JP4701532B2 - Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査、診断におけるＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出用のオリゴヌクレオチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）はヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の病原体である。ＨＩＶには、全世界に広がっているＨＩＶ−１、アフリカ西海岸を中心に流行しているＨＩＶ−２というサブタイプが知られている。ＨＩＶ−２の塩基配列は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）に近く、人畜共通の感染の可能性が考えられる。しかし、一般にＨＩＶ−２感染の臨床症状は、ＨＩＶ−１感染のそれに比べて軽症なことが多い。
【０００３】
ＨＩＶ−１に感染するとＨＩＶ−１の構造蛋白や調節蛋白に対する抗体産生が誘導される。ＨＩＶ−１は、Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋リンパ球を主要な標的免疫細胞とする。その結果、免疫システムに多様な異常が発生し、ＨＩＶ−１感染が進行すれば、Ｂ細胞が刺激されて高γグロブリン血症が起こり、自己抗体や免疫複合体が出現する。さらに白血球や血小板の減少が顕著になる。ＨＩＶ−１感染による免疫不全が高度になると、結核やニューモシスチス・カリニ肺炎などの日和見感染症を合併し、ＡＩＤＳ発症と診断される。
【０００４】
ＨＩＶ−１感染の診断には、ウイルス抗原に対して抗体が反応すれば着色するＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏ−Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法が利用できる。疑似陽性の場合にはウエスタンブロット法と呼ばれる、ウイルス粒子の諸抗原を電気泳動したブロットに血清を加えて抗体が特定のウイルス抗原に反応すれば、陽性と確定診断する。ただし、このような抗体を検出する方法では抗体が産生される前の感染初期の段階での診断は不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来法では感染初期の診断が不可能なことや、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に存在する極微量のＨＩＶ−１を検出することは困難であり、より迅速かつ高感度な検出法の出現が望まれている。特にＨＩＶ−１ ＲＮＡを定量することは病態の進行や抗ＨＩＶ薬の薬効を知る上では重要である。さらには、検査をより簡便にするためには、自動化された検査装置の開発が望まれている。
【０００６】
検出を高感度で行うためには、検出および同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中の特定の配列を増幅した上で検出することが好適である。ＨＩＶ−１ウイルスのようにゲノム核酸がＲＮＡである場合、特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメレースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。
【０００７】
しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す煩雑な操作が必要であり、またそのことが自動化への障害として挙げられる。
【０００８】
特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方法だと考えられる。
【０００９】
しかし、これらの増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上させるための操作が必要であった。
【００１０】
そこで本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレオチドを、核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとして提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するＨＩＶ−１に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡ増幅工程である。
【００１２】
本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係わり、前記特定配列と重複（１から１０塩基）して５’末端側に隣接する領域に対して相補的な配列を有する第三のオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１由来のＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることを含み、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１）第二のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（３）第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（４）第二のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（５）第二のプライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（６）第二のプライマーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（７）第二のプライマーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（８）第二のプライマーとして、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（９）第二のプライマーとして、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増幅工程である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、請求項１、２のいずれかの増幅工程を、増幅により生じるＲＮＡ転写産物に特異的に結合可能であり、かつ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ただし、前記該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列である）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することを特徴とする、ＨＩＶ−１の検出工程である。
【００１４】
本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする、検出工程である。
【００１５】
そして、本願請求項５の発明は、請求項４の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、配列番号３４の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、試料中のＨＩＶ−１ ＲＮＡを増幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供するものである。本発明の増幅工程には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応させ）ＨＩＶ−１の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
【００１７】
例えばＮＡＳＢＡ法では、試料中に存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程であるが、本発明では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定部位に結合可能である、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドからなる、増幅されるＨＩＶ−１ ＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１８】
本願発明の態様の一例では、前記記載の増幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）。なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に限定しないが、これらの活性のすべてを有しているＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレースについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファージＲＮＡポリメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ましい。
【００１９】
上記増幅工程では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’末端に位置していないＨＩＶ−１ ＲＮＡをも増幅可能となる。この切断のためのオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２１から３３のオリゴヌクレオチドを使用することが出来る。なお、この切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を抑えるために３’水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２０】
また前記のような、特定配列と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とする場合、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１）第二のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（３）第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（４）第二のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（５）第二のプライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（６）第二のプライマーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（７）第二のプライマーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（８）第二のプライマーとして、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（９）第二のプライマーとして、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることが好ましい。この場合においても、第三のオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）は、３’末端からの伸長反応を抑制するために３’末端水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２１】
以上のような核酸増幅工程で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、前記増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオリゴヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたものが例示できる。この好適なプローブでは、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないからである(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７)。
【００２２】
前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限定しないが、例えばＲＮＡ増幅工程において第一のプライマーとして配列番号１から配列番号７、第二のプライマーとして配列番号８から配列番号２０のいずれかの組合せを使用した場合には、配列番号３４の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列が好ましい。また、プローブをプライマーとした伸長反応を抑えるためにプローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
【００２３】
上記のようなプローブ共存下で増幅工程を行うことにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２５】
実施例 １
本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、標的ＨＩＶ-1 ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。
【００２６】
（１）ＨＩＶ−１ ＲＮＡの塩基配列のうち、コア蛋白（ｇａｇ）の構造遺伝子を含む１６２８ｎｔのＲＮＡを標準ＲＮＡとした。標準ＲＮＡはＡＣＣＲＵＮTM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ４００（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）製）よりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出後、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｇａｇ領域の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製したＲＮＡである。
【００２７】
（２）標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）を用い１０5コピー／５μｌ、１０4コピー／５μｌ、１０3コピー／５μｌ、１０2コピー／５μｌ、１０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００２８】
（３）以下の組成の反応液２０．８μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００２９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１３ｍＭ 塩化マグネシウム
１１５ｍＭ 塩化カリウム
３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のプライマー（配列番号１）
１．０μＭの第二のプライマー（配列番号１５）（ここで、第二のプライマーの塩基配列の５’ 末端側にはＴ７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である））。
【００３０】
０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド（配列番号２７）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番号３４のうち、５’末端から１４番目の「Ｔ」と１５番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを添加した。
【００３１】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ ソルビトール
３μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
容量調整用蒸留水
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。なお、初期ＲＮＡ量は１０コピー／３０μｌから１０5コピー／３０μｌである。
【００３２】
図２より、得られた蛍光プロファイルは、標的ＲＮＡの初期濃度に依存した。
また、１０コピー／３０μｌが約１０分で検出された。蛍光強度比が１．２を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を横軸にプロットすると、直線関係が得られた（図３）。図３を検量線として用いることで、未知試料中に存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上より、本法により、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度かつ定量可能な検出が可能であることが示された。
【００３３】
実施例 ２
本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出を行った。
【００３４】
（１）ＨＩＶ陽性血清には、ＡＣＣＲＵＮTM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ５００（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）製）を用いた。陽性血清３００μｌよりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））により、推定ＲＮＡ量が１０3コピー／５μｌとなるよう希釈した。標準ＲＮＡは実施例１と同様のものを使用した。標準ＲＮＡの濃度は１０3コピー／５μｌとした。
【００３５】
（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３６】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１３ｍＭ 塩化マグネシウム
１１５ｍＭ 塩化カリウム
３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭの第二のプライマー（配列番号１３）（ここで、第二のプライマーの塩基配列の５’末端側にはＴ７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である））。
【００３７】
０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド（配列番号２６）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番号３４のうち、５’ 末端から１４番目の「Ｔ」と１５番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを添加した。
【００３８】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ ソルビトール
３μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示した。
【００３９】
図４より、ＨＩＶ陽性血清から抽出されたＲＮＡ（推定１０3コピー／３０μｌ）が検出された。また、対照の標準ＲＮＡ（ＲＮＡ濃度１０3コピー／３０μｌ）と検出時間が同等であった。
【００４０】
以上のことから、本法により、ＨＩＶ陽性血清抽出物からＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度な検出が可能であることが示された。
【００４１】
【発明の効果】
以上の説明のように、本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレオチドであって、核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出方法を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、実施例２で用いたインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインターカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸塩基を示す。
【図２】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０5コピー／３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた。
【図３】実施例１の結果から、蛍光強度比が１．２を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を横軸にプロットして得られた検量線である。
【図４】実施例２で行ったＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出結果から得られた、反応時間と蛍光増加率とのグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査、診断におけるＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出用のオリゴヌクレオチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）はヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の病原体である。ＨＩＶには、全世界に広がっているＨＩＶ−１、アフリカ西海岸を中心に流行しているＨＩＶ−２というサブタイプが知られている。ＨＩＶ−２の塩基配列は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）に近く、人畜共通の感染の可能性が考えられる。しかし、一般にＨＩＶ−２感染の臨床症状は、ＨＩＶ−１感染のそれに比べて軽症なことが多い。
【０００３】
ＨＩＶ−１に感染するとＨＩＶ−１の構造蛋白や調節蛋白に対する抗体産生が誘導される。ＨＩＶ−１は、Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋リンパ球を主要な標的免疫細胞とする。その結果、免疫システムに多様な異常が発生し、ＨＩＶ−１感染が進行すれば、Ｂ細胞が刺激されて高γグロブリン血症が起こり、自己抗体や免疫複合体が出現する。さらに白血球や血小板の減少が顕著になる。ＨＩＶ−１感染による免疫不全が高度になると、結核やニューモシスチス・カリニ肺炎などの日和見感染症を合併し、ＡＩＤＳ発症と診断される。
【０００４】
ＨＩＶ−１感染の診断には、ウイルス抗原に対して抗体が反応すれば着色するＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏ−Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法が利用できる。疑似陽性の場合にはウエスタンブロット法と呼ばれる、ウイルス粒子の諸抗原を電気泳動したブロットに血清を加えて抗体が特定のウイルス抗原に反応すれば、陽性と確定診断する。ただし、このような抗体を検出する方法では抗体が産生される前の感染初期の段階での診断は不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来法では感染初期の診断が不可能なことや、複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に存在する極微量のＨＩＶ−１を検出することは困難であり、より迅速かつ高感度な検出法の出現が望まれている。特にＨＩＶ−１ ＲＮＡを定量することは病態の進行や抗ＨＩＶ薬の薬効を知る上では重要である。さらには、検査をより簡便にするためには、自動化された検査装置の開発が望まれている。
【０００６】
検出を高感度で行うためには、検出および同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中の特定の配列を増幅した上で検出することが好適である。ＨＩＶ−１ウイルスのようにゲノム核酸がＲＮＡである場合、特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメレースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。
【０００７】
しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す煩雑な操作が必要であり、またそのことが自動化への障害として挙げられる。
【０００８】
特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方法だと考えられる。
【０００９】
しかし、これらの増幅法は比較的低温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上させるための操作が必要であった。
【００１０】
そこで本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレオチドを、核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとして提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するＨＩＶ−１に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡ増幅工程である。
【００１２】
本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係わり、前記特定配列と重複（１から１０塩基）して５’末端側に隣接する領域に対して相補的な配列を有する第三のオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１由来のＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることを含み、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１）第二のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（３）第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（４）第二のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（５）第二のプライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（６）第二のプライマーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（７）第二のプライマーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（８）第二のプライマーとして、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（９）第二のプライマーとして、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増幅工程である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、請求項１、２のいずれかの増幅工程を、増幅により生じるＲＮＡ転写産物に特異的に結合可能であり、かつ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ただし、前記該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列である）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することを特徴とする、ＨＩＶ−１の検出工程である。
【００１４】
本願請求項４の発明は、請求項３の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする、検出工程である。
【００１５】
そして、本願請求項５の発明は、請求項４の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、配列番号３４の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、試料中のＨＩＶ−１ ＲＮＡを増幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供するものである。本発明の増幅工程には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応させ）ＨＩＶ−１の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
【００１７】
例えばＮＡＳＢＡ法では、試料中に存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程であるが、本発明では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定部位に結合可能である、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドからなる、増幅されるＨＩＶ−１ ＲＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１８】
本願発明の態様の一例では、前記記載の増幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）。なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に限定しないが、これらの活性のすべてを有しているＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレースについても特に限定するものではないが、Ｔ７ファージＲＮＡポリメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ましい。
【００１９】
上記増幅工程では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ配列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’末端に位置していないＨＩＶ−１ ＲＮＡをも増幅可能となる。この切断のためのオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２１から３３のオリゴヌクレオチドを使用することが出来る。なお、この切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を抑えるために３’水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２０】
また前記のような、特定配列と重複（１から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とする場合、第一のプライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１）第二のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（３）第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（４）第二のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（５）第二のプライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（６）第二のプライマーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（７）第二のプライマーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（８）第二のプライマーとして、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（９）第二のプライマーとして、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることが好ましい。この場合においても、第三のオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）は、３’末端からの伸長反応を抑制するために３’末端水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２１】
以上のような核酸増幅工程で得られた増幅産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、前記増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオリゴヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたものが例示できる。この好適なプローブでは、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としないからである(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７)。
【００２２】
前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限定しないが、例えばＲＮＡ増幅工程において第一のプライマーとして配列番号１から配列番号７、第二のプライマーとして配列番号８から配列番号２０のいずれかの組合せを使用した場合には、配列番号３４の少なくとも連続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列が好ましい。また、プローブをプライマーとした伸長反応を抑えるためにプローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
【００２３】
上記のようなプローブ共存下で増幅工程を行うことにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段階で増幅し検出することが可能となり、自動化への適用も容易となる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２５】
実施例 １
本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、標的ＨＩＶ-1 ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。
【００２６】
（１）ＨＩＶ−１ ＲＮＡの塩基配列のうち、コア蛋白（ｇａｇ）の構造遺伝子を含む１６２８ｎｔのＲＮＡを標準ＲＮＡとした。標準ＲＮＡはＡＣＣＲＵＮTM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ４００（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）製）よりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出後、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｇａｇ領域の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製したＲＮＡである。
【００２７】
（２）標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）を用い１０5コピー／５μｌ、１０4コピー／５μｌ、１０3コピー／５μｌ、１０2コピー／５μｌ、１０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００２８】
（３）以下の組成の反応液２０．８μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００２９】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１３ｍＭ 塩化マグネシウム
１１５ｍＭ 塩化カリウム
３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のプライマー（配列番号１）
１．０μＭの第二のプライマー（配列番号１５）（ここで、第二のプライマーの塩基配列の５’ 末端側にはＴ７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である））。
【００３０】
０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド（配列番号２７）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番号３４のうち、５’末端から１４番目の「Ｔ」と１５番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを添加した。
【００３１】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ ソルビトール
３μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
容量調整用蒸留水
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。なお、初期ＲＮＡ量は１０コピー／３０μｌから１０5コピー／３０μｌである。
【００３２】
図２より、得られた蛍光プロファイルは、標的ＲＮＡの初期濃度に依存した。
また、１０コピー／３０μｌが約１０分で検出された。蛍光強度比が１．２を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を横軸にプロットすると、直線関係が得られた（図３）。図３を検量線として用いることで、未知試料中に存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上より、本法により、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度かつ定量可能な検出が可能であることが示された。
【００３３】
実施例 ２
本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出を行った。
【００３４】
（１）ＨＩＶ陽性血清には、ＡＣＣＲＵＮTM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ５００（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）製）を用いた。陽性血清３００μｌよりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））により、推定ＲＮＡ量が１０3コピー／５μｌとなるよう希釈した。標準ＲＮＡは実施例１と同様のものを使用した。標準ＲＮＡの濃度は１０3コピー／５μｌとした。
【００３５】
（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３６】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１３ｍＭ 塩化マグネシウム
１１５ｍＭ 塩化カリウム
３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のプライマー（配列番号２）
１．０μＭの第二のプライマー（配列番号１３）（ここで、第二のプライマーの塩基配列の５’末端側にはＴ７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である））。
【００３７】
０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド（配列番号２６）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番号３４のうち、５’ 末端から１４番目の「Ｔ」と１５番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修飾されている。）
１３％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液４．２μｌを添加した。
【００３８】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ ソルビトール
３μｇ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示した。
【００３９】
図４より、ＨＩＶ陽性血清から抽出されたＲＮＡ（推定１０3コピー／３０μｌ）が検出された。また、対照の標準ＲＮＡ（ＲＮＡ濃度１０3コピー／３０μｌ）と検出時間が同等であった。
【００４０】
以上のことから、本法により、ＨＩＶ陽性血清抽出物からＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度な検出が可能であることが示された。
【００４１】
【発明の効果】
以上の説明のように、本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレオチドであって、核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出方法を提供する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、実施例２で用いたインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインターカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸塩基を示す。
【図２】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０5コピー／３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた。
【図３】実施例１の結果から、蛍光強度比が１．２を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を横軸にプロットして得られた検量線である。
【図４】実施例２で行ったＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出結果から得られた、反応時間と蛍光増加率とのグラフである。
Claims (4)
- 試料中に存在するＨＩＶ−１に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー（ここで第二のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を付加した配列を有するプライマーである）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して一本鎖ＤＮＡを生成し、該一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを生成し、そして該二本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅方法において、（ア）第一のプライマーとして配列番号１のオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして配列番号１５のオリゴヌクレオチドが利用される、又は、（イ）第一のプライマーとして配列番号２のオリゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとして配列番号１３のオリゴヌクレオチドが利用される、のいずれかであり、前記（ア）の場合には配列番号２７のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドとして添加し、前記（イ）の場合には配列番号２６のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドとして添加し、リボヌクレエースＨによりＨＩＶ−１由来のＲＮＡを特定塩基配列の５’末端領域で切断して核酸増幅初期の鋳型とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増幅方法。
- 請求項１の増幅方法を、増幅により生じるＲＮＡ転写産物に特異的に結合可能であり、かつ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ただし、前記標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列である）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定することを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、配列番号３４の配列であることを特徴とする、請求項３に記載の検出方法。
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