する細胞数をプロットしており、従って抗体を含む細胞数を反映する。ｘ軸は、対数目盛での細胞数０ないし１０^４あり、ｙ軸は等分目盛でのカウント数０ないし２００である。

本明細書で引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物、データベースエントリ（例えば、ジェンバンク配列又はジーンＩＤ（ＧｅｎｅＩＤ）エントリ）、特許出願、又は特許が、言及によって組み込まれることが明確かつ個別に明示されたかのような同じ範囲について、言及によって組み込まれている。本明細書で言及する核酸及びタンパク質配列に関するジェンバンクの受入番号は、本出願の出願日におけるデータベースの内容を表している。当該データベースエントリは、その後に修正され得るが、ジェンバンクは、全ての配列の前のバージョンの公的記録を日付に応じて保持しており、そのことが当該データベースエントリを特異的配列への明確な照会先としている。

さらに、如何なる特許又は特許出願公開公報への言及による組み込みも、当該特許又は特許出願公開公報に収載されている配列中の配列を組み込むことを意図している。例えば、特異的にＩＬ−２３ｐ１９に結合する抗体を開示する特許又は特許出願公開公報への言及による組み込みは、タンパク質及び核酸の双方の形での、全てのＣＤＲ、ＣＤＲ変異型、可変ドメイン、並びに軽鎖又は重鎖を含む、全ての配列を本明細書に組み込むことを意図している。

言及による組み込みに関する本記載は、例え当該引用が言及による組み込みに関する開示された記載に直ちには近接していないとしても、米国特許規則§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に確認することのできる、各々の及び全ての個別の刊行物、データベースエントリ（例えば、ジェンバンク配列又はジーンＩＤエントリ）、特許出願、又は特許に関わるために、同規則§１．５７（ｂ）（１）に基づいて、出願人によって意図されたものである。言及による組み込みに関する開示された記載が明細書内に含まれていたとしても、何ら言及による組み込みに関するこの一般的な記載を弱めるものではない。本明細書での参考文献の引用は、当該参考文献が関連する先行技術であることを認める意図でも、これらの刊行物又は文書の内容又は日付に関する如何なる承認をも構成するものではない。
Ｉ．定義

特許請求の範囲を含み本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の単語の単数形には、他に文中で明確に断らない限り、その対応する複数形への言及が含まれる。

本明細書で使用する場合、「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」とは、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ１２基礎培地の１：１混合物を云う。当該培地は、例えば、シグマＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＡＣＦ ＣＨＯ培地（カタログ番号 Ｃ５４６７）として市販されている。本発明の栄養補助剤（ＳＰ栄養補給剤）は、無機塩を低減した（生産中の浸透圧増加を低減する目的）、及びＨＥＰＥＳ又はフェノールレッド無添加の、修正型２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づいている。本修正型２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、表３の成分１−４３を含んでいる。他に断らない限り、本明細書で言及する番号をつけた「成分」は、表３に収載した成分である。ＳＰ栄養補給剤は、表３の全４９成分を含んでおり、換言すれば、グルタミンを１５ｇ／Ｌ添加した修正２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２であり、更に示した通り、亜セレン酸ナトリウム（０．３ｍｇ／Ｌ）及びビタミンＥ（３０．２ｍｇ／Ｌ）で栄養補給されている。

他に断らない限り、表３の番号で言及する成分は、表３に収載した濃度で使用する。

実用的な理由から、グルタミン（成分４７）は、グルタミン酸の脱アミノ化を避けるために、典型的には栄養補給の直前にＳＰ栄養補給混合物に添加する。加えて、チロシン（成分２７）及びシステイン（成分１３）は、定刻前に他の成分と混合してはならず、その代り栄養補給時に別々に培養に添加する。理論によって制限されることを意図するのではないが、チロシン及びシステインの溶解度が栄養補給に先立つＳＰ栄養補給剤濃縮液へのそれらの添加を不可能にしているのは、培養期間中それらが溶液から降下する傾向にあるためである。例えば、３回の大量瞬時栄養補給を含む生産工程に関しては、ＳＰ栄養補給剤成分である１−４７の予備混合溶液を、培養容量の６．７％（生産工程の間添加される全栄養補給である２０％の１／３）分を添加することによって、栄養補給の日に培養に添加する。培養液中の全４９成分の終濃度が、仮に全４９成分が表３に与えられた量を含む予備混合溶液（濃縮液）として添加されていたならば、終濃度がそうであったと実質的に同じになるように、適切な量の亜セレン酸ナトリウムを培養液に添加し、並びに適切な量のビタミンＥを培養液に添加する。当該計算は、治療用タンパク質を製造する当業者に公知である。成分４８、成分４９、及び成分１−４７の混合物は培養液に別々に添加するけれども、それらを任意の順に添加することができる。表３に規定した処方は、従って、実際的な利用又は便宜のために、限られた数の成分が別々に添加されるか否かに関わらず、あたかも単一の溶液が調製されたかのように、栄養補給濃縮液の成分が同じ最終結果を達成するために添加され得る、という意味において「仮想的な」処方とみなすことができる。

本発明の補助剤には、種々の実施態様において、それが処方された濃度に関わらず、表３にある成分の比率によって定義される組成物が包含される。従って、本発明は、如何なる特定の濃度にも限定されない。本発明は、表３に規定した２０Ｘ濃縮液型を包含し、１Ｘ、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１１Ｘ、１２Ｘ、１３Ｘ、１４Ｘ、１５Ｘ、１６Ｘ、１７Ｘ、１８Ｘ、１９Ｘ、２０Ｘ、２１Ｘ、２２Ｘ、２３Ｘ、２４Ｘ、２５Ｘ、２６Ｘ、２７Ｘ、２８Ｘ、２９Ｘ、３０Ｘ未満、又は３０Ｘ超等の任意の濃度を包含することができ、同様に任意の非整数倍の濃縮液も包含する。厳密である必要は無いが、終濃度が約４Ｘとなるように補助剤が添加されることを意図している。

本明細書で報告する「Ｘ」濃度とは恣意的なものであり、単に本発明の栄養補助剤が「２０Ｘ」のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に由来するという事実に基づいているだけである。従って、「Ｘ」濃度は如何なる望ましい作業濃度又は終濃度を反映しない。培養培地の終濃度４Ｘが、例えば、完全に適しているかもしれない。この使用は、「１Ｘ」がある望ましい「最終」濃度が反応混合物又は培養培地であることがしばしば暗に示されているところの、典型的な使用にふさわしくないかもしれない。

本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、望ましい生物学的活性を示す如何なる型の抗体にも言及することができる。従って、それは最も広い意味に用いられ、具体的には、それらが望ましい生物学的活性を示す限りは、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（例えば、二重選択性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、等を包含する。

本明細書で使用する場合、抗体に言及するときに、用語「その結合フラグメント」又は「その抗体結合フラグメント」は、まだ実質的にその標的に結合する能力を保持する抗体のフラグメント又は誘導体を包含する。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体；一本鎖抗体、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；及び抗体フラグメントから形成された多選択性抗体が含まれる。典型的には、結合フラグメント又は誘導体は、その標的に対する少なくとも１０％の親和力、例えば、解離平衡結合乗数（Ｋｄ）における変化が１０倍以下、を保持している。望ましい生物学的効力を発揮するための十分な親和力を有する如何なる結合フラグメントも有用ではあるが、好ましくは、結合フラグメント又は誘導体は、その結合親和力の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％（又はそれ以上）を保持する。特定された場合、結合フラグメントには、実質的にその生物学的活性を変えない保存アミノ酸の置換による配列変異型が含まれ得ることをも意図している。

「ＩＬ０２３アンタゴニスト」とは、ＩＬ−２３の活性を何らか阻害する分子である。幾つかの実施態様において、本発明の抗体又はその抗体結合フラグメントは、例えば、ＩＬ−２３のサブユニット又はその受容体に結合することによって、ＩＬ−２３受容体を介してＩＬ−２３のシグナル伝達を阻害するＩＬ−２３アンタゴニストである。他の実施態様において、ＩＬ−２３アンタゴニストは、アンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ等の小分子又はポリヌクレオチドである。

「インターロイキン−２３」（又は「ＩＬ−２３」）とは、二つのポリペプチドサブユニット、ｐ１９及びｐ４０から成るタンパク質を意味する。ｐ１９サブユニット（ＩＬ−２３ｐ１９、ＩＬ２３Ａとしても知られる）の配列は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベース受入番号ＮＰ＿０５７６６８、ＡＡＨ６７５１１、ＡＡＨ６６２６７、ＡＡＨ６６２６８、ＡＡＨ６６２６９、ＡＡＨ６６７５１２、ＡＡＨ６６７５１２の何れか又はこれらの配列の自然界で見出される変異型に提供されている。ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ１２Ｂとしても知られる）の配列は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベース受入番号ＮＰ＿００２１７８、Ｐ２９４６０、ＡＡＧ３２６２０、ＡＡＨ７４７２３、ＡＡＨ６７５０２、ＡＡＨ６７４９９、ＡＡＨ６７４９８、ＡＡＨ６７５０１の何れかに記載されており、又はこれらの配列の自然界で見出される変異型の配列である。これらの配列の全ては、言及によって本明細書にそっくりそのまま組み込まれている。

「インターロイキン−２３Ｒ」又は「ＩＬ−２３Ｒ」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベース受入番号ＮＰ＿６５３３０２（ＩＬ２３Ｒ，ジーンＩＤ（Ｇｅｎｅ ＩＤ）：１４９２３３）に記載された通り、ヒトＩＬ−２３Ｒの成熟型又はその自然界で見出される変異型の配列から成る、一本鎖ポリペプチドを意味する。ＩＬ−２３Ｒ配列の変異型について、ＷＯ０１／２３５５６号及びＷＯ０２／２９０６０号に更に開示されている。これらの配列及び文書のすべては、言及によって、本明細書にそのままそっくり組み込まれている。

「インターロイキン−１２Ｒβ１」又は「ＩＬ−１２Ｒβ１」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベース受入番号ＮＰ＿７１４９１２、ＮＰ＿００５５２６（ＩＬ１２ＲＢ１、ジーンＩＤ：３５ｐ４）に記載された通り、ヒトＩＬ−１２Ｒβ１の成熟型又はその自然界で見出される変異型の配列から成る、一本鎖ポリペプチドを意味する。これらの配列及び文書のすべては、言及によって、本明細書にそのままそっくり組み込まれている。

本明細書において使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体母集団から得られた抗体への言及であり、還元すれば、母集団を構成する個々の抗体は、少量だけ存在し得る自然界で見出される可能な突然変異以外は同一である。単一の抗原エピトープに配向されることより、モノクローナル抗体は高度に特異的である。対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体製剤は、典型的には、異なるエピトープに配向する（又は特異的に配向する）多数の抗体を含んでいる。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体母集団から得られたものとしての抗体の特性を示しており、任意の特別な方法による抗体生産を要求するものと解釈してはならない。例えば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、最初にコーラーら（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、第２５６巻：ｐ．４９５、によって開示されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６．５６７号を参照）によって作成してもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、クラックソンら（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、第３５２巻：ｐ．６２４−６２８及びマークスら（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１年、第２２２巻：ｐ．５８１−５９７、に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。

本明細書のモノクローナル抗体には、具体的にいうと「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が含まれ、ここでキメラ抗体において、それらが望ましい生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の分子種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残部は、別の分子種に由来する又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、当該抗体のフラグメントも同様である。米国特許第４，８１６，５６７号；モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻：ｐ６８５１−６８５５。

「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む、免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの例において、二以上のＶ_Ｈ領域がペプチドリンカーによって共有結合し、二価のドメイン抗体を作成している。二価のドメイン抗体の二つのＶ_Ｈ領域は、同一の又は異なる抗原を標的にすることができる。

「二価抗体」は、二つの抗原結合部位を含んでいる。幾つかの例において、二つの結合部位は、同一の抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体とは、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体フラグメントへの言及であり、ここでこれらのドメインは一本鎖のポリペプチドに存在している。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨとＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーを含んでおり、ｓｃＦＲｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説に関しては、プリュックツーン著「モノクローナル抗体に関する薬理学（ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ）」、第１１３巻、ローゼンブルグ及びムーア（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｕｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ）編、スプリンガー出版社（Ｓｐｒｉｎｇｅ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２６９−３１５、を参照。

本明細書のモノクローナル抗体には、ラクダ化した単一ドメイン抗体も含まれる。例えば、ムイルダーマンスら（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００１年、第２６巻、ｐ．２３０；ライヒマンら（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９９年、第２３１巻：ｐ．２５；ＷＯ９４／０４６７８号；ＷＯ９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号、を参照。一実施態様において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成するような修飾を有する、二つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「二重特異性抗体」とは、二つの抗原結合部位を有し、そのフラグメントが同一のポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）の中で軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる、小さな抗体フラグメントへの言及である。同一鎖状の二つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは他の鎖の相補的なドメインと対合され二つの抗原結合部位を作成する。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；及びホリンガーら（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻：ｐ．６４４４−６４４８、において完全に記載されている。一般的な遺伝子操作抗体変異体の総説に関しては、ホリンガー及びハドソン（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００５年、第２３巻、ｐ．１１２６−１１３６、を参照。

本明細書で使用する場合、用語「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体と同様に非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列を含んでいる、抗体型への言及である。当該抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含んでいる。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも一の、典型的には二の可変ドメインの全てを含むものであり、ここでその中では、全ての又は実質的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、並びに全て又は実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を任意に含むものである。ヒト化抗体を親のげっ歯類抗体から区別する必要があるときは、抗体クローンの命名に、接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」又は「ｈ」が付加される（しかし、これと同じ命名は、文脈によってはヒトの特定のタンパク質型を示すこともできる）。げっ歯類抗体のヒト化型は、一般的に親のげっ歯類抗体と同じＣＤＲ配列を含むものであるが、しかしヒト化抗体の親和力を高めるため、又は安定性を高めるため、又は他の理由によって、一定のアミノ酸置換を含むことがきる。

抗体には、変更エフェクター機能を提供するための修飾（又は遮断）Ｆｃ領域を有する抗体も含まれる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０号；ＷＯ２００５／１２０５７１号；ＷＯ２００６／００５７７０２号；プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、２００６年、第５８巻：ｐ．６４０−６５６、を参照。当該修飾は、免疫系の種々の反応を強化又は抑制するために使用することができ、診断及び治療において受け入れられる有用な効果をもたらす。Ｆｃ領域の変更には、アミノ酸変化（置換、欠失及び挿入）、グリコシル化又は脱グリコシル、及び多重Ｆｃ付加が含まれる。Ｆｃの変化は、治療用抗体中おける抗体の半減期をも変えることができる。半減期の延長は、便宜を増し、原料使用を低下させと共に、結果として服用量の減少をもたらし得る。プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、第１１６巻：ｐ．７３４−３５、を参照。

抗体には、完全なエフェクター機能を提供するインタクトなＦｃ領域を有する抗体、例えば、標的細胞中で補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起する、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体等も含まれる。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、母集団細胞由来の同族抗原を発現する細胞を選択的に枯渇させるために投与される。

用語「完全ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体への言及である。完全ヒト化抗体は、マウス体内、マウス細胞内、又はマウス細胞由来のハイブリドーマ内で生産されるならば、マウスの糖鎖を含むことができる。同様に、「マウス抗体」又は「ラット抗体」とは、それぞれマウス又はラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体への言及である。完全ヒト化抗体は、人間体内、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列を有するトランスジェニック動物体内において、ファージディスプレー又は他の分子生物学的な方法によって生成することができる。

「結合化合物」とは、標的に結合することのできる、分子、小分子、高分子、ポリペプチド、抗体又はフラグメント又はそのアナログ、又は可溶性受容体、への言及である。「結合化合物」とは、標的に結合することのできる、非共有結合性複合体等の分子の複合体、イオン化分子、及び例えば、リン酸化、アシル化、架橋結合、環化、又は限定開裂等によって修飾された共有結合性の又は非共有結合性の修飾を受けた分子、への言及でもあり得る。抗体と関連して使用されるとき、用語「結合化合物」とは、抗体及び抗原結合フラグメントの双方への言及である。「結合」とは、標的との結合化合物の会合への言及であり、場合によっては結合化合物が溶液に溶解又は懸濁することができるが、ここで当該会合は、結合化合物の通常のブラウン運動の低下を結果として生じる。「結合組成物」とは、安定剤、賦形剤、塩、バッファー、溶媒、又は添加剤と併用された、標的に結合することのできる分子、例えば結合化合物等への言及である。

抗体又は抗体の抗原結合部位由来の結合組成物は、巧妙な方法に基づき、関連しない抗原との親和力よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、そして最も好ましくは少なくとも１００倍大きな親和力によってその抗原に結合する。好ましい一実施態様において、抗体は、例えばスキャチャード解析等によって測定される通り、約１０^９ｌｉｔｅｒｓ／ｍｏｌより大きい親和力を有するであろう。ムンゼンら（Ｍｕｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８０年、第１０７巻：ｐ．２２０−２３９。
ＩＩ．動物生産物不含／加水分解物不含の生産栄養補助剤

本発明は、哺乳動物（例えば、ＣＨＯ）の細胞培養における、モノクローナル抗体及びタンパク質の生物製剤の生産のための、動物性成分及び定義付けが乏しいタンパク質加水分解物への依存を除去しようとの欲求に基づいている。成果は、小規模のバイオリアクターでの大豆加水分解物を栄養補給した培養力価よりも２５％高い生産収率を有し、並びに振盪フラスコ実験での補助剤無添加の培養力価を二倍にする、化学的に規定された、生産栄養補助剤である。図２を参照。この修正ＤＭＥＭ／Ｆ１２濃縮液を使用して生産したタンパク質は、加水分解物を含有する補助剤を使用して生産したそれに匹敵する純度である。

一実施態様において、本発明は、動物性成分及びタンパク質加水分解物を欠いている高収量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）生産栄養補助剤を提供する。当該補助剤は、強化された力価で、並びに加水分解物を使用する従来法に匹敵する生成物品質特性を有するｍＡｂｓを生産する。

幾つかの実施態様において、補助剤は、例えば、ｐ１９サブユニットを介してヒトＩＬ−２３に特異的に結合する、治療用抗体、又はその抗原結合フラグメントを生産するうえで、細胞を増殖するために使用することができる。ヒトＩＬ−２３ｐ１９に結合する代表的な抗体は、一般に配布された国際公開ＷＯ２００８／１０３４３２号に開示されている。他の実施態様において、培地は、ＩＬ−２３ｐ１９以外のタンパク質に特異的に結合する抗体を含み、抗体フラグメント又は誘導体、サイトカイン、サイトカイン受容体、成長因子、ワクチン用ポリペプチド、及び非治療用タンパク質さえも含む、他のタンパク質を生産するために使用することができる。

本発明の増殖培地補助剤（「ＳＰ栄養補給剤」と呼ぶ）は、ビタミンＥ及び亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳｅＯ_３）で栄養補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地の修正、濃縮した処方に基づいている。ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び亜セレン酸ナトリウムによる栄養補給に関連する抗体生産のための他の栄養補給プロトコルは、報告されている。ジョウら（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、第２４巻：ｐ９９。

栄養補給ストラテジーは、細胞培養に導入される栄養量が栄養消費及び細胞の増殖速度に基づく、予測栄養補給原理に基づいている。例えば、ジョウら（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、第２４巻：ｐ９９を参照。本発明の培地及び方法は、振盪フラスコ及び小規模の撹拌型タンクバイオリアクター（ＳＴＲ）で試験を行った。生産工程のキャラクタリゼーション及び製品評価は同時に行った。振盪フラスコは、細胞増殖の一般的特性、温度に応じた増殖、基礎培地及び栄養補給培地の効果、及び細胞株の予備的な安定性評価、等のパラメータを評価するために用いた。並行してＳＴＲは、より制御された生育環境での新生産栄養補給培地の実施可能性を研究するために使用した。栄養補給に伴って生じる生理学的変化及び工程パラメータの変化を分析し監視して、生産物の偏差を減少させた

一つの側面において、本発明は、抗体等の治療用ポリペプチドを生産するための、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を培養する方法に関する。出願人は、細胞増殖及び栄養消費速度が最高になる時を決定するために、ＳＰ栄養補給剤の連日栄養補給を使用し、数種類の抗体産生細胞株を培養して研究した。出願人は、グルコース４ｇごとにグルタミン１ｇが消費されることを見出し、それがＳＰ栄養補給剤におけるグルタミン対グルコースの比１：４へと導いた。出願人は、少なくとも幾つかの細胞株にとって、連日の栄養補給よりも生産工程中の有限回の大量瞬時栄養補給（ｂｏｋｕｓ ｆｅｅｄ）を使用することで、高抗体力価及び生産を達成することが可能であることも見出した。例えば、栄養補給は、例えば摂取後３、５及び１０日目での３回の大量瞬時栄養補給として実施することができる。栄養補給回数の減少は、生産工程を非常に簡素化し、それは、例えば臨床材料の調製等の大規模な生産工程において格別価値がある。従って、一実施態様において、本方法は、生産工程の間に一以上の大量瞬時栄養補給、例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の大量瞬時栄養補給を含んでいる。当該栄養補給は、細胞生存能及び生産が最適化されるように、好ましくは培養の栄養が枯渇する前に実施される。幾つかの場合、当該栄養補給は、接種後、３、５及び１０日目に行うことができる。

図１Ａに示した通り、ＳＰ栄養補給剤は、タンパク質生産の通常の添加剤である大豆加水分解物で細胞を栄養補給した時に得られる力価に比例して、最終の抗体力価を約２０％ないし８０％増加する。本発明の栄養補助剤は、幾つかの細胞株によってより生産を強化するために、大豆加水分解物等の他の補助剤と併用して使用することもできる。図１Ｂは、抗体Ｂを生産する細胞株からの生産を、大豆加水分解物が２０％増加する一方、ＳＰ栄養補給剤が＞７０％増加し、併用が９０％増加することを証明している。

図２Ａ−２Ｄに図解した通り、幾つかの異なる抗体に関し、ＳＰ栄養補給剤による栄養補給は、大豆加水分解物による栄養補給に比例して力価を約２０％−６０％改善した。ＳＰ栄養補給剤を使用した場合、バイオリアクター及び振盪フラスコの双方で（図２Ａ及び２Ｂ）力価がより高く、付随して、どちらの補助剤に関しても、振盪フラスコに比較してバイオリアクターの方が、２０−３３％高い力価であった（データ未掲載）。

その結果を図１Ａ、１Ｂ及び２Ａ−２Ｄに提示する、実験に使用した抗体を全体として表１に記載する。

図３に示した通り、増殖培地補助剤に関係なく、３７℃で増殖した培養よりも３４℃で増殖した培養の方が高い力価を有した。ＳＰ栄養補給剤による栄養補給は、大豆加水分解物による栄養補給と比較して抗体力価を改善し、両補助剤の併用は力価を幾分か更に強化した。
ＩＩＩ．抗体産生細胞のキャラクタリゼーション

生産される抗体の品質及び純度は、生産細胞における生理学的変化によって影響を受け得る。それ故に、本発明の栄養補助剤の細胞生理機能の幾つかの面に及ぼす影響をも特性づけられる。細胞のＤＮＡ含量を測定し、細胞周期範囲内での細胞の分布を定量し（データ未掲載）、アポトーシス状態を定量し、細胞の生存能を評価し（図４）、並びに細胞会合ｍＡｂを定量し、生産性を評価する（図５）。三つの全パラメータは、フローサイトメトリーによって、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ多目的フローサイトメーターシステム（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｍｕｊｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）等を使用して、定量する。

細胞のＤＮＡ分布は、ヨウ化プロピジウム染色によるフローサイトメトリーによって分析する。細胞周期のＧ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期にある細胞のパーセントの分析が、ＳＰ栄養補給剤で栄養補給された培養が大豆加水分解物で栄養補給された培養に類似する細胞周期の分布をしていることを明らかにしている。

細胞のアポトーシス状態は、アネキシンＶ結合（ＦＩＴＣ標識タグ・アネキシン使用）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって分析する。例えば、ベルメシュ（Ｖｅｒｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１９９５年、第１８４巻：ｐ３９；ムーアら（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．）、「メソッズ・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）」、１９９８年、第５７巻：ｐ２６５；テイト（Ｔａｉｔ）、「ザ・ジャーナル・オブ・ヌクレアー・メディシン（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．）」、２００８年、第４９巻：ｐ．１５７３、を参照。図４は、生産１３及び１９日目において、大豆加水分解物によって栄養補給された培養における細胞と比較して、ＳＰ栄養補給剤によって栄養補給された培養からの細胞のヴァイアブルゲートにおける高いパーセントが（左下、ＬＬ四分の一区）、そして遅いアポトーシス／ネクローシスゲートにおける低いパーセントが（右上、ＵＲ四分の一区）見出されることを示している。このような結果は、ＳＰ栄養補給剤が細胞の生存能を保持するためにより良い環境を提供することを示している。加えて、両栄養補給が細胞当たり同等の蛍光強度の中央値を示す一方で、図５及び表２（下記）は、大豆加水分解物補助剤条件よりもＳＰ栄養補給剤で栄養補給された培養中の細胞の方が、ヴァイアブルゲートにおける細胞の高いパーセントを示すことを明らかにしている（１３及び１９日目）。生細胞の高い個体群及び細胞ごとの同等の収量という最終結果は、ＳＰ栄養補給剤で栄養補給された培養が、１３及び特に１９日目に有意により多い抗体を生産することを意味している。

一般的に、本発明の補助剤及び方法は、如何なる哺乳動物細胞株由来の如何なるタンパク質の生産にも使用することができ、そして特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養による治療用タンパク質の生産での使用に適している。非限定的な一例において、治療用タンパク質は、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体（又はその抗原結合フラグメント）等の抗体である。種々の実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、一般に配布された国際公開ＷＯ２００８／１０３４３２号に開示されたヒト化抗体の１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲ配列、又は重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含んでおり、ここで、その開示は、例えばｈｕ１３Ｂ８等のように、本明細書に言及によってそっくり組み込まれている。他の実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、ヒトＩＬ−２３との結合に関し抗体ｈｕ１３Ｂ８と拮抗する。他の実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、ｈｕ１３Ｂ８が結合するのと同じヒトＩＬ−２３上のエピトープに結合する。他の実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、ヒトＩＬ−２３ｐ１９の、ブダペスト条約に基づいて２００６年８月１７日に、受入番号ＰＴＡ−７８０３でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ−マナッサス、バージニア州、米国）に寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体への結合をクロスブロッキングアッセイにおいて防止することができる。更にそれ以上の実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、受入番号ＰＴＡ−７８０３でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体が結合するのと同じエピトープに結合する。更なる実施態様において、抗ヒトＩＬ−２３ｐ１９抗体は、受入番号ＰＴＡ−７８０３でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体が含むのと同じＣＤＲ配列を含んでいる。

本発明の培地及び方法を使用する生産に適したさらなる抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体は、一般に配布された国際公開ＷＯ２００７／０２７７１４号及びＷＯ２００８／１０３４７３号に開示されており、その開示は、言及によって本明細書にそっくりそのまま組み込まれている。さらなる抗ＩＬ−２３抗体は、例えば、米国特許第７，２４７，７１１号（セントコア社（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、抗ＩＬ−２３ｐ４０特異的抗体を開示）、米国特許出願公開第２００７／０００９５２６号及び２００７／０２１８０６４号（セントコア社、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体を開示）、国際公開ＷＯ２００７／０２４８４６号（イーライリリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体を開示）、及び国際公開ＷＯ２００７／１４７０１９号（ザイモジェネティクス社（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＬ−２３ｐ１９及びＩＬ−１７に対する二重特異性抗体を開示）等に開示されており、その開示は、言及によって本明細書にそっくりそのまま組み込まれている。既に臨床試験にある代表的なＩＬ−１２／ＩＬ−２３（ａｎｔｉ−ｐ４０）抗体には、セントコア社の完全ヒト化抗体ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）（ＣＮＴＯ １２７５）及びアボット社（Ａｂｂｏｔｔ）の完全ヒト化抗体ＡＢＴ−８７４が含まれる。

種々の実施態様において、本発明の抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体には、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ‘）_２及び二重特異性抗体等の抗原結合フラグメントが含まれる。

本発明の幅広い範囲は、本発明を特定の実施態様に限定することを意図するのではないが、以下の実施例を参照して良く理解される。
実施例
実施例１
一般的な方法

分子生物学における標準法が記載されている。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）著、「モレキュラー・クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８２年；サムブルック及びラッセル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第３版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、２００１年；ウー（Ｗｕ）著、「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」、第２１７巻、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州。標準法は、またアウスベルら（Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）著、「分子生物学のカレントプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１−４巻、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ・インク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＮＹ、にも発表されており、それには、細菌細胞のクローニング及びＤＮＡ突然変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞及び酵母のクローニング（第２巻）、複合糖質及びタンパク質の発現（第３巻）、及びバイオインフォマティクス（第４巻）が記載されている。

免疫沈降法、クロマトグラフィー、電気泳動法、遠心分離法及び分別結晶法を含むタンパク質精製法が記載されている。コリガンら（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．）著、「タンパク質科学のカレントプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ・インク、ニューヨーク。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生産、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、コリガンら著、「タンパク質科学のカレントプロトコル」、第２巻、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ・インク、ニューヨーク、２０００年；アウスベルら著、「分子生物学のカレントプロトコル」、第３巻、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ・インク、ニューヨーク、ＮＹ、ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７、２００１年；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．）著、「生命科学研究用製品（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、セントルイス、ミズーリ州、ｐｐ．４５−８９；アマシャムファルマシアバイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）著、「バイオ・ディレクトリー（ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ）」、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州、ｐｐ．３８４−３９１、２００１年、を参照。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生産、精製、及びフラグメンテーションが記載されている。コリガンら著、「免疫学のカレントプロトコル」、第１巻、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ・インク、ニューヨーク、２００１年；ハーロー及びレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）著、「抗体の使用法（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ，１９９９年；ハーロー及びレーン、前掲書。リガンド／受容体相互作用をキャラクタリゼーションするための標準技術が入手可能である。例えば、コリガンら著、「免疫学のカレントプロトコル」、第４巻、ジョン・ウィイリー・インク、ニューヨーク、２００１年、を参照。

蛍光活性化細胞選別検知システム（ＦＡＣＳ；登録商標）を含む、フローサイトメトリー法が入手可能である。例えば、オーウェンスら（Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．）著、「臨床検査室実践用フローサイトメトリー原理（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ、ホーボーケン、ニュージャージー州、１９９４年；ギバン（Ｇｉｖａｎ）著、「フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、第２版、ウィリーリス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ホーボーケン、ニュージャージー州、２００１年；シャピロ著（Ｓｈａｐｉｒｏ）、「プラクティカル・フローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」、ジョン・ウィイリー・アンド・サンズ、ホーボーケン、ニュージャージー州、２００３年、等を参照。例えば診断試薬として使用するために、核酸プライマー及びプローブを含む核酸、ポリペプチド、及び抗体を修飾するのに適した蛍光試薬を利用することができる。「分子プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）」（カタログ）、モレキュラー・プローブ・インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）、ユージーン、オレゴン準州、２００３年；シグマアルドリッチ社カタログ、セントルイス、ミズーリ州、２００３年。

免疫系組織学の標準法が記載されている。例えば、ミュラーハーメリンク（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ）編、「ヒト胸腺：組織病理学及び病理学（Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、スプリンガー出版社、ニューヨーク、ＮＹ，１９８６年；ハイアットら（Ｈｉａｔｔ，ｅｔ ａｌ．）著、「組織学カラーアトラス（Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）」、リッピンコット、ウィリアムズ、アンド、ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、２０００年；ルイスら（Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．）、「基礎組織学：教本及び図譜（Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）」、マグローヒル、ニューヨーク、ＮＹ、２００２年、を参照。

統計分析は、これに限定されないが、ＪＭＰ（登録商標）統計ソフトウェア（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｏｆｔｏｗａｒｅ）、ＳＡＳインスティテュート・インク（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ケーリー（Ｃａｒｙ）、ノースカロライナ州（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）、米国、を含む市販のソフトウェアを使用して実施することができる。

細胞増殖培地及び方法は、例えば、国際公開ＷＯ９０／０３４３０号及び米国特許第５，８３０，７６１号に提供されており、その開示は、言及によって本明細書にそっくりそのまま組み込まれている。
実施例２
抗体生産

本発明の栄養補助剤及び方法を使用して、モノクローナル抗体を以下の通り生産する。完全長ヒト化ＩｇＧ抗ヒトＩＬ２３ｐ１９モノクローナル抗体である抗体Ｄを発現する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１ｍＬ／Ｌの鉄キレート剤Ｃ２１１５（シグマアルドリッチ社製、セントルイス、ミズーリ州、米国）、２０ｍＬ／Ｌの２００ｍＭグルタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク、米国）、並びに各１ｍＬ／Ｌのセルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）微量元素Ａ及びセルグロ微量元素Ｂ（両者ともメディアテック社製、マナッサス、バージニア州、米国）を添加したＣ５４６７ＣＨＯタンパク質不含培地（ＣＨＯ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍｕ）（ＡＴＡ無添加）（シグマアルドリッチ社製）を含む基礎培地（ＢＭ）で、振盪フラスコ中通気して連続的に継代培養する。細胞を湿度７．５％のＣＯ２恒温槽中３７℃で培養し、振盪フラスコをフォーマ社製回転振盪盤（Ｆｏｒｍａ ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上１００ｒｐｍで撹拌する。生細胞密度が１−２ｘ１０^６細胞数／ｍＬのときに、ＣＨＯ細胞を１：３ないし１：５の分割比で継代培養する。

ＳＰ栄養補給剤による抗体（ＩｇＧ）生産への栄養補給効果は、以下のように測定する。対照の培養は、ゼロ時点に、２００ｇ／Ｌの保存溶液を使用して、熱処理した大豆加水分解物を終濃度５ｇ／Ｌまで添加することによって、大豆加水分解物で栄養補給する。グルコース（４５０ｇ／Ｌ）及びグルタミン（２００ｍＭ）の保存溶液からの添加によって、グルコース及びグルタミンをそれぞれ１．５ｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌ以上に保持する。

他の培養液は、その処方を表３に提供する、２０Ｘ濃縮液であるＳＰ栄養補給剤によって栄養補給する。ＳＰ栄養補給剤は、表３に記載し本明細書の他処で論じた通り、亜セレン酸ナトリウム及びビタミンＥ（α−トコフェロール）によって栄養補給された修正２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に基づいている。グルコース（成分４６）を６０ｇ／Ｌで提供し、予め定めたグルコース対グルタミンの１：４の消費比に従って、グルタミン濃度（成分４７）を１５ｇ／Ｌに調整する。

細胞は、２Ｌの作業容量を有するブラウン・バイオリアクター（Ｂ．ブラウン・メディカル・インク（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、ベスレヘム、ペンシルベニア州、米国）で培養する。接種菌液は、７．５％のＣＯ_２で覆ったウェイブ培養バッグ（ｗａｖｅ ｂａｇ）（ウェイブ・バイオテック・ＬＬＣ、ＧＥヘルスケア（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｃｈ ＬＬＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ）、サマセット、ニュージャージー州、米国）中、３７℃でスケールアップする。バイオリアクターは、ｐＨ６．８、溶存酸素（ＤＯ）６０％、及び撹拌速度２００ｒｐｍで運転する。温度は、初期に３７℃に設定し、３、４又は５日目に３４℃に低下する。溶存酸素は、酸素吹き込みによって制御し、ｐＨは、１Ｍ ＮａＯＨ又はＣＯ_２ガスの添加によって制御する。

ＳＰ栄養補給剤によって栄養補給されるバッチにとって、予測栄養補給は一の指標、グルコース／グルタミンの比に基づいている。栄養補給量は、下記の式によって決定された。式中、Ｑ_{グルコース}は、０．０１９ｇ／１０^５細胞／日の平均グルコース消費速度、Ｘ_ｎは、Ｔ_ｎで測定した生細胞密度、及びＣ_{グルコース}＝６０ｇ／Ｌである。

振盪フラスコ及びバイオリアクター中の生細胞密度及び全細胞密度は、セデッ
クス（Ｃｅｄｅｘ）自動細胞培養分析装置（イノバティス（Ｉｎｎｏｖａｔ
ｉｓ）ＡＧ、ビーレフェルト、ドイツ）を使用して測定する。グルコース、乳酸、
グルタミン及びグルタミン酸は、ＹＳＩ２０００分析装置（ＹＳＩ、イェロー
スプリングスインスツールメンツ社（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）、オハイオ州、米国）を使用して定量する。アンモニア
は、ノバ・イオプロフィール１００プラス・分析装置（Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏ
ｆｉｌｅ １００ ｐｌｕｓ ａｎａｌｙｚｅｒ）（ノバ・バイオメディカル・コ
ープ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、ウォーザン（Ｗａｌｔｈ
ａｍ）、マサチューセッツ州、米国）によって測定する。浸透圧は、アドバーンス
ト微量浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ）（アドバ
ーンスト・インスツールメンツ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、
ノーウッド（Ｎｏｒｗｏｏｄ）、マサチューセッツ州、米国）によって測定する。
ｐＨ、ｐＣＯ_２、ｐＯ_２は、ＡＢＬ５分析装置（ラジオメーター・アメリカ・インク（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．）、ウェストレイク（Ｗｅｓｔｌａｋｅ、オハイオ州、米国）によって測定する。抗体は、逆相ＨＰＬＣ又はタンパク質Ａ ＨＰＬＣによって定量する。

所定の産生細胞株の代表的な幾つかの培養が、いつ栄養補給が実施されるべきかを決めるために、上記の式を使用して分析され、そして当該培養が十分な再現性を示すならば、同一細胞のその後の培養は、培養を頻繁に監視せずとも、予め決められた時間に簡単に栄養補給することができる。例えば、培養は、摂取後、３、５及び１０日目に栄養補給することができる。あるいは、培養は、対数増殖期の初期、対数増殖期の後期、及び定常期の間に栄養補給することができる。

本明細書で検討した幾つかの培養にとって、（生産工程の進行に亘る培養の作業容量の２０％という総栄養補給のための）各６．６７％容量の３回の大量瞬時栄養補給が、高レベルの抗体生産を支持するために適していた。従って、各栄養補給は、表３の「２０Ｘ」処方から培養培地中の最終濃度である１．３３Ｘまでの希釈液を含んでいる。消費尽くされてはならない成分に対しては、二回目及び三回目の大量瞬時栄養補給において、濃度をそれぞれ２．６６Ｘ及び４Ｘに高める。上記の通り、本明細書で報告する「Ｘ」濃度は、本栄養補給アプリメントが由来する、２０Ｘ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にのみ基づいており、如何なる特定の望ましい作業（又は最終）濃度（例えば、「１Ｘ」）を反映するものではない。

ＳＰ栄養補給剤を添加して培養した細胞は、強化された細胞増殖、遅い時期での（摂取後１３及び１９日目）アポトーシスの減少を示し、そして栄養補給されなかった培養又は大豆加水分解物のみで栄養補給された培養よりもより高い抗体力価を生み出す。抗体Ｄを発現するＣＨＯ細胞株での実験で、ＳＰ栄養補給剤で栄養補給された培養においては、大豆加水分解物でのみ栄養補給された培養に比較して、力価が２倍まで高い。

更に実験により、精製後に逆相（ＲＰ）及びサイズ排除（ＳＥＣ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した時に、ＳＰ栄養補給剤で栄養補給された培養から生産した抗体が、大豆加水分解物の栄養補給剤を使用して調製した抗体と同様の特性を有することを、確認している。

Claims (10)

1. 下記の段階を含む抗体又はその抗原結合フラグメントの生産方法；
   ａ）培養中に、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するＣＨＯ細胞を増殖する段階；
   ｂ）以下の表の成分１−４７（表中に規定の濃度による）
   

   

   
   

   

   
   及び亜セレン酸ナトリウム及びビタミンＥを含み、動物成分を含まない細胞栄養補助剤濃縮液によって培養を栄養補給する段階；及び
   ｃ）培養からの抗体又はその抗原結合フラグメントの回収段階。
2. 培養温度を３７℃から３４℃に変化させることを更に含む請求項１に記載の方法。
3. 温度の変化が接種後の３日目、４日目、又は５日目に実施される請求項２に記載の方法。
4. 栄養補給段階（ｂ）が追加の２回以上繰り返し行われる請求項１に記載の方法。
5. 栄養補給段階が接種後３、５及び１０日目に実施される請求項４に記載の方法。
6. 抗体又はその抗原結合フラグメントがヒトＩｇＧ定常ドメインを含む請求項１に記載の方法。
7. 抗体、又はその抗原結合フラグメントが、ヒトＩＬ−２３ｐ１９に特異的に結合する請求項１に記載の方法。
8. 抗体、又はその抗原結合フラグメントが、抗体ｈｕ１３Ｂ８ｂの、少なくとも一つの重鎖ＣＤＲ、及び少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む請求項７に記載の方法。
9. 亜セレン酸ナトリウムが０．３ｍｇ／Ｌで存在する請求項１に記載の方法。
10. ビタミンＥが３０．２ｍｇ／Ｌで存在する請求項１に記載の方法。

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