JP4837992B2 - 蛋白修飾物生成抑制剤 - Google Patents

Description

この発明は、蛋白修飾物生成抑制剤、特に非酵素的条件下にカルボニル化合物と反応することによって生じる糖化最終産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＧＥｓ」と称する）、脂質過酸化最終産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＬＥｓ」と称する）等の蛋白修飾物の生成を抑制する薬剤に関する。

糖化反応（グリケーション）とは、ペプチドや蛋白質等のアミノ基と還元糖等のカルボニル基との非酵素的反応から始まる一連の反応（メイラード反応（非特許文献１参照））をいい、初期段階と後期段階に大別することができる。初期段階は糖の濃度と反応時間とに依存する可逆反応であり、前記アミノ基と前記カルボニル基とが非酵素的に反応してシッフ塩基を生成し、さらにアマドリ転位によりアマドリ化合物を形成する。

後期段階では初期段階で生成したアマドリ化合物が非可逆的に脱水、縮合、環状化、酸化、断片化、重合、転位等を受け、最終的に ＡＧＥｓと呼ばれる蛋白修飾物を形成する。糖の自動酸化等により、３−デオキシグルコソン（以下、「３−ＤＧ」と称する）、グリオキサール（以下、「ＧＯ」と称する）およびメチルグリオキサール（以下、「ＭＧＯ」と称する）等の反応性の高いジカルボニル化合物が生成するが、これらのカルボニル化合物も蛋白と反応し、多くの場合蛋白質のリジン残基やアルギニン残基等が修飾されたＡＧＥｓを生成する。

また、酸化ストレス下では、生体内に豊富に存在する糖、脂質、アミノ酸等は酸化反応等により、反応性の高いカルボニル化合物へと変化する。その結果生じる、ＧＯ、ＭＧＯ、アラビノース、グリコールアルデヒドなどの化合物はＡＧＥｓの前駆物質となる。また、アスコルビン酸の酸化により生成するデヒドロアスコルビン酸もＡＧＥｓの前駆物質となる。これらの前駆物質はいずれもカルボニル基を有しており、蛋白質のアミノ基と非酵素的に反応してシッフ塩基を生成してＡＧＥｓを形成する（非特許文献２参照）。

一方、酸化ストレス下では脂質過酸化も進行し、マロンジアルデヒド、ヒドロキシノネナールおよびアクロレインのような、様々なカルボニル化合物が形成される（非特許文献３参照）。これらのカルボニル化合物も蛋白質のアミノ基等と反応し、マロンジアルデヒド修飾リジンやヒドロキシノネナール修飾物等のＡＬＥｓと呼ばれる蛋白修飾物を形成する（非特許文献２参照）。

更に、セリンやスレオニンなどのアミノ酸も酸化によりアクロレイン、ＧＯなどのカルボニル化合物が生成し、蛋白修飾物を形成する（非特許文献４参照）。多くのカルボニル化合物は酸化的経路で生成されるが、３−ＤＧのように非酸化的経路を経て生成されるカルボニル化合物も存在する。

公知のＡＧＥｓ生成経路として、１）シッフ塩基、アマドリ化合物から３−ＤＧを経由する経路、２）シッフ塩基が酸化的にグリコールアルデヒド−アルキルイミンへ変化し、アルドアミンを経てＡＧＥｓに至る経路、３）アルドアミンがグリオキサールモノアルキルイミンを経てＡＧＥｓに至る経路、４）アマドリ化合物から２，３−エンジオールを経て生成されるＭＧＯを中間体とする経路、５）その他等がある。

最近、ＡＧＥｓのひとつであるカルボキシメチルリジンが不飽和脂肪酸の脂質酸化反応の結果生じるＧＯによっても生成することが明らかになり、糖化・酸化反応と脂質酸化反応が共通の基盤で起こっていると考えられる。

以上のように、糖、脂質、アミノ酸およびアスコルビン酸から酸化的、非酸化的経路により生成されたカルボニル化合物は、蛋白を非酵素的に修飾して最終的にＡＧＥｓやＡＬＥｓ等の蛋白修飾物を形成するに至る。特に、複数の反応経路を経て生成されたカルボニル化合物により蛋白修飾反応が亢進している状態をカルボニル過剰による蛋白修飾、すなわち、カルボニルストレスと呼んでいる。

公知のＡＧＥｓとしては、ペントシジン（非特許文献５参照）、クロスリン（非特許文献６参照）、Ｘ１（フルオロリンク）、ピロピリジン（非特許文献７参照）、ピラリン（非特許文献８参照）、カルボキシメチルリジン（非特許文献９参照）、イミダゾロン化合物（非特許文献１０参照）、カルボキシエチルリジン（非特許文献１１参照）、ＭＧＯダイマー（非特許文献１２参照）、ＧＯダイマー（非特許文献１３参照）、イミダゾリジン（非特許文献１４参照）およびアルグピリミジン（非特許文献１５参照）等が知られている。

現在クローニングされているＡＧＥｓ受容体として、ＲＡＧＥ（非特許文献１６参照）、マクロファージスカベンジャー受容体クラスＡ（非特許文献１７参照）、ガレクチン３（非特許文献１８参照）、ＯＳＴ−４８および８０Ｋ−Ｈ等がある（非特許文献１７参照）。

血管組織においてＡＧＥｓがＲＡＧＥ（免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞膜貫通型蛋白質）に結合すると、細胞内で活性酸素が生成し、ｐ２１ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路が活性化され（非特許文献１９参照）、これにより転写因子ＮＦ−κＢ活性化が誘導され、ＶＣＡＭ−１等の血管障害関連因子の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２０参照）。また、ＡＧＥｓはＲＡＧＥを介して、微小血管の内皮細胞の増殖を制御し、恒常性維持に重要な役割を果たしている周皮細胞の増殖を抑制するとともに、毒性効果を発揮することが報告されている（非特許文献２１参照）。

さらに、ＡＧＥｓはＲＡＧＥを介して、微小血管の内皮細胞に直接的に作用し血管新生を促進すること、ＰＧＩ２の産生を阻害して血栓傾向となること（非特許文献２２参照）が報告されている。その他、ＡＧＥｓやＡＬＥｓ等の生理活性として、メサンギウム細胞の基質産生の亢進、単球遊走能の亢進、マクロファージからの炎症性サイトカインの放出、滑膜細胞のコラゲナーゼ産生促進、破骨細胞の活性化、血管平滑筋の増殖作用、血小板凝集の促進、ＮＯ活性とその平滑筋弛緩反応の抑制が報告されている（非特許文献２３参照）。

ＡＧＥｓが関与する疾患として、１）糖尿病合併症である腎症（非特許文献２４参照）、神経障害（非特許文献２５参照）、網膜症（非特許文献２１参照）および白内障、２）動脈硬化（非特許文献２６参照）、３）透析合併症である透析アミロイドーシス（非特許文献２７参照）および腹膜透析患者における腹膜硬化症、４）中枢神経疾患であるアルツハイマー病（非特許文献２８参照）、ピック病およびパーキンソン病、５）リウマチ性関節炎（非特許文献２９参照）、６）日光弾性線維症、７）老化、８）腎不全（非特許文献３０参照）等が知られている。その他、糖尿病の場合、血管内皮由来の血管拡張がＡＧＥｓによって障害されること（非特許文献３１参照）、ＡＧＥｓが腎硬化を促進させること（非特許文献３２参照）等が報告されている。

以上のことから、ＡＧＥｓを初めとする蛋白修飾物は、直接的にまたは受容体を介して生体に悪影響を与えることが明らかとなっている。

一方、腎機能が低下するに従って、血中のＡＧＥｓの濃度が上昇することが知られている。腎機能低下により、分子量５ｋＤａ以下と考えられるカルボニル化合物は体内に蓄積する。ペントシジンやピラリン等の場合、遊離型も存在するが、血清アルブミン等の蛋白結合型が大部分を占めている（非特許文献３３参照）。また、血中ペントシジン濃度は糸球体濾過機能の影響を強く受けるという報告がある（非特許文献３４参照）。

この様に、ＡＧＥｓはその大部分が腎において処理され、健康時には血中濃度は低く保たれているが、腎機能が低下すると尿毒症毒素（ｕｒｅｍｉｃ ｔｏｘｉｎ）として慢性の生物活性をもたらすようになる。

透析療法によって遊離型のものは除去されるが、蛋白結合型のものや分子内架橋を形成するものは除去することは困難である（非特許文献３５参照）。従って、腎不全期間の経過と共に蛋白修飾物の生体内蓄積量は増加する。また、生体内で糖が反応する基本的な過程以外に食品中から供給される遊離型ＡＧＥｓや、生体内で既に形成されたアマドリ化合物などから形成される活性の強い３−ＤＧ、ＧＯ、ＭＧＯなどの中間体が次々に蛋白と反応し、ＡＧＥｓの産生を促進することが認められている。また、血液は透析膜と接触することによって、補体系や白血球の活性化などの様々な影響を受け、フリーラジカルの産生亢進へとつながる等、透析療法そのものによる酸化の亢進も存在し、ＡＧＥｓ生成の一因となっている。

ゆえに、透析療法での対策としては透析導入の初期からこれらの遊離型物質の除去を図り、結合型のＡＧＥｓ形成を極力抑制することが重要であり、上記のように結合型のＡＧＥｓを透析療法によって除去することは困難であるので、透析療法では蛋白修飾物の生成を抑制する薬物の開発が希求されている。

また、腎機能に起因するばかりではなく、腎不全に伴う抗酸化防御機構の低下も蛋白修飾物の蓄積に関与していると考えられる。腎不全患者では、血中還元型グルタチオンに対する酸化型グルタチオンの上昇（非特許文献３６参照）、グルタチオン依存酵素群の活性低下、保存期腎不全血漿グルタチオンペルオキシダーゼの低下（非特許文献３７参照）、全血中グルタチオンの低下（非特許文献３８参照）、ならびに血漿セレン濃度の低下に対する血漿スーパーオキサイドジスムターゼの活性上昇（非特許文献３９参照）といった抗酸化能の不均衡が示唆されている（非特許文献４０参照）。

また、一般に慢性腎不全の患者では、高血糖の有無に関わらず血中や組織中に反応性の高いカルボニル化合物やＡＧＥｓが著しく蓄積していることが報告されている（非特許文献４１参照）。腎不全においては、非酵素的化学反応によりカルボニル化合物が高負荷の状態（カルボニルストレス）となり、蛋白質修飾が亢進される病態が存在しており、糖・脂質からカルボニル化合物が生成され蛋白質を修飾するためであると考えられる（非特許文献４２参照）。

ゆえに、様々な要因によって生じる蛋白修飾物の生成を抑制することが、組織障害の軽減につながり、ＡＧＥｓ等の蛋白修飾物質が関与する病態を予防および治療することができる。

慢性腎不全患者に行われる透析には、血液透析と腹膜透析がある。腹膜透析の場合、血中の老廃物は腹膜を通して腹膜透析液中に排泄される。高浸透圧の腹膜透析液（グルコース、イコデキストリンまたはアミノ酸等を含有する）は、腎不全患者の血中に蓄積した反応性の高いカルボニル化合物（例えば腎不全患者の血中に酸化ストレスに伴って蓄積する、炭水化物に由来するカルボニル化合物（アラビノース、ＧＯ、ＭＧＯ、３−ＤＧ）、アスコルビン酸に由来するカルボニル化合物（デヒドロアスコルビン酸）、脂質に由来するカルボニル化合物（ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、アクロレイン））を、腹膜を介して腹腔内の腹膜透析液中に集める作用がある。

また、腹膜透析液の滅菌や保存中に、反応性の高いカルボニル化合物（３−ＤＧ、５−ヒドロキシメチルフルフラール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ＧＯ、ＭＧＯ、レプリン酸、フルフラール、アラビノースなどのカルボニル化合物）が腹膜透析液中に生成することが知られている（非特許文献４３参照）。

そのため腹膜透析液中の前記カルボニル化合物濃度は上昇し、蛋白修飾物質の生成が亢進する。その結果、腹膜の機能が低下し、除水能の低下や腹膜硬化症への進展に関与すると考えられる。（非特許文献４４参照）。

実際に腹膜透析患者においては、導入されたグルコースによって腹腔内がカルボニルストレス状態となっていることは、内皮および中皮の免疫組織学的検討から証明されている（非特許文献４５参照）。

この様に、透析患者においてもカルボニル化合物による蛋白修飾物の生成が腹膜の形態学的変化およびこれに伴う機能（除水能）の低下の原因となっていることが推測されており、その改善方法の提供が求められている。

以上の事実と腎不全をはじめとする種々の病態を考え合わせると、カルボニル化合物蓄積がＡＧＥｓ産生亢進の原因のひとつであると考えられ（非特許文献４６参照）、ＡＧＥｓの産生を抑制することが、ＡＧＥｓが関連する病態に対し有効であると考えられる。

代表的なＡＧＥｓ生成阻害薬としてアミノグアニジンがある。アミノグアニジンはグルコース、シッフ塩基やアマドリ生成物から生成される３−ＤＧなどのジカルボニル化合物と反応してチアゾリンを形成することによってＡＧＥｓ生成を阻害すると考えられている。糖尿病モデル動物を用いた解析では、糖尿病性腎症（非特許文献４７参照）、網膜症（非特許文献４８参照）および白内障（非特許文献４９参照）の進展を遅延させる効果が確認されている。

他に、この種に属する化合物としてピリドキサミン誘導体（ピリドリン）がある。また、ＯＰＢ−９１９５（（±） ２−イソプロピリデンヒドラゾノ−４−オキソ−チアゾリジン−５−イルアセトアニリド）はヒドラジンの窒素原子がカルボニル基と反応して安定な構造を形成し、遊離または蛋白に結合した反応性カルボニルを捕捉することにより（非特許文献５０参照）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＧＥｓのみならずＡＬＥｓの生成も抑制する。メトホルミンやブホルミン等のビグアナイド化合物もカルボニル化合物を捕捉できるため、（非特許文献５１参照）ＡＧＥｓ生成阻害薬として利用できる可能性がある。さらに、ＡＧＥｓの特徴である架橋を切断するタイプのＡＧＥｓ阻害剤、アマドリ化合物を分解する酵素（ａｍａｄｏｒｉａｓｅ）等の提案もされている。

一方、カルボニル化合物を消去することにより、ＡＧＥｓやＡＬＥｓの生成を阻害する可能性も検討されている。カルボニル化合物の消去にはいくつかの酵素や酵素的経路が存在し、例えばアルドース還元酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼやグリオキサラーゼ経路が挙げられるが（非特許文献５２参照）還元型グルタチオン（ＧＳＨ）やＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどのレドックス補酵素はこれらの経路の活性に重要な要素である。

これらの消去系の低下は同時に多数のカルボニル化合物の上昇につながる。ＭＧＯ、ＧＯなどのカルボニル化合物はＧＳＨのチオール基と反応し、結果的に酵素グリオキサラーゼにより代謝される。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈはグルタチオン還元酵素を活性化し、ＧＳＨレベルを上昇させる。すなわち、細胞内レドックス機構の不均衡によるＧＳＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの低下によりカルボニル化合物の消去系が阻害され、ＡＧＥｓやＡＬＥｓの蓄積につながると考えられる。また、糖尿病においては、高血糖によりポリオール経路が活性化され、ＮＡＤ（Ｐ）ＨやＧＳＨが低下し、結果的にカルボニル化合物の消去系が低下することが示唆される。

前述したようにＧＳＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどのチオール濃度の低下がカルボニル化合物消去の低下につながり、結果としてＡＧＥｓやＡＬＥｓを形成する原因のひとつとなっているとすれば、チオールレベルを上昇させることによりカルボニル化合物を減少できる可能性がある。これには、ＧＳＨ、システイン、アセチルシステイン等によりチオール基を補充する方法、ビタミンＥやユビキノール等によりＧＳＨ需要を低下させる方法、アルドース還元酵素阻害薬等によりポリオール系を阻害する方法が提案されている。さらに、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ヒドラジン、ビグアナイド化合物およびＳＨ基含有化合物を用いて、カルボニル化合物をトラップさせる方法も提案されている（特許文献１参照）。

以上詳細に述べたように、ＡＧＥｓおよびＡＬＥｓの生成を阻害することが、これらに関連する病態を予防または治療できる方法である。

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本発明者らは、上記従来技術に基づく知見を前提として、非酵素的条件下、カルボニル化合物と反応することによって生じる蛋白修飾物（ＡＧＥｓおよび／またはＡＬＥｓ）が関与する病態を予防および／または治療するための薬剤を開発すべく鋭意研究を行った結果、先に、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンまたは薬理学的に許容されるその塩が効果的にＡＧＥｓ、ＡＬＥｓ等の蛋白修飾物の生成を抑制する事実を発見し、この発見事実に基づいて、当該物質を有効成分とする蛋白修飾物生成抑制剤の発明を完成した（特願２００３−０７６９５５号明細書）。

本発明者らは、その後さらに研究を続け、上記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの１位フェニル基および３位メチル基を他の置換基に変化させた類縁体についても同様の活性を有することを見出したが、同時に、それら３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンやその類縁体は、これを生体に投与した場合、ビタミンＢ６欠乏症を起こすことが判明した。そこで、この欠陥を克服すべくさらに研究を進めたところ、そのようなビタミンＢ６欠乏症は、血中に存在するビタミンＢ６分子が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンやその類縁体の基本骨格である２−ピラゾリン−５−オン環によって捕捉されることに基因するものであることが明らかとなった。そして、そのような捕捉が、当該２−ピラゾリン−５−オン環の４位メチレン基に対してビタミンＢ６分子が結合することによるものであることも明らかとなった。

本発明は、このような解明事実に基づいて完成されたものであって、その目的とするところは、蛋白修飾物生成抑制剤として有用な３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンやその類縁体について、不可避の副作用であるビタミンＢ６欠乏症を抑制することにあり、この目的は、本発明により、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンやその類縁体に対し、その４位メチレン基にビタミンＢ６分子が結合することを妨害する置換基を導入することにより達成された。

ただし、４位メチレン基に導入された置換基は、その種類により必ずしも安定に存在するとは限らない。たとえば、４位メチレン基にピリドキサール残基を導入する目的で、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンにピリドキサールを反応させたところ、現実に得られるものは、４−（３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン）−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンではなく、１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールである。

これは次式に示すように、いったん前者が形成された後、分子内転位して後者を生成するものと考えられる：

現時点までの研究によれば、ビタミンＢ６分子の結合を妨害するために４位メチレン基に置換基が導入された化合物は、それが上記のように分子内転位すると否とを問わず、一般に蛋白修飾物生成抑制作用を発揮する。

（発明を実施するための最良の形態）
すなわち、本発明は、蛋白修飾物生成抑制作用を有し、かつ、副作用としてのビタミンＢ６欠乏症が抑制された化合物を有効成分とする、蛋白修飾物生成抑制剤を提供するものである。その技術的範囲には、具体的に、以下の技術的態様が包含される：
（１） 遊離形または塩形の１−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オンの４位に、ビタミンＢ６分子の結合を妨げる置換基（ビタミンＢ６分子自体に由来するものを含む）を導入した化合物またはその分子内転位体を有効成分とする、蛋白修飾物生成抑制剤。
（２） 有効成分である化合物が、遊離形または塩形の式（Ｉ）：

または式（ＩＩ）：

［式中、Ｒ１は置換または非置換の芳香環基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子または１価の有機基であるか、またはＲ２とＲ３は両者合して縮合環を形成するか、もしくはＲ３とＲ４は両者合して２価の有機基を表す。ただし、Ｒ３とＲ４が共に水素原子であることはない。］
で示される化合物から選択される、上記（１）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（３） Ｒ１で表される芳香環基が、４個を越えることのないヘテロ原子を含むことがある、２０個を越えることのない環構成原子を有する炭素環または異項環の芳香環基であって、３つを越えない置換基を有することがあるものである、上記（２）項記載の蛋白質修飾物生成抑制剤。
（４） Ｒ２、Ｒ３またはＲ４で表される１価の有機基が、それぞれ独立して、炭素数３０個を越えない、鎖状または環状の脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素基であって、３つを越えない置換基を有することのあるものであるか、またはハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、カルボキシ（低級）アルキル基、低級アルコキシカルボニル基、ホルミル基、低級アルカノイル基、低級アルキルアミノ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、低級アルカノイルアミノ基、アリール（低級）アルカノイル基、アリールオキシアミノ基、スルホン酸基または３〜７員ヘテロ環基であって、置換基を有することのあるものである、上記（２）または（３）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（５） Ｒ２とＲ３が両者合して形成する縮合環が、５〜６員炭素飽和環であって、置換基を有することもあるものである、上記（２）または（３）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（６） Ｒ３とＲ４が両者合して形成する２価の有機基が、フェニルメチレン、フェニルアルケニルメチレン、キノリニルメチレン、フラニルメチレン、ジアゾリルメチレン、アミノメチレン、ジ（低級）アルキルアミノメチレン、ピリジルメチレンおよびチオフェニルメチレンから選択されたものであって、置換基を有することもあるものである、上記（２）または（３）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（７） 置換基が、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルコキシ基、低級アルケニルオキシ基、低級アルカノイル基、ハロ（低級）アルキル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、カルボキシ（低級）アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、低級アルカノイルアミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、ヒドロキシスルホニル基、アミノスルホニル基、アリール（低級）アルカノイル基、アリールオキシアミノ基、アリール基、アリール（低級）アルキル基、シクロ（低級）アルキル基、シクロ（低級）アルケニル基、シクロ（低級）アルキル（低級）アルキル基および３〜７員ヘテロ環基から選択されたものである、上記（３）〜（７）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（８） 式（Ｉ）において、Ｒ１がフェニル基、Ｒ２がメチル基、Ｒ３とＲ４が合して３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン基である、上記（２）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（９） 式（ＩＩ）において、Ｒ１がフェニル基、Ｒ２がメチル基、Ｒ３が６−メチル−１，３−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール基である、上記（２）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（１０） 蛋白修飾物が、ＡＧＥｓ、ＡＬＥｓおよびこれらの組合せよりなる群から選択されるものである、上記（１）〜（９）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（１１） 蛋白修飾物がＡＧＥｓである、上記（１０）項記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（１２） ＡＧＥｓがペントシジンである、上記（１１）記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
（１３） 上記（１）〜（１２）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、腎組織保護剤。
（１４） 上記（１）〜（１２）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、腹膜透析液。
（１５） 上記（１）〜（１２）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、血液透析液。
（１６） 上記（１）〜（１２）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を液体試料と接触させる工程を含む、液体試料のカルボニル化合物含有量を低減させる方法。
（１７） 上記（１）〜（１２）項のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を患者の血液または腹膜透析液と接触させる工程を含む、蛋白修飾物の生成抑制方法。
（１８） 蛋白修飾物生成抑制剤として有用な、遊離形または塩形の１−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オンの４位に、ビタミンＢ６分子の結合を妨げる置換基（ビタミンＢ６分子自体に由来するものを含む）を導入することを特徴とする、当該蛋白修飾物生成抑制剤に起因するビタミンＢ６欠乏症を抑制する方法。
（１９） １−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オンが、式（ＩＩＩ）：

［式中、Ｒ１は水素原子または置換または非置換の芳香環基であり、Ｒ２は水素原子または１価の有機基である。］
で表される化合物から選択されるものである、上記（１８）記載の方法。
（２０） ４位に導入される、ビタミンＢ６分子の結合を妨げる置換基が有機基から選択されるものである、上記（１６）項記載の方法。
（２１） 遊離形または塩形の１−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オンの４位に、ビタミンＢ６分子の結合を妨げる置換基（ビタミンＢ６分子自体に由来するものを含む）を導入した化合物またはその分子内転位体。
（２２） 遊離形または塩形の式（Ｉ）：

または式（ＩＩ）：

［式中、Ｒ１は置換または非置換の芳香環基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素原子または１価の有機基であるか、またはＲ２とＲ３は両者合して縮合環を形成するか、もしくはＲ３とＲ４は両者合して２価の有機基を表す。ただし、Ｒ３とＲ４が共に水素原子であることはない。］
で示される化合物。
（２３） 式（Ｉ）において、Ｒ１がフェニル基、Ｒ２がメチル基、Ｒ３とＲ４が合して３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン基である、上記（２２）項記載の化合物。
（２４） 式（ＩＩ）において、Ｒ１がフェニル基、Ｒ２がメチル基、Ｒ３が６−メチル−１，３−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール基である、上記（２２）項記載の化合物。
（２５） 蛋白修飾物生成抑制剤の製造における上記（２１）〜（２４）項のいずれか記載の化合物の使用。
（２６） 蛋白修飾物生成により仲介される疾患の処置方法であって、当該処置を必要としている対象に、治療上有効量の上記（２１）〜（２４）項のいずれか記載の化合物を投与することを含んでなる方法。

ここに「蛋白修飾物」とは、非酵素的条件下にカルボニル化合物と反応することによって生じる蛋白修飾物（たとえばＡＧＥｓ、ＡＬＥｓなど）をいい、特記しない限りＡＧＥｓとＡＬＥｓの両者を含むものとする。蛋白修飾物は、ＡＧＥｓ、ＡＬＥｓまたはこれらの組合せであってもよく、ＡＧＥｓには、たとえばペントシジン、クロスリン、Ｘ１（フルオロリンク）、ピロピリジン、ピラリン、カルボキシメチルリジン、イミダゾロン化合物、カルボキシエチルリジン、ＭＧＯダイマー、ＧＯダイマー、イミダゾリジン、アルグピリミジンなどが含まれ、ＡＬＥｓには、たとえばマロンジアルデヒドリジン、ヒドロキシノネナール修飾物などが含まれる。

「カルボニル化合物」とは、生体由来または非生体由来に関係なく、蛋白修飾の原因となるカルボニル基を有する化合物であればよく、ジカルボニル化合物も含まれる。従って、カルボニル化合物の具体例としては、アラビノース、ＧＯ、ＭＧＯ、３−ＤＧ、グリコールアルデヒド、デヒドロアスコルビン酸、ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、アクロレイン、５−ヒドロキシメチルフルフラール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、レプリン酸、フルフラールなどを挙げることができる。

「ビタミンＢ６欠乏症」とは、ビタミンＢ６の欠乏に基因する諸疾患をいい、口角炎、口内炎、舌炎、口唇炎、急性および慢性湿疹、接触性皮膚炎、末梢神経炎、貧血、リンパ球減少症、神経障害などが例示される。「ビタミンＢ６（分子）」には、ピリドキシン、ピロドキサール、ピリドキサミンや、それらのリン酸エステルが包含される。

「蛋白修飾物生成抑制剤」の有効成分である、遊離形または塩形の１−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オン化合物の４位に、ビタミンＢ６分子の結合を妨げる置換基（ビタミンＢ６分子自体に由来するものを含む）を導入した構造を有する化合物または当該化合物の転位体は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたは／およびｉｎ ｖｉｔｒｏに拘わらず、蛋白修飾物の生成を結果的に抑制することができる。「結果的に抑制する」とは、カルボニル化合物をトラップする作用を有することによるものであってもよく、蛋白修飾物を生成する反応を抑制することによるものであってもよく、最終的に蛋白修飾物の生成を抑制すればよく、その作用機序には限定されない。なお、「抑制剤」または「保護剤」の語には、予防または／および治療のために使用する薬剤が包含される。

本発明にかかる蛋白修飾物生成抑制剤の有効成分として使用される化合物は、前記式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わすことができるものである。

式（Ｉ）または（ＩＩ）において、Ｒ１は、水素原子または置換または非置換の芳香環（異項環を含む。）基を表わす。「芳香環基」には、２０個を越えることのない環構成原子数（そのなかに酸素、硫黄、窒素などのヘテロ原子が存在してもよいが、それらの数が４個を越えることはない）を有するものが包含され、特に環構成炭素原子数６〜１０個を有するアリール（たとえばフェニル、ナフチル）が好ましい。

置換基としては、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルケニルオキシ、低級アルカノイル、ハロ（低級）アルキル、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、カルボキシ（低級）アルキル、ハロ（たとえば塩素、臭素、ヨウ素、フッ素）、ニトロ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級）アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、ヒドロキシ、チオール、ヒドロキシスルホニル、アミノスルホニル、アリール（低級）アルカノイル、アリールオキシアミノ、アリール、アリール（低級）アルキル、シクロ（低級）アルキル、シクロ（低級）アルケニル、シクロ（低級）アルキル（低級）アルキル、３〜７員ヘテロ環（たとえばオキサジアゾリル、チアジアゾリル）などの中から１種またはそれ以上が選択されてよい。置換基の数に制限はないが、通常、３個を越えることはない。

Ｒ１で表される置換または非置換の芳香環基の具体例を挙げると、次のとおりである：フェニル、ナフチル、ｏ−，ｍ−またはｐ−低級アルキルフェニル（たとえばｏ−メチルフェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−エチルフェニル）、ｏ−，ｍ−またはｐ−低級アルコキシフェニル（たとえばｏ−，ｍ−またはｐ−メトキシフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−エトキシフェニル）、ｏ−，ｍ−またはｐ−アミノフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−ニトロフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−ハロフェニル（たとえばｏ−，ｍ−またはｐ−クロロフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−フルオロフェニル）、ｏ−，ｍ−またはｐ−ハロ（低級）アルキルフェニル（たとえばｏ−，ｍ−またはｐ−トリフルオロメチルフェニル）、ｏ−，ｍ−またはｐ−スルファモイルフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−カルボキシフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−低級アルコキシカルボニルフェニル（たとえばｏ−，ｍ−またはｐ−メトキシカルボニルフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−エトキシカルボニルフェニル、ｏ−，ｍ−またはｐ−イソプロポキシカルボニルフェニル）、ｏ−，ｍ−またはｐ−低級アルカノイルフェニル（たとえばｏ−，ｍ−またはｐ−アセチルフェニル）、ジ（低級）アルキルフェニル（たとえば３，４−ジメチルフェニル）、ジヒドロキシフェニル（たとえば２，４−ジヒドロキシフェニル）、２−アミノ−４−カルボキシフェニル、３−アミノ−５−カルボキシフェニル、３−低級アルコキシ−４−ヒドロキシフェニル（たとえば３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）、３−カルボキシ−４−ハロフェニル（たとえば３−カルボキシ−４−クロロフェニル）など。

Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子または１価の有機基を表わす。「１価の有機基」には、置換または非置換の炭化水素基、ハロ基、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、カルボキシ（低級）アルキル基、低級アルコキシカルボニル基、ホルミル基、低級アルカノイル基、低級アルキルアミノ基、ジ（低級）アルキルアミノ基、低級アルカノイルアミノ基、アリール（低級）アルカノイル基、アリールオキシアミノ基、スルホン酸基、３〜７員ヘテロ環基などが包含される。「炭化水素基」には、炭素数３０個を越えない（好ましくは８個を越えない）鎖状または環状の、脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素基が包含され、具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基などが例示される。「３〜７員ヘテロ環基」は、環構成原子として３個を越えないヘテロ原子を含むものであり、たとえばピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、チアモルホリノなどが挙げられる。置換基の種類と数は、Ｒ１について説明したのと同様である。ただし、Ｒ３とＲ４が共に水素原子であることはない。

また、Ｒ２とＲ３は、両者合して縮合環を形成することができる。当該縮合環は、５または６員飽和炭素環（すなわち、Ｒ２＋Ｒ３＝トリメチレンまたはテトラメチレン）が好ましく、置換基が存在していてもよい。なおまた、Ｒ３とＲ４は、両者合して２価の有機基を表わすことができる。当該２価の有機基としては、たとえばメチレンタイプのものとスピロタイプのものを挙げることができる。メチレンタイプのものとしては、フェニルメチレン、フェニルアルケニルメチレン、キノリニルメチレン、フラニルメチレン、ジアゾリルメチレン、アミノメチレン、ジ（低級）アルキルアミノメチレン、ピリジルメチレン、チオフェニルメチレンなどが例示され、それらは、適宜、置換基を有していてもよい。これら縮合環や２価の有機基に存在しうる置換基の種類と数は、Ｒ１の場合と同様であってよい。

なお、上記において、アルキル、アルコキシ、アルカノイルなどの語に関連して使用された「低級」なる言葉は、通常、炭素数８個まで、好ましくは炭素数５個までの基を指称するものとして使用される。

本発明の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の具体例を挙げれば、次のとおりである：
１． ２−（３−アミノ−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−オキソ−Ｎ−フェニル−アセトアミド；
２． ２−（３−アミノ５−オキソ−１−フェニル−４，５−ヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−オキソ−Ｎ−チアゾール−２−イル−アセトアミド；
３． ２−（３−アミノ−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−オキソ−アセトアミド；
４． ２−（３−アミノ−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−Ｎ−（３，４−ジメチル−フェニル）−４−オキソ−ブチルアミド；
５． ２−（４−アミノ−フェニル）−４−（２−ヒドロキシ−エチル）−５−メチル−２，４−ヒドロ−ピラゾール−３−オン；

６． ５−アミノ−２−フェニル−４−（１−フェニル−１Ｈ−テトラゾール−５−イルスルファニル）−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
７． ３−（３−メチル−５−オキソ−１−ペニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−プロピオン酸；
８． Ｎ−（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−アセトアミド；
９． ４−［（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈピラゾール−４−イル）−フェニル−メチル］−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
１０． ２−フェニル−３ａ，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−シクロペンタピラゾール−３−オン；

１１． ４−メチル−Ｎ−（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ベンゼンスルホンアミド；
１２． Ｎ−（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−アセトアミド；
１３． ５−メチル−２−（３−ニトロ−フェニル）−４−（１−フェニル−１Ｈ−テトラゾール−５−イルスルファニル）−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
１４． Ｎ−［５−オキソ−１−フェニル−４−（１−フェニル−１Ｈ−テトラゾール−５−イルスルファニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］−ベンズアミド；
１５． ４−（ヒドロキシ−フェニル−メチル）−２−フェニル−５−トリフルオロメチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；

１６． ４−（１−ヒドロキシイミノ−エチル）−２，５−ジフェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
１７． ５，５’−ジメチル−２，２’−ジフェニル−２，４，２’，４’−テトラヒドロ−［４，４’］ビピラゾール−３，３’−ジオン；
１８． ２−（４−クロロ−フェニル）−４−エチル−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
１９． ４−［４−（４−メトキシ−フェニル）−チアゾール−２−イルスルファニル］−５−メチル−５−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
２０． ４−（２−オキソ−２−フェニル−エチル）−２−フェニル−５−プロピル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；

２１． ５−メチル−２−フェニル−４−（４−ｐ−トルイル−チアゾール−２−イルスルファニル）−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
２２． ２−（４−フルオロ−フェニル）−４−［［１−（４−フルオロ−フェニル）−５−ヒドロキシ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（２−ヒドロキシ−フェニル）−メチル］−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
２３． Ｎ−（３，４−ジメチル−フェニル）−２−（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２−オキソ−アセトアミド；
２４． ５−（４−クロロ−ベンゾイル）−４，４−ジヒドロキシ−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
２５． ソジウム；４−ヒドロキシ−３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−スルホン酸ナトリウム；

２６． ５−メチル−４，４−ジ−モルホリン−４−イル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
２７． ３−ベンゾイルアミノ−４−ヒドロキシ−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−スルホン酸ナトリウム；
２８． ３−メチル−１−フェニル−５−オキソ−４−スピロ（３オキソ−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール；
２９． ４，４，５−トリメチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
３０． ４，１０−ジメチル−２，８，１１−トリフェニル−２，３，８，９−テトラザ−ジスピロ［４．０．４．１］ウンデカ−３，９−ジエン−１，７−ジオン；

３１． ２−（２−クロロ−フェニル）−４−（３−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
３２． ２−（２−クロロ−フェニル）−４−（４−ジメチルアミノ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
３３． ５−メチル−４−（３−フェニル−アリリデン）−２−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
３４． ３−｛５−［３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイル−フェニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝−安息香酸；
３５． ４−（４−ヂメチルアミノ−ベンジリデン）−２−（３−フルオロ−フェニル）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；

３６． ３−｛４−［４−（３−クロロ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル）−ベンジリデン］−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル｝−安息香酸；
３７． ３−［４−（２−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−オキソ−３−フェニル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；
３８． ３−［１−（３−クロロ−フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデンメチル］−１Ｈ−キノリン−２−オン；
３９． ３−｛５−［３−メチル−５−オキソ−１−（４−スルファモイル−フェニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデンメチル］−フラン−２−イル｝−安息香酸メチル；
４０． ４−（４−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルメチレン−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル）−安息香酸メチル；

４１． ４−｛３−メチル−５−オキソ−４−［５−（４−スルファモイル−フェニル）−フラン−２−イルメチレン］−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル｝−安息香酸メチル；
４２． ２−（４−クロロ−フェニル）−４−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
４３． ２−（４−クロロ−フェニル）−４−（３−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロピラゾール−３−オン；
４４． ４−（３，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２−ｐ−トルイル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
４５． ３−［１−（４−アセチル−フェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデン］−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン；

４６． ２−（４−フルオロ−フェニル）−４−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−ｏ−トルイル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
４７． ２−（４−クロロ−フェニル）−４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンジリデン）−５−トリフルオロメチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
４８． ２−（４−エチル−フェニル）−４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
４９． ４−［４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−ベンゼンスルホンアミド；
５０． ４−（５−オキソ−４−チオフェン−２−イルメチレン−３−トリフルオロメチル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル）−安息香酸エチル；

５１． ４−［４−（４−ジメチルアミノ−ベンジリデン）−５−オキソ−３−トリフルオロメチル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−ベンゼンスルホンアミド；
５２． ４−イソプロピリデン−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
５３． ４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−２−フェニル−５−トリフルオロメチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
５４． ４−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）−２−（３，４−ジメチル−フェニル）−５−メチル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
５５． ３−［４−（３−エトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；

５６． ４−［４−（３，５−ジ− ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；
５７． ３−［３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；
５８． ３−［３−ヒドロキシ−４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンジリデン）−５−オキソ−ピラゾリジン−１−イル］−安息香酸；
５９． ４−（３−ヒドロキシ−２，４−ジメトキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
６０． ４−［４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−ピラゾリジン−１−イル］−安息香酸イソプロピル；

６１． ２−クロロ−５−［４−（２−クロロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；
６２． ４−［４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸エチル；
６３． ４−［４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−オキソ−３−トリフルオロメチル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸エチル；
６４． ４−［４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−安息香酸；
６５． ４−ジメチルアミノメチレン−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒトロ−ピラゾール−３−オン；

６６． ４−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチレン）−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
６７． ４−（４−クロロ−ベンジリデン）−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
６８． １−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール；
６９． １−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール（塩酸塩）；
７０． ４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；

７１． ２−（３−クロロ−フェニル）−４−（４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２，４−ジヒドロピラゾール−３−オン；
７２． ４−（４−ベンジルオキシ−ベンジリデン）−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロピラゾール−３−オン；
７３． ２−（３−クロロ−フェニル）−５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジオン ４−オキシム；
７４． ５−（５−オキソ−１，３−ジフェニル−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデン）−４−フェニル−４，５−ジヒドロ−［１，３，４］チアゾール−２−カルボン酸エチル；
７５． ４−［１，３］ジチオラン−２−イリデン−５−メチル−２−フェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；

７６． ５−（４−クロロ−フェニルスルファニルメチル）−２−フェニル−４−［Ｎ’−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ヒドラジノ］−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
７７． ４−（５−ベンゾイル−３−フェニル−３Ｈ−［１，３，４］チアジアゾール−２−イリデン）−２，５−ジフェニル−２，４−ジヒドロ−ピラゾール−３−オン；
７８． フォスフォリックアシッド モノ−［５−ヒドロキシ−６−メチル−４−（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−１，５−ジヒドロ−ピラゾール−４−イリデンメチル）−ピリジン−３−イルメチル］エステルなど。

上記本発明目的化合物（Ｉ）を製造するには、一般に、次式で表わされる１−置換または非置換−３−置換または非置換−２−ピラゾリン−５−オン（ＩＩＩ）を、４位に導入すべき置換基の種類に応じて、適宜、自体公知の化学反応に付すればよい：

［式中、Ｒ１は水素原子または置換または非置換の芳香環基であり、Ｒ２は水素原子または１価の有機基である。］。

たとえば、化合物（ＩＩＩ）と式：Ｒ３−ＣＨＯ（ＩＶ）で示されるアルデヒドとを反応させることによって、化合物（Ｉ）を製造することができる。また、化合物（Ｉ）は、分子内転位を生じさせ、化合物（ＩＩ）として取得することも可能である。通常、化合物（ＩＩＩ）とアルデヒド（ＩＶ）を、水性媒体中、アルカリ条件下、または有機溶媒（たとえばテトラヒドロフラン、ジオキサン）中、有機または無機塩基の存在下、−２０〜１００℃で処理することによって実施することができる。

出発物質である化合物（ＩＩＩ）は、それ自体、公知であるか、または、自体常套の化学反応を利用して製造することができる。たとえば、化合物（ＩＩＩ）におけるＲ１がフェニル、Ｒ２がメチルである３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは、一般名をエダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）と称し、フリーラジカル消去作用を有しており、脳機能正常化剤（特公平５−３１５２３号公報）、過酸化脂質生成抑制剤（特公平５−３５１２８号公報）、抗潰瘍剤（特許第２９０６５１２号公報）、血糖上昇抑制剤（特許第２９０６５１３号公報）などの薬剤として有用であることが知られている。ただし、エダラボンが、カルボニル化合物をトラップし、カルボニルストレス状態を改善して、カルボニルストレス下で発生する種々の病態の予防または治療に有効であること、すなわち蛋白修飾物生成抑制剤としての有用であることは、特願２００３−０７６９５５号明細書で開示される以前には、知られていなかった。

上記したとおり、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、生体内において、副作用としてのビタミンＢ６欠乏症を示すことなく、それ自体で蛋白修飾物生成抑制作用を示すものである。この事実は、次の試験によって確認することができる：

（Ａ）化合物（Ｉ）がそれ自体で蛋白修飾物生成抑制作用を示す事実を証明する試験：−
（１）代表的なＡＧＥｓであるペントシジンを指標として、非糖尿病の腎不全透析患者から血漿を採取し、本発明の化合物を添加し、一定時間後のペントシジン生成量を測定した。
（２）フェニルアラニンは、ヒドロキシラジカル存在下でＯＨラジカルと結合し、ｏ−またはｍ−チロシンを生成する。さらに、チロシンは、パーオキシナイトライト存在下でＮＯラジカルと反応してニトロチロシンを生成する。一方、ラジカルは生体内で腎に障害を与えることが知られている。そこで、フェニルアラニン−ラジカル反応系における本発明の化合物のラジカル捕捉能を検証した。

（Ｂ）化合物（Ｉ）がビタミンＢ６欠乏症を惹起しないことを証明する試験：
（１）ビタミンＢ６溶液に本発明の化合物を加え、一定時間後のビタミンＢ６残存量を測定した。
（２）正常ラットに本発明の化合物を投与し、一定期間後のビタミンＢ６欠乏症発症の有無を確認した。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を有効成分として含有する本発明の蛋白修飾物生成抑制剤は、以下に例示する病態の予防および／または治療に有用である：腎障害、糖尿病合併症（腎症、神経障害、網膜症、白内障など）、動脈硬化、透析合併症である透析アミロイドーシス、腹膜透析患者における腹膜硬化症、中枢神経疾患であるアルツハイマー病、ピック病およびパーキンソン病、リウマチ性関節炎、日光弾性線維症、老化など。当該抑制剤は、特に腎障害、予防および／または治療するのに有用である。

予防剤または治療剤として用いる場合、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を、そのままあるいは水に希釈する等の各種処理を施して使用することができ、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。この場合の配合量は、病態や製品に応じて適宜選択されるが、通常全身投与製剤の場合には、０．００１〜５０重量％、特に０．０１〜１０重量％とすることができ、０．００１重量％より少ないと満足する予防または治療作用が認められない可能性があり、また、５重量％を越えると製品そのものの安定性や香味等の特性が損なわれる可能性があるので好ましくない。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、遊離形または塩形で製剤中に含有されてよい。塩形としては、通常、薬剤学的に許容されているもの、たとえば無機塩基や有機塩基との塩、無機酸、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸などの酸付加塩などが挙げられる。無機塩基との塩としては、たとえばアルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩としては、たとえば第１級アミン（エタノールアミンなど）、第２級アミン（ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなど）、第３級アミン（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミンなど）との塩が挙げられる。

無機酸との塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が例示され、有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が例示される。さらに、塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が例示され、酸性アミノ酸との塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が例示される。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、必要に応じて、アミノグアニジン、ピリドキサミン誘導体、ＯＰＢ−９１９５、ビグアナイド化合物、架橋形成阻害薬、アマドリ化合物を分解する酵素、ＧＳＨ、システイン、アセチルシステイン、ビタミンＥ、ユビキノール、アルドース還元酵素阻害薬、カルボニル化合物トラップ剤など、公知の薬物と共に使用されてもよく、これにより蛋白修飾物生成抑制作用の持続性を高めることができる。また、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を失活化または分解する物質を同定し、これを阻害する物質を選択し、これを併用あるいは配合し、組成物中の有効成分の安定化を図ることができる。

本発明の薬剤の投与方法として、経口投与や静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与などが適宜選択でき、その投与方法に応じて、種々の製剤として用いることができる。以下に、各製剤について記載するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種製剤として用いることができる。

蛋白修飾物が関与する病態に対する予防薬または治療薬として用いる場合には、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の経口投与量は、一般的に０．０３ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。全身投与を行う場合、特に静脈内投与の場合には老若男女または体型等により変動があるが、通常、有効血中濃度が０．２μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲となるように投与する。

経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などがあり、適宜選択することができる。また、口腔内局所投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤などがあり、適宜選択することができる。なお、上記製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施してもよい。

上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書に言うＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠など）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤、胃溶性製剤などのような、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用などを勘案して、最適の製剤形態にした製剤をいう。

ＤＤＳの構成要素には、基本的に薬物、薬物放出モジュール、被包体および治療プログラムが含まれ、各々の構成要素について、特に放出を停止させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、投与部位の生体組織と反応しない被包体が好ましく、さらに、設定された期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが好ましい。薬物放出モジュールは、基本的に薬物貯蔵庫、放出制御部、エネルギー源および放出孔または放出表面を有している。これら基本的構成要素は全て揃っている必要はなく、適宜追加あるいは削除等を行い、最良の形態を選択することができる。

ＤＤＳに使用できる材料としては、高分子、シクロデキストリン誘導体、レシチンなどがある。高分子には不溶性高分子（シリコーン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン・ビニルアルコール共重合体、エチルセルロース、セルロースアセテートなど）、水溶性高分子およびヒドロキシルゲル形成高分子（ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート架橋体、ポリアクリル架橋体、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、水溶性セルロース誘導体、架橋ポロキサマー、キチン、キトサンなど）、徐溶解性高分子（エチルセルロース、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルなど）、胃溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリビニルピロリドン、メタアクリル酸ジメチルアミノエチル・メタアクリル酸メチルコポリマーなど）、腸溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、アクリル酸系ポリマーなど）、生分解性高分子（熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリシアノアクリレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリβヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトンなど）があり、剤型によって適宜選択することができる。

特に、シリコン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体およびメチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、セルロースアセテートは浸透圧ポンプの材料として使用でき、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびメチルセルロースは、徐放性製剤の膜素材として使用でき、ポリアクリル架橋体は口腔粘膜あるいは眼粘膜付着剤として使用できる。

また、製剤中には、その剤形（経口投与剤、注射剤、座剤など）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤など適宜の添加剤を配合して製造することができる。これら各添加剤について、以下にそれぞれの具体例を挙げるが、これらに特に限定されるものではない。

溶剤としては、精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリンなどを挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトールなどを挙げることができる。コーティング剤としては、白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロースおよび上記記載した高分子などを挙げることができる。基剤としては、ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤などを挙げることができる。

結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴムなどの天然高分子化合物、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチなどを挙げることができる。滑沢剤としては、ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、小麦デンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロースなどを挙げることができる。

溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。懸濁化剤としては、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤などが挙げられる。粘稠剤としては、カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。乳化剤としては、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチンなどが挙げられる。

安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質などがある。緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸などがある。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などがある。無痛化剤としては、塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコールなどがある。保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサールなどがある。矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリンなどがある。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油などがある。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素などがある。

上記したように、医薬品を徐放化製剤、腸溶性製剤または薬物放出制御製剤のようなＤＤＳ製剤化することにより、薬物の有効血中濃度の持続化、バイオアベイラビリティーの向上などの効果が期待できる。しかし、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は生体内で失活化または分解され、その結果、所望の効果が低下または消失する可能性がある。従って、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を失活化または分解する物質を阻害する物質を本発明の蛋白修飾物に関与する病態の予防または治療組成物と併用することにより、成分の効果をさらに持続化させ得る。これらは製剤中に配合してもよく、または別々に投与してもよい。当業者は適切に、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を失活化または分解する物質を同定し、これを阻害する物質を選択し、配合あるいは併用することができる。

製剤中には、上記以外の添加物として通常の組成物に使用されている成分を用いることができ、これらの成分の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、また、腹膜透析や血液透析における蛋白修飾物質による障害を抑制するために使用することができる。すなわち、蛋白修飾物生成抑制剤としての化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を、常套の腹膜透析液や血液透析液中に配合すればよい。

本発明による液体試料中のカルボニル化合物含有量を低減させる方法は、蛋白修飾物生成抑制剤としての化合物（Ｉ）または（ＩＩ）と当該液体試料とを接触させる工程を含むものである。

また、本発明の蛋白修飾物の生成抑制方法は、蛋白修飾物生成抑制剤としての化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を、患者血液または腹膜透析液と接触させる工程を含むものである。透析における蛋白修飾物としては、腹膜透析または血液透析を受ける患者に由来するカルボニル化合物により生成される蛋白修飾物および腹膜透析液または血液透析液自体に由来するカルボニル化合物により生成される蛋白修飾物などが含まれる。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を添加する腹膜透析液または血液透析液の組成は、公知のものでよい。一般的な腹膜透析液は、浸透圧調節剤（グルコースなど）、緩衝剤（乳酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、炭酸水素ナトリウムなど）、無機塩類（ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩素イオンなど）などで構成されている。化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を添加した腹膜透析液または血液透析液は、そのまま密封して加熱滅菌することができる。そうすることによって、加熱滅菌処理時または保存時に伴う、これら主成分からの蛋白修飾物の生成を抑制することができる。

また、第一室および第二室からなる分画された容器に腹膜透析などの液を収容し、第一室に還元糖を収容し、第二室に化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を収容し、使用直前に混合しても良い。アミノ酸が含まれる場合には、当業者は適宜第三室を設ける等、最良の形態をとることができる。

腹腔内または血管内に投与された後は、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）が蛋白修飾物の生成を抑制するため、腹膜硬化のような副作用を軽減できる。さらに、その他の病態（糖尿病合併症など）の予防・治療にも効果を発揮することが期待できる。透析液には、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の他に、公知のアミノグアニジンなどの薬物を混合して用いることができる。また、粉末型透析剤にも応用可能である。

適当な混注用コネクターを装備した透析回路に、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を注入することもできる。また、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を直接腹腔内に注入して、腹腔内で腹膜透析液と混合することもできる。また、腹膜透析液を患者へ注入する前、または腹腔内貯留中に、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を静脈内注射することにより、蛋白修飾物の生成を効果的に抑制することもできる。

透析液などは、適当な密閉容器に充填し、滅菌処理する。滅菌処理には高圧蒸気滅菌や熱水滅菌などの加熱滅菌が有効である。この場合、高温で有害物質を溶出せず、滅菌後も輸送に耐える強度を備えた容器を用いる。具体的には、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、エチレン酢酸ビニル共重合体などからなる可撓性プラスチックバッグが挙げられる。また、外気の影響による液の劣化を避けるために、透析液等を充填した容器をさらにガスバリアー性の高い包装材で包装しても良い。

高圧加熱滅菌を含む加熱滅菌により滅菌処理を行う場合、用いられる化合物（Ｉ）または（ＩＩ）が加熱などの処理に対して十分安定であるならば、透析液配合時に化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を予め添加してから、加熱滅菌操作を行うこともできる。用いる化合物（Ｉ）または（ＩＩ）が加熱滅菌に安定でない場合は、加熱を要しない滅菌法を用いることもできる。この様な滅菌法には、たとえば濾過滅菌などがある。

たとえば、孔径０．２μｍ程度のメンブランフィルターを備えた精密濾過器を用いて濾過することにより滅菌することができる。濾過滅菌された透析液は、可撓性プラスチックバックなどの容器に充填された後、密封される。また、予め加熱滅菌した腹膜透析液などに、後で化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を添加しても良い。

添加する時期は特に限定されない。液を滅菌後あるいは滅菌前に化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を添加しても良いし、透析直前または同時に添加しても良いし、透析液を注した後に直接腹膜に注入しても良い。

本発明の腹膜透析液は、現行の腹膜透析液や血液透析液と同様の透析処理に利用される。すなわち、腹膜透析の場合にあっては、透析患者の腹腔内に本発明による腹膜透析液を適量注入し、腹膜を通過して生体内の低分子量成分を腹膜透析液内に移行させる。腹膜透析液は間欠的に循環させ、患者の症状に応じて透析を継続する。このとき、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は透析液内または生体内での蛋白修飾物の生成を抑制する。クレアチニンや無機塩類、あるいは塩素イオン等の透析成分とともに、カルボニル化合物も血中や腹膜内から腹膜透析液中へ移行する。ゆえに、蛋白修飾物による生体への悪影響が減少される。

化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、透析液のみに使用できるのではなく、栄養輸液、電解質輸液、経腸・経管栄養剤など、あらゆる液剤に利用できる。

本発明の化合物は、注射剤としても治療に有用に用いることが出来るが、本発明化合物の中には、溶液状態にすると直ちに分解が始まり、１２時間（２５℃）後には４０％程度が分解してしまう化合物が含まれる。本発明者らは、これに鑑み鋭意検討した結果、安定な状態で投薬できる本発明化合物含有注射剤を見いだした。したがって、本発明により、安定な状態で投薬できる本発明含有注射剤も提供される。

本発明により、効果的にＡＧＥｓ、ＡＬＥｓ等の蛋白修飾物の生成を抑制する蛋白修飾物生成抑制剤が提供される。特に、腎障害、腎症、神経障害、網膜症、白内障等の糖尿病合併症、動脈硬化、透析合併症である透析アミロイドーシス、腹膜透析患者における腹膜硬化症、中枢神経疾患であるアルツハイマー病、ピック病、パーキンソン病、リウマチ性関節炎、日光弾性線維症、老化等に対して、予防および／または治療用の薬剤が、本発明により提供され得る。特に、腎障害、糖尿病合併症である糖尿病性腎症において血圧降下剤の腎保護薬としての適応があるが、本発明により血圧降下作用を薬理作用として持たない、多くの患者に幅広く使用出来る腎保護薬が提供され得る。さらに、本発明の化合物が小胞体ストレス（ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ）を抑制する点からも、本発明の化合物が糖尿病、パーキンソン病、関節リウマチなどの疾患の処置に使用できることが示される。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［製造例１］１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールの製造

０．１Ｍ ＮａＯＨ（１００ｍＬ）に３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（１．７４ｇ）（以下、エダラボンという）を室温で撹拌しながら溶解した液に、水（１００ｍＬ）にピリドキサール塩酸塩（２．４４ｇ）を溶解した液を撹拌しながら滴下して加え、反応させた。滴下終了後、約３０分間撹拌し、白色沈殿の析出が終了したと思われる時点を反応終了点とし、４℃の低温室にて放冷して、沈殿物を充分に析出させた。該反応液を一夜放冷後、析出した白色沈殿物を濾取し、１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールの粗生成物（ｗｅｔ）を（２３．７ｇ）得た。

該粗生成物をメタノール（５０ｍＬ）に懸濁させ、５０℃で超音波撹拌器中６０分間撹拌した後、溶け残った不溶物を濾過して取り除き、濾液を約１０ｍＬに濃縮後、４℃の低温室に一夜放冷して結晶を析出させた。析出した結晶を濾取し、真空デシケーター中、遮光下に乾燥して１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールの純粋な結晶（０．２２ｇ）を得た。収率：６．８％。外観性状：結晶性粉末、淡黄白色。融点：２０７−２０９℃（褐変溶融）。

［製造例２］１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール塩酸塩の製造

０．５００６ｇの１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１−Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールを１５０ｍＬのメタノールに溶解し、２Ｎ塩酸メタノール１．６５ｍＬを加えてよく撹拌した。該溶解液を約２０ｍＬ程度に濃縮し、結晶が析出し始めた時点で、結晶溶媒を置換するため、５０ｍＬのエタノールを加えて濃縮し、この操作を２回繰り返してから、約５ｍＬまで濃縮した。この濃縮液を一夜低温室（４℃）に放置し、析出した結晶を濾取し、真空デシケーター中で乾燥して、１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１−Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オールの一塩酸塩（０．５０１１ｇ）を得た。収率９０．０％。外観性状：結晶性粉末、淡黄白色。融点：２４７−２４９℃（褐変溶融）。

［試験例１］ペントシジン生成抑制効果
１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール（以下、「ＴＭ−２００２」という。）について、代表的なＡＧＥｓであるペントシジンの生成抑制効果を調べた。

血液透析患者の透析前の血漿を同意の下に透析前に採取し、濾過滅菌した。血漿（４５０μＬ）にＴＭ−２００２のジメチルスルホキシド溶液（５０μＬ）を加え（最終濃度：０．８、２．０、５．０ｍＭ）、３７℃で１週間インキュベートし、ペントシジンの生成量を測定した。

ペントシジンの測定は、以下のようにして行った。インキュベーション後の各試料（５０μＬ）に、等容積の１０％トリクロロ酢酸を加えた後、５０００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去後、ペレットを５％トリクロロ酢酸（３００μＬ）で洗浄した。ペレットを減圧下乾燥後、窒素雰囲気下で６Ｎ ＨＣｌ溶液（１００μＬ）中にて、１１０℃で１６時間加水分解を行った。次いで酸加水分解物に５Ｎ ＮａＯＨ（１００μＬ）および０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（２００μＬ）を添加した後、０．５μｍ孔のポアフィルタを通して濾過し、ＰＢＳで希釈した。遊離したペントシジンの濃度は、蛍光検出器（ＲＦ−１０Ａ、島津製作所）を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて測定した（Ｍｉｙａｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．９３， ｐ．２３５３−２３５８， １９９６）。流出液を３３５／３８５ｎｍの励起／発光波長でモニターした。合成ペントシジンを標準物質として使用した。ペントシジンの検出限界は、０．１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。

抑制効果は、化合物ＴＭ−２００２と同様にして反応させた陽性対照（ピリドキサミン（シグマ））と比較することにより評価した。なお、アミノグアニジン、オルメサルタン、エダラボンについても、同様に抑制効果を調べた。結果（ペントシジン量ｎｍｏｌ／ｍｌ）を、図１（図中、対照とあるのは、溶媒のみを使用した陰性対照を意味する。以下、同じ。）に示す。この結果から、ＴＭ−２００２が陽性対照のピリドキサミンに比較して有意にペントシジンの生成を抑制することが理解される。

［試験例２］ヒドロキシラジカルによるフェニルアラニンのヒドロキシル化反応抑制効果
フェニルアラニン（最終濃度：１ｍＭ）、ＴＭ−２００２（最終濃度：０．１、０．５、２．５ｍＭ）、過酸化水素（最終濃度：５ｍＭ）、硫酸銅（最終濃度：０．１ｍＭ）を２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解し（全量５００μＬ）、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＤＴＰＡ（最終濃度：１ｍＭ）、２６０ ｕｎｉｔのカタラーゼを添加して反応を停止させた。ｏ−チロシンおよびｍ−チロシンの生成量をＨＰＬＣで分析した。

すなわち、一定時間後、反応液を１００倍希釈し２０μＬをＨＰＬＣにインジェクトし、Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ：野村化学製）で分離後、励起波長２７５ｎｍ、蛍光波長３０５ｎｍの条件で蛍光検出器（ＲＦ−１０Ａ：島津製）を用いて検出した。移動相は、０．６ｍＬ／分の流速で、バッファＢ濃度を６．５％から１０％まで２５分間で変化させた（バッファＡ：０．１０％トリフルオロ酢酸、バッファＢ：０．０８％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル）。結果を、アミノグアニジン、ピリドキサミンおよびオルメサルタンについて得られた結果とともに、図２および３に示す。

［試験例３］パーオキシナイトライトによるチロシンのニトロ化反応の抑制効果
試験は、Ｐａｎｎａｌａ ＡＳらの方法（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２４： ５９４−６０６， １９９８）に準じて実施された。すなわち、チロシン（最終濃度：１００μＭ）、ＴＭ−２００２（最終濃度：０．１、０．５、２．５ｍＭ）、パーオキシナイトライト（同仁化学製）（最終濃度：５００μＭ）を２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解し（液量５００μＬ）、３７℃で１５分間インキュベートさせた。インキュベート終了後、ニトロチロシンの生成量をＨＰＬＣで分析した。すなわち、一定時間後、反応液（２０μＬ）をＨＰＬＣにインジェクトし、Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ：ウォーターズ製）で分離後、紫外検出器（ＲＦ−１０Ａ：島津製）を用い２８０ｎｍの波長で検出した。移動相は、０．６ｍＬ／分の流速で、バッファＢ濃度を５．０％から３０％まで３０分間で変化させた（バッファＡ：０．１０％トリフルオロ酢酸、バッファＢ：０．０８％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル）。４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸（１００μＭ）を内部標準として使用した。結果を、アミノグアニジン、ピリドキサミン、オルメサルタンおよびエダラボンについて得られた結果とともに、図４に示す。

［試験例４］
患者血漿に代え、ＢＳＡとアラビノースとともにインキュベートする以外は、［試験例１］と同様にして、他の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）のペントシジン生成抑制活性を調べた。結果は、表１に示すとおりであった。なお、「−」は、試験を行わなかったことを示す。

［試験例５］バルーン傷害モデルによる検討
血管拡張術後再狭窄モデルであるラット頸動脈バルーン傷害モデルによる、血管内皮肥厚の抑制効果を検討した。
ＴＭ−２００２をカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液（０．５％）で乳鉢を用いて懸濁し、メスシリンダーで１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。
陽性対照としてアミノグアニジン塩酸塩（シグマ）を用い、同様にＣＭＣ水溶液（０．５％）で乳鉢を用いて懸濁し、メスシリンダーで１１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。各調製液は用時調製してディスポーザブル注射筒および経口ゾンデを用いて懸濁させながら強制経口投与した。

溶媒群（ｎ＝１０）は、ＣＭＣ水溶液（０．５％）を４ｍＬ／ｋｇ／回、１日２回経口投与した（８ｍＬ／ｋｇ／ｄａｙ）。ＴＭ−２００２（被試物質）群（ｎ＝１０）は、１−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール塩酸塩を５０ｍｇ／ｋｇ／回、１日２回経口投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。アミノグアニジン群（ｎ＝１０）は、アミノグアニジン塩酸塩を４５ｍｇ／ｋｇ／回、１日２回経口投与した（９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。
投与はバルーン傷害前日から開始し、傷害日を１日目として１４日目までの合計１５日間、１日朝夕２回６時間以上の間隔をあけて投与した（バルーン傷害１５日目に解剖、１５日目の投与は実施しない）。

ラットは、９週齢（バルーン傷害時週齢：１０週齢）のＳＤ系雄性ラット（日本エスエルシー）を用いた。試験動物の入荷時に各動物の健康状態を肉眼的に観察し、異常のない動物を動物室に収容した。入荷時より６日間以上予備飼育した後、一般状態の良好な個体を試験に用いた。ラットを１群１０匹とし、投与開始前の体重をもとに溶媒群、被試物質群、アミノグアニジン群の３群に分けた。

ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）麻酔下でラットの頸部および大腿部を切開し、左頸動脈および大腿動脈を露出する。大腿動脈に切開を加えバルーンカテーテル（２Ｆｒ，フォガティカテーテル；バクスター）を挿入し、先端を左頸動脈の内外頸動脈分岐部まで導く。バルーンカテーテルが確実に頸動脈内にあることを目視で確認し、バルーン内に空気（０．３ｍＬ）を注入してバルーンを膨らます。バルーンを膨らませたまま大動脈弓までバルーンカテーテルを引き抜く。この操作を３回繰り返し血管内膜に傷害を与える。バルーンカテーテル抜去後、大腿動脈を結紮する。切開部を縫合し、傷口はイソジン液を用いて十分に消毒する。なお、右頸動脈には損傷を与えずに各個体の対照として用いる。

試験中は毎日動物の生死及び手術部位の状態について観察を行う。また体重は傷害前日からバルーン傷害１４日目まで１日１回測定する。体重から各個体の投与容量を算出した。

バルーン傷害１５日目にエーテル麻酔下で腹部大静脈から採血を行う。採血後、左頸動脈を摘出して３分割し、各セクションから約５ｍｍを切り取り、右頸動脈を摘出して中央部から約５ｍｍを切り取りそれぞれ１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。ホルマリン固定した頸動脈標本はパラフィンブロックを作製後、薄切しＨＥ染色を行った。画像解析装置（ＶＭ−３０、オリンパス光学）で血管内腔面積、内弾性板で囲まれた面積および外弾性板で囲まれた面積を計測した。

測定した面積をもとに血管の新生内膜面積、中膜面積及び新生内膜／中膜面積比を各切片（３部位）について求めた。各個体で求めた３部位の平均値を用いて内膜肥厚を評価した。結果を図５（Ａ、ＢおよびＣ）に示す。この結果から、ＴＭ−２００２群は、陽性対照であるアミノグアニジン群に匹敵する血管内皮肥厚の抑制効果を示すことが理解される。

［試験例６］ビタミンＢ６との反応性の検討
ビタミンＢ６（ピリドキサール−５’−リン酸）（５０μＭ）とＴＭ−２００２（０．５μＭ）をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、３７℃でインキュベートした。０〜２０時間の間でカイネテイックスを測定するために、残存するピリドキサール−５’−リン酸濃度をＨＰＬＣで分析した。すなわち、一定時間後、１０μＬの反応液をＨＰＬＣにインジェクトし、ＰｕｒｅｃｉｌＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ：ウォーターズ製）で分離後、励起波長３００ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍの条件で蛍光検出器（ＲＦ−１０Ａ：島津製）を用いて検出した。移動相は、０．６ｍｌ／Ｌの流速で、バッファＢ濃度を０％から３％まで２５分間で変化させた（バッファＡ：０．１０％トリフルオロ酢酸、バッファＢ：０．０８％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル）。対照として、ビタミンＢ６捕捉作用が知られているアミノグアニジンを用いた。

２０時間後、ＴＭ−２００２群のピリドキサール−５’−リン酸残存率は９７％であったのに対し、対照のアミノグアニジン群のピリドキサール−５’−リン酸残存率はわずか０．２％であり、ＴＭ−２００２がビタミンＢ６と反応しないことが示された。
なお、他の化合物（Ｉ）および（ＩＩ）もＴＭ−２００２と同様の結果を示した。

［試験例７］ビタミンＢ６欠乏症抑制効果
正常ラット（ＷＫＹラット：日本エスエルシー）にＴＭ−２００２を投与し、ビタミンＢ６欠乏症の有無を検討した。対照として、ビタミンＢ６捕捉作用が知られているアミノグアニジンを用いた。動物数は、各群１０匹とし、カルボキシメチルセルロース（０．５％）に懸濁したＴＭ−２００２またはアミノグアニジンをおのおの１３ｍｇ／ｋｇ／匹／回の量でゾンデにより１日２回強制経口投与した。投与期間は、２０週とした。餌は、一般餌（ＣＲＦ１：オリエンタル酵母）を用いた。

２０週後のＷＫＹラットの形態を観察したところ、ＴＭ−２００２投与群においては、口角炎、口内炎、舌炎、口唇炎、急性および慢性湿疹、接触性皮膚炎、末梢神経炎、貧血、リンパ球減少症、神経障害などのビタミン欠乏に起因する症状はまったく認められず、正常な状態を保っていた。一方、アミノグアニジン投与群では、皮膚炎、癲癇および脳障害による痙攣を認めた。
なお、他の化合物（Ｉ）および（ＩＩ）もＴＭ−２００２と同様の結果を示した。

［試験例８］ＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐラットおよびＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏラットにおける腎保護効果
従来より、高血圧、高血糖、高脂血症、肥満、高インスリン血症を呈することが知られ、週令の増加とともに腎機能に障害を来たすことが知られているＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐ（ＳＨＲ等疾患モデル共同研究会）ラットを用いて、腎保護効果を観察した。
９週令のＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐラットおよびＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏラット（ＳＨＲ等疾患モデル共同研究会）を３週間馴化後、投薬前の体重測定・採血を行った。体重が４４０ｇ±３２ｇの範囲にあるものを群分けして１群５匹とした。群分け後、陰性対照としての賦形剤、陽性対照化合物および被検化合物を２０週間投与した。賦形剤としてはカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａ／和光純薬工業株式会社製）溶液を、また、陽性対照化合物としては腎保護作用が知られているアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗剤の１つであるオルメサルタンを用い、被検化合物であるＴＭ−２００２の効果を確認した。投与量としては、オルメサルタンは体重１ｋｇ当たり３ｍｇとし、被検化合物のＴＭ−２００２は体重１ｋｇ当たり５０ｍｇに設定した。投与する検体については、オルメサルタンは、その必要量を１．０ｍｌの０．５％カルボキシメチルセルロース溶液または蒸留水に懸濁・溶解して調製し、被検化合物のＴＭ−２００２についてはその必要量を１日に与える一定量（３０ｇ）の飼料に混合して調製した。試験動物は体重増加が大きく、毎週行う体重測定に基づいて陽性対照化合物および被検化合物の量を調整した。投与法としては陰性対照投与群においては賦形剤の０．５％カルボキシメチルセルロース溶液を、また、陽性対照化合物投与群においては必要量を調整したオルメサルタンの０．５％カルボキシメチルセルロース溶液をそれぞれ１ｍｌずつゾンデで経口投与し、被検化合物群においてはＴＭ−２００２の必要量を調整した飼料の１日の設定投与量を自由に摂取させた。飼料の摂取量は陰性対照としての賦形剤投与群、陽性対照化合物群、被検化合物群とも１日当たり３０ｇとして全量を摂取させた。投与期間中、体重については毎週測定したが、採血、採尿、および血圧測定の各測定項目については、４週令までは隔週毎に行い、５週令以降は４週毎に行った。採血は動物を３８℃の保温器で温めた後、尾静脈より８００μｌ採血を行った（ヘパリン処理：ヘパリン量は血液１ｍｌに対して１５μｌの割合とする）。採尿は採尿代謝ケージ（日本クレア社製）により行った。採尿時には１日尿量を測定した。血圧測定は非観式血圧測定装置（株式会社ソフトロン社製）を用いて行った。
各採血、採尿サンプルを用い、血液サンプルでは血中グルコ−ス、トリグリセライド、総コレステロ−ル、ヘモグロビンＡ１ｃ、インシュリンの濃度を測定した。また、尿サンプルを用い、尿中の蛋白、クレアチニン、尿素窒素量を測定した。これらの検査は日本ＳＲＬ株式会社に依頼して行った。

該試験での３３週令における腎保護効果に関する結果は、陰性対照の賦形剤投与群は高血圧を呈し、尿蛋白も高値を示し、その値から腎機能障害を起こしていることが示されていた。これに対して陽性対照化合物のオルメサルタンは降圧剤であるため血圧低下が見られ、尿蛋白が抑制され、腎機能の改善が見られた。一方、被検化合物は陰性対照に比較し、血圧低下が見られないにもかかわらず有意に尿蛋白を抑制し、陽性対照のそれよりも抑制効果は強く、優れた腎保護効果を示した。この結果は、高血圧症を伴わない腎疾患における治療や、腎保護作用を有さない降圧剤との併用による腎疾患治療、さらには、腎保護効果を有する降圧剤との併用による相乗効果が期待でき、腎疾患治療薬として有用である。該結果を図７および図８に示す。

［試験例９］Ｔｈｙ−１腎炎モデルラットに対する腎保護作用
本病態モデルはメサンギウム増殖性腎炎を呈する代表的な糸球体腎炎モデルであり、Ｗｉｓｔａｒラット（雄、体重１５０ｇ、６週齢）に抗Ｔｈｙ−１抗体であるＯＸ−７を１．２ｍｇ／ｋｇ尾静脈投与することによって作製する。抗Ｔｈｙ−１抗体を投与した後、被検化合物（ＴＭ−２００２、５０ｍｇ／ｋｇ体重、１日２回）を０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁させゾンデにより５日間連続強制投与、６日目に採材し、腎臓を採取、病理解析（糸球体細胞数のカウント）を行った。具体的には、常法に従いＰＡＳ染色した染色像を３ＣＣＤカメラ（オリンパス）で取り込んだ後、イメ―ジグラヴァＰＣＩ（富士写真フィルム）とマックアスペクト（三谷株式会社）のソフトウエアを使用して糸球体細胞数を解析した。また、血液・尿の生化学的解析（臨床解析受託会社：ＳＲＬ）も行った。その結果、ＴＭ−２００２投与群では蛋白尿の値が改善され、ＢＵＮ値においてはその値が有意（ｐ＜０．０１）に改善されているとともに、障害に伴い増殖する糸球体細胞数も有意差をもって大幅に抑制（ｐ＜０．０００１）され、その腎保護作用が示された。その結果を図８〜図１０に示す。

［試験例１０］虚血再灌流モデルラットに対する腎保護作用
本病態モデルは、代表的な急性腎不全モデルである。作製方法として、Ｗｉｓｔａｒラット（雄、体重１５０ｇ、６週齢）の右腎摘出手術を行い、翌日全身麻酔下に残った左片腎の腎動脈をクリップで結紮する。クリップ後体温が下がらないように加温器の上で４５分間観察（虚血）した後、クリップをはずし再灌流を行う。虚血再還灌流モデル作製後、被検化合物（ＴＭ−２００２、５０ｍｇ／ｋｇ体重、１日２回）を０．５％カルボキシメチルセルロースに懸濁させゾンデにより２日間連続強制投与し、３日目に腎臓を採取し、病理解析（尿細管間質障害のスコアリング）を行った。具体的には、常法に従いＰＡＳ染色した腎染色像の尿細管間質障害は尿細管壊死，尿細管肥大、尿細管萎縮、尿細管基底膜肥厚、ｃａｓｔの有無を評価した。併せて血液の生化学的解析（臨床解析受託会社：ＳＲＬ）も行った。その結果、ＴＭ−２００２投与群では蛋白尿の値およびＢＵＮ値が改善され、また、障害に伴い増殖する糸球体細胞数は有意差をもって大幅に抑制（ｐ＜０．０００１）され、その腎保護作用が示された。その結果を（図１１〜図１３）に示す。

［試験例１１］
中大脳動脈虚血再還流モデルにおける脳保護作用
体重２７０〜３５０ｇのＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ雄性ラット（日本チャルスリバー株式会社 日野生産場２２号室特定生産）（１群８匹）を２％イソフルラン（７０％Ｎ_２Ｏ（笑気ガス）と３０％Ｏ_２の混合ガス）で麻酔して不動化した後に、ヒーティングパット上に置き、動物の直腸温と脳温を３７〜３８℃に保持した。次いで、実験上の安定性を観察するために、該動物の尾動脈にポリエチレン製カニューレ（ＰＥ−５０／ベクトン・ディッキンソン社製）を挿入、留置し、これより採血や血圧測定を行い血糖値、ヘマトクリット、ＣＯ_２濃度、酸素分圧、ｐＨ、血圧等の生化学的パラメーターをモニターした。また、皮質における脳血流量はレイザー・ドップラー・フルオメトリー（ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｉｎｃ社製／製品名：ＯＭＥＧＡ ＦＬＯＷ（ＦＬＯ−Ｃ１））検出部位をブレグマ左４ｍｍの位置に、直接頭蓋にあてて測定した。このように準備された動物左頚部を切開し、総頚動脈の内頚・外頚動脈分岐点から内頚動脈の上流に向け、長さ１６ｍｍ、直径０．２〜０．３ｍｍで先端３ｍｍをシリコンコーティングしたナイロン製外科用スレッドを通したまま留置し、２時間のあいだ中大脳動脈を閉塞した。その後スレッドを抜き取り中大脳動脈を開放し２１時間のあいだ血液を再還流した。対照であるエダラボン（３．０ｍｇ／ｋｇ）および被験薬物であるＴＭ−２００２（５．５８ｍｇ／ｋｇ）を、は中大脳動脈を閉塞後５分後と５時間後に尾動脈に留置したカニューレより２回投与した。上記手技が終了後、動物より脳を摘出し、２ｍｍ厚で７枚の脳切片を調製後、生理食塩水４０ｍｌに２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（シグマ社製）を０．８ｇ溶解した液（ＴＴＣ染色液）に３７℃で１５分間浸漬して染色処理を施した後に１０％の中性ホルマリン液を用いて固定し、標本とした。これらの標本は、それぞれＣＣＤカメラで画像化し、Ｓｗａｎｓｏｎ等の方法（Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １０：２９０−２９３； １９９４）によって解析した。その結果、対照薬剤のエダラボンおよび被検薬剤のＴＭ−２００２は、それぞれ、賦形剤単回投与群と比較して有意差をもって脳梗塞巣を縮小した。結果を図１４および図１５に示す。また、神経状態の評価は施術マウスを水平な台の上におき、横から押して麻痺なく正常に歩ける状態のものをグレード０、横から押して抵抗があり、前にまっすぐ歩けるが、前脚の屈曲を呈するような状態をグレード１、横から押して抵抗がないが、前にまっすぐ歩ける状態のものをグレード２、横から押すと抵抗がなく前にまっすぐ歩けない（回転や転倒する）状態のものをグレード３に分類し、四段階の基準による、Ｂｅｄｅｒｓｏｎらの方法によるグレーディングシステム（Ｓｔｒｏｋｅ １７：４７２−４７６， １９９０）で評価した。更に、機能回復の面では、回転ローター上にマウスを歩かせ、その歩行状態がどの程度可能であるかを評価する方法による、ローターロッド試験を施術前後に行いその評価を行った。その結果、対照薬剤のエダラボンおよび被検薬剤のＴＭ−２００２において、それぞれ、賦形剤単開投与群と比較して有意差をもって神経状態の改善および機能回復が認められた。その結果を表２に示す。

［試験例１２］溶解性の検討試験
ＴＭ−２００２を１ｍｌ中１０ｍｇになるように精製水の中に加え、塩酸を加えてｐＨ２．０に調整して溶解した。次いで、この溶液のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０、ｐＨ８．０およびｐＨ２．０（無調整）に調整し、３溶液を製造した。この溶液を室温冷暗所に置き２４時間後に溶液の状態を観察した。その結果、ｐＨ２．０においては澄明な溶液状態を維持していたが、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０では沈殿物の析出が見られた。特にｐＨ７．０、ｐＨ８．０では色調の変化も見られた。この結果より、ＴＭ−２００２の注射製剤には塩酸、硫酸などの無機酸の他、各種の有機酸を用いて酸性状態を維持するか、該各種酸を用いて作成したＴＭ−２００２塩酸塩、硫酸塩を原料に用いることにより溶解性において安定な製剤を作れることが示唆された。

［試験例１３］安定化剤の検討
通常、疾患治療用薬剤の安定化には各種の安定化剤が用いられ、有効な方法としては抗酸化剤の添加がよく知られている。特に酸化を受けやすい化合物の安定化には酸化還元電位の低い物質を共存させることがよいとされている。そこで、通常注射製剤等に用いられる亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）とＬ−システイン（Ｃ_３Ｈ_７Ｏ_２Ｓ・ＨＣｌ）について、ＴＭ−２００２塩酸塩の水溶液を用いて添加実験を行い、その安定性を検討した。

はじめに亜硫酸水素ナトリウムの添加によるＴＭ−２００２塩酸塩の溶解状態を検討した。実験方法は、精製水と亜硫酸水素ナトリウム０．５ｍｇおよび１ｍｇを溶解した水溶液を各１ｍｌずつ用意した。次いで、これらにＴＭ−２００２塩酸塩を６３ｍｇずつ加え、よく撹拌して溶解した。これらの溶液を室温で放置し、その溶解状態を観察した。その結果、亜硫酸水素ナトリウムの０．５ｍｇおよび１ｍｇを加えた溶液では時間とともに結晶性の沈殿物が析出し、２４時間後には明らかな沈殿物の存在が観測された。これに対して精製水のみに溶かした溶液ではｐＨが２〜２．５を呈し、２４時間後でも溶解状態に変化は見られず、また、ＴＭ−２００２の分解の大幅な抑制も観察された。すなわち、塩酸塩を用いることでＴＭ−２００２自体の安定化は増大する。

上記実験の亜硫酸水素ナトリウムに代えて、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_３）、ピロ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）を用いて同様の実験を行ったが、これらの安定化剤を添加した溶液では全てに結晶性の沈殿物の析出が観察された。
次いで、Ｌ−システイン塩酸塩の添加によるＴＭ−２００２塩酸塩の溶解状態を検討した。実験方法は、Ｌ−システイン塩酸塩１ｍｇおよび２ｍｇを精製水に溶解した水溶液を各１ｍｌずつ用意した。Ｌ−システイン塩酸塩を加えた溶液においてはｐＨを６．５に調整した。次いで、それぞれの溶液にＴＭ−２００２塩酸塩を６３ｍｇずつ加え、よく撹拌して溶解した。これらの溶液を室温で放置し、その溶解状態を観察した。その結果、いずれの溶液にも沈殿物、析出物は見られず、２４時間後でも安定な溶解状態を保った。また、分解性においては薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ／ Ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ ６０Ｆ２５４（メルクジャパン株式会社）／展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１／検出：ＵＶ＝２５４ｎｍ）での観察により、２４時間以上の室温放置で徐々に分解するが、Ｌ−システインの添加により大幅に安定化された。さらに、本溶液を−２０℃に保存すると１週間後でも安定であった。すなわち、本発明により、Ｌ−システインを含有するＴＭ−２００２塩酸塩の溶液を低温で処理し、凍結乾燥することで、ＴＭ−２００２の凍結乾燥製剤が得られる。

ＴＭ−２００２注射用凍結乾燥製剤の調製
Ｌ−システイン塩酸塩１６０ｍｇを精製水８０ｍｌに加えた後、よく撹拌して溶解した。次いで、この溶液のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．７に調整した後、ＴＭ−２００２の塩酸塩を１ｇ加えよく撹拌して溶解した後、メスフラスコで１００ｍｌに定溶した。該調製液は６．３ｍｌずつを５０ｍｌ容積のバイアル瓶に６．３ｍｌずつ分注し、直ちにドライアイスで凍結させた後−８０℃に放置して完全に凍結させた。次いで、これを凍結乾燥機に３日間かけて凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、ゴム蓋をした後、アルミキャップで締機を用いて密封し、ＴＭ−２００２注射用凍結乾燥製剤を得た。

ＴＭ−２００２注射用凍結乾燥製剤の溶解性と安定性
上記調製法により作成したＴＭ−２００２注射用凍結乾燥製剤に、１バイアル当たり２０ｍｌの精製水を加えた。凍結乾燥物は直ちに溶解し、淡黄色の澄明な溶液となった。この溶液１ｍｌに生理食塩水１．５ｍｌを加え、室温に放置した状態で、溶解状態並びに安定性を、溶解の３時間後、６時間後および１０時間後に観察した。成分の変化の有無はＴＬＣ（Ｋｉｅｚｅｌ ｇｅｌ ６０Ｆ２５４／展開溶媒：ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ＝９：１／検出：ＵＶ＝２５４ｎｍ）を用いて行った。その結果、本溶液は、溶解の１０時間後においても沈殿物や結晶、不溶物の析出などはまったく見られず、また、目立った色調の変化も見られなかった。さらに成分の安定性においては、対照としたＴＭ−２００２塩酸塩の水溶液は１０時間目に分解物が観察されるのに対して、本注射用製剤の溶液では分解物は観察されなかった。その薄層クロマトグラフィーによる結果を図１６に示す。また、生理食塩水での希釈率を高めても同様に安定であることも明らかとなった。さらに、該注射用凍結乾燥製剤は３０日間室温に放置したものを同様の溶解法により溶解性、安定性を観察したが、製作直後のものと差異は見られず、用時調製用の注射用凍結乾燥製剤として充分な性能を発揮し、安定かつ実用的である。

［試験例１４］ＴＭ−２００２のｉｎ ｖｉｖｏにおける小胞体ストレス（ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ）軽減作用の評価
従来より、高血圧、高血糖、高脂血症、肥満、高インスリン血症を呈することが知られ、週令の増加とともに腎機能に障害を来たすことが知られているＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐ（ＳＨＲ等疾患モデル共同研究会）ラットの腎組織を用いて、抗ＯＲＰ１５０抗体で免疫染色を行いＴＭ−２００２の小胞体ストレスの軽減作用を評価した。染色に用いた染色切片サンプルは、ＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐラットに、被検化合物ＴＭ−２００２の投与量を体重１ｋｇ当たり１００ｍｇに設定して、その必要量を１日に与える一定量（３０ｇ）の飼料に混合してその全量を摂取させた群と薬剤を投与しない群、また、比較対照に置いたＳＨＲ（高血圧）ラットおよびＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏラットのそれぞれの腎組織を薬剤投与期間終了後（３３週齢）に採材して、全てをカルノア固定した後にパラフィン包埋したものを用いて切片標本を作成した。各サンプルの切片の染色は、ＤＡＫＯ社のＣａｔａｌｙｚｅｄ Ｓｉｆｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＣＳＡ） Ｓｙｓｔｅｍを使用するので、そのプロトコルに準じて行った。まず、脱パラフィンをＨｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒ（ｐａｔｉｏｎａｌ ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）で５分間３回、１００％エタノールで３分間３回ずつ行い、蒸留水に５分間馴染ませた。その後、１０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ．６．０）の中に入れ、マイクロウエーブで５分間沸騰させて加熱処理を施し、抗原を賦活化した。このサンプルを室温で冷やし、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）にて４分間３回洗浄した。その後、３％過酸化水素水（ＤＡＣＯ社）に３分間漬け、内因性ペルオキシダ−ゼをブロックした。次いで、ＰＲＯＴＥＩＮ ＢＬＯＣＫ（ＤＡＣＯ社）にて５分間、抗体の非特異的反応の阻止を行い、１．５％ヤギ血清で４００倍に希釈した抗ＯＲＰ１５０抗体を一次抗体として１５分間反応させた後に、ＴＢＳ−Ｔにて４分間３回洗浄した。その後、２００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ウサギ抗体を２次抗体として１５分間反応させ、ＴＢＳ−Ｔにて４分間３回洗浄した。このようにして処理したサンプルに、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＡＣＯ社）を１５分間反応後、ＴＢＳ−Ｔにて４分間３回洗浄した。次いで、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＡＣＯ社）で１５分間反応後、ＴＢＳ−Ｔにて４分間３回洗浄した後に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＤＡＣＯ社）と１５分間反応させた後、ＴＢＳ−Ｔにて４分間３回洗浄した。そして、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎにて、ＤＡＢ発色を行い、蒸留水にて水洗し、脱水を１００％エタノールで３分間３回、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒ（ｐａｔｉｏｎａｌ ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ）で５分間３回行い、封入して標本を完成した。該標本は光学顕微鏡（オリンパス社製）により検鏡し、結果の解析を行った。その結果、コントロールであるＷｉｓｔａｒ Ｋｙｏｔｏラット、高血圧モデルであるＳＨＲラットでのＯＲＰ１５０陽性染色部位が無く、２型糖尿病高血圧モデルであるＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐラットに陽性染色部位を認め、ＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐラットにおいて小胞体ストレスの亢進を認めた。さらに、ＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐのＴＭ−２００２投与群では、陽性染色部位の減少を認め、小胞体ストレスが抑制されていた（図１７参照）。

［試験例１５］ＴＭ−２００２の小胞体ストレス誘導性分子の発現変動における薬効評価
６穴培養皿にラット膵臓β細胞株（ＲＩＮ−５Ｆ）を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう播種し、２４時間後、ＤＭＳＯに２００ｍＭ、５０ｍＭの濃度で溶解したＴＭ−２００２を最終濃度２００μＭ、５０μＭになるよう添加した。さらに１時間後、メタノールで１ｍｇ／ｍｌに溶解したツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ社）を０．２μｌ添加した。８時間培養後、細胞を２ｍｌのＰＢＳ（＋）で２回洗浄後、溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＦ、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、０．１％ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ社）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）１００μｌで細胞を溶解した。この細胞溶解液の不溶化画分を除くため１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液をＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を使用し、蛋白濃度の定量を行った後、各検体１μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。その後、５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで１時間、室温でブロッキングを行い、特異抗体として抗ＯＲＰ１５０抗体を５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで２０００倍希釈、抗ＧＲＰ７８抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで１００倍希釈、抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社）５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで２００倍希釈し、それぞれ室温で２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで１０分、３回洗浄後、ＯＲＰ１５０、アクチンの検出には二次抗体としてＨＲＰラベルされた抗ウサギ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで２，０００倍希釈し、ＧＲＰ７８の検出には二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識された抗ヤギ抗体を５％スキムミルク／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５０００倍希釈し使用し、室温で１時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで１０分、３回洗浄後、ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用し検出を行った。検出後のシグナルをＬａｎｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ社）により解析し、シグナル強度の算出を行った。その結果、ツニカマイシン添加検体ではコントロール検体に対し、１．８８倍のＯＲＰ１５０の発現亢進、１．４６倍のＧＲＰ７８の発現亢進を認め、小胞体ストレスが惹起されていることが分かる。ＴＭ−２００２およびツニカマイシンの共添加検体では、ツニカマイシンによるＯＲＰ１５０、ＧＲＰ７８の発現亢進は抑制され、ツニカマイシンにより惹起された小胞体ストレスが軽減されていることが分かる（図１８および図１９参照）。

ペントシジン生成に対するＴＭ−２００２の抑制効果を示す図。 ヒドロキシラジカルによるフェニルアラニンのヒドロキシル化反応に対するＴＭ−２００２の抑制効果（ｏ−チロシン生成抑制を指標とする）を示す図。 ヒドロキシラジカルによるフェニルアラニンのヒドロキシル化反応に対するＴＭ−２００２の抑制効果（ｍ−チロシン生成抑制を指標とする）を示す図。 パーオキシナイトライトによるチロシンのニトロ化反応に対するＴＭ−２００２の抑制効果を示す図。 ラット頚動脈バルーン傷害モデル実験におけるＴＭ−２００２の血管内皮肥厚抑制効果を示す写真（Ａは対照；ＢはＴＭ−２００２ ５０ｍｇ／ｋｇ投与；Ｃはアミノグアニジン ４５ｍｇ／ｋｇ投与）。 ＴＭ−２００２が血圧降下作用を有していないことを示す図。 ＴＭ−２００２が尿蛋白抑制作用を有することを示す図。 ＴＭ−２００２がＴｈｙ−１腎炎モデルにおいてＢＵＮ値を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２がＴｈｙ−１腎炎モデルにおいて尿蛋白値を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２がＴｈｙ−１腎炎モデルにおいて糸球体細胞数を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２が虚血再灌流モデルにおいてＢＵＮ値を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２が虚血再灌流モデルにおいて尿蛋白値を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２が虚血再灌流モデルにおいて間質障害スコアーを減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２が脳梗塞巣を縮小させることを示す図。 ＴＭ−２００２が脳梗塞巣を縮小させることを示す図。 ＴＭ−２００２注射用凍結乾燥製剤の水溶液の安定性を示す図。 ＴＭ−２００２がＳＨＲ／ＮＤｍｃｒ−ｃｐの陽性染色部位を減少させることを示す図。 ＴＭ−２００２がツニカマイシンによりＯＰＲ１５０の発現亢進を抑制することを示す図。 ＴＭ−２００２がツニカマイシンによりＧＲＰ７８の発現亢進を抑制することを示す図。

Claims (9)

1. 遊離形または塩形の化合物名：
   ４−（３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン）−１−フェニル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；または
   １−（５−ヒドロキシ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−メチル−１，３−ジヒドロ−フロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オール
   の化合物。
2. 遊離形または塩形の請求項１の化合物を有効成分とする、ピラゾール環４位にビタミンＢ６分子を導入してビタミンＢ６分子の結合を妨げることができる蛋白修飾物生成抑制剤であって、ここで、該蛋白修飾物が、糖化最終産物（ＡＧＥｓ）、脂質過酸化最終産物（ＡＬＥｓ）およびこれらの組合せよりなる群から選択されるものである、蛋白修飾物生成抑制剤。
3. 蛋白修飾物がＡＧＥｓである、請求項２記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
4. ＡＧＥｓがペントシジンである、請求項３記載の蛋白修飾物生成抑制剤。
5. 請求項２〜４のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、腎組織保護剤。
6. 請求項２〜４のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、腹膜透析液。
7. 請求項２〜４のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を含む、血液透析液。
8. 請求項２〜４のいずれか記載の蛋白修飾物生成抑制剤を液体試料と接触させる工程を含む、液体試料のカルボニル化合物含有量を低減させる方法。
9. ピラゾール環４位にビタミンＢ６分子を導入してビタミンＢ６分子の結合を妨げることができる蛋白修飾物生成抑制剤の製造における請求項１に記載の化合物の使用であって、ここで、該蛋白修飾物が、糖化最終産物（ＡＧＥｓ）、脂質過酸化最終産物（ＡＬＥｓ）およびこれらの組合せよりなる群から選択されるものである、使用。

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