JP5096173B2

JP5096173B2 - 経口摂取用関節リウマチ抑制剤

Info

Publication number: JP5096173B2
Application number: JP2007557905A
Authority: JP
Inventors: 通生羽鳥; 浩司大木; 真彩橋村; 辰彦弘田; 一仁大澤
Original assignee: Calpis Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2027-02-09
Also published as: US8367614B2; JPWO2007091678A1; WO2007091678A1; EP1992354A1; US20100167979A1; EP1992354B1; EP1992354A4; US20110251129A1

Description

本発明は、経口摂取により、慢性関節リウマチ等の関節リウマチ抑制作用を示す特定の獣乳カゼイン加水分解物を有効成分とする経口摂取用関節リウマチ抑制剤及び該抑制作用が期待できる機能性食品に関する。

慢性関節リウマチ(RAと略すことがある)は、自己免疫疾患の一つで、慢性的に関節に炎症が生じ、関節の腫れや変形をきたすものであるが、その原因は今のところ分っていない。
該RAの炎症には、プロスタグランジン(PGE)、プロスタサイクリン(PGI)、ヒスタミンやブラジキニンを代表とするキニンが関与していると考えられるため、その治療には、まずNSAID(非ステロイド性抗炎症薬)に代表される抗炎症薬が処方される例が多い。そして、抗炎症薬で効果がない場合、Tリンパ球、Bリンパ球を介した免疫調節作用に関わる、TNFα、インターロイキン１(IL-1)、IL-6等の炎症性サイトカインを抑制し、免疫全般の働きを抑える免疫抑制薬や、RAに関連する免疫の異常な働きのみを抑える免疫調整薬等の抗リウマチ薬が処方され、最近では初期の段階でも該抗リウマチ薬が処方される場合も出てきている。
しかし、従来の免疫抑制薬や免疫調整薬等の抗リウマチ薬では、何等かの副作用の影響があり、その処方にある程度の制限が必要である。そこで、最近では、このような副作用を少しでも抑制するために、RAの病態を悪化させる分子のみを標的とした分子生物学的アプローチがなされている。例えば、抗TNFαモノクローナル抗体、可溶性TNFαレセプター(sTNFR)融合蛋白、IL-1レセプター拮抗薬、IL-6レセプター抗体等を利用した生物学的製剤の開発も進められている。

ところで、従来、乳成分やその分解物等における生理機能が多く見出されている。例えば、特許文献１には、特定の乳蛋白質の酵素分解物における特定物が、TNFαやIL-6抑制作用を有し、全身性炎症反応症候群(systemic inflammatory response syndrome)や炎症反応を緩和しうることが、また、特許文献２には、獣乳カゼインを平均鎖長がアミノ酸残基数として２．１以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物が、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性又は血圧降下作用を有することが提案されている。
しかしながら、食品素材として知られ、その安全性が十分確保されている乳成分やその分解物等にRA抑制作用があることについては従来知られていない。
特開２００４−１５５７５１号公報 WO２００５−１０２５４２号パンフレット

本発明の課題は、関節リウマチに係る関節炎等の抑制作用を示し、副作用等の懸念が少なく、安全性に優れた経口摂取用関節リウマチ抑制剤を提供することにある。

本発明によれば、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む酵素群を用いて、牛乳カゼインを、平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む関節リウマチ抑制剤であって、前記ペプチドとして、Xaa Pro配列を有するジペプチド及びXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドを含み、Xaa Pro配列を有するジペプチドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して５重量％以上であり、Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して１重量％以上であり、前記遊離アミノ酸の含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して３５〜５０重量％であることを特徴とする経口摂取用関節リウマチ抑制剤が提供される。

本発明の経口摂取用関節リウマチ抑制剤は、食品素材として知られる、特定のカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含むので、安全性に優れ、関節リウマチに係る関節炎等の抑制作用が期待できる。特に、これら有効成分を粉末又は錠剤とした剤を、機能性食品等に添加する場合は、日常的に連用可能である。

実施例２で行ったアジュバント関節炎に対する評価における血漿PGE₂測定の結果を示すグラフである。実施例２で行ったアジュバント関節炎に対する評価における血漿NO測定の結果を示すグラフである。

以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の関節リウマチ抑制剤は、牛乳カゼインをアミノ酸残基数として平均鎖長が特定範囲になるように加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチド混合物を、好ましくはカゼイン加水分解物全量に対して８０重量％以上、特に好ましくは８０〜９０重量％含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む。特に、該ペプチドが、Xaa Pro配列を有するジペプチド及びXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドからなる生体内難分解性ペプチドを特定割合で含む。但し、ペプチドはペプチド塩としても良い。

ここで、平均鎖長とは、カゼインにおける酸加水分解物の総アミノ酸のモル数に対する、同重量の獣乳カゼインを加水分解した際に生産されるペプチド及び遊離アミノ酸の合計モル数の比で示すことができる。カゼインにおける酸加水分解物とは、カゼインタンパク質をアミノ酸にまで分解したものである。
該平均鎖長は、例えば、アミノ基に反応して発色するOPA(o-フタルアルデヒド)試薬を用いたOPA法により、加水分解物中のモル濃度を評価し、平均鎖長＝(カゼイン酸加水分解物中のモル数)／(カゼイン酵素加水分解物中のモル数)として求めることができる。
また、前記生体内難分解性ペプチドとは、生体の腸管から吸収された際に、生体内ペプチダーゼ群に対して分解抵抗性が高い、カルボキシ末端にProを有するジペプチドXaa Pro及びトリペプチドXaa Pro Proを意味する。

本発明において、獣乳カゼインを加水分解して得られる分解物の平均鎖長は、アミノ酸残基数として２．１以下、好ましくは１．１〜２．１、特に好ましくは１．３〜２．１である。該平均鎖長が２．１を超える場合には、所望のジペプチド及びトリペプチド、更には遊離アミノ酸の割合が低下し、生体吸収性、更には生体内難分解性ペプチドの含有割合が低下し、所望の効果が得られ難い恐れがある。
前記カゼイン加水分解物中に含まれるXaa Pro配列を有するジペプチドの含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常５重量％以上、好ましくは５〜２５重量％である。該含有割合が５重量％未満の場合には、所望の作用が低下する恐れがある。
前記カゼイン加水分解物中に含まれるXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常１重量％以上、好ましくは１〜５重量％である。該含有割合が１重量％未満の場合には、所望の作用が低下する恐れがある。

前記カゼイン加水分解物中のペプチドにおいて、Xaa Pro配列を有するジペプチド及びXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドのXaaは、任意のアミノ酸であって良い。例えば、Xaa Pro配列を有するジペプチドとしては、Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Proが挙げられ、Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドとしては、Ser Pro Pro、Ile Pro Pro、Val Pro Proが挙げられる。カゼイン加水分解物としては、前記例示したジペプチド及びトリペプチドの少なくとも１種もしくは全部を含むカゼイン加水分解物が好ましく挙げられる。

前記カゼイン加水分解物は、ペプチド以外に遊離アミノ酸を含むが、遊離アミノ酸の含有割合は、分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して通常３５〜５０重量％、好ましくは４０〜４５重量％である。
前記カゼイン加水分解物には、前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例えば市販の獣乳カゼイン等に通常含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維、水分等が１０〜２０重量％程度含まれていても良く、また、必要に応じてこれらのうちの適当な成分の一部若しくは全部を除去しても良い。

前記カゼイン加水分解物を製造するには、例えば、カゼイン加水分解物の平均鎖長がアミノ酸残基数として２．１以下に分解しうる特定の酵素群を用いて、牛乳カゼインを、該平均鎖長２．１以下に加水分解する方法により得ることができる。
牛乳カゼインを加水分解する際のカゼイン濃度は、特に限定されないが前記加水分解物を効率良く生産するために、３〜１９重量％が好ましい。

前記酵素群としては、カゼイン分解物の平均鎖長がアミノ酸残基数として２．１以下に分解しうる、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む酵素群である。この酵素群は、Xaa Pro Xaa又はXaa Pro Pro Xaaのカルボキシ末端のPro Xaa配列が切断可能なペプチダーゼを含む。
酵素群は、所望の加水分解物を効率良く、且つ短時間で、更には１段階反応で得ることができる。また前記Pro Xaa配列が切断可能なペプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示す酵素であることが好ましい。

前記酵素群は、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)の菌体を、適当な培地で培養し、生産される酵素を水抽出した酵素群等が挙げられ、特に、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素群のうちの等電点が酸性域を示す酵素群が好ましく挙げられる。
アスペルギルス・オリゼー由来の酵素群としては、市販品を利用することができ、例えば、スミチームFP、LP又はMP(以上、登録商標、新日本化学(株)製)、ウマミザイム(登録商標、天野エンザイム(株)製）、Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上、商品名、株式会社樋口商会製）、オリエンターゼONS(登録商標、阪急バイオインダストリー(株)製)、デナチームAP(登録商標、ナガセ生化学社製)が挙げられ、特に、スミチームFP(登録商標、新日本化学(株)製)の使用が好ましい。
これら市販の酵素群を用いる場合には、通常、至適条件が設定されているが、前記カゼイン加水分解物が得られるように条件、例えば、使用酵素量や反応時間等を、用いる酵素群に応じて適宜変更して行なうことができる。

前記牛乳カゼインを加水分解する際の酵素群の添加量は、例えば、牛乳カゼインを溶解した水溶液に、酵素群／牛乳カゼインが重量比で１／１０００以上、好ましくは１／１０００〜１／１０、特に好ましくは１／１００〜１／１０、更に好ましくは１／４０〜１／１０の割合となるような量である。
反応条件は、酵素群に応じて目的のカゼイン加水分解物が得られるように適宜選択できる。例えば、反応温度は、通常２５〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃であり、pHは、３〜１０、好ましくは５〜９、特に好ましくは５〜８である。また、酵素反応時間は、通常２〜４８時間、好ましくは７〜１５時間である。

酵素反応の終了は、酵素を失活させることにより行なうことができ、通常、６０〜１１０℃で酵素を失活させ、反応を停止させることができる。
酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、遠心分離除去や各種フィルター処理により除去することが好ましい。
また、必要に応じて、得られる加水分解物から苦味や臭味を有するペプチドを除去することもできる。このような苦味成分や臭味成分の除去は、活性炭又は疎水性樹脂を用いて行なうことができる。例えば、得られた加水分解物中に、使用したカゼイン量に対して活性炭を１〜２０重量％添加し、１〜１０時間反応させることにより実施できる。使用した活性炭の除去は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法により行なうことができる。

得られるカゼイン加水分解物を含む反応液は、そのまま飲料等の液体製品に添加して機能性食品に利用することができる。また、前記カゼイン加水分解物の汎用性を高めるために、前記反応液を濃縮後、乾燥し粉末の形態とすることで、関節リウマチ抑制作用を付与する機能付与剤とすることができる。
このような粉末には、栄養的バランスや風味等を改善するために、各種補助添加剤を含有させることもできる。例えば、各種炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤が挙げられる。

本発明の関節リウマチ抑制剤の有効投与量は、ヒトの場合、１日あたり、カゼイン加水分解物の乾燥量又はカゼイン加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の乾燥量として、通常０．０４〜１００ｇ、特に０．２〜２０ｇ程度が好ましく、１日に何回かに分けて摂取しても良い。
関節リウマチ抑制剤の投与期間は、その症状等により調整することができ、通常１〜３６５日間で、常用的な摂取が好ましい。

本発明の関節リウマチ抑制剤の投与方法は、経口投与であり、その形態は、経口投与用の製剤の形態、例えば、錠剤、丸剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル、散剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。
前記製剤化は、例えば、適宜必要に応じて、薬剤として許容される担体、アジュバント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で製造することができる。

以下、本発明を製造例、実施例及び比較例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されない。
製造例１
牛乳由来カゼイン(日本NZMP社製)１ｇを約８０℃に調整した蒸留水９９ｇに加えて充分に撹拌した後、１N水酸化ナトリウム(和光純薬社製)溶液を添加してpH７．０とし、また温度を２０℃に調整して基質溶液を調製した。
得られた基質溶液にアスペルギルス・オリゼー由来であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む市販の酵素(登録商標「スミチームFP」、新日本化学工業社製)を、酵素／カゼインの重量比が１／２５となるように添加して、５０℃で１４時間反応させた。続いて、１１０℃で１０分間のオートクレーブにより酵素を失活させ、カゼイン酵素分解物溶液を得た。次に、得られた酵素分解物溶液をスプレードライヤーにより乾燥し、粉末を調製した。
得られた粉末中の含有成分の分析を行なった。タンパク質はケルダール法で測定し、アミノ酸についてはアミノ酸分析装置にて測定した。また、該タンパク質量からアミノ酸を引いた量をペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法で、灰分は直接灰化法で、水分は常圧加熱乾燥法でそれぞれ測定した。尚、１００％から各成分を引いた残りを炭水化物量とした。その結果、アミノ酸は３５．８重量％、ペプチドは４５．７重量％、水分は６．６重量％、脂質は０．２重量％、灰分は４．１重量％及び炭水化物は７．６重量％であった。

＜平均鎖長の測定＞
得られた粉末に含まれるアミノ酸及びペプチドの平均鎖長は、それに含まれる遊離アミノ酸及びペプチドのアミノ基に反応するOPA試薬でモル数を測定し、同様に測定したカゼイン酸加水分解物のモル数との比で評価した。
メタノール１ｍｌにo-フタルアルデヒド(蛍光分析用特級試薬、ナカライテスク社製)４０ｍｇを溶解させ、β-メルカプトエタノール１００μｌを加えた。予め調製しておいた１００ｍMの四ホウ酸ナトリウム溶液２５ｍｌに、２０％ドデシル硫酸ナトリウム２．５ｍｌを加えたものを用いて、上記溶解したo-フタルアルデヒドを２５ｍｌに希釈し、更に蒸留水で５０ｍｌとすることでOPA試薬を調製した。
前記酵素を反応させた１％カゼイン酵素加水分解物粉末試料を、適当な溶媒に適当な濃度で溶解し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清５０μｌを分取した。続いて、上記OPA試薬を１ｍｌ加え、よく撹拌し、室温で５分間放置した後、吸光光度計(商品名Ubest-35、日本分光(株)製)で３４０ｎｍの吸収を測定した。
検量線は１％のカゼイン酸加水分解物を調製し、適切に希釈したものを用いて同様に測定した結果から、吸光度とモル濃度の関係を求めた。そして、平均鎖長は以下の式に従って計算した。その結果、平均鎖長は１．４であった。
平均鎖長＝(１％カゼイン酸加水分解物のモル濃度)／(各試料１％カゼイン酵素加水分解物のモル濃度)

＜ペプチド構成アミノ酸の測定＞
上記で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解し、自動ペプチド分析機(商品名PPSQ-10(株)島津製作所製)を用いて解析し、粉末中においてN末端側から順に如何なるアミノ酸が位置するかを調べた。結果を表１に示す。尚、自動ペプチド分析機は遊離アミノ酸を検出しない。
また、５残基目のアミノ酸の合計は１２０ｐｍｏｌ、６残基目のアミノ酸の合計は１００ｐｍｏｌであった。これらの結果より、前記粉末中に含まれるペプチドのほとんどがジペプチド及びトリペプチドであることが判った。また、２残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合が４９．５％と顕著に上昇していた。更に３残基目のアミノ酸がProであるペプチドの割合も２９．８％と多かった。
従って、前記粉末には、Xaa Pro又はXaa Pro Proが多く含まれ、これらペプチドは生体内プロテアーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が高いペプチドであると推定できる。

＜酵素分解物中に含まれるペプチドの測定＞
上記酵素分解物の粉末について、各種の化学合成標準ペプチドを用いて、常法に従い、該粉末に含まれる表２に示すジペプチド及びトリペプチド量を求めた。結果を表２に示す。

前記粉末を蒸留水で希釈溶解した溶液中のペプチド及び遊離アミノ酸量が８．１５ｍｇ／ｍｌであり、ペプチド量が４．５７ｍｇ／ｍｌであり、該ペプチド中のXaa Pro量が５１４．５μｇであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対するXaa Proの割合は６．３重量％であり、更に、該ペプチド中のXaa Pro Pro量が１１６．５μｇであったので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対するXaa Pro Proの割合は１．４重量％であることを確認した。

製造例２
ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＭ４株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６０６０，寄託日１９９７．８．１５）（以下、CM4株と称す)を用意した。このCM4株は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。
次に、市販の脱脂粉乳を固形率９％(w／w)となるように蒸留水で溶解し、オートクレーブで１０５℃、１０分間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し、CM４株スターター発酵液(菌数５×１０⁸個／ml)を３％(v／w)接種して、３７℃で２４時間、静置状態で発酵させCM４発酵乳を得た。得られたCM4発酵乳を８０℃達温殺菌後、凍結乾燥によりCM４発酵粉末を得た。

実施例１及び比較例１〜３
被験物質として、製造例１で調製したカゼイン酵素分解物(実施例１)、製造例２で調製したCM４発酵粉末(比較例１)、牛乳カゼインナトリウム(比較例２)及び牛乳カゼイン酸分解物アミノ酸(比較例３)を準備した。
一方、加熱して死菌としたM. tuberculosis H37a(和光純薬社製)を適当量秤り、メノウ乳鉢で微粉末にした。次いで、流動パラフィン(和光純薬社製)を少しずつ加えて懸濁し、５ｍｇ／ｍｌの懸濁液を調製し、感作アジュバントとした。この感作アジュバントの調製は、後述するアジュバントの感作日に行った。

８週齢の雌性Lewis系ラット(SPF)を７日間予備飼育して実験に供した。ラットは、予備飼育期間及び実験期間を通して、室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のSPFバリア飼育室において、照明時間８時〜１８時、換気回数１８回／時間で飼育した。この際、ラットは、２〜３匹／ケージとし、全ての群に、固形飼料(商品名MF、オリエンタル酵母社製)と、滅菌脱イオン水をそれぞれ自由摂取させた。ラットの個体識別は、ピクリン酸を被毛に塗布して行った。
前記予備飼育終了後、８匹／群の５群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、上記で調製した感作アジュバントの０．１ｍｌを右後肢の足蹠皮内に注射して関節炎を誘発した。尚、誘発日をday０とした。
次いで、day０からday２１まで、４群のラットに上記被験物質のそれぞれを０．５％CMC(カルボキシメチルセルロース)溶液にて１０％に希釈したものを別個に、ラット用経口ゾンデを用いて１日１回、１ｍｌ／１００ｇの割合で強制経口投与した。対照として、被験物質を含まない０．５％CMC溶液を投与した群を１群設けた。以下の検査項目について観察を行った。

一般状態：毎日１回症状を観察し、記録用紙に記入した。
体重：day０、５、９、１４、１９及び２２に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア：感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の３箇所について、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを０点、軽度を１点、中程度を２点、やや重度を３点、重度を４点とし、最高１２点の合計点で評価した。観察日は、day０、５、９、１４、１９及び２２とした。
足容積：右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置(商品名TK-105、室町機械社製)により測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
得られた関節炎スコアは、群毎の平均値±標準誤差として示す。対照群(１群)に対する各群の統計的有意を検定するために、解析ソフト(Stat View, Abacus Inc., USA)を用いて分散分析(ANOVA)を行い等分散であることを確認した後、Fisher's PLSD法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
関節炎スコアの結果を表３に示す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化は見られなかった。一般症状は、試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。

表３の関節炎スコアの結果、day１４、１９及び２２のスコア測定で、実施例１の被験物質を投与した群でスコア増加を有意に抑制した(ｐ＜０．０５)。

実施例２
被験物質として、製造例１で調製したカゼイン酵素分解物(実施例２)、陽性対照物質としてIbuprofen(和光純薬社製)を準備した。
一方、実施例１と同様に、後述するアジュバントの感作日に感作アジュバントの調製を行った。

８週齢の雌性Lewis系ラット(SPF)を７日間予備飼育して実験に供した。ラットは、予備飼育期間及び実験期間を通して、室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のSPFバリア飼育室において、照明時間７時〜１９時、換気回数１８回／時間で飼育した。この際、ラットは、２〜３匹／ケージとし、全ての群に、固形飼料(商品名MF、オリエンタル酵母社製)と、滅菌脱イオン水をそれぞれ自由摂取させた。ラットの個体識別は、ピクリン酸を被毛に塗布して行った。
前記予備飼育終了後、８匹／群の６群のラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、上記で調製した感作アジュバントの０．１ｍｌを右後肢の足蹠皮内に注射して関節炎を誘発した。尚、誘発日をday０とした。
次いで、day０からday２１まで、５群のラットに上記被験物質を０．５％CMC溶液にてカゼイン酵素分解物を、５％(EL５％)、１０％(EL１０％)又は２０％(EL２０％)に希釈したもの、Ibuprofenを０．３％に希釈したものを別個に、ラット用経口ゾンデを用いて１日１回、１ｍｌ／１００ｇの割合で強制経口投与した。対照として、被験物質を含まない０．５％CMC溶液を投与した群を１群設け、また無処置群を１群設けた。以下の検査項目について観察及び測定を行った。

一般状態：毎日１回症状を観察し、記録用紙に記入した。
体重：day０、５、９、１４、１９及び２１に体重計により体重を測定した。
関節炎スコア：感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢及び左後肢の３箇所について、発赤、腫脹及び強直の程度を肉眼で観察し、無しを０点、軽度を１点、中程度を２点、やや重度を３点、重度を４点とし、最高１２点の合計点で評価した。観察日は、day０、５、９、１４、１９及び２１とした。
足容積：右後肢及び左後肢の容積を足容積測定装置(商品名TK-105、室町機械社製)を使用して測定した。測定日は関節炎スコア観察日と同一にした。
血漿分析：試験終了翌日(day２２)及び翌々日(day２３)にエーテル吸入麻酔下で、注射器(ヘパリンＮａ添加)を用いて心臓より採血し、遠心後の上層(血漿)部分に対して、NO₂／NO₃Assay Kit-CII Colorimetric(同仁科学社製)を用いて一酸化窒素(NO)をGriess法で測定し、Prostaglandin E₂ EIA Kit-Monoclonal(Cayman Chemical社製)を用いてプロスタグランジンE₂(PGE₂)をEIA法で測定した。

得られた関節炎スコア、足容積、NO及びPGE₂は、群毎の平均値±標準誤差として示した。対照群(１群)に対する各群の統計的有意を検定するために、解析ソフト(Stat View, Abacus Inc., USA)を用いて分散分析(ANOVA)を行い等分散であることを確認した後、Fisher's PLSD法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。統計的有意差はｐ＜０．０５の場合を有意であるとした。
関節炎スコアの結果を表４に、足容積における感作肢容積結果を表５に、非感作肢容積結果を表６に、血漿PGE₂の結果を図１に、血漿NOの結果を図２にそれぞれに示す。尚、体重は、対照に比べて各群とも顕著な変化は見られなかった。一般症状は、試験の全期間を通じて全ての群が関節炎症状以外の異常症状は示さなかった。

表４の関節炎スコアの結果、day９、１４、１９及び２１のスコア測定で、実施例２の被験物質２０００ｍｇ／ｋｇを投与した群でスコア増加を有意に抑制した(ｐ＜０．０１)。
表５の感作後足容積の結果、実施例２の被験物質５００ｍｇ／ｋｇを投与した群でday９、１９及び２１の感作後足容積増加を有意に抑制した(ｐ＜０．０５)。実施例２の被験物質２０００ｍｇ／ｋｇを投与した群でday５、９、１９及び２１の感作後足容積増加を有意に抑制した(ｐ＜０．００１)。
表６の非感作後足容積の結果、実施例２の被験物質１０００ｍｇ／ｋｇ及び２０００ｍｇ／ｋｇを投与した群で、非感作後左肢容積の増加を、day９、１４、１９及び２１で有意に抑制した(ｐ＜０．００１)。
図１の血漿PGE₂の結果、実施例２の被験物質２０００ｍｇ／ｋｇを投与した群で血漿PGE₂濃度増加を有意に抑制した(ｐ＜０．０５)。
図２のNOの結果、実施例２の被験物質５００、１０００、２０００ｍｇ／ｋｇを投与した群で血漿NO（NO₂ ^-+NO₃）濃度増加を有意に抑制した(ｐ＜０．０５)。

尚、上述のアジュバント関節炎モデル実験は、慢性リウマチ性関節炎のモデルとして、例えば、炎症 Vol.15 No.5 (1995) ｐ395-399(日本炎症学会雑誌)に記載されているように当該疾患モデルとして広く認められている。

Claims

アスペルギルス・オリゼー由来の酵素であり、少なくとも金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプチダーゼを含む酵素群を用いて、牛乳カゼインを、平均鎖長がアミノ酸残基数として2.1以下に加水分解して得た、遊離アミノ酸及びペプチドを含むカゼイン加水分解物、又は該加水分解物に含まれる遊離アミノ酸及びペプチド混合物を有効成分として含む関節リウマチ抑制剤であって、
前記ペプチドとして、Xaa Pro配列を有するジペプチド及びXaa Pro Pro配列を有するトリペプチドを含み、Xaa Pro配列を有するジペプチドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して５重量％以上であり、Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドの含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して１重量％以上であり、前記遊離アミノ酸の含有割合が分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計に対して３５〜５０重量％であることを特徴とする経口摂取用関節リウマチ抑制剤。
Xaa Pro配列を有するジペプチドとして、少なくともIle Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro及びTyr Proを含み、Xaa Pro Pro配列を有するトリペプチドとして、少なくともSer Pro Pro、Ile Pro Pro及びVal Pro Proを含む請求項１記載の経口摂取用関節リウマチ抑制剤。