JP4942508B2 - abl遺伝子変異の検出用プローブおよびその用途 - Google Patents
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Description
(A1)配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(A2)配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(B1)配列番号4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(B2)配列番号5の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(C1)配列番号6の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(C2)配列番号7の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(D1)配列番号8の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(D2)配列番号9の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(E1)配列番号10の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(F1)配列番号11の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(G1)配列番号12の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(G2)配列番号13の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(H1)配列番号14の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(H2)配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(I1)配列番号16の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(1)DNAを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
(2)前記DNAに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
(3)前記DNAと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
(4)前記シグナルの変動を解析してTm値を決定する工程
(5)前記Tm値から変異の有無を決定する工程
本発明のプローブは、前述のように、abl遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、前記(A1)〜(I1)からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。abl遺伝子のcDNA配列(mRNA配列)を、配列番号1に示す。なお、この配列は、NCBIアクセッションNo.NM_005157に登録されている。以下に、これらのプローブについて説明する。
(A1)配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(A2)配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−tgtgcttcaCggtgatgtcc−3’
(配列番号2)
5’−gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc−3’
(配列番号3)
(B1)配列番号4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(B2)配列番号5の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−caagctgggcgAgggcc−3’ (配列番号4)
5’−cacaagctgggcgAggg−3’ (配列番号5)
(C1)配列番号6の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(C2)配列番号7の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−ctcagCgatgatatagaacgg−3’ (配列番号6)
5’−cagCgatgatatagaacggg−3’ (配列番号7)
(D1)配列番号8の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(D2)配列番号9の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−ctcaAtgatgatatagaacg−3’ (配列番号8)
5’−actcaAtgatgatatagaac−3’ (配列番号9)
(E1)配列番号10の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−ttcccgtaggtcatCaac−3’ (配列番号10)
(F1)配列番号11の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−gtcagccaCggagtacc−3’ (配列番号11)
(G1)配列番号12の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(G2)配列番号13の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−gtttttcttcCccaggtactc−3’ (配列番号12)
5’−gtttttcttcCccaggtactcc−3’ (配列番号13)
(H1)配列番号14の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
(H2)配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−gatgaCgtttttcttctcc−3’ (配列番号14)
5’−tgtggatgaCgtttttcttc−3’ (配列番号15)
(I1)配列番号16の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
5’−ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc−3’
(配列番号16)
本発明の変異検出方法は、前述のように、abl遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程(1)〜(5)を含むことを特徴とする。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
(1)DNAを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
(2)前記DNAに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
(3)前記DNAと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
(4)前記シグナルの変動を解析してTm値を決定する工程
(5)前記Tm値から変異の有無を決定する工程
センスプライマー 配列番号17
5’−gacaagtgggagatggaacgc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号18
5’−cacggccaccgtcagg−3’
B1プローブおよびB2プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号19
5’−gacaagtgggagatggaacgc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号20
5’−cacggccaccgtcagg−3’
C1プローブおよびC2プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号21
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号22
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
D1プローブおよびD2プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号23
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号24
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
E1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号25
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号26
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
F1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号27
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号28
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
G1プローブおよびG2プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号29
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号30
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
H1プローブおよびH2プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号31
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号32
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
I1プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号33
5’−acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号34
5’−acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc−3’
本発明のプローブキットは、abl遺伝子の変異の検出に使用するプローブキットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明のプローブキットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのTm解析を行う場合、各プローブは、別個の標識化物質で標識化されていることが好ましい。このように標識化物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記標識化物質としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における730番目塩基の点突然変異(A→G)についてのTm解析を行った。
5’−gacaagtgggagatggaacgc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号18
5’−cacggccaccgtcagg−3’
(実施例1−1)
検出用プローブA1 配列番号2
5’−tgtgcttcaCggtgatgtcc−(TAMRA)−3’
(実施例1−2)
検出用プローブA2 配列番号3
5’−gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc
−(TAMRA)−3’
(比較例1)
検出用プローブ 配列番号35
5’−(TAMRA)−caccGtgaagcacaag−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例1−1 56.0 65.0
実施例1−2 69.0 74.0
比較例1 50.0 57.0
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における749番目塩基の点突然変異(G→A)についてのTm解析を行った。
5’−gacaagtgggagatggaacgc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号20
5’−cacggccaccgtcagg−3’
(実施例2−1)
検出用プローブB1 配列番号4
5’−(TAMRA)−caagctgggcgAgggcc−P−3’
(実施例2−2)
検出用プローブB2 配列番号5
5’−(TAMRA)−cacaagctgggcgAggg−P−3’
(比較例2)
検出用プローブ 配列番号36
5’−(TAMRA)−cccTcgcccagctt−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例2−1 59.0 66.0
実施例2−2 58.0 64.0
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における943番目塩基の点突然変異(A→G)についてのTm解析を行った。
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号22
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
(実施例3−1)
検出用プローブC1 配列番号6
5’−(Pacific Blue)−ctcagCgatgatatagaacgg−P−3’
(実施例3−2)
検出用プローブC2 配列番号7
5’−(TAMRA)−cagCgatgatatagaacggg−P−3’
(比較例3−1)
検出用プローブ 配列番号37
5’−(TAMRA)−catgaactcaGcgatgatatag−P−3’
(比較例3−2)
検出用プローブ 配列番号38
5’−(TAMRA)−cccgttctatatcatcgCtg−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例3−1 52.0 61.0
実施例3−2 50.0 60.0
比較例3−1 52.0 N.D
比較例3−2 55.0 N.D
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における944番目塩基の点突然変異(C→T)についてのTm解析を行った。
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号24
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
(実施例4−1)
検出用プローブD1 配列番号8
5’−(BODIPY FL)−ctcaAtgatgatatagaacg−P−3’
(実施例4−2)
検出用プローブD2 配列番号9
5’−actcaAtgatgatatagaac−(TAMRA)−3’
(比較例4−1)
検出用プローブ 配列番号39
5’−(TAMRA)−cccgttctatatcatcaTtgag−P−3’
(比較例4−2)
検出用プローブ 配列番号40
5’−(TAMRA)−ccgttctatatcatcaTtg−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例4−1 46.0 55.0
実施例4−2 46.0 55.0
比較例4−1 54.0 59.0
比較例4−2 49.0 54.0
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における951番目塩基の点突然変異(C→G)についてのTm解析を行った。
5’−ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc−3’
アンチセンスプライマー 配列番号26
5’−ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag−3’
(実施例5)
検出用プローブE1 配列番号10
5’−ttcccgtaggtcatCaac−(TAMRA)−3’
(比較例5−1)
検出用プローブ 配列番号41
5’−ttGatgacctacgggaacc−(TAMRA)−3’
(比較例5−2)
検出用プローブ 配列番号42
5’−ttGatgacctacgggaac−(TAMRA)−3’
(比較例5−3)
検出用プローブ 配列番号43
5’−(TAMRA)−cccgtaggtcatCaactc−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例5 47.0 60.0
比較例5−1 58.0 62.0
比較例5−2 56.0 60.0
比較例5−3 N.D. N.D.
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における1052番目塩基の点突然変異(T→C)についてのTm解析を行った。
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号28
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
(実施例6)
検出用プローブF1 配列番号11
5’−gtcagccaCggagtacc−(BODIPY FL)−3’
(比較例6−1)
検出用プローブ 配列番号44
5’−ccactcagatctcgtcagccaCggagtacc
−(TAMRA)−3’
(比較例6−2)
検出用プローブ 配列番号45
5’−(TAMRA)−ccaTggagtacctagCgaag−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例6 53.0 64.0
比較例6−1 68.0 73.0
比較例6−2 N.D. N.D.
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における1064番目塩基の点突然変異(A→G)についてのTm解析を行った。
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号30
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
(実施例7−1)
検出用プローブG1 配列番号12
5’−gtttttcttcCccaggtactc−(TAMRA)−3’
(実施例7−2)
検出用プローブG2 配列番号13
5’−gtttttcttcCccaggtactcc−(TAMRA)−3’
(比較例7)
検出用プローブ 配列番号46
5’−(TAMRA)−cttcCccaggtactcc−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例7−1 53.0 62.0
実施例7−2 55.0 63.0
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における1075番目塩基の点突然変異(T→G)についてのTm解析を行った。
5’−ggccggccccgtggtgctgctgtacatg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号32
5’−cacgccctgtgactccatg−3’
(実施例8−1)
検出用プローブH1 配列番号14
5’−gatgaCgtttttcttctcc−(TAMRA)−3’
(実施例8−2)
検出用プローブH2 配列番号15
5’−tgtggatgaCgtttttcttc−(TAMRA)−3’
(比較例8−1)
検出用プローブ 配列番号47
5’−(TAMRA)−ctgtggatgaCgtttttc−P−3’
(比較例8−2)
検出用プローブ 配列番号48
5’−(TAMRA)−cctgtggatgaCgtttttc−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例8−1 48.0 58.0
実施例8−2 50.0 60.0
比較例8−1 48.0 58.0
比較例8−2 50.0 59.0
本発明のプローブを使用して、abl遺伝子における1187番目塩基の点突然変異(A→G)についてのTm解析を行った。
5’−acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg−3’
アンチセンスプライマー 配列番号34
5’−acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc−3’
(実施例9)
検出用プローブI1 配列番号16
5’−ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc−(TAMRA)−3’
(比較例9−1)
検出用プローブ 配列番号49
5’−gctccagcaCgggctgtgtaggtgtcc−(TAMRA)−3’
(比較例9−2)
検出用プローブ 配列番号50
5’−(TAMRA)−ccagcaCgggctgtgtag−P−3’
プローブ wtDNA(100%) mtDNA(100%)
実施例9 66.0 73.0
比較例9−1 69.0 75.0
比較例9−2 55.0 65.0
Claims (17)
- abl遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記(A1)〜(I1)からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
(A1)配列番号2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(A2)配列番号3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(B1)配列番号4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(B2)配列番号5の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(C1)配列番号6の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(C2)配列番号7の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(D1)配列番号8の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(D2)配列番号9の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(E1)配列番号10の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(F1)配列番号11の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(G1)配列番号12の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(G2)配列番号13の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(H1)配列番号14の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(H2)配列番号15の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(I1)配列番号16の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 前記(A1)および(A2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における730番目の塩基Aの変異(A→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(B1)および(B2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における749番目の塩基Gの変異(G→A)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(C1)および(C2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における943番目の塩基Aの変異(A→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(D1)および(D2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における944番目の塩基Cの変異(C→T)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(E1)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における951番目の塩基Cの変異(C→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(F1)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における1052番目の塩基Tの変異(T→C)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(G1)および(G2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における1064番目の塩基Aの変異(A→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(H1)および(H2)のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基配列における1075番目の塩基Tの変異(T→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記(I1)オリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号1の塩基における1187番目の塩基Aの変異(A→G)を検出するためのプローブである、請求項1記載のプローブ。
- 前記プローブが標識化プローブである、請求項1から10のいずれか一項に記載のプローブ。
- 前記標識化プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求項11記載のプローブ。
- 前記標識化プローブが、蛍光色素で標識されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項11記載のプローブ。
- 前記プローブにおいて、5’末端または3’末端の塩基がCであり、前記末端塩基Cが標識化されている、請求項13記載のプローブ。
- 前記プローブが、Tm解析用のプローブである、請求項1から14のいずれか一項に記載のプローブ。
- abl遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程(1)〜(5)を含むことを特徴とする変異の検出方法。
(1)DNAを含有する試料に、請求項1から15のいずれか一項に記載のプローブを添加する工程
(2)前記DNAに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
(3)前記DNAと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
(4)前記シグナルの変動を解析してTm値を決定する工程
(5)前記Tm値から変異の有無を決定する工程 - 前記試料が、血液試料である、請求項16記載の変異の検出方法。
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