JP4945279B2 - Ｄｎａ分析方法および分析装置 - Google Patents

Description

本発明は，微量のＤＮＡの塩基配列を高感度に測定することのできる方法および装置に関する。

ＤＮＡシーケンサなどの塩基配列解析技術の発達により，ヒトをはじめ様々な生物種で全ゲノム配列が解析されている。これらのゲノム配列は特定の個体のものであり，次の段階として，個体ごとのゲノム配列の違いを調べることが進められている。しかし，現在の塩基配列技術で全ゲノム配列を解析するには膨大な時間と費用がかかるため，個体ごとに全ゲノム配列を解析することは困難な状況にあり，ゲノム配列を迅速かつ安価に解析する塩基配列解析技術が望まれている。すなわち，ＤＮＡシーケンサの高スループット化及びサンプルの微量化が必要となっている。

ＤＮＡシーケンサの高スループット化を実現する方法として，ビーズハンドリング技術とパイロシーケンシング技術と組み合わせた方法(M. Margulies et.al., Nature 437, 376-380 (2005))によると，測定対象のＤＮＡをビーズに固定化し，４５万個のビーズを高集積化して同時にパイロシーケンシングを行うことで，一塩基当たりの塩基配列解析速度を向上させることができる。パイロシーケンシングとは，ＤＮＡポリメラーゼによる二本鎖ＤＮＡの合成反応（伸長反応）により，デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が二本鎖ＤＮＡに取り込まれる際にピロリン酸が放出されることを利用した，塩基配列解析技術である。塩基配列解析を行うＤＮＡ（サンプルＤＮＡ）に相補鎖合成の開始点を決定するＤＮＡ（プライマーＤＮＡ）をハイブリダイズさせたものに対して，ＤＮＡポリメラーゼ存在下で４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰαＳ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）を順番に与えていくと，伸長反応が行われた場合，伸長塩基数に応じたピロリン酸が生成する。生成したピロリン酸はルシフェラーゼを用いた酵素反応により発光に変換され，その発光を光電子変換素子により検出する。各種ｄＮＴＰ添加時の伸長反応の有無や発光量を測定することで，サンプルＤＮＡの配列を決定することができる。その際，ｄＮＴＰとしてｄＡＴＰを用いると，ｄＡＴＰとＡＴＰの構造が類似しているため背景光が増大してしまうため，ｄＡＴＰαＳが通常用いられている。

一方，光検出法を使用せず，ＦＥＴセンサやｐＨセンサを用いて電気的にＤＮＡシーケンスやＳＮＰタイピングを行なう試みも行なわれている。ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡシーケンサでは，ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を表面電位の変化として検出する（T. Sakata et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2225-2228 (2006)）。ＦＥＴセンサの表面に固定化したプライマーＤＮＡにサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせ，ＤＮＡポリメラーゼ存在下で４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰαＳ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）を順番に与えていく。伸長反応が行われた場合，ＤＮＡは水溶液中では側鎖のリン酸基が負電荷を有しているため，表面に固定化したＤＮＡの塩基数が増えることでＦＥＴセンサ表面の負電荷の量が増え，結果として表面の電位が低下する。この電位変化をＦＥＴセンサで検出することにより，サンプルＤＮＡの配列を決定することができる。

ｐＨセンサを用いたピロリン酸検出センサ(特許第３７６１５６９号)では，ＰＣＲ反応などの核酸増幅反応に伴い生成したピロリン酸を酵素により水素イオンに変換し，ｐＨセンサを用いて増加した水素イオンを検出する。ｐＨ変化量からＰＣＲ反応が進行したかどうかを検出し，サンプルＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）を判定する。

特許第３７６１５６９号 M. Margulies et.al., Nature 437, 376-380 (2005) T. Sakata et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2225-2228 (2006)

パイロシーケンサの高スループット化は，ＤＮＡを固定化するビーズ径を小さくして高集積化を行なうことにより達成可能である。しかし，パイロシーケンシング法は，ＤＮＡ伸長反応の際に生じるピロリン酸を発光により検出することを基本原理にしているため，高集積化に伴うＤＮＡサンプルの微量化により発光量は減少する。すなわち，ビーズの微小化による高集積化は検出感度の低下を招き，高価な検出器が必要となり，装置の大型化やコスト増大を招く。また，パイロシーケンサで使用するｄＡＴＰαＳはｄＡＴＰよりも１００倍高価であり，塩基配列解析に要するコストを増大させる要因となっている。

ＦＥＴ方式ＤＮＡシーケンサは，電位測定を基本原理としているため，サンプルを微量化しても感度が低下しない利点を有している。さらに，複雑な検出系を必要としないため，高集積化が容易である。しかし，負電荷の表面電位に与える影響はＦＥＴセンサ表面と電荷の距離（Debye長）に依存するため，二本鎖ＤＮＡの伸長反応が進み，伸長反応部位がセンサ表面から遠ざかっていくほど，一塩基の伸長反応当たりの表面電位の変化は小さくなる。すなわち，検出可能な塩基長はDebye長に大きく依存し，特殊な低濃度バッファー条件下（2.5mM）でさえ読み取り可能な塩基長は１０塩基程度であった。この際のDebye長は約1nmで，一塩基の大きさ（0.34nm）を考慮すると，理論的には３０塩基が検出限界であり，通用のシーケンシングに使用することは困難であった。

一方，ｐＨセンサを用いたピロリン酸検出センサを用いてパイロシーケンスを行う場合，ＤＮＡ伸長反応により生成するピロリン酸を検出する際に，ピロリン酸の量では無くピロリン酸濃度を測定するため，微量化をしても感度は低下しない。また，検出可能な塩基長は，ＦＥＴ方式ＤＮＡシーケンサのような制約を受けず，発光検出式のパイロシーケンスと同程度の読み取り塩基長が期待できる。しかし，ＤＮＡシーケンシングの際に添加した試薬の影響でｐＨが変化したり，バッファーの影響でｐＨ変化量がピロリン酸濃度の変化量に比べて減少したりするため，本センサを用いてＤＮＡシーケンサを構築することは困難である。

上記課題を解決するために，本発明では，ＤＮＡ伸長反応により生成したピロリン酸を酵素を用いて酸化還元物質に変換し，この酸化還元物質を電気的に検出する。電極表面での夾雑物の反応や吸着による電位変化を低減するために，絶縁性分子を用いて電極表面に電気化学活性物質を固定化する。固定化する電気化学活性物質は，使用する酸化還元物質に応じて最適化する。さらに，電位差測定装置として，測定電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを用いる。ＤＮＡシーケンスを高スループットに行なうために検出素子を高集積化する際には，測定電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを，同一基板上に形成した集積回路でシリアルデータに変換する。

本発明によると，ピロリン酸を酸化還元物質に変換し，酸化還元物質濃度の変化を表面電位変化として検出することで，検出感度を低下させずに高集積化すなわちサンプルの微量化を行うことができる。反応系にＡＴＰが直接介在しないため，ｄＡＴＰによる背景信号が生じず，ｄＡＴＰαＳよりも安価なｄＡＴＰを用いた測定を行うことができる。信号強度は二本鎖ＤＮＡの伸長反応部位に依存しないため，二本鎖ＤＮＡの伸長反応が進んでも信号強度は減少しない。また，ＤＮＡ伸長反応生成物であるピロリン酸を酸化還元物質に変換しているため，バッファーや試薬の影響を受け難い。絶縁性分子を用いて電極表面に電気化学活性物質を固定化することで，感度低下の原因となるリーク電流を低減できると同時に，電極表面での夾雑物の反応や吸着による電位変化を低減することができる。その際，固定化する電気化学活性物質を使用する酸化還元物質に合せて選択することで，感度を向上させることができる。電位差測定装置として，測定電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを用いることで，低コストで小型の装置を構築できる。装置を高スループット化する際に，測定電極と同一基板上に形成された絶縁ゲート電界効果トランジスタを，同一基板上の集積回路でシリアルデータに変換することで，配線数を低減でき，装置構成を簡略化することができる。

以下，図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

図１は，本発明による核酸配列解析装置の一例を示すブロック図である。本実施例の計測システムは，測定部１０１，信号処理回路１０２，及びデータ処理装置１０３から構成される。測定部１０１は，洗浄液容器１０４，反応溶液容器１０５，ｄＡＴＰ溶液容器１０６，ｄＴＴＰ溶液容器１０７，ｄＧＴＰ溶液容器１０８，ｄＣＴＰ溶液容器１０９，洗浄液供給バルブ１１０，反応溶液供給バルブ１１１，ｄＡＴＰ溶液供給バルブ１１２，ｄＴＴＰ溶液供給バルブ１１３，ｄＧＴＰ溶液供給バルブ１１４，ｄＣＴＰ溶液供給バルブ１１５，測定セル１１６，セパレータ１１７，ビーズ１１８，測定電極１１９，電界効果トランジスタ１２０，参照電極１２１，廃液容器１２２からなる。各バルブを開閉することで，測定セルへの各溶液の供給を制御することができる。測定セル１１６は，セパレータ１１７によって複数（ｎ個）の空間に仕切られていて，各空間にはビーズ１１８，測定電極１１９，電界効果トランジスタ１２０が一組ずつ配置されている。各ビーズ１１８表面には，プローブＤＮＡが固定化されていて，プローブＤＮＡにはターゲットＤＮＡがハイブリダイズしている。ビーズには通常用いられるポリスチレンビーズ，磁気ビーズなどを用いる。ビーズ表面はカルボキシル基，アミノ基，マレイミド基，水酸基，ビオチン，アビジンなどで修飾されている。ここに，アミノ基，カルボキシル基，ＳＨ基，シラノール基，アビジン，ビオチンなどで修飾されたプローブＤＮＡを固定化する。ビーズの代わりに，金微粒子などを用いても構わない。この場合，ＳＨ基で修飾されたプローブＤＮＡを用いたり，金微粒子を様々な官能基を有する分子で被覆したりすることで，様々な官能基で修飾されたプローブＤＮＡを固定化することができる。測定電極１１９表面には，絶縁性分子を介して電気化学活性物質が固定化されている。測定電極１１９には，金電極などの貴金属の電極やカーボンの電極を用いる。参照電極１２１は廃液容器１２２内の溶液と接触している。

洗浄液容器１０４内の洗浄液として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を用いた。反応溶液容器１０５内の反応溶液としてトリス塩酸緩衝液にＤＮＡポリメラーゼ，ピルベートオルソフォスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ），乳酸脱水素酵素，ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ），アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ），ＮＡＤＨを溶解した溶液を用いた。ｄＡＴＰ溶液容器１０６，ｄＴＴＰ溶液容器１０７，ｄＧＴＰ溶液容器１０８，ｄＣＴＰ溶液容器１０９それぞれの中の溶液にはｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰそれぞれをトリス塩酸緩衝液に溶解した溶液を用いた。参照電極１２１には，内部溶液に飽和塩化カリウム溶液を用いた銀塩化銀参照電極を用いたが，一塩基伸長時の電位変化に比べて電位の変動が十分小さいものであればどのような参照電極を用いてもよい。

本実施例では廃液容器１２２内で参照電極１２１と溶液とを接触させているが，測定セル内の溶液と接触していれば，参照電極１２１は測定系のいずれの箇所に配置されていてもよい。ビーズには，50μm径のカルボキシル末端を有するポリスチレンビーズを用いた。ビーズへのプローブＤＮＡの固定化には，ビーズとアミノ基修飾されたプローブＤＮＡを混合し，N-hydroxysuccinimide（ＮＨＳ），1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(ＥＤＣ)を加え，ビーズにプローブＤＮＡを化学的に結合させた。測定電極１１９には金電極を用いた。絶縁性分子として１１−アミノ−１−ウンデカンチオール（１１−ＡＵＴ）を，電気化学活性物質としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を用いた。１１−ＡＵＴ溶液を用いて，金電極表面に１１−ＡＵＴの単分子膜を形成した。この電極の表面に，ＰＱＱ，ＮＨＳ，ＥＤＣの混合液を滴下し，一晩反応させ，１１−ＡＵＴのアミノ基とＰＱＱのカルボキシル基の化学結合を用いて，ＰＱＱを固定化した。

測定手順の一例を図２に示す。まず初めに，洗浄液供給バルブ１１０を開き（２０２），測定容器内を電位初期化液で満たしてから（２０３），洗浄液供給バルブ１１０を閉じた（２０４）。この操作により，測定電極１１９の表面に固定化された電気化学活性物質を還元状態にした。次に，反応溶液供給バルブ１１１を開き（２０５），測定容器内を反応溶液で満たしてから（２０６），反応溶液供給バルブ１１１を閉じた（２０７）。参照電極１２１に一定電圧Ｖ_Gを印加し，各電界効果トランジスタのドレイン電流を測定した（２０８）。このときの各ドレイン電流値をＩ_D（１，ｎ）（ｎは電界効果トランジスタに割り振られた番号）とした。反応溶液供給バルブ１１１とｄＮＴＰ溶液供給バルブ１１２もしくは１１３もしくは１１４もしくは１１５を開き（２０９），反応溶液とｄＮＴＰ溶液の混合溶液で測定容器内を満たしてから（２１０），反応溶液供給バルブ１１１とｄＮＴＰ溶液供給バルブ１１２もしくは１１３もしくは１１４もしくは１１５を閉じた（２１１）。ｄＮＴＰとして，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを順に用いた（２０１，２１３〜２１７）。参照電極１２１に一定電圧Ｖ_Gを印加し，各電界効果トランジスタのドレイン電流を測定した（２１２）。このときの各ドレイン電流値をＩ_D（２，ｎ）（ｎは測定セルの番号）とし，ΔＩ_D（ｎ）＝Ｉ_D（２，ｎ）−Ｉ_D（１，ｎ）とした。ΔＩ_DはｄＮＴＰ供給による各電界効果トランジスタでのドレイン電流の変化分である。再び洗浄液供給バルブ１１０を開く操作（２０２）に戻り，ｄＮＴＰとしてｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを順に用いて繰り返し測定を行った。

ｄＡＴＰ溶液容器１０６内のｄＡＴＰ溶液として，反応溶液容器１０５内の反応溶液にｄＡＴＰを予め溶解したものを，ｄＴＴＰ溶液容器１０７内のｄＴＴＰ溶液として，反応溶液容器１０５内の反応溶液にｄＴＴＰを予め溶解したものを，ｄＧＴＰ溶液容器１０８内のｄＧＴＰ溶液として，反応溶液容器１０５内の反応溶液にｄＧＴＰを予め溶解したものを，ｄＣＴＰ溶液容器１０６内のｄＣＴＰ溶液として，反応溶液容器１０５内の反応溶液にｄＣＴＰを予め溶解したものを，用いることもできる。その場合には，反応溶液供給バルブ１１１とｄＮＴＰ溶液供給バルブ１１２もしくは１１３もしくは１１４もしくは１１５を開く操作（２０９）を，ｄＮＴＰ溶液供給バルブ１１２もしくは１１３もしくは１１４もしくは１１５を開く操作とする。ｄＮＴＰとして用いるｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰの順番は，どのような順番でも４回周期であればよい。ｄＮＴＰの代わりに，一部の分子を硫黄原子で置き換えたアナログ体（ｄＮＴＰαＳ, 糖４’部位硫黄置換(N. Inoue et. al., Nucleic Acids Research, 3476-3483, 34, 2006)）など，ＤＮＡ鎖合成酵素によって塩基配列特異的に二本鎖ＤＮＡの合成反応に取り込まれ，ピロリン酸を生成するものであれば用いることができる。洗浄液は，ピロリン酸から変換された酸化還元物質により変化した電極の表面電位を初期化するために用いる。本実施例では伸長反応により表面電位が増加するが，洗浄液内の還元物質によって表面電位が減少し，再び伸長反応を測定できるようになる。洗浄液としては上記の物質以外に，チオール化合物などの還元物質を含む溶液を用いることもできる。また，反応液内の酸化還元物質と酵素の組み合わせによっては，伸長反応により表面電位が減少する場合もある。その場合には，洗浄液として，過酸化水素水，フェロシアン化カリウムなどの酸化物質を含む溶液を用いることもできる。

図３は，本発明による核酸配列解析装置に用いる電界効果トランジスタの一例を示す回路図である。本回路図で示した回路は，一枚の基板上に集積されていることが望ましい。複数の電界効果トランジスタがマトリックス状に並んでいて，ソースドレイン間の電流電圧特性を読み出したい電界効果トランジスタを，Ｘセレクタ３０１とＹセレクタ３０２で選択することができる。例えば，左から３個目，上から２個目の電界効果トランジスタのソースドレイン間の電流電圧特性を読み出したい場合，セレクタＸで上から２本目を，セレクタＹで左から３個目を接続する。このようにすることで，多数の電極の電圧を測定する場合における配線の数を低減することができる。

本発明による核酸配列解析装置を用いて配列解析を行う際の，伸長反応が電位変化として検出されるまでの化学反応過程の一例を以下に示す。ビーズ上の二本鎖ＤＮＡの合成反応により，ピロリン酸が生成される。本反応は，ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。

二本鎖ＤＮＡ(ｎ塩基長)＋ｄＮＴＰ → 二本鎖ＤＮＡ(ｎ＋１塩基長)＋ピロリン酸
生成したピロリン酸は，ピルビン酸に変換される。本反応は，ＰＰＤＫにより触媒される。

ピロリン酸＋ＰＥＰ＋ＡＭＰ→ピルビン酸＋ＡＴＰ＋リン酸
生成したピルビン酸は，ＮＡＤに変換される。本反応は，乳酸脱水素酵素により触媒される。

ピルビン酸＋ＮＡＤＨ→乳酸＋ＮＡＤ
生成したＮＡＤは，電極表面に固定化されたＰＱＱを酸化する。

ＰＱＱ(還元)＋ＮＡＤ⇔ＰＱＱ(酸化)＋ＮＡＤＨ
この反応は平衡反応であり，ＰＱＱの酸化還元状態はＮＡＤとＮＡＤＨの比に応じたものとなる。

絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を，他の実施例を用いて説明する。図４（ａ）は未処理の測定電極を用いた場合の評価系を，図４（ｂ）は絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定した場合の評価系を示している。未処理の測定電極を用いた場合の評価系は，電位差計測装置４０１，参照電極４０２，測定セル４０３を備える。測定セル４０３内には測定溶液４０４，金電極４０５，参照電極４０２が配置されている。絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定した場合の評価系は，電位差計測装置４１１，参照電極４１２，測定セル４１３を備える。測定セル４１３内には，測定溶液４１６，電気化学活性物質４１４が絶縁性分子４１５を介して固定化された金電極４１７，参照電極４１２が配置されている。

図５は，図４の評価系を用いて測定した，測定溶液中の酸化還元物質濃度比の対数（フェリシアン化カリウム濃度とフェロシアン化カリウム濃度の比の対数）に対する参照電極と金電極の間の電位差を示している。図５中の△のプロットは，図４（ａ）の評価系を用いて測定した結果を，図５中の白丸のプロットは，図４（ｂ）の評価系を用いて測定した結果を示している。参照電極４０２，４１２に，飽和塩化カリウム水溶液を内部溶液に使用している銀・塩化銀参照電極を用いた。絶縁性分子４１５を介して固定化された電気化学活性物質４１４には，１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール（１１−ＦＵＴ）を用いた。測定溶液４０４，４１６には，フェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムの合計の濃度を１０μＭとした０．１Ｍ 硫酸ナトリウム水溶液を用いた。測定温度は２５℃とした。酸化還元物質濃度比の対数が−１〜３の範囲では，△のプロット，白丸のプロットのどちらも５８ｍＶの直線でよくフィッティングでき，ネルンストの式に従い電圧が生じていることが分かる。しかし，△のプロットは，酸化還元物質濃度比の対数が−２以下と４以上では直線から外れてきていて，直線でフィッティングされた電圧の範囲は１３４〜４０９ｍＶであり，これは４．７桁の濃度範囲に相当する。一方，白丸のプロットは，直線でフィッティングされた電圧の範囲は８０〜４４２ｍＶであり，これは６．２桁の濃度範囲に相当する。すなわち，測定電極表面に絶縁性分子を介して電気化学活性物質を固定することで，ダイナミックレンジが１．５桁向上した。

測定電極表面に絶縁性分子を固定化しないと，測定電極と測定溶液間の絶縁性は低い。そのため，電極表面のリーク電流の影響により，測定対象物濃度の微小な変化を捉えることができない。一方，測定電極表面に絶縁性分子を介して電気化学活性物質を固定化することによって，測定電極と測定溶液間の絶縁性が高まり，電極表面のリーク電流が減少し，測定対象物のより微小な変化を捉えることができるようになる。その際，電気化学活性物質を測定電極表面に同一の長さの絶縁性分子で固定化することで，絶縁性を持ち，かつ電気化学活性物質の状態変化が均一に測定電極の表面電位に影響を及ぼすようにすることができる。

本発明による絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を，他の実施例を用いて説明する。図６は，未処理の金電極と絶縁性分子を固定化した金電極のボルタモグラムを示している。ポテンショスタットには，電気化学アナライザーALS Model 611Bを用いた。参照電極として，飽和塩化カリウム水溶液を内部溶液に使用している銀・塩化銀参照電極を用いた。対向電極として，白金線を用いた。溶液には，０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を用いた。このボルタモグラムにおいて，掃引方向で変化する電流値は電極表面の静電容量を，印加電圧に対する電流値の傾きは電極表面の抵抗を示している。未処理の金電極に比べて，絶縁性分子として１１−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（１１−ＨＵＴ）を固定化した金電極では，印加電圧に対する電流値の傾きは小さくなった。これは，電極表面に絶縁性分子を固定化したことにより，電極表面の絶縁性が高くなったことを意味している。また，未処理の金電極に比べて，絶縁性分子として１１−ＨＵＴを固定化した金電極では，電流の絶対値が小さくなっている。これは，未処理の金電極では電極表面に電気二重層といわれる一分子程度の層が存在し，１４μＦ／ｃｍ²の大きな静電容量が発生しているのに対し，電極表面に絶縁性分子が固定化されたことで，絶縁性分子の長さである２ｎｍ程度の絶縁層が形成され，静電容量が２．３μＦ／ｃｍ²に減少したためである。このように，電極表面に絶縁性分子を固定することで，電極表面の抵抗値が増大し，静電容量が減少した。この結果，リーク電流が低減し，さらに，充電電流も低減し，より微小な酸化還元物質濃度の変化を捉えることができるようになった。

本発明による絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を，他の実施例を用いて説明する。図７は，絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定した場合の評価系を示している。本評価系は，電位差計測装置７０１，参照電極７０２，測定物質を含有する試料溶液を供給する試料溶液注入器７０３，測定セル７０４を備える。測定セル７０４内の測定溶液７０７中には，電気化学活性物質７０５が絶縁性分子７０６を介して固定化された金電極７０８，参照電極７０２が配置されている。

図８は，図７の評価系を用いて測定した，測定物質を注入した際の参照電極と金電極の間の電位差の時間変化を示している。参照電極７０２に飽和塩化カリウム水溶液を内部溶液に使用している銀・塩化銀参照電極を使用した。絶縁性分子７０６を介して固定化された電気化学活性物質７０５には，（ａ）６−フェロセニル−１−ヘキサンチオール，（ｂ）８−フェロセニル−オクタンチオール，（ｃ）１１−ＦＵＴを用いた。試料溶液注入器内の試料溶液には，フェロシアン化カリウム水溶液を用いた。測定溶液８０７に０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を用いた。図８の横軸は，試料溶液注入時を０とした時間を，縦軸は，試料溶液注入直前の電圧を１，注入１００秒後の電圧を０として規格化した参照電極と金電極間の電位差を示している。試料溶液注入によって電位が０．１になるまでの時間，すなわち９０％の電位変化に要する時間を緩和時間とすると，緩和時間は（ａ）＞（ｂ）＞（ｃ）の順番であった。すなわち，絶縁性分子７０６の長さが長いほど，緩和時間が短かった。絶縁性分子７０６の長さが長いほど，測定電極と測定溶液間の絶縁性は高い。すなわち，絶縁性が高いほど応答速度が速くなっている。

本発明による固定化する電気化学活性物質を使用する酸化還元物質に合せて選択することで，感度を向上させることができることの効果を，他の実施例を用いて説明する。図９は，金電極表面に１１−ＦＵＴを固定化した電極（１１−ＦＵＴ固定化電極）で酸化還元物質であるＮＡＤおよびＮＡＤＨを測定した結果を示している。図１０は，金電極表面に１１−アミノ−１−ウンデカチオールを固定化し，さらにピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を固定化した電極（ＰＱＱ固定化電極）で酸化還元物質であるＮＡＤおよびＮＡＤＨを測定した結果を示している。１１−ＦＵＴ固定化電極ではスロープ感度が２４ｍＶであるが，ＰＱＱ固定化電極ではスロープ感度が５８ｍＶである。

上記の反応を理論的に考察する。１１−ＦＵＴ固定化電極を用いた場合，固定化されたフェロセンと溶液中のＮＡＤおよびＮＡＤＨの間では，次のような平衡反応が成立する。

２フェロセン(還元)＋ＮＡＤ⇔２フェロセン(酸化)＋ＮＡＤＨ
そのため，次式が成立する。

[フェロセン(酸化)]：酸化型フェロセン濃度
[フェロセン(還元)]：還元型フェロセン濃度
[ＮＡＤ]：ＮＡＤ濃度
[ＮＡＤＨ]：ＮＡＤＨ濃度
電極の表面電位Ｅは，理論的には次のネルンストの式によって，電極表面に固定化された電気化学活性物質の酸化還元状態の比から求まる。

E⁰：標準酸化還元電位
R：気体定数
T：絶対温度
n：交換される電子数
F：ファラデー定数
[Red]：還元型電気化学活性物質濃度
[Ox]：酸化型電気化学活性物質濃度
式(2)に式(1)を代入すると，

となり，ＮＡＤおよびＮＡＤＨ濃度に対するスロープ感度は，２５℃において３０ｍＶと求まる。測定されたスロープ感度が理論値よりも小さかったのは，フェロセンとＮＡＤおよびＮＡＤＨの間での酸化還元反応の反応速度が遅く，平衡状態に達していなかったためと考えられる。

ＰＱＱ固定化電極を用いた場合，固定化されたＰＱＱと溶液中のＮＡＤおよびＮＡＤＨの間では，次のような平衡反応が成立する。

ＰＱＱ(還元)＋ＮＡＤ⇔ＰＱＱ＋ＮＡＤＨ
そのため，次式が成立する。

[ＰＱＱ(酸化)]：酸化型ＰＱＱ濃度
[ＰＱＱ(還元)]：還元型ＰＱＱ濃度
式(2)に式(4)を代入すると，

となり，ＮＡＤおよびＮＡＤＨ濃度に対するスロープ感度は，２５℃において５９ｍＶと求まる。測定されたスロープ感度と理論値はほぼ等しく，ＰＱＱとＮＡＤおよびＮＡＤＨの間での酸化還元反応の反応速度が十分に速く，電圧測定時には平衡状態に達していたと考えられる。このように，酸化還元物質に合せて電極表面に固定化する電気化学活性物質を選択することで，感度を向上させることができる。ピロリン酸を電気的に検出するための好適な組み合わせを以下に示す。

図１１は，ＤＮＡの伸長反応を検出した結果およびその計算値を示す。二本鎖ＤＮＡ（１０μＭ，５０μＬ），ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），フルクトシル６リン酸キナーゼ（０．５Ｕ／ｍｌ，１μＬ），アルドラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素（１Ｕ／ｍｌ，１μＬ），ジアホラーゼ（１０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），フルクトシル６リン酸（９０ｍＭ，１μＬ），ＮＡＤ（３ｍｇ／ｍｌ，１μＬ），フェリシアン化カリウム（１０ｍＭ，５μＬ）を混合した溶液に，ｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ(それぞれ５ｍＭ,１μＬ)を順番に添加していった。二本鎖ＤＮＡの配列は，
プライマーＤＮＡ: 3'- CACAC TCACA GTTTT CACTT -5'
サンプルＤＮＡ : 3'- GCATA CACTA AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
とした。ｄＴＴＰの添加により，ＤＮＡポリメラーゼの働きによって一塩基の伸長反応が行われた。これは，サンプルＤＮＡの３’末端から１０番目の塩基がＡであることによる。伸長反応に伴い生成されたピロリン酸は，
ピロリン酸 ＋ フルクトシル６リン酸 → フルクトシル１，６ジリン酸 ＋ リン酸
フルクトシル１，６ジリン酸 → グリセロアルデヒドリン酸 ＋ ジヒドロキシアセトン
グリセロアルデヒドリン酸 ＋ ＮＡＤ ＋ リン酸 → グリセレート１，３ジリン酸 ＋ ＮＡＤＨ
ＮＡＤＨ ＋ ２フェリシアニド → ＮＡＤ ＋ ２フェロシアニド
の反応によってフェリシアニドの還元によるフェロシアニドの生成を引き起こした。このフェロシアニドの生成は，電極の表面電位の変化を引き起こした。結果，図に示すように１６．７ｍＶの電圧の低下が観測された。次のｄＡＴＰの添加により，一塩基の伸長反応が行われた。これは，サンプルＤＮＡの３’末端から９番目の塩基がＴであることによる。この伸長反応により，同様にして，１５．１ｍＶの電圧の低下が観測された。ｄＧＴＰの添加により，溶液中に存在するｄＮＴＰはｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰとなり，サンプルＤＮＡの３’末端の塩基Ｇを除く２番目から８番目の塩基配列ＣＡＴＡＣＡＣの相補配列であるＧＴＧＴＡＴＧの伸長反応が行われた。この７塩基の伸長反応により，同様にして，２３．８ｍＶの電圧の低下が観測された。

電圧低下量を理論的に考察する。溶液中のフェロシアニド濃度をｘとすると，２５℃ではネルンストの式に従い，Ｅ₀−５９log x の電圧が電極表面に発生する。１塩基の伸長反応により生成されるフェロシアニド濃度をΔｘ，伸長反応前のフェロシアニド濃度をｃ₀とすると，それぞれの時点でのフェロシアニド濃度は
伸長反応前：ｃ₀
ｄＴＴＰ添加後：ｃ₀＋Δｘ
ｄＡＴＰ添加後：ｃ₀＋２×Δｘ
ｄＧＴＰ添加後：ｃ₀＋９×Δｘ
である。そのため，それぞれの時点での電極表面に発生する電位は，
伸長反応前：Ｅ₀−５９ log(ｃ₀)
ｄＴＴＰ添加後：Ｅ₀−５９log(ｃ₀＋Δｘ)
ｄＡＴＰ添加後：Ｅ₀−５９log(ｃ₀＋２×Δｘ)
ｄＧＴＰ添加後：Ｅ₀−５９log(ｃ₀＋９×Δｘ)
である。従って，電位変化は，
ｄＴＴＰ添加：５９log(ｃ₀＋Δｘ)−５９log(ｃ₀)
ｄＡＴＰ添加：５９log(ｃ₀＋２×Δｘ)−５９log(ｃ₀＋Δｘ)
ｄＧＴＰ添加：５９log(ｃ₀＋９×Δｘ)−５９log(ｃ₀＋２×Δｘ)
である。フィッティングを行うと，Δｘ＝０．８３ｃのときに最適解が求まり，図１１のようになった。実験結果をよく再現しており，それぞれのｄＮＴＰの添加時の二本鎖ＤＮＡ伸長反応によって生成されたピロリン酸が，電位変化として検出されたことが分かる。

同様にして，ＳＮＰｓ（一塩基多型）の検出を行うことができる。二本鎖ＤＮＡ（５０μＭ，５０μＬ），ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），フルクトシル６リン酸キナーゼ（０．５Ｕ／ｍｌ，１μＬ），アルドラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素（１Ｕ／ｍｌ，１μＬ），ジアホラーゼ（１０Ｕ／ｍｌ，１μＬ），フルクトシル６リン酸（９０ｍM,１μＬ)，ＮＡＤ(3mg/ml,１μＬ)，フェリシアン化カリウム(10mM,５μＬ)を混合した溶液に，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ (それぞれ５ｍＭ,１μＬ)を順番に添加していった。二本鎖ＤＮＡの配列は，
プライマーＤＮＡ: 3'- CACAC TCACA GTTTT CACTT -5'
サンプルＤＮＡ（野生型）: 3'- GCATA CACTA AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
サンプルＤＮＡ（変異型）: 3'- GCATA CACTG AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
とし，プライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（野生型）もしくはプライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（変異型）の組み合わせで測定を行った。図１２に示すように，プライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（野生型）の組み合わせでは，ｄＣＴＰの添加では電圧の変化は１ｍＶ以下で，ｄＴＴＰの添加で１９．５ｍＶの電圧減少が観測された。一方，プライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（変異型）の組み合わせでは，ｄＣＴＰの添加で２０．２ｍＶの電圧減少が観測され，ｄＴＴＰの添加では電圧の変化は１ｍＶ以下であった。この結果は，プライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（野生型）の組み合わせでは，ｄＣＴＰの添加では伸長反応が起こらないが，ｄＴＴＰの添加では伸長反応が起こること，そして，プライマーＤＮＡとサンプルＤＮＡ（変異型）の組み合わせでは，ｄＣＴＰの添加では伸長反応が起こるが，ｄＴＴＰの添加では伸長反応が起こらないことを反映したものであり，このことを利用し，ＳＮＰｓを検出することができる。

電位差計測を行うことによって測定体積微小化における信号低下を解決できることを，理論的考察によって以下に示す。比表面積（実表面積の幾何学的表面積に対する割合）Ｒ，半径ｒのビーズを一辺２ｒの立方体のセルに配置したときの，発光方式と電位差計測でのビーズ半径依存性を考える。ビーズの表面積は，４πｒ²Ｒであり，半径の２乗に比例する。発光方式での信号強度はＤＮＡの量，すなわちビーズの表面積に依存するため，ＤＮＡの固定化密度が一定の場合，半径の２乗に依存し，測定体積微小化によって信号強度は減少する。一方，電位差計測では，信号強度はＤＮＡの濃度に依存する。溶液の体積は，立方体の体積８ｒ³からビーズの体積４／３πｒ³を引いた（８−４／３π）ｒ³であり，半径の３乗に比例する。したがって，ＤＮＡの固定化密度が一定の場合，ＤＮＡの濃度は半径に反比例するため，電位差計測では信号強度は半径の逆数に依存し，電位差計測では測定体積微小化によって信号強度は増加する。このように電位差計測では測定体積微小化に伴う信号強度の低下がないため，大規模並列解析に適している。

どの程度のビーズ径が適しているのかを以下に考察する。前述の計算から，溶液の体積は（８−４／３π）ｒ³である。ビーズ表面に間隔ｄでＤＮＡが固定されている場合には，ビーズ表面にはＤＮＡが４πｒ²Ｒ／ｄ²個固定化されている。その際，ＤＮＡの濃度は３Ｒ／｛（６−π）ｄ²ｒＮ_A｝ｍｏｌ／ｍ³であり，Ｒ＝１と仮定すると，ビーズ半径とＤＮＡ濃度の関係が求まる（図１３）。酸化還元物質を検出可能な濃度が１０^-6Ｍの場合には，ビーズの半径が７０μｍ以下，すなわち直径が１４０μｍ以下であれば一塩基の伸長反応を検出可能である。

本発明によるＤＮＡ分析システムの一例を示すブロック図。 本発明によるＤＮＡ分析システムを用いた分析方法の一例を示すフロー図。 本発明によるＤＮＡ分析システムに用いるＦＥＴセンサの回路図の一例を示すブロック図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの評価系の説明図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を示す図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を示す図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定した場合の評価系を示す図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を示す図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を示す図。 絶縁性分子を介して電気化学活性物質を測定電極表面に固定することの効果を示す図。 本発明によるＤＮＡ分析システムを用いた分析結果の一例を示す図。 一塩基多型の検出側を示す図。 核酸固定化ビーズの半径と見かけの核酸濃度の関係を示す図。

符号の説明

１０１…測定部
１０２…信号処理回路
１０３…データ処理装置
１０４…洗浄液容器
１０５…反応溶液容器
１０６…ｄＡＴＰ溶液容器
１０７…ｄＴＴＰ溶液容器
１０８…ｄＧＴＰ溶液容器
１０９…ｄＣＴＰ溶液容器
１１０…洗浄液供給バルブ
１１１…反応溶液供給バルブ
１１２…ｄＡＴＰ溶液供給バルブ
１１３…ｄＴＴＰ溶液供給バルブ
１１４…ｄＧＴＰ溶液供給バルブ
１１５…ｄＣＴＰ溶液供給バルブ
１１６…測定セル
１１７…セパレータ
１１８…ビーズ
１１９…測定電極
１２０…電界効果トランジスタ
１２１…参照電極
１２２…廃液容器
３０１…Ｘセレクタ
３０２…Ｙセレクタ
４０１，４１１，７０１…電位差計測装置
４０２，４１２，７０２…参照電極
４０３，４１３，７０４…測定セル
４１４，７０５…電気化学活性物質
４１５，７０６…絶縁性分子
４０４，４１６，７０７…測定溶液
４０５，４１７，７０８…金電極
７０３…試料溶液注入器

Claims (17)

1. プローブとハイブリダイズした試料核酸を用意する工程と，
   核酸基質とポリメラーゼを用いて前記プローブの伸長反応を行う工程と，
   前記伸長反応で生じるピロリン酸を酸化還元物質に変換する工程と，
   前記酸化還元物質を電気的に検出する検出工程とを有し，
   前記検出工程では，試料核酸を含む液体に接する電極の界面電位の変化を検出することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
2. 請求項１記載のＤＮＡ分析方法において，前記電極とゲート部が電気的に結合されている前記電極と同一基板上の電界効果トランジスタを用いて前記電極の界面電位の変化を検出することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
3. 請求項１記載のＤＮＡ分析方法において，前記核酸基質は，デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）またはイオウを含有するその誘導体であることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
4. 請求項１記載のＤＮＡ分析方法において，前記電極には絶縁性分子に結合した電気化学活性物質が固定されていることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
5. 請求項４記載のＤＮＡ分析方法において，前記絶縁性分子が炭素鎖であることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
6. 請求項４記載のＤＮＡ分析方法において，前記酸化還元物質は酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドであり，前記電気化学活性物質はキノン含有分子であることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
7. 請求項４記載のＤＮＡ分析方法において，前記酸化還元物質は金属錯体であり，前記電気化学活性物質はフェロセン含有物質であることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
8. 請求項４記載のＤＮＡ分析方法において，洗浄液による洗浄工程を有することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
9. 請求項８記載のＤＮＡ分析方法において，前記洗浄液は酸化還元物質を含むことを特徴とするＤＮＡ分析方法。
10. 核酸が固定されており，もしくは核酸が固定された物体が内部に配置されており，前記核酸の伸長反応で生じるピロリン酸を酸化還元物質に変換する物質を含む液体が導入される容器と，
    前記容器中に配置される液体に接触する測定電極と，
    前記測定電極の表面に固定される，絶縁性分子に結合した電気化学活性物質と，
    前記液体と接触する参照電極と，
    前記測定電極の界面電位を測定する電位差計と，
    ｄＡＴＰもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第１供給部と，
    ｄＧＴＰもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第２供給部と，
    ｄＣＴＰもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第３供給部と，
    ｄＴＴＰもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第４供給部とを備え，
    前記電位差計は，前記核酸の伸長反応により生成したピロリン酸が変換された前記酸化還元物質の濃度変化を前記測定電極の界面電位の変化として電気的に検出することを特徴とするＤＮＡ分析システム。
11. 請求項１０記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記核酸が固定された物体が半径ｒ比表面積Ｒのビーズであり，前記核酸は間隔ｄで固定化されていて，前記電位差計の酸化還元物質の測定下限濃度をＣ_lim，アボガドロ数をＮ_Aとしたときに，
    ｒ≦３ＲＣ_lim／｛（６−π）ｄ²Ｎ_A｝
    の関係が成り立つことを特徴とするＤＮＡ分析システム。
12. 請求項１０記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記電位差計が電界効果トランジスタであることを特徴とするＤＮＡ分析システム。
13. 請求項１２記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記測定電極が複数あり，前記電界効果トランジスタが複数あり，前記測定電極と前記電界効果トランジスタが同一の基板に形成されていることを特徴とするＤＮＡ分析システム。
14. 請求項１０記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記電気化学活性物質はキノン含有分子であることを特徴とするＤＮＡ分析システム。
15. 請求項１０記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記電気化学活性物質はフェロセン含有物質であることを特徴とするＤＮＡ分析システム。
16. 請求項１０記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記容器中に洗浄液を供給する洗浄部を備えることを特徴とするＤＮＡ分析システム。
17. 請求項１６記載のＤＮＡ分析システムにおいて，前記洗浄液は酸化還元物質を含むことを特徴とするＤＮＡ分析システム。

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