JP5159710B2 - Microbial culture method and culture apparatus, biological hydrogen production method and fuel cell system - Google Patents
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Description
本発明は、水素生産能を有する微生物の培養方法およびその微生物を用いた水素製造方法に関するものである。 The present invention relates to a method for culturing a microorganism capable of producing hydrogen and a method for producing hydrogen using the microorganism.
水素は化石燃料と異なり、燃焼しても炭酸ガスや硫黄酸化物など環境問題より懸念される物質を発生しない究極のクリーンエネルギー源として注目され、単位質量当たりの熱量は石油の３倍以上あり、燃料電池に供給すれば電気エネルギーおよび熱エネルギーに高い効率で変換できる。 Unlike fossil fuels, hydrogen is attracting attention as the ultimate clean energy source that does not generate substances of concern due to environmental problems such as carbon dioxide and sulfur oxides even when burned. The amount of heat per unit mass is more than three times that of petroleum, If supplied to the fuel cell, it can be converted into electric energy and heat energy with high efficiency.
水素の生産は従来より化学的製法として、天然ガスやナフサの熱分解水蒸気改質法などの技術が提案されている。この方法は高温高圧の反応条件を必要とすること、そして製造される合成ガスにはＣＯ（一酸化炭素）が含まれるため燃料電池用燃料として使用する場合には燃料電池の電極触媒劣化防止のため、技術的課題解決難度の高いＣＯ除去を行うことが必要となる。
一方、微生物による生物的水素生産方法は常温常圧の反応条件であること、そして発生するガスにはＣＯが含まれないためその除去も不要である。
このような観点から、微生物による生物的水素生産は燃料電池用燃料供給方法のより好ましい方法として、注目されている。
For the production of hydrogen, techniques such as pyrolysis steam reforming of natural gas or naphtha have been proposed as chemical production methods. This method requires high-temperature and high-pressure reaction conditions, and since the produced synthesis gas contains CO (carbon monoxide), when used as fuel for a fuel cell, it prevents the deterioration of the electrode catalyst of the fuel cell. Therefore, it is necessary to perform CO removal with a high degree of technical problem solving difficulty.
On the other hand, the biological hydrogen production method using microorganisms is a reaction condition at normal temperature and pressure, and the generated gas does not contain CO, so that it is not necessary to remove it.
From this point of view, biological hydrogen production by microorganisms has attracted attention as a more preferable method for supplying fuel for fuel cells.
生物的水素生産方法には大別して光合成微生物を使用する方法と非光合成微生物（主に嫌気性微生物）を使用する方法に分けられる。前者の方法は水素発生に光エネルギーを用いるため、その低い光エネルギー利用効率により広大な集光面積を要し、水素発生装置の価格問題や維持管理の難しさ等、解決しなければならない課題が多く、実用的なレベルではない。 Biological hydrogen production methods can be broadly classified into methods using photosynthetic microorganisms and methods using non-photosynthetic microorganisms (mainly anaerobic microorganisms). Since the former method uses light energy for hydrogen generation, it requires a large light condensing area due to its low light energy utilization efficiency, and there are problems to be solved such as price problems and difficulty in maintenance management of the hydrogen generator. Many are not practical.
後者の嫌気性微生物を使用する従来の水素製造方法は、これら嫌気性微生物の分裂増殖に依存したものであるが、増殖が極めて遅くなる（特許文献１、特許文献２）。そのため、水素発生能力を有する嫌気性微生物の濃度が少なく水素発生速度は十分ではないため、工業的有利に実施が質的、量的に可能程度の水素生産能を有する嫌気性微生物を得ることは容易ではなかった。この点に関して、一段の向上が求められている。 The conventional hydrogen production method using the latter anaerobic microorganisms relies on the division and growth of these anaerobic microorganisms, but the growth is extremely slow (Patent Documents 1 and 2). Therefore, since the concentration of anaerobic microorganisms having hydrogen generation capacity is small and the hydrogen generation rate is not sufficient, it is possible to obtain anaerobic microorganisms having hydrogen production ability that is qualitatively and quantitatively feasible industrially. It was not easy. In this regard, further improvement is required.
従来の水素生産能を有する嫌気性微生物を増殖する方法としては、嫌気条件下での培養が主に用いられてきた。すなわち、嫌気性微生物の分裂増殖と同時に水素を製造する方法である。しかしながら、嫌気条件下での水素の製造を伴う嫌気性微生物の増殖は、好気条件下での増殖に比較して、培養液中の微生物濃度を高濃度にするのが困難であり、また一方で、好気条件下では微生物濃度を高濃度まで増殖させることは容易であるものの、水素生産能を有する微生物を得ることは困難である。
嫌気性微生物の分裂増殖に依存した従来の水素製造方法の上記の問題は、換言すれば、従来の技術では水素発生反応器内で高密度の嫌気性微生物の獲得及び嫌気性微生物の水素発生機能の獲得を短時間で同時に実現する方法を見出せなかったことによる。
本発明は嫌気性微生物による水素製造方法に関するこれら技術的課題を解決することを目的とする。本発明の目的は、水素発生反応に充分な菌体数の嫌気性微生物の短時間での獲得、嫌気性微生物の短時間での水素発生機能の獲得及び水素の工業的有利な製造を実現する方法を提供することにある。また、本発明は、嫌気条件下での嫌気性微生物の長時間の分裂増殖に依存する方法ではなく、水素発生速度が反応初期から充分に高く、実用的レベルで燃料電池を稼動させることのできる方法を提供することを目的とする。
As a conventional method for growing anaerobic microorganisms having hydrogen-producing ability, culture under anaerobic conditions has been mainly used. That is, a method for producing hydrogen simultaneously with the division and growth of anaerobic microorganisms. However, the growth of anaerobic microorganisms accompanied by the production of hydrogen under anaerobic conditions makes it difficult to increase the concentration of microorganisms in the culture medium compared to the growth under aerobic conditions. Thus, although it is easy to grow the microorganism concentration to a high concentration under aerobic conditions, it is difficult to obtain a microorganism capable of producing hydrogen.
The above-mentioned problems of the conventional hydrogen production method depending on the division and growth of anaerobic microorganisms are, in other words, the acquisition of high-density anaerobic microorganisms and the hydrogen generation function of anaerobic microorganisms in the conventional technology. This is because we have not found a way to achieve the acquisition of
An object of the present invention is to solve these technical problems relating to a method for producing hydrogen by anaerobic microorganisms. An object of the present invention is to achieve anaerobic microorganisms having a sufficient number of cells for hydrogen generation reaction in a short time, anaerobic microorganisms to acquire a hydrogen generation function in a short time, and industrially advantageous production of hydrogen. It is to provide a method. Further, the present invention is not a method that relies on long-term division growth of anaerobic microorganisms under anaerobic conditions, and the hydrogen generation rate is sufficiently high from the beginning of the reaction, and the fuel cell can be operated at a practical level. It aims to provide a method.
すなわち、本発明は水素生産能を有する嫌気性微生物の培養方法、およびその微生物を用いた水素製造方法に関し、これら技術的課題を解決することを目的として、長時間の分裂増殖に依存しなければならない増殖培養方法の問題を解決し、比較的短時間で水素生産能を有する微生物を培養する方法および装置、それを用いた生物的水素製造方法を提供するものである。 That is, the present invention relates to a method for culturing anaerobic microorganisms capable of producing hydrogen, and a method for producing hydrogen using the microorganisms, in order to solve these technical problems, unless relying on long-term division growth. An object of the present invention is to provide a method and apparatus for culturing microorganisms having hydrogen production ability in a relatively short time, and a biological hydrogen production method using the same.
本発明者等は上記の課題を解決することを目的として、鋭意検討を行った結果、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を好気的条件にて培養することにより蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を短時間で大量に取得（又は製造）できること、すなわち工業的有利な当該微生物の増殖方法又は培養方法が可能となることを知見した。このようにして取得された微生物は、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有するが、通常は、水素生成能力を有していない。本発明者らは上記の好気的条件で得られた微生物を嫌気的条件下の培養液中において有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら、培養することによって、高水素生産能を有する微生物を大量に得ることができることを見出した。 As a result of intensive studies aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors have cultivated microorganisms having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene under aerobic conditions to thereby formate dehydrogenase gene. It was also found that a microorganism having a hydrogenase gene can be obtained (or produced) in a large amount in a short time, that is, an industrially advantageous method for growing or culturing the microorganism can be obtained. The microorganism obtained in this way has a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene, but usually does not have the ability to generate hydrogen. The present inventors have a high hydrogen production ability by culturing a microorganism obtained under the above aerobic conditions while controlling the concentration of organic acid and / or alcohol in a culture solution under anaerobic conditions. It has been found that a large amount of microorganisms can be obtained.
さらに、本発明者らは、このようにして取得した微生物を還元状態にある水素発生用溶液ならびに有機性基質と接触させることによって、一段と優れた反応容積あたりの水素発生速度で水素が製造できることを見出し、さらに種々検討して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を好気的条件下で培養して得られた微生物を、嫌気的条件下の培養液中における有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら培養することを特徴とする水素生産能を有する微生物の培養方法、
（２）有機酸が、酢酸、乳酸、酪酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、およびプロピオン酸から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする（１）に記載の微生物の培養方法、
（３）アルコールが、エタノール、ブタンジオール、イソプロパノール、およびブタノールから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする（１）に記載の微生物の培養方法、
（４）有機酸の濃度が２００ｍＭ以下の培養液中で培養することを特徴とする（１）に記載の微生物の培養方法、
（５）アルコールの濃度が２００ｍＭ以下の培養液中で培養することを特徴とする（１）に記載の微生物の培養方法、
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で得られた微生物を、還元状態にある水素発生用溶液に加え、該溶液に有機性基質を供給することを特徴とする生物的水素製造方法、
（７）（６）に記載の方法で製造される水素が燃料電池用燃料ガスとして用いられていることを特徴とする燃料電池を含むシステム、
（８）（１）に記載の微生物の培養方法のための培養装置であって、水素センサーが載置していることを特徴とする培養装置。
（９）（１）に記載の微生物の培養方法のための培養装置であって、発生ガスの発生速度を検出できる検出機器が載置していることを特徴とする培養装置、
（１０）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を好気的条件下で培養して得られた微生物を、嫌気的条件下の培養液中における有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら培養する容器に、水素センサーが載置していることを特徴とする水素生産能を有する微生物の培養装置、および
（１１）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を好気的条件下で培養して得られた微生物を、嫌気的条件下の培養液中における有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら培養する容器に、発生ガスの発生速度を検出できる検出機器が載置していることを特徴とする水素生産能を有する微生物の培養装置、
に関する。
Furthermore, the present inventors have shown that hydrogen can be produced at a much higher rate of hydrogen generation per reaction volume by bringing the microorganisms thus obtained into contact with a reducing hydrogen generation solution and an organic substrate. The present invention was completed by the headings and further various studies.
That is, the present invention
(1) Controlling the concentration of organic acid and / or alcohol in a culture solution under anaerobic conditions for a microorganism obtained by culturing a microorganism having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene under aerobic conditions A method for culturing a microorganism having hydrogen-producing ability, characterized by
(2) The method for culturing a microorganism according to (1), wherein the organic acid is at least one selected from acetic acid, lactic acid, butyric acid, malic acid, fumaric acid, succinic acid, and propionic acid,
(3) The method for culturing a microorganism according to (1), wherein the alcohol is at least one selected from ethanol, butanediol, isopropanol, and butanol,
(4) The method for culturing a microorganism according to (1), wherein the organic acid is cultured in a culture solution having a concentration of 200 mM or less,
(5) The method for culturing a microorganism according to (1), wherein the culture is performed in a culture solution having an alcohol concentration of 200 mM or less,
(6) An organism characterized in that the microorganism obtained by the method according to any one of (1) to (5) is added to a hydrogen generation solution in a reduced state, and an organic substrate is supplied to the solution. Hydrogen production method,
(7) A system including a fuel cell, wherein hydrogen produced by the method according to (6) is used as a fuel gas for a fuel cell,
(8) A culture apparatus for the microorganism culture method according to (1), wherein a hydrogen sensor is mounted.
(9) A culture apparatus for the method for culturing a microorganism according to (1), wherein a detection device capable of detecting a generation rate of a generated gas is mounted,
(10) A microorganism obtained by culturing a microorganism having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene under an aerobic condition is used to control the concentration of an organic acid and / or alcohol in a culture solution under an anaerobic condition. And a microorganism-cultivating apparatus having a hydrogen-producing ability, characterized in that a hydrogen sensor is placed in a vessel for culturing, and (11) a microorganism having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene under aerobic conditions A detection device capable of detecting the generation rate of the generated gas is placed in a container for culturing the microorganisms obtained by cultivating the microorganisms while controlling the concentration of organic acid and / or alcohol in the culture solution under anaerobic conditions. An apparatus for culturing microorganisms having hydrogen-producing ability,
About.
本発明は、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を用いて、好気的条件下で培養して得られた微生物を嫌気的条件で有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら培養することにより、水素生産能を有する微生物を短時間に得ることが出来、さらに得られた微生物に還元状態にある水素発生用溶液を加え、有機性基質を供給することで、単位反応容積あたりの水素発生速度が向上し、燃料電池の燃料として用いることが可能な水素製造方法を提供することができる。 The present invention uses a microorganism having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene to culture a microorganism obtained by culturing under an aerobic condition while controlling the concentration of organic acid and / or alcohol under an anaerobic condition. Thus, microorganisms capable of producing hydrogen can be obtained in a short time, and further, a hydrogen generation solution in a reduced state is added to the obtained microorganisms, and an organic substrate is supplied. It is possible to provide a hydrogen production method that can improve the hydrogen generation rate and can be used as a fuel for a fuel cell.
本発明の水素の製造方法に関与する工程は下記第１〜第３工程である。
すなわち、本発明は全体として、特定の菌体を好気的条件で培養して菌体を増殖させる第１工程と、ついで増殖した菌体を嫌気的条件下の培養液中における有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら培養して菌体に水素発生能力を付与する第２工程と、このように水素発生能力を付与した菌体を還元状態にある水素発生溶液に加え有機性基質を供給して水素を発生させる第３工程を含む。
The steps involved in the hydrogen production method of the present invention are the following first to third steps.
That is, the present invention as a whole is a first step of cultivating specific bacterial cells under aerobic conditions to proliferate the cells, and then the grown bacterial cells in the culture solution under anaerobic conditions and / or Alternatively, the second step of cultivating while controlling the concentration of alcohol to impart hydrogen generation capability to the cells, and adding the organic substrate to the hydrogen generation solution in a reduced state by adding the cells thus provided with hydrogen generation capability to the reduced hydrogen generation solution. A third step of supplying and generating hydrogen.
本発明で使用される微生物は蟻酸脱水素酵素遺伝子（F.Zinoni,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.83, pp4650-4654, July 1986 Biochemistry）およびヒドロゲナーゼ遺伝子（R.Boehm, et al., Molecular Microbiology (1990) 4(2), 231-243）を有する微生物で主として嫌気性微生物である。 The microorganisms used in the present invention include formate dehydrogenase gene (F. Zinoni, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, pp4650-4654, July 1986 Biochemistry) and hydrogenase gene (R. Boehm, et al., Molecular Microbiology (1990) 4 (2), 231-243) and mainly anaerobic microorganisms.
嫌気性微生物内における水素発生に関する代謝経路は色々な経路が知られている（グルコースのピルビン酸への分解経路における代謝産物としての水素発生、ピルビン酸がアセチルＣｏＡをへて酢酸が生成する経路での代謝産物としての水素発生そしてピルビン酸由来の蟻酸より水素が発生する経路等）。本発明は例えば蟻酸等の有機性基質より水素が生成する生産能を有する微生物の培養方法および生物的水素製造方法に関する。 Various metabolic pathways are known for hydrogen generation in anaerobic microorganisms (hydrogen generation as a metabolite in the degradation pathway of glucose to pyruvate, and pathway in which acetic acid is generated by pyruvate through acetyl-CoA. Generation of hydrogen as a metabolite and pathway of hydrogen generation from formic acid derived from pyruvic acid). The present invention relates to a microorganism culturing method and a biological hydrogen production method capable of producing hydrogen from an organic substrate such as formic acid.
本発明で使用される具体的な嫌気性微生物の例としては、エシェリキア（Escherichia）属微生物―例えばエシェリキア コリ（Escherichia coli ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ１１７７５、ＡＴＣＣ４１５７等）、クレブシェラ（Klebsiella）属微生物―例えばクレブシェラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae ＡＴＣＣ１３８８３、ＡＴＣＣ８０４４等）、エンテロバクター（Enterobacter）属微生物―例えばエンテロバクター アエロギネス（Enterobacter aerogenes ＡＴＣＣ１３０４８、ＡＴＣＣ２９００７等）そしてクロストリジウム（Clostridium）属微生物―例えばクロストリジウム ベイエリンキイ（Clostridium beijerinckii ＡＴＣＣ２５７５２、ＡＴＣＣ１７７９５等）等が挙げられる。 Examples of specific anaerobic microorganisms used in the present invention include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli ATCC 9637, ATCC 11775, ATCC 4157, etc., microorganisms belonging to the genus Klebsiella, such as Klebsiella. pneumoniae ATCC 13883, ATCC 8044 etc.), Enterobacter microorganisms such as Enterobacter aerogenes ATCC 13048, ATCC 29007 etc. and Clostridium microorganisms such as Clostridium beijerinck 25 .
これらの嫌気性微生物の嫌気的条件による分裂増殖は好気的条件によるそれと比較して極めて遅いことより、好気的条件による培養増殖が好ましい。この意味では嫌気性微生物の内、偏性嫌気性微生物よりも通性嫌気性微生物が好適に使用される。上記微生物の内ではエシェリキア コリ（Escherichia coli）、エンテロバクター アエロギネス（Enterobacter aerogenes）等が好適に使用される。
第一工程は、上記の微生物を好気的条件で、培養して増殖させることにより行われる。
The growth of these anaerobic microorganisms under anaerobic conditions is much slower than that under aerobic conditions, and culture growth under aerobic conditions is preferred. In this sense, among anaerobic microorganisms, facultative anaerobic microorganisms are preferably used rather than obligate anaerobic microorganisms. Among the above microorganisms, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes and the like are preferably used.
The first step is performed by culturing and growing the above microorganisms under aerobic conditions.
好気的条件下での微生物の培養は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地をもちいて行うことが出来る。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクト−ス、スクロース、セルロース、廃糖蜜、グリセロール等を、窒素源としては、無機態窒素源では、例えばアンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩等を、有機態窒素源では、例えば尿素、アミノ酸類、タンパク質等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることができる。無機態、有機態ともに同様に利用することが可能である。またミネラル源として、おもにＮａ、Ｋ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓなどを含む、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。
第１工程の培地としては表１のものが挙げられる。
Culture of microorganisms under aerobic conditions can be performed using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, a mineral source, and the like. Examples of the carbon source include glucose, fructose, galactose, mannose, lactose, sucrose, cellulose, waste molasses, glycerol, and the like, and examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium salt, and nitrate. In the organic nitrogen source, for example, urea, amino acids, proteins and the like can be used alone or in combination. Both inorganic and organic forms can be used in the same manner. Further, as the mineral source, for example, potassium monohydrogen phosphate, magnesium sulfate, etc., mainly containing Na, K, P, Mg, S, etc. can be used. In addition to these, nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, biotin and thiamine can be added to the medium as necessary.
Examples of the culture medium in the first step include those in Table 1.
好気的条件下および嫌気的条件下での培養の条件として、温度域は、約２０℃〜４５℃、好ましくは約２５℃〜４０℃で培養を行うことが好ましい。ｐＨ域は、ｐＨ約４．０〜１０．０、好ましくは約５．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。同時にｐＨを制御することが好ましく、酸、アルカリを用いてｐＨの調整を行うことも可能である。温度域、ｐＨ域ともに、上記の範囲内が微生物にとって最適な温度域、ｐＨ域である。通常、培養開始時の炭素源濃度は約０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、さらに好ましくは約１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は、約０．２５日〜７日間である。
なお、培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気的条件下に行う。これら微生物の好気的条件における培養は従来よく知られているので、それらに従ってもよい。
第１工程の培養終了時の微生物培養液中の濃度（ｗ／ｗ％）は、培養開始時に比較して約２〜１０００倍程度とするのがよい。
As a culture condition under an aerobic condition and an anaerobic condition, it is preferable that the temperature range is about 20 ° C. to 45 ° C., preferably about 25 ° C. to 40 ° C. The pH range is preferably about 4.0 to 10.0, preferably about 5.0 to 8.0. It is preferable to control the pH at the same time, and it is also possible to adjust the pH using an acid or alkali. In the temperature range and the pH range, the above range is the optimum temperature range and pH range for the microorganism. Usually, the carbon source concentration at the start of culture is preferably about 0.1 to 20% (W / V), more preferably about 1 to 5% (W / V). The culture period is about 0.25 days to 7 days.
Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as aeration stirring and shaking. The culture of these microorganisms under aerobic conditions is well known in the art and may be followed.
The concentration (w / w%) in the microorganism culture solution at the end of the culture in the first step is preferably about 2 to 1000 times that at the start of the culture.
第２工程は、本発明は、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有する微生物を、好気的条件下で培養して得られた微生物を、嫌気的条件下で培養し、培養中培養液中に生成する有機酸および／またはアルコールの濃度を制御しながら嫌気的条件下で培養することにより行われる。
第１工程により得られる菌体は菌数は増加しているが、水素発生能力を有しない。
In the second step, the present invention is a method in which a microorganism obtained by culturing a microorganism having a formate dehydrogenase gene and a hydrogenase gene under an aerobic condition is cultured under an anaerobic condition, Is performed under anaerobic conditions while controlling the concentration of the organic acid and / or alcohol produced.
The bacterial cells obtained by the first step have an increased number of bacteria but do not have the ability to generate hydrogen.
次に第２工程について述べると、このように第１工程で培養された菌体は好ましくは培養液から一旦分離して回収し第２工程に使用される。好気的条件で増殖させた菌を水素発生の阻害になる成分（例えば、エタノール、酢酸、乳酸など）を含む第１工程の培養液から菌体を分離することが好ましい。
分離の方法としては、遠心分離、膜分離などによる、一般的な方法が用いられる。好気的培養された微生物を分離回収しないで使用することは、好気的条件での培養時に生成した細胞内外に存在する代謝産物が、水素生産能を有する微生物を培養するのに悪影響を及ぼすために好ましくない。
なお、好気的条件で増殖させた菌体は水素発生能力を有しない。第２工程前の菌体の分離には例えば遠心分離、ろ過等が挙げられる。回収された菌体は、嫌気的条件で培養液（水素発生能力誘導培地）中に懸濁して培養して、菌体に水素発生能力を付与する。すなわち、水素発生能力が第２工程によって菌体に付与される。
Next, the second step will be described. The cells cultured in the first step in this manner are preferably once separated from the culture medium and recovered and used in the second step. It is preferable to isolate the bacterial cells from the culture solution in the first step containing components (for example, ethanol, acetic acid, lactic acid, etc.) that inhibit the hydrogen generation of the bacteria grown under aerobic conditions.
As a separation method, a general method such as centrifugation or membrane separation is used. Use of aerobically cultured microorganisms without separating and recovering them may adversely affect the cultivation of microorganisms capable of producing hydrogen due to metabolites present inside and outside the cells that are produced during cultivation under aerobic conditions. Therefore, it is not preferable.
Note that cells grown under aerobic conditions do not have the ability to generate hydrogen. Examples of the separation of the cells before the second step include centrifugation and filtration. The collected microbial cells are suspended and cultured in a culture solution (hydrogen generation capability induction medium) under anaerobic conditions to impart hydrogen generation capability to the microbial cells. That is, the hydrogen generation ability is imparted to the cells by the second step.
嫌気条件下での培養液中での微生物濃度は、水素生産能を発現する微生物を得るために、約０．１％〜８０％（湿潤状態菌体質量基準）が好ましい。さらに好ましくは、水素生産能を有する微生物を効率的に得るために約１％〜８０％（湿潤状態菌体質量基準）である。嫌気条件下での培養液中での微生物濃度の経時変化は、分裂増殖をしているほうが好ましいものの、限界的なものではない。
嫌気的条件下とは、培養液中の酸化還元電位で−１００ｍＶ〜−５００ｍＶ、さらに好ましくは−２００ｍＶ〜−５００ｍＶであることから、確認できる。培地の嫌気状態を調整する方法としては、加熱処理や減圧処理あるいは窒素ガス等のバブリングにより溶存ガスを除去する方法があげられる。具体的には培養液中の溶存ガス、特に溶存酸素の除去を行う方法として、約１３．３３×１０２Ｐａ以下、好ましくは約６．６７×１０２Ｐａ以下、より好ましくは約４．００×１０２Ｐａ以下の減圧下で約１〜６０分間、好ましくは５〜６０分間程度、脱気処理することにより、嫌気条件の培養液を得ることができる。また、必要に応じて還元剤を水溶液に添加して嫌気的条件の水溶液を調整することができる。用いる還元剤としては、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンそして硫化ソーダ等が挙げられる。これらの一種、あるいは数種類を組み合わせて用いることも可能である、
The microorganism concentration in the culture solution under anaerobic conditions is preferably about 0.1% to 80% (wet cell mass standard) in order to obtain microorganisms that express hydrogen production ability. More preferably, it is about 1% to 80% (wet cell mass standard) in order to efficiently obtain microorganisms having hydrogen-producing ability. The change over time in the concentration of microorganisms in the culture solution under anaerobic conditions is not limitative, although it is preferable that cells are dividing and growing.
The anaerobic condition can be confirmed from the oxidation-reduction potential in the culture solution being −100 mV to −500 mV, more preferably −200 mV to −500 mV. Examples of the method for adjusting the anaerobic state of the medium include a method in which dissolved gas is removed by heat treatment, decompression treatment, or bubbling of nitrogen gas or the like. Specifically, as a method for removing dissolved gas, particularly dissolved oxygen in the culture solution, about 13.33 × 10 2 Pa or less, preferably about 6.67 × 10 2 Pa or less, more preferably about 4.00. A culture solution under anaerobic conditions can be obtained by performing a deaeration treatment under a reduced pressure of × 10 2 Pa or less for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 60 minutes. Moreover, a reducing agent can be added to aqueous solution as needed, and the aqueous solution of anaerobic conditions can be adjusted. Examples of the reducing agent used include thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, and sodium sulfide. It is also possible to use one of these or a combination of several types.
本発明の第２工程では有機酸および／またはアルコールは、嫌気条件下での培養液中、主に微生物の代謝経路において生成する。嫌気的条件下での培養中には、有機酸としては、酢酸、乳酸、酪酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、およびプロピオン酸等を、アルコールとしては、エタノール、ブタンジオール、イソプロパノール、およびブタノール等が生成する。これらの嫌気条件下での培養中に生成する有機酸および／またはアルコールの濃度を特定の濃度範囲に制御することが、本発明の水素生産能を有する微生物を得るために必須となる。 In the second step of the present invention, the organic acid and / or alcohol is produced mainly in the metabolic pathway of the microorganism in the culture solution under anaerobic conditions. During the culture under anaerobic conditions, acetic acid, lactic acid, butyric acid, malic acid, fumaric acid, succinic acid, and propionic acid are used as organic acids, and ethanol, butanediol, isopropanol, and butanol are used as alcohols. And so on. Controlling the concentration of the organic acid and / or alcohol produced during the culture under these anaerobic conditions to a specific concentration range is essential for obtaining the microorganisms capable of producing hydrogen of the present invention.
嫌気条件下での培養液中の有機酸および／またはアルコールの濃度が２００ｍＭ以下になるように制御することが、水素生産能を有する微生物を培養するために必要であり、１００ｍＭ以下になるように制御することが、より好ましい。 Controlling the concentration of the organic acid and / or alcohol in the culture solution under anaerobic conditions to be 200 mM or less is necessary for culturing microorganisms having hydrogen-producing ability, so that the concentration is 100 mM or less. It is more preferable to control.
制御の方法としては、培養液中の微生物を分離しながら、連続的に本発明の特定濃度範囲内にある培養液を入れ替える方法、あるいは、有機酸および／またはアルコールの濃度が特定の濃度範囲外になる前に、回収・遠心分離を行い、微生物と上澄み液を分離し、分離した微生物に特定濃度範囲内にある培養液を入れて、再度、微生物を懸濁させ、さらに培養させる方法などが挙げられる。上記の方法以外にも嫌気条件下での培養液中の有機酸および／またはアルコールの濃度を本発明の濃度範囲に維持することが可能であれば、制御する方法は特に制限されない。培養液を入れ替える場合、入れ替えの頻度は、１時間当たり、０．１〜６０回が好ましい。１時間当たり０．１回以下の場合は、嫌気条件下での攪拌培養中に微生物の代謝産物である有機酸および／またはアルコールの影響により、水素生産能を有する微生物を得ることが困難になるために好ましくない。１時間に６０回以上入れ換わることは、培地成分が大量に必要となるために好ましくない。 As a control method, while separating microorganisms in the culture solution, the culture solution in the specified concentration range of the present invention is continuously replaced, or the concentration of the organic acid and / or alcohol is outside the specified concentration range. Before becoming a sample, it is collected and centrifuged to separate the microorganism and supernatant, and the separated microorganism is charged with a culture solution within a specific concentration range, and the microorganism is suspended again and further cultured. Can be mentioned. In addition to the above method, the control method is not particularly limited as long as the concentration of the organic acid and / or alcohol in the culture solution under anaerobic conditions can be maintained within the concentration range of the present invention. When the culture solution is replaced, the replacement frequency is preferably 0.1 to 60 times per hour. In the case of 0.1 times or less per hour, it becomes difficult to obtain microorganisms capable of producing hydrogen due to the influence of organic acids and / or alcohols, which are metabolites of microorganisms, during stirring culture under anaerobic conditions. Therefore, it is not preferable. Replacing 60 times or more in one hour is not preferable because a large amount of medium components are required.
嫌気的条件下での微生物の培養は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地をもちいて行うことが出来る。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクト−ス、スクロース、セルロース、廃糖蜜、グリセロール等を、窒素源としては、無機態窒素源では、例えばアンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩等を、有機態窒素源では、例えば尿素、アミノ酸類、タンパク質等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることができる。無機態、有機態ともに同様に利用することが可能である。またミネラル源として、おもにＫ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓなどを含む、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。 Culture of microorganisms under anaerobic conditions can be performed using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, a mineral source, and the like. Examples of the carbon source include glucose, fructose, galactose, mannose, lactose, sucrose, cellulose, waste molasses, glycerol, and the like, and examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium salt, and nitrate. In the organic nitrogen source, for example, urea, amino acids, proteins and the like can be used alone or in combination. Both inorganic and organic forms can be used in the same manner. Further, as the mineral source, for example, potassium monohydrogen phosphate, magnesium sulfate, etc., mainly containing K, P, Mg, S and the like can be used. In addition to these, nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, biotin and thiamine can be added to the medium as necessary.
また蟻酸脱水素酵素およびヒドロゲナーゼからなるユニット機能の発現のためには微量な金属成分を含むことが好ましい条件である。必要な微量金属成分は微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン、ニッケル等が挙げられる。これらの金属を含む化合物、例えばモリブデン酸ソーダ無水物、亜セレン酸ソーダ五水和物が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキスなどの天然栄養源には相当程度含まれている。そのため、必ずしも添加を必要とはしない。
第２工程の培地としては下記表２のものが挙げられる。
In addition, it is a preferable condition that a trace amount of a metal component is included for the expression of a unit function composed of formate dehydrogenase and hydrogenase. Necessary trace metal components vary depending on the microorganism species, and examples thereof include iron, molybdenum, selenium, and nickel. Examples of the compound containing these metals include sodium molybdate anhydride and sodium selenite pentahydrate. In addition, these trace metal components are contained in a considerable amount in natural nutrient sources such as yeast extract. Therefore, addition is not always necessary.
Examples of the culture medium in the second step include those shown in Table 2 below.
好気的条件下および嫌気的条件下での培養の条件として、温度域は、約２０℃〜４５℃、好ましくは約２５℃〜４０℃で培養を行うことが好ましい。ｐＨ域は、ｐＨ約４．０〜１０．０、好ましくは約５．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。同時にｐＨを制御することが好ましく、酸、アルカリを用いてｐＨの調整を行うことも可能である。温度域、ｐＨ域ともに、上記の範囲内が微生物にとって最適な温度域、ｐＨ域である。通常、培養開始時の炭素源濃度は約０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、さらに好ましくは約１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。
上記培養は、好ましくは、培養液中の微生物が充分量の水素を製造し始めるまで行うのが好ましい。
As a culture condition under an aerobic condition and an anaerobic condition, it is preferable that the temperature range is about 20 ° C. to 45 ° C., preferably about 25 ° C. to 40 ° C. The pH range is preferably about 4.0 to 10.0, preferably about 5.0 to 8.0. It is preferable to control the pH at the same time, and it is also possible to adjust the pH using an acid or alkali. In the temperature range and the pH range, the above range is the optimum temperature range and pH range for the microorganism. Usually, the carbon source concentration at the start of culture is preferably about 0.1 to 20% (W / V), more preferably about 1 to 5% (W / V).
The culture is preferably performed until the microorganism in the culture solution starts producing a sufficient amount of hydrogen.
従って、嫌気的条件下での培養装置としては、培養する容器に水素センサーが載置していることを特徴とする培養装置が好ましい。嫌気条件下での水素生産能を有する微生物が水素を生成するため、容器中の水素濃度は上昇していくことが確認できる。さらに、容器からのガスの排出工程には発生ガスの検出機器、例えばフローメータが載置していることが好ましい。これにより、ガスの発生速度が確認できる。このガス発生速度の増加の割合が小さくなった場合に、嫌気条件下での水素生産能力を有する微生物の培養反応は終点に到達したと確認することが可能となる。 Therefore, as a culture apparatus under anaerobic conditions, a culture apparatus characterized in that a hydrogen sensor is placed in a container for culture is preferable. It can be confirmed that the concentration of hydrogen in the container increases because microorganisms capable of producing hydrogen under anaerobic conditions produce hydrogen. Further, it is preferable that a device for detecting the generated gas, for example, a flow meter, is mounted in the process of discharging the gas from the container. Thereby, the gas generation rate can be confirmed. When the rate of increase in the gas generation rate is reduced, it is possible to confirm that the culture reaction of the microorganisms capable of producing hydrogen under anaerobic conditions has reached the end point.
第３工程は、第２工程で得られた微生物を還元状態にある水素発生溶液に加え、該溶液に有機性基質を供給することによって、水素を発生させることにより行われる。
ついで第３工程について述べると、上記の如くして回収分離された水素発生能力を有する菌体は還元状態にある水素発生用溶液に加えられ、連続的にあるいは間歇的に有機性基質が生物的水素製造方法に供せられる。有機性基質は連続的に供給するのが好ましいが、間歇的に供給する場合には水素発生に充分な量が反応系に存在していることが必要である。なお、回収された菌体の使用形態としては、何らの処理も加えずに使用する事もでき、また、回収菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化処理したものも使用することができる。
The third step is performed by generating hydrogen by adding the microorganism obtained in the second step to the hydrogen generation solution in a reduced state and supplying an organic substrate to the solution.
Next, regarding the third step, the cells having the ability to generate hydrogen recovered and separated as described above are added to the hydrogen generation solution in a reduced state, and the organic substrate is biologically or continuously added intermittently. It is used for the hydrogen production method. The organic substrate is preferably supplied continuously, but when it is supplied intermittently, it is necessary that an amount sufficient for hydrogen generation is present in the reaction system. The recovered bacterial cells can be used without any treatment, or the recovered bacterial cells immobilized with acrylamide or carrageenan can be used.
なお、菌体の回収分離に関して、好気的条件で培養された菌体をそのまま還元状態下での水素発生に使用するのではなく、本発明の如く、好気的培養されさらに嫌気的培養され、菌体が水素発生ユニット機能を獲得した後に一度分離回収し、これを水素発生用溶液に加え還元状態で水素を発生させることは本発明の方法の効果を発揮する上で好ましい。 Regarding the recovery and separation of bacterial cells, the bacterial cells cultured under aerobic conditions are not directly used for hydrogen generation under reduced conditions, but are aerobically cultured and further anaerobically cultured as in the present invention. In order to demonstrate the effects of the method of the present invention, it is preferable to separate and recover the cells once the hydrogen generation unit function has been obtained and add this to the hydrogen generation solution to generate hydrogen in a reduced state.
水素発生用溶液としては前記第２工程で使用した培地と同一又は類似したものが使用されるが、水素発生が激しいので消泡剤（市販の消泡剤、例えばシリコーン系消泡剤、ポリエーテル系消泡剤等）を使用することが推奨される。 As the hydrogen generation solution, the same or similar medium as that used in the second step is used. However, since hydrogen generation is intense, an antifoaming agent (a commercially available antifoaming agent such as a silicone-based antifoaming agent, polyether) is used. It is recommended to use an antifoaming agent.
菌体濃度は約０．１％（ｗ／ｗ）乃至８０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）、好ましくは約５％（ｗ／ｗ）乃至７０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）、さらにこのましくは約１０％（ｗ／ｗ）乃至７０％（ｗ／ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）で使用される。 The cell concentration is about 0.1% (w / w) to 80% (w / w) (wet cell mass standard), preferably about 5% (w / w) to 70% (w / w) ( Wet cell mass basis), more preferably about 10% (w / w) to 70% (w / w) (wet cell mass basis).
還元剤を使用してもよいことは第２工程と同様である。ただし、菌体の増殖は起こさないので菌体の増殖に必要な量の糖質は、通常は液組成に含まれない。この場合には菌を実質的に増殖させないのが重要なポイントであるから、培地中に菌の増殖に用いられるグルコース等の炭素源は不要である。炭素源は用いられることがあっても微生物細胞の水素発生能力維持にのみ必要なだけの量でよい（なぜならば、本発明は好ましくは実質的に増殖を停止した細胞による生物的水素製造方法であることによる）。 As in the second step, a reducing agent may be used. However, since the growth of the bacterial cells does not occur, the amount of carbohydrate necessary for the growth of the bacterial cells is usually not included in the liquid composition. In this case, since it is an important point that the bacteria do not substantially grow, a carbon source such as glucose used for the growth of the bacteria in the medium is unnecessary. Although the carbon source may be used, it may be in an amount necessary only to maintain the hydrogen generation capacity of the microbial cell (because the present invention is preferably a method for producing biological hydrogen by cells that have substantially stopped growing). Depending on what)
また蟻酸脱水素酵素およびヒドロゲナーゼからなるユニット機能の発現のためには微量な金属成分を含むことが好ましい条件である。必要な微量金属成分は微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン、ニッケル等が挙げられる。これらの金属を含む化合物、例えばモリブデン酸ソーダ無水物、亜セレン酸ソーダ五水和物が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキスなどの天然栄養源には相当程度含まれている。そのため、必ずしも添加を必要とはしない。 In addition, it is a preferable condition that a trace amount of a metal component is included for the expression of a unit function composed of formate dehydrogenase and hydrogenase. Necessary trace metal components vary depending on the microorganism species, and examples thereof include iron, molybdenum, selenium, and nickel. Examples of the compound containing these metals include sodium molybdate anhydride and sodium selenite pentahydrate. In addition, these trace metal components are contained in a considerable amount in natural nutrient sources such as yeast extract. Therefore, addition is not always necessary.
第３工程の培地としては下記表３のものが挙げられる。
水素発生用溶液の還元状態の実現は、第２工程の嫌気的条件に準じて行うことができる。水素発生用溶液の還元状態の特定は、その酸化還元電位が約−１００ｍＶ〜−５００ｍＶ、より好ましくは−２００ｍＶ〜−５００ｍＶである。
Examples of the medium in the third step include those shown in Table 3 below.
Realization of the reduced state of the hydrogen generation solution can be performed according to the anaerobic conditions of the second step. The reduction state of the solution for hydrogen generation is specified by the oxidation-reduction potential of about −100 mV to −500 mV, more preferably −200 mV to −500 mV.
水素発生原料に必要な有機性基質として供給されるのは、培養液内の菌体内代謝でおこる経路において蟻酸に変換される化合物（例えばグルコース、フラクトース、キシロース、アラビノース等の単糖類、スクロース、マルトース等の二糖類や糖蜜等）であってもよく、また、直接的に外部より供給される蟻酸や蟻酸塩（例えば蟻酸ソーダ、蟻酸カリウム）等の蟻酸類であってもよい。蟻酸に変じうる化合物を使用する間接的供給方法と直接的供給方法の併用もできるが、外部からの直接的供給方法が好適である。 The organic substrate required for the hydrogen generation raw material is a compound that is converted to formic acid in the pathway that occurs in the bacterial metabolism in the culture solution (for example, monosaccharides such as glucose, fructose, xylose, arabinose, sucrose, maltose). And formic acids such as formic acid and formate (for example, sodium formate and potassium formate) that are directly supplied from the outside. Although an indirect supply method using a compound that can be changed to formic acid and a direct supply method can be used in combination, a direct supply method from the outside is preferable.
供給される有機性基質が蟻酸類の場合には、濃度は微生物濃度を維持する観点から、濃度の高いものが好ましい。例えば、有機性基質として蟻酸を用いた場合には、３０〜１００％未満（ｗ／ｗ）が好ましい。さらに好ましくは５０〜１００％未満（ｗ／ｗ）である。濃度が低い場合、蟻酸類の供給に伴い、水素発生溶液の体積が増加するために、微生物濃度も変化していくことから好ましくない。また、有機性基質の供給速度としては、水素発生溶液のｐＨが４．０〜９．０の範囲で制御される範囲であれば、特に制限はない。
水素の発生反応の反応温度は、用いる微生物種にもよるが、一般的に常温微生物を用いた場合、２０℃〜４５℃の条件が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜４０℃の範囲が微生物のライフの面からも好ましい。
本発明方法によって、水素ガスは反応容積１リットル１時間当たり０．０１〜５００Ｌ／ｈｒ／Ｌの速度で製造できる。その速度の測定は公知方法に従って行われる。
When the organic substrate to be supplied is formic acid, the concentration is preferably high from the viewpoint of maintaining the microorganism concentration. For example, when formic acid is used as the organic substrate, 30 to less than 100% (w / w) is preferable. More preferably, it is 50 to less than 100% (w / w). When the concentration is low, the volume of the hydrogen generating solution increases with the supply of formic acid, and therefore the microorganism concentration also changes, which is not preferable. The supply rate of the organic substrate is not particularly limited as long as the pH of the hydrogen generating solution is controlled within the range of 4.0 to 9.0.
The reaction temperature of the hydrogen generation reaction depends on the microorganism species to be used, but in general, when normal temperature microorganisms are used, conditions of 20 ° C. to 45 ° C. are preferable, and a range of 30 ° C. to 40 ° C. is more preferable. It is also preferable from the aspect of life.
According to the method of the present invention, hydrogen gas can be produced at a rate of 0.01 to 500 L / hr / L per hour per liter of reaction volume. The measurement of the speed is performed according to a known method.
本発明の微生物を用いた生物的水素製造では主に水素と二酸化炭素からなるガスを生成し、基本的には一酸化炭素を生成しない。一般的に、現在の固体高分子型燃料電池の燃料として用いる場合には、一酸化炭素を除去するシステム（ＣＯ変成器、ＣＯ除去器等）を用いて、ＣＯは１０ｐｐｍ以下に維持する必要があるものの、本発明の水素製造方法を燃料電池の燃料として用いたシステムでは、ＣＯを除去するシステムが不要であり、装置を簡易化することができるために好ましい。
また、水素製造時の反応容器の温度制御に関しても、一般的に従来の天然ガスを用いた改質方法では６００℃以上の改質温度が必要となり、メタノールを用いた場合でも数百℃の改質温度が必要となるのに対して、本発明の反応容器の温度は常温で用いることが可能である。
上記より、燃料電池の劣化の面でも問題が少なく、水素の供給方法の面でも高温のシステムを必要としないことにより、本発明の水素製造方法を用いた燃料電池システムが、優れていることがわかる。
In the biological hydrogen production using the microorganism of the present invention, a gas mainly composed of hydrogen and carbon dioxide is produced, and basically no carbon monoxide is produced. In general, when used as a fuel for a current polymer electrolyte fuel cell, it is necessary to maintain CO at 10 ppm or less by using a system for removing carbon monoxide (CO converter, CO remover, etc.). However, a system using the hydrogen production method of the present invention as a fuel for a fuel cell is preferable because a system for removing CO is unnecessary and the apparatus can be simplified.
As for the temperature control of the reaction vessel during hydrogen production, the reforming method using natural gas generally requires a reforming temperature of 600 ° C. or higher, and even when methanol is used, the reforming temperature is several hundred ° C. The temperature of the reaction vessel of the present invention can be used at room temperature, while the temperature of the material is required.
From the above, the fuel cell system using the hydrogen production method of the present invention is excellent because there is little problem in terms of deterioration of the fuel cell and no high temperature system is required in terms of the hydrogen supply method. Recognize.
以下実施例により具体的に本発明を説明するが、本発明はこれによりなんら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
〔実施例１〕
エシェリキア コリ株（Escherichia coli W strain；ATCC９６３７）による生物的水素製造方法。
本菌株を、好気的条件下、下表１で示される組成の培養液に加え、３７℃で培養を行った。
[Example 1]
Biological hydrogen production method using Escherichia coli strain (ATCC9637).
This strain was added to a culture solution having the composition shown in Table 1 below under aerobic conditions and cultured at 37 ° C.
次に好気的条件下、培養を行った培養液より微生物を分離し、下表２で示される組成の培養液に加え、３７℃、嫌気的条件下で培養を行った。嫌気的条件下での培養液の酸化還元電位は、−３８５ｍＶであった。
嫌気的条件での操作は、気相での酸素濃度が１０ｐｐｍ以下に制御されたボックス内にて行った。
嫌気的条件下での培養開始から６時間後に、本培養液を遠心分離機にかけ（５０００回転、１５分）、上澄み液を取り除いた。その後、下表２で示される嫌気的条件下用の培養液を加えて、微生物を懸濁する操作を行った。それから、さらに嫌気的条件下で６時間同様に培養を行い、計１２時間の嫌気的条件下での培養を行った。
Next, microorganisms were separated from the culture broth cultured under aerobic conditions, added to the culture broth having the composition shown in Table 2 below, and cultured under anaerobic conditions at 37 ° C. The redox potential of the culture solution under anaerobic conditions was -385 mV.
The operation under anaerobic conditions was performed in a box in which the oxygen concentration in the gas phase was controlled to 10 ppm or less.
Six hours after the start of culture under anaerobic conditions, the main culture was centrifuged (5000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was removed. Thereafter, a culture solution for anaerobic conditions shown in Table 2 below was added to suspend the microorganisms. Then, the cells were further cultured for 6 hours under anaerobic conditions, and cultured under anaerobic conditions for a total of 12 hours.
本培養液を遠心分離機にかけ（５０００回転、１５分）、上澄み液を除去し、水素生産能を有する微生物を得た。
分離した微生物を下表３の組成で示される還元状態下の水素発生用溶液１００ｍｌに懸濁調製した（微生物濃度４０％ 湿潤状態菌体質量基準）。
The culture broth was centrifuged (5000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was removed to obtain a microorganism capable of producing hydrogen.
The separated microorganisms were suspended and prepared in 100 ml of a hydrogen generation solution under reduced conditions shown in the composition of Table 3 below (microbe concentration 40% wet cell mass basis).
水素発生用反応容器は、蟻酸供給ノズル、攪拌装置、ｐＨ調整装置、温度維持装置および酸化還元電位測定装置を備え付け、３７℃に設定されている恒温水槽内に載置されている。
２６ｍｏｌ（モル）／Ｌ（リットル）濃度の蟻酸をマイクロポンプを用いて８ｍｌ／ｈｒのフィード速度で連続的に反応容器に供給して発生するガス量を測定した。
蟻酸の供給と同時にガス発生が起こり、蟻酸の連続的に供給を行った。捕集されたガスをガスクロマトグラフィー（島津製作所製）により、水素炎イオン化検出器により分析したところ、発生ガス中には５０％の水素と残余のガスを含んでいた。ガスフローメーターより測定された水素発生速度は１時間当り４５Ｌ（Ｈ２）／ｈｒ／Ｌ（反応容積）で約１時間の間、ほぼ一定のガス発生が継続した。
The reaction vessel for hydrogen generation is equipped with a formic acid supply nozzle, a stirring device, a pH adjusting device, a temperature maintaining device, and an oxidation-reduction potential measuring device, and is placed in a constant temperature water tank set at 37 ° C.
The amount of gas generated by measuring 26 mol (mol) / L (liter) of formic acid at a feed rate of 8 ml / hr continuously using a micropump was measured.
Gas generation occurred simultaneously with the formic acid supply, and the formic acid was continuously supplied. The collected gas was analyzed by gas chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation) using a flame ionization detector. As a result, the generated gas contained 50% hydrogen and the remaining gas. The hydrogen generation rate measured by a gas flow meter was 45 L (H 2 ) / hr / L (reaction volume) per hour, and almost constant gas generation continued for about 1 hour.
〔比較例１〕
嫌気的条件下で１２時間連続して、培養液の交換をせずに培養を行なうこと以外は、実施例１と同様の条件で行った。ガス発生条件も実施例１と同様の方法で行った。
ガスを発生させ、水素発生速度を測定したところ、１２Ｌ（Ｈ２）／ｈｒ／Ｌ（反応容積）であった。
上記の嫌気条件下での培養を行った液中に存在している有機酸濃度は、高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製）を用いて測定した。カラムはＴＳＫｇｅｌ Ｏａｐａｋ−Ａ（東ソー株式会社製）を用いて、電気伝導度検出器により分析を行った。アルコール濃度は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所製）を用いて測定した。カラムはＴｈｅｒｍｏｎ−１０００（島津製作所製）を用いて、水素炎イオン化検出器により分析を行った。
遠心分離を行い、微生物を分離した上澄み液を分析することにより、嫌気条件下での培養時の培養液中の濃度を調べた結果を図１に示す。
[Comparative Example 1]
The test was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the culture was continued for 12 hours under anaerobic conditions without exchanging the culture medium. The gas generation conditions were also the same as in Example 1.
When gas was generated and the hydrogen generation rate was measured, it was 12 L (H 2 ) / hr / L (reaction volume).
The concentration of organic acid present in the liquid cultured under the above-mentioned anaerobic conditions was measured using high performance liquid chromatography (manufactured by Tosoh Corporation). The column was analyzed using an electrical conductivity detector using TSKgel Oapak-A (manufactured by Tosoh Corporation). The alcohol concentration was measured using gas chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation). The column was analyzed with a flame ionization detector using Thermo-1000 (manufactured by Shimadzu Corporation).
FIG. 1 shows the results of examining the concentration in the culture solution during culture under anaerobic conditions by analyzing the supernatant from which the microorganisms were separated by centrifugation.
実施例１、比較例１の結果により、嫌気的条件下で培養中に、培養液中の微生物を分離した上澄み液を取り除き、表２で示した嫌気的条件用培養液を加え、微生物を懸濁する操作を行うことにより、嫌気条件下での培養液中の有機酸およびアルコールの濃度の制御を行いながら、嫌気的条件下での培養を行うことで、効果的に水素生産能を有する微生物の培養が可能となることが判明した。
さらに、有機酸およびアルコールの濃度が２００ｍＭ以下になるように制御を行うことが効果的であることが判明した。
According to the results of Example 1 and Comparative Example 1, during culture under anaerobic conditions, the supernatant liquid from which the microorganisms in the culture solution were separated was removed, and the culture solution for anaerobic conditions shown in Table 2 was added to suspend the microorganisms. Microorganisms capable of effectively producing hydrogen by culturing under anaerobic conditions while controlling the concentration of organic acids and alcohols in the culture solution under anaerobic conditions by performing a turbid operation It became clear that culture | cultivation of was possible.
Furthermore, it has been found that it is effective to control the concentration of the organic acid and alcohol to be 200 mM or less.
〔実施例２〕
エシェリキア コリ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ ｓｔｒａｉｎ；ＡＴＣＣ９６３７）による生物的水素製造方法。
嫌気的条件下での培養開始から４時間後に、本培養液を遠心分離機にかけ（５０００回転、１５分）、上澄み液を取り除き、表２で示した嫌気条件用培養液を加えて、微生物を懸濁する操作を行い、さらに４時間培養し、その後同様に繰り返し操作を行い、計１２時間の嫌気的条件下での培養を行うこと以外は、実施例１と同様に準備し、水素発生速度の測定を実施例１と同様に行った。
[Example 2]
A method for producing biological hydrogen using Escherichia coli W strain (ATCC 9637).
After 4 hours from the start of the culture under anaerobic conditions, the main culture is centrifuged (5000 rpm, 15 minutes), the supernatant is removed, the anaerobic culture shown in Table 2 is added, and the microorganisms are added. Prepare the same procedure as in Example 1 except that the suspension is performed and further cultured for 4 hours, then repeated in the same manner, and cultured under anaerobic conditions for a total of 12 hours. Was measured in the same manner as in Example 1.
その結果、ガスフローメーターより測定された水素発生速度は１時間当り４５Ｌ（Ｈ２）／ｈｒ／Ｌ（反応容積）で約３時間の間、ほぼ一定のガス発生が継続した。
嫌気的条件下での培養を行った培養液中に存在している有機酸およびアルコールの濃度を高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーを用いて測定し、培養液中の濃度を調べた結果を図２に示す。培養時間４、８、１２時間のいずれの段階においても有機酸およびアルコールの濃度ともに１００ｍＭ以下に制御されていることが判明した。
As a result, the hydrogen generation rate measured by the gas flow meter was 45 L (H 2 ) / hr / L (reaction volume) per hour, and almost constant gas generation continued for about 3 hours.
The concentration of organic acid and alcohol present in the culture solution cultured under anaerobic conditions was measured using high performance liquid chromatography and gas chromatography, and the results of examining the concentration in the culture solution are shown in the figure. It is shown in 2. It was found that both the organic acid and alcohol concentrations were controlled to 100 mM or less at any stage of the culture time of 4, 8, and 12 hours.
実施例１と実施例２の結果により、嫌気的条件下で培養時に培養液中の有機酸および／またはアルコールの濃度を１００ｍＭ以下に制御することにより、微生物の水素生成機能力が向上することが判明した。上記の結果より、嫌気的条件下での培養時の培養液中の有機酸および／またはアルコールの濃度は、１００ｍＭ以下の範囲に制御する方法の優れていることが判明した。
さらに、実施例２の結果により、燃料電池を必要な水素発生速度が長時間にわたり、安定することが明らかとなった。また、この水素発生速度は必要なときに、即座に稼働する能力を燃料電池に与えるものである。
According to the results of Example 1 and Example 2, the ability of microorganisms to generate hydrogen can be improved by controlling the concentration of organic acid and / or alcohol in the culture solution to 100 mM or less during culture under anaerobic conditions. found. From the above results, it was found that the method of controlling the concentration of the organic acid and / or alcohol in the culture solution during culture under anaerobic conditions to be in the range of 100 mM or less was found to be excellent.
Furthermore, the results of Example 2 revealed that the hydrogen generation rate necessary for the fuel cell is stable over a long period of time. This hydrogen generation rate also gives the fuel cell the ability to operate immediately when needed.
本発明によって、水素が工業上有利に製造できる。 According to the present invention, hydrogen can be produced industrially advantageously.
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