JP2002320481A - Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法 - Google Patents
Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法Info
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- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
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Abstract
(57)【要約】
【課題】比較的低温かつ一定温度でＨＩＶ−１のゲノム
ＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴ
ヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、
迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出
方法を提供する。 【解決手段】ＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出するためのオリ
ゴヌクレオチドであって、比較的低温かつ一定温度（３
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲ
ノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオ
リゴヌクレオチドであって、核酸増幅法で使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーを提供することで、それを
利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの
検出方法を提供する。
ＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴ
ヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、
迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出
方法を提供する。 【解決手段】ＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出するためのオリ
ゴヌクレオチドであって、比較的低温かつ一定温度（３
５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−１のゲ
ノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオ
リゴヌクレオチドであって、核酸増幅法で使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーを提供することで、それを
利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮＡの
検出方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、診断に
おけるＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出用のオリゴ
ヌクレオチドに関するものである。
おけるＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出用のオリゴ
ヌクレオチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Ｈｕｍ
ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕ
ｓ）はヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Ａｃｑｕ
ｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ）の病原体である。ＨＩＶには、全世界に広が
っているＨＩＶ−１、アフリカ西海岸を中心に流行して
いるＨＩＶ−２というサブタイプが知られている。ＨＩ
Ｖ−２の塩基配列は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：
Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ
ｉｒｕｓ）に近く、人畜共通の感染の可能性が考えられ
る。しかし、一般にＨＩＶ−２感染の臨床症状は、ＨＩ
Ｖ−１感染のそれに比べて軽症なことが多い。
ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕ
ｓ）はヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Ａｃｑｕ
ｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ）の病原体である。ＨＩＶには、全世界に広が
っているＨＩＶ−１、アフリカ西海岸を中心に流行して
いるＨＩＶ−２というサブタイプが知られている。ＨＩ
Ｖ−２の塩基配列は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：
Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ
ｉｒｕｓ）に近く、人畜共通の感染の可能性が考えられ
る。しかし、一般にＨＩＶ−２感染の臨床症状は、ＨＩ
Ｖ−１感染のそれに比べて軽症なことが多い。
【０００３】ＨＩＶ−１に感染するとＨＩＶ−１の構造
蛋白や調節蛋白に対する抗体産生が誘導される。ＨＩＶ
−１は、Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋リンパ球を主要な標的
免疫細胞とする。その結果、免疫システムに多様な異常
が発生し、ＨＩＶ−１感染が進行すれば、Ｂ細胞が刺激
されて高γグロブリン血症が起こり、自己抗体や免疫複
合体が出現する。さらに白血球や血小板の減少が顕著に
なる。ＨＩＶ−１感染による免疫不全が高度になると、
結核やニューモシスチス・カリニ肺炎などの日和見感染
症を合併し、ＡＩＤＳ発症と診断される。
蛋白や調節蛋白に対する抗体産生が誘導される。ＨＩＶ
−１は、Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋リンパ球を主要な標的
免疫細胞とする。その結果、免疫システムに多様な異常
が発生し、ＨＩＶ−１感染が進行すれば、Ｂ細胞が刺激
されて高γグロブリン血症が起こり、自己抗体や免疫複
合体が出現する。さらに白血球や血小板の減少が顕著に
なる。ＨＩＶ−１感染による免疫不全が高度になると、
結核やニューモシスチス・カリニ肺炎などの日和見感染
症を合併し、ＡＩＤＳ発症と診断される。
【０００４】ＨＩＶ−１感染の診断には、ウイルス抗原
に対して抗体が反応すれば着色するＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍ
ｏ−Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法が利用できる。疑似
陽性の場合にはウエスタンブロット法と呼ばれる、ウイ
ルス粒子の諸抗原を電気泳動したブロットに血清を加え
て抗体が特定のウイルス抗原に反応すれば、陽性と確定
診断する。ただし、このような抗体を検出する方法では
抗体が産生される前の感染初期の段階での診断は不可能
である。
に対して抗体が反応すれば着色するＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍ
ｏ−Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法が利用できる。疑似
陽性の場合にはウエスタンブロット法と呼ばれる、ウイ
ルス粒子の諸抗原を電気泳動したブロットに血清を加え
て抗体が特定のウイルス抗原に反応すれば、陽性と確定
診断する。ただし、このような抗体を検出する方法では
抗体が産生される前の感染初期の段階での診断は不可能
である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、従来法
では感染初期の診断が不可能なことや、複雑な操作と長
時間を要し、また短時間で試料中に存在する極微量のＨ
ＩＶ−１を検出することは困難であり、より迅速かつ高
感度な検出法の出現が望まれている。特にＨＩＶ−１
ＲＮＡを定量することは病態の進行や抗ＨＩＶ薬の薬効
を知る上では重要である。さらには、検査をより簡便に
するためには、自動化された検査装置の開発が望まれて
いる。
では感染初期の診断が不可能なことや、複雑な操作と長
時間を要し、また短時間で試料中に存在する極微量のＨ
ＩＶ−１を検出することは困難であり、より迅速かつ高
感度な検出法の出現が望まれている。特にＨＩＶ−１
ＲＮＡを定量することは病態の進行や抗ＨＩＶ薬の薬効
を知る上では重要である。さらには、検査をより簡便に
するためには、自動化された検査装置の開発が望まれて
いる。
【０００６】検出を高感度で行うためには、検出および
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中
の特定の配列を増幅した上で検出することが好適であ
る。ＨＩＶ−１ウイルスのようにゲノム核酸がＲＮＡで
ある場合、特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメ
レースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知ら
れている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤ
ＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端
部に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセン
スプライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮ
Ａポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによ
って特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。
同定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ中
の特定の配列を増幅した上で検出することが好適であ
る。ＨＩＶ−１ウイルスのようにゲノム核酸がＲＮＡで
ある場合、特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメ
レースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知ら
れている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤ
ＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端
部に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセン
スプライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮ
Ａポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによ
って特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。
【０００７】しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作
（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温
・降温を繰り返す煩雑な操作が必要であり、またそのこ
とが自動化への障害として挙げられる。
（逆転写工程およびＰＣＲ工程）、および、急激な昇温
・降温を繰り返す煩雑な操作が必要であり、またそのこ
とが自動化への障害として挙げられる。
【０００８】特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、逆転写
酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特
定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知
られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロ
モーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボ
ヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖
ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポ
リメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲ
ＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うもの
である。このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度
での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方法だ
と考えられる。
酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特
定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知
られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロ
モーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボ
ヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖
ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポ
リメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲ
ＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うもの
である。このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度
での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方法だ
と考えられる。
【０００９】しかし、これらの増幅法は比較的低温（例
えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが分子内
構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応効率を
低下させる可能性が考えられる。したがって、増幅反応
の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの
分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上させる
ための操作が必要であった。
えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが分子内
構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応効率を
低下させる可能性が考えられる。したがって、増幅反応
の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの
分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上させる
ための操作が必要であった。
【００１０】そこで本願発明は、比較的低温かつ一定温
度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−
１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合
するオリゴヌクレオチドを、核酸増幅法で使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーとして提供することで、そ
れを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮ
Ａの増幅および検出方法を提供することを目的とする。
度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１℃）で、ＨＩＶ−
１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合
するオリゴヌクレオチドを、核酸増幅法で使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーとして提供することで、そ
れを利用した簡便、迅速かつ高感度なＨＩＶ−１ ＲＮ
Ａの増幅および検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するＨ
ＩＶ−１に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該
特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよ
び該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー
（ここで一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレ
ースのプロモーター配列を付加した配列を有するプライ
マーである）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース
によりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによって
ＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡ
を生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定
配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモ
ーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２
本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産
物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型とな
るようなＲＮＡ増幅工程において、第一のプライマーと
して、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとし
て、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩ
Ｖ−１由来のＲＮＡ増幅工程である。
になされた本願請求項１の発明は、試料中に存在するＨ
ＩＶ−１に由来するＲＮＡの特定配列を鋳型として、該
特定配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよ
び該特定配列に相同的な配列を有する第二のプライマー
（ここで一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレ
ースのプロモーター配列を付加した配列を有するプライ
マーである）を用い、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース
によりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによって
ＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡ
を生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記特定
配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモ
ーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２
本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産
物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型とな
るようなＲＮＡ増幅工程において、第一のプライマーと
して、配列番号１から配列番号７のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドが利用され、第二のプライマーとし
て、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドが利用されることを特徴とする、ＨＩ
Ｖ−１由来のＲＮＡ増幅工程である。
【００１２】本願請求項２の発明は、請求項１の発明に
係わり、前記特定配列と重複（１から１０塩基）して
５’末端側に隣接する領域に対して相補的な配列を有す
る第三のオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１
由来のＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌ
クレエースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とするこ
とを含み、第一のプライマーとして、配列番号１から配
列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用
され、（１）第二のプライマーとして、配列番号８から
なるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオ
リゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２
のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオ
リゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌ
クレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のい
ずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（３）
第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴ
ヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレ
オチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれ
かからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（４）第二
のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌク
レオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチ
ドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかか
らなるオリゴヌクレオチドが利用され、（５）第二のプ
ライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオ
チドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドと
して、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからな
るオリゴヌクレオチドが利用され、（６）第二のプライ
マーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチド
を利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとし
て、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなる
オリゴヌクレオチドが利用され、（７）第二のプライマ
ーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを
利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、
配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリ
ゴヌクレオチドが利用され、（８）第二のプライマーと
して、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用
した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌ
クレオチドが利用され、（９）第二のプライマーとし
て、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１０）第二のプライマーとし
て、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１１）第二のプライマーとし
て、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレ
オチドが利用され、（１２）第二のプライマーとして、
配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場
合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３
２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチ
ドが利用され、又は、（１３）第二のプライマーとし
て、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることを
特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増幅工程であ
る。
係わり、前記特定配列と重複（１から１０塩基）して
５’末端側に隣接する領域に対して相補的な配列を有す
る第三のオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１
由来のＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌ
クレエースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とするこ
とを含み、第一のプライマーとして、配列番号１から配
列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用
され、（１）第二のプライマーとして、配列番号８から
なるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオ
リゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２２
のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオ
リゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌ
クレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のい
ずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（３）
第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴ
ヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレ
オチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれ
かからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（４）第二
のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌク
レオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチ
ドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかか
らなるオリゴヌクレオチドが利用され、（５）第二のプ
ライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオ
チドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドと
して、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからな
るオリゴヌクレオチドが利用され、（６）第二のプライ
マーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチド
を利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとし
て、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなる
オリゴヌクレオチドが利用され、（７）第二のプライマ
ーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを
利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、
配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリ
ゴヌクレオチドが利用され、（８）第二のプライマーと
して、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用
した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌ
クレオチドが利用され、（９）第二のプライマーとし
て、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１０）第二のプライマーとし
て、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１１）第二のプライマーとし
て、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレ
オチドが利用され、（１２）第二のプライマーとして、
配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場
合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３
２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチ
ドが利用され、又は、（１３）第二のプライマーとし
て、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用されることを
特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増幅工程であ
る。
【００１３】本願請求項３の発明は、請求項１、２のい
ずれかの増幅工程を、増幅により生じるＲＮＡ転写産物
に特異的に結合可能であり、かつ、インターカレーター
性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
（ただし、前記該標識されたオリゴヌクレオチドは、前
記第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる
配列である）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することを特徴とする、ＨＩＶ−１の検出工程で
ある。
ずれかの増幅工程を、増幅により生じるＲＮＡ転写産物
に特異的に結合可能であり、かつ、インターカレーター
性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
（ただし、前記該標識されたオリゴヌクレオチドは、前
記第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる
配列である）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化
を測定することを特徴とする、ＨＩＶ−１の検出工程で
ある。
【００１４】本願請求項４の発明は、請求項３の発明に
係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＲＮ
Ａ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するよう
に設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍
光特性が変化するものであることを特徴とする、検出工
程である。
係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記ＲＮ
Ａ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するよう
に設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍
光特性が変化するものであることを特徴とする、検出工
程である。
【００１５】そして、本願請求項５の発明は、請求項４
の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブの配
列が、配列番号３４の配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補
的な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴
とする。以下、本発明を詳細に説明する。
の発明に係わり、前記オリゴヌクレオチドプローブの配
列が、配列番号３４の配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補
的な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴
とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】本発明は、試料中のＨＩＶ−１ ＲＮＡを
増幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって
生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供するものであ
る。本発明の増幅工程には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、
３ＳＲ法等を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲ
ＮＡポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反
応させ）ＨＩＶ−１の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳ
ＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
増幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって
生成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供するものであ
る。本発明の増幅工程には、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、
３ＳＲ法等を含むが、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素およびＲ
ＮＡポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反
応させ）ＨＩＶ−１の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳ
ＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増幅法が好ましい。
【００１７】例えばＮＡＳＢＡ法では、試料中に存在す
るＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リ
ボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレ
ース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産
物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
るｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程であ
るが、本発明では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定部位に結
合可能である、配列番号１から配列番号７のいずれかか
らなるオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマー
と、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドからなる、増幅されるＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマ
ー（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、
その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター
配列を含む）を用いることを特徴とする。
るＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リ
ボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からなる
ＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレ
ース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産
物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
るｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程であ
るが、本発明では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの特定部位に結
合可能である、配列番号１から配列番号７のいずれかか
らなるオリゴヌクレオチドからなる第一のプライマー
と、配列番号８から配列番号２０のいずれかからなるオ
リゴヌクレオチドからなる、増幅されるＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡ配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマ
ー（ここで第一、第二のプライマーのいずれか一方は、
その５’ 末端側にＲＮＡポリメレースのプロモーター
配列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１８】本願発明の態様の一例では、前記記載の増
幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１
から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチド
が利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から
配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが
利用されることを特徴とする（ここで第一、第二のプラ
イマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポ
リメレースのプロモーター配列を含む）。なお、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レース、リボヌクレエースＨは特に限定しないが、これ
らの活性のすべてを有しているＡＭＶ逆転写酵素が好ま
しい。また、ＲＮＡポリメレースについても特に限定す
るものではないが、Ｔ７ファージＲＮＡポリメレース、
ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ましい。
幅工程において、第一のプライマーとして、配列番号１
から配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチド
が利用され、第二のプライマーとして、配列番号８から
配列番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが
利用されることを特徴とする（ここで第一、第二のプラ
イマーのいずれか一方は、その５’ 末端側にＲＮＡポ
リメレースのプロモーター配列を含む）。なお、ＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レース、リボヌクレエースＨは特に限定しないが、これ
らの活性のすべてを有しているＡＭＶ逆転写酵素が好ま
しい。また、ＲＮＡポリメレースについても特に限定す
るものではないが、Ｔ７ファージＲＮＡポリメレース、
ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ましい。
【００１９】上記増幅工程では、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ配
列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１
から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を
有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１
ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレー
スＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることによ
り、特定配列が５’末端に位置していないＨＩＶ−１
ＲＮＡをも増幅可能となる。この切断のためのオリゴヌ
クレオチドとしては、例えば、配列番号２１から３３の
オリゴヌクレオチドを使用することが出来る。なお、こ
の切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応を抑えるために３’水酸基が化学的に修飾（例えばア
ミノ化）されたものであることが望ましい。
列の中で特定配列とする領域の５’末端領域と重複（１
から１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を
有するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１
ＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレー
スＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とすることによ
り、特定配列が５’末端に位置していないＨＩＶ−１
ＲＮＡをも増幅可能となる。この切断のためのオリゴヌ
クレオチドとしては、例えば、配列番号２１から３３の
オリゴヌクレオチドを使用することが出来る。なお、こ
の切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応を抑えるために３’水酸基が化学的に修飾（例えばア
ミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２０】また前記のような、特定配列と重複（１か
ら１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレース
Ｈによる）して核酸増幅初期の鋳型とする場合、第一の
プライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれ
かからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（１）第二
のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレ
オチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチド
として、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからな
るオリゴヌクレオチドが利用され、（２）第二のプライ
マーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを
利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、
配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリ
ゴヌクレオチドが利用され、（３）第二のプライマーと
して、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用
した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌ
クレオチドが利用され、（４）第二のプライマーとし
て、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（５）第二のプライマーとして、
配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場
合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２
２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオ
チドが利用され、（６）第二のプライマーとして、配列
番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合に
は、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３か
ら配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチド
が利用され、（７）第二のプライマーとして、配列番号
１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、
第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配
列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利
用され、（８）第二のプライマーとして、配列番号１５
からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三
のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番
号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用さ
れ、（９）第二のプライマーとして、配列番号１６から
なるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオ
リゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３
０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１
のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２の
いずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（１
２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオ
リゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌ
クレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいず
れかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌ
クレオチドが利用されることが好ましい。この場合にお
いても、第三のオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌク
レオチド）は、３’末端からの伸長反応を抑制するため
に３’末端水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）さ
れたものであることが望ましい。
ら１０塩基）して隣接する領域に対し相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボヌクレース
Ｈによる）して核酸増幅初期の鋳型とする場合、第一の
プライマーとして、配列番号１から配列番号７のいずれ
かからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（１）第二
のプライマーとして、配列番号８からなるオリゴヌクレ
オチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチド
として、配列番号２１と配列番号２２のいずれかからな
るオリゴヌクレオチドが利用され、（２）第二のプライ
マーとして、配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを
利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、
配列番号２２から配列番号２６のいずれかからなるオリ
ゴヌクレオチドが利用され、（３）第二のプライマーと
して、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドを利用
した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号２２から配列番号２８のいずれかからなるオリゴヌ
クレオチドが利用され、（４）第二のプライマーとし
て、配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（５）第二のプライマーとして、
配列番号１２からなるオリゴヌクレオチドを利用した場
合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２
２から配列番号２９のいずれかからなるオリゴヌクレオ
チドが利用され、（６）第二のプライマーとして、配列
番号１３からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合に
は、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３か
ら配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチド
が利用され、（７）第二のプライマーとして、配列番号
１４からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、
第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２３から配
列番号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利
用され、（８）第二のプライマーとして、配列番号１５
からなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三
のオリゴヌクレオチドとして、配列番号２４から配列番
号３０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用さ
れ、（９）第二のプライマーとして、配列番号１６から
なるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオ
リゴヌクレオチドとして、配列番号２５から配列番号３
０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１０）第二のプライマーとして、配列番号１７からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号２７から配列番号３１
のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（１１）第二のプライマーとして、配列番号１８からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号３１と配列番号３２の
いずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（１
２）第二のプライマーとして、配列番号１９からなるオ
リゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌ
クレオチドとして、配列番号３２と配列番号３３のいず
れかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、又は、
（１３）第二のプライマーとして、配列番号２０からな
るオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリ
ゴヌクレオチドとして、配列番号３３からなるオリゴヌ
クレオチドが利用されることが好ましい。この場合にお
いても、第三のオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌク
レオチド）は、３’末端からの伸長反応を抑制するため
に３’末端水酸基が化学的に修飾（例えばアミノ化）さ
れたものであることが望ましい。
【００２１】以上のような核酸増幅工程で得られた増幅
産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、
前記増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオ
リゴヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチ
ド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍
光色素を結合させたものが例示できる。この好適なプロ
ーブでは、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないからである(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９
６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７)。
産物は既知の核酸検出方法で検出することができるが、
前記増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識さ
れたオリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応
液の蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオ
リゴヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチ
ド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍
光色素を結合させたものが例示できる。この好適なプロ
ーブでは、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成する
とインターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレ
ートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要とし
ないからである(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９
６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２
４）４９９２−４９９７)。
【００２２】前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定しないが、例えばＲＮＡ増幅工程において第一のプラ
イマーとして配列番号１から配列番号７、第二のプライ
マーとして配列番号８から配列番号２０のいずれかの組
合せを使用した場合には、配列番号３４の少なくとも連
続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列が
好ましい。また、プローブをプライマーとした伸長反応
を抑えるためにプローブの３’末端の水酸基は化学的に
修飾（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定しないが、例えばＲＮＡ増幅工程において第一のプラ
イマーとして配列番号１から配列番号７、第二のプライ
マーとして配列番号８から配列番号２０のいずれかの組
合せを使用した場合には、配列番号３４の少なくとも連
続した１０塩基からなる配列、あるいはその相補配列が
好ましい。また、プローブをプライマーとした伸長反応
を抑えるためにプローブの３’末端の水酸基は化学的に
修飾（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
【００２３】上記のようなプローブ共存下で増幅工程を
行うことにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡを、一チューブ
内、一定温度、一段階で増幅し検出することが可能とな
り、自動化への適用も容易となる。
行うことにより、ＨＩＶ−１ ＲＮＡを、一チューブ
内、一定温度、一段階で増幅し検出することが可能とな
り、自動化への適用も容易となる。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。
【００２５】実施例 １ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的ＨＩＶ-1 ＲＮＡの様々な初期コヒ゜ー数における
検出を行った。
て、標的ＨＩＶ-1 ＲＮＡの様々な初期コヒ゜ー数における
検出を行った。
【００２６】（１）ＨＩＶ−１ ＲＮＡの塩基配列のう
ち、コア蛋白（ｇａｇ）の構造遺伝子を含む１６２８ｎ
ｔのＲＮＡを標準ＲＮＡとした。標準ＲＮＡはＡＣＣＲ
ＵＮ TM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ４００
（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎ
ｃ．）製）よりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出
後、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｇａｇ領域の塩基配列を含
む２本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型としたインビトロ
転写により合成、精製したＲＮＡである。
ち、コア蛋白（ｇａｇ）の構造遺伝子を含む１６２８ｎ
ｔのＲＮＡを標準ＲＮＡとした。標準ＲＮＡはＡＣＣＲ
ＵＮ TM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ Ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ４００
（ＢＢＩ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎ
ｃ．）製）よりＨＩＶ−１ ＲＮＡを定法により抽出
後、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｇａｇ領域の塩基配列を含
む２本鎖ＤＮＡを調製し、これを鋳型としたインビトロ
転写により合成、精製したＲＮＡである。
【００２７】（２）標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの紫外部
吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）を用い１０5コピー／５μ
ｌ、１０4コピー／５μｌ、１０3コピー／５μｌ、１０
2コピー／５μｌ、１０コピー／５μｌとなるよう希釈
した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈
液のみを用いた。
吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）を用い１０5コピー／５μ
ｌ、１０4コピー／５μｌ、１０3コピー／５μｌ、１０
2コピー／５μｌ、１０コピー／５μｌとなるよう希釈
した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈
液のみを用いた。
【００２８】（３）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ
（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定
濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ
（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定
濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００２９】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム １１５ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ １．０μＭの第一のプライマー（配列番号１） １．０μＭの第二のプライマー（配列番号１５）（ここ
で、第二のプライマーの塩基配列の５’ 末端側にはＴ
７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを
使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列であ
る））。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム １１５ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ １．０μＭの第一のプライマー（配列番号１） １．０μＭの第二のプライマー（配列番号１５）（ここ
で、第二のプライマーの塩基配列の５’ 末端側にはＴ
７プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを
使用した（配列番号３５において、５’末端一番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列であ
る））。
【００３０】０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド
（配列番号２７） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標
識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番
号３４のうち、５’末端から１４番目の「Ｔ」と１５番
目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入
されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修
飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
（配列番号２７） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標
識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番
号３４のうち、５’末端から１４番目の「Ｔ」と１５番
目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導入
されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で修
飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
【００３１】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、
試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラ
ウンドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。な
お、初期ＲＮＡ量は１０コピー／３０μｌから１０5コ
ピー／３０μｌである。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、
試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラ
ウンドの蛍光強度値）の経時変化を図２に示した。な
お、初期ＲＮＡ量は１０コピー／３０μｌから１０5コ
ピー／３０μｌである。
【００３２】図２より、得られた蛍光プロファイルは、
標的ＲＮＡの初期濃度に依存した。また、１０コピー／
３０μｌが約１０分で検出された。蛍光強度比が１．２
を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃
度を横軸にプロットすると、直線関係が得られた（図
３）。図３を検量線として用いることで、未知試料中に
存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの定量が可能であることが
示された。以上より、本法により、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ
の迅速・高感度かつ定量可能な検出が可能であることが
示された。
標的ＲＮＡの初期濃度に依存した。また、１０コピー／
３０μｌが約１０分で検出された。蛍光強度比が１．２
を超えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃
度を横軸にプロットすると、直線関係が得られた（図
３）。図３を検量線として用いることで、未知試料中に
存在するＨＩＶ−１ ＲＮＡの定量が可能であることが
示された。以上より、本法により、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ
の迅速・高感度かつ定量可能な検出が可能であることが
示された。
【００３３】実施例 ２ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、ＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１
ＲＮＡの検出を行った。
て、ＨＩＶ陽性血清からの核酸抽出物中のＨＩＶ−１
ＲＮＡの検出を行った。
【００３４】（１）ＨＩＶ陽性血清には、ＡＣＣＲＵＮ
TM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ５００（ＢＢ
Ｉ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）
製）を用いた。陽性血清３００μｌよりＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡを定法により抽出後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））により、推定Ｒ
ＮＡ量が１０3コピー／５μｌとなるよう希釈した。標
準ＲＮＡは実施例１と同様のものを使用した。標準ＲＮ
Ａの濃度は１０3コピー／５μｌとした。
TM３１５（商品名）、ＨＩＶ−１ＲＮＡ Ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ Ｃｏｎｔｏｒｏｌ、Ｓｅｒｉｅｓ ５００（ＢＢ
Ｉ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．）
製）を用いた。陽性血清３００μｌよりＨＩＶ−１ Ｒ
ＮＡを定法により抽出後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製））により、推定Ｒ
ＮＡ量が１０3コピー／５μｌとなるよう希釈した。標
準ＲＮＡは実施例１と同様のものを使用した。標準ＲＮ
Ａの濃度は１０3コピー／５μｌとした。
【００３５】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ
（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定
濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ
（パーキンエルマー社製））に分注し、これに上記所定
濃度のＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３６】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム １１５ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ １．０μＭの第一のプライマー（配列番号２） １．０μＭの第二のプライマー（配列番号１３）（ここ
で、第二のプライマーの塩基配列の５’末端側にはＴ７
プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使
用した（配列番号３５において、５’末端一番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列であ
る））。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム １１５ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ １．０μＭの第一のプライマー（配列番号２） １．０μＭの第二のプライマー（配列番号１３）（ここ
で、第二のプライマーの塩基配列の５’末端側にはＴ７
プロモーター配列（配列番号３５）を付加したものを使
用した（配列番号３５において、５’末端一番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列であ
る））。
【００３７】０．１６μＭの第３のオリゴヌクレオチド
（配列番号２６） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標
識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番
号３４のうち、５’ 末端から１４番目の「Ｔ」と１５
番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導
入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で
修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
（配列番号２６） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）で標
識されたオリゴヌクレオチド（配列番号３４）（配列番
号３４のうち、５’ 末端から１４番目の「Ｔ」と１５
番目の「Ｔ」の間にインターカレーター性蛍光色素が導
入されている。また３’末端の水酸基はグリコール酸で
修飾されている。） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
【００３８】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、
試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラ
ウンドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示した。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢＣＯ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、
試料の蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラ
ウンドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示した。
【００３９】図４より、ＨＩＶ陽性血清から抽出された
ＲＮＡ（推定１０3コピー／３０μｌ）が検出された。
また、対照の標準ＲＮＡ（ＲＮＡ濃度１０3コピー／３
０μｌ）と検出時間が同等であった。
ＲＮＡ（推定１０3コピー／３０μｌ）が検出された。
また、対照の標準ＲＮＡ（ＲＮＡ濃度１０3コピー／３
０μｌ）と検出時間が同等であった。
【００４０】以上のことから、本法により、ＨＩＶ陽性
血清抽出物からＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度な検
出が可能であることが示された。
血清抽出物からＨＩＶ−１ ＲＮＡの迅速・高感度な検
出が可能であることが示された。
【００４１】
【発明の効果】以上の説明のように、本願発明は、比較
的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１
℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー
領域に対して結合するオリゴヌクレオチドであって、核
酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを
提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度
なＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出方法を提供する。
的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４１
℃）で、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡの分子内構造フリー
領域に対して結合するオリゴヌクレオチドであって、核
酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを
提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度
なＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出方法を提供する。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120>ＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅および検出法 <130> 211-0459 <160> 35 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 1 actgtattat ataatgatct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 2 attatataat gatctaagtt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 3 ataatgatct aagttcttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 4 gagggttgct actgtattat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 5 caatagaggg ttgctactgt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 6 gcacacaata gagggttgct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第一のプライマー <400> 7 ttgctactgt attatataat 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 8 ggaaagaaaa aatataaatt aaaac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 9 gaaaaaatat aaattaaaac atata 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 10 aaaaatataa attaaaacat atagt 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 11 aaaatataaa ttaaaacata tagta 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 12 aaatataaat taaaacatat agtat 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 13 aatataaatt aaaacatata gtatg 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 14 atataaatta aaacatatag tatgg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 15 tataaattaa aacatatagt atggg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 16 ataaattaaa acatatagta tgggc 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 17 aaattaaaac atatagtatg ggcaa 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 18 aaaacatata gtatgggcaa gcagg 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 19 atatagtatg ggcaagcagg gagct 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第二のプライマー <400> 20 gtatgggcaa gcagggagct agaac 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 21 tttccccctg gccttaaccg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 22 ttttctttcc ccctggcctt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 23 ttttttcttt ccccctggcc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 24 attttttctt tccccctggc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 25 tattttttct ttccccctgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 26 atattttttc tttccccctg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 27 tatatttttt ctttccccct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 28 ttatattttt tctttccccc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 29 tttatatttt ttctttcccc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 30 aatttatatt ttttctttcc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 31 gttttaattt atattttttc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 32 tatatgtttt aatttatatt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第三のオリゴヌクレオチド <400> 33 catactatat gttttaattt 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴヌクレオチドプローブ <400> 34 tctgaaggga tggttgtag 19 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ｔ７ポリメレースのプロモーター配列 <400> 35 aattctaata cgactcacta tagggaga 28
【図１】実施例１、実施例２で用いたインターカレータ
ー性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインタ
ーカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜
Ｂ3は核酸塩基を示す。
ー性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインタ
ーカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜
Ｂ3は核酸塩基を示す。
【図２】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０5コピー／
３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、反応時間
とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフで
ある。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用
いた。
３０μｌから１０コピー／３０μｌにおいて、反応時間
とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフで
ある。ＮｅｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用
いた。
【図３】実施例１の結果から、蛍光強度比が１．２を超
えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を
横軸にプロットして得られた検量線である。
えた時間を検出時間として縦軸に、ＲＮＡの初期濃度を
横軸にプロットして得られた検量線である。
【図４】実施例２で行ったＨＩＶ陽性血清からの核酸抽
出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出結果から得られた、
反応時間と蛍光増加率とのグラフである。
出物中のＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出結果から得られた、
反応時間と蛍光増加率とのグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB41 DA13 FB02 FB12 2G054 AA02 AA06 CA22 EA03 4B024 AA01 CA04 CA09 CA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA18 QQ10 QQ42 QQ52 QR08 QR38 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02
Claims (5)
- 【請求項１】試料中に存在するＨＩＶ−１に由来するＲ
ＮＡの特定配列を鋳型として、該特定配列に相補的な配
列を有する第一のプライマーおよび該特定配列に相同的
な配列を有する第二のプライマー（ここで一方のプライ
マーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配
列を付加した配列を有するプライマーである）を用い、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成
し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡ二本鎖
のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
り、前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列か
らなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２
本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポ
リメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ
転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工
程において、第一のプライマーとして、配列番号１から
配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利
用され、第二のプライマーとして、配列番号８から配列
番号２０のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用
されることを特徴とする、ＨＩＶ−１由来のＲＮＡの増
幅工程。 - 【請求項２】前記特定配列と重複（１から１０塩基）し
て５’末端側に隣接する領域に対して相補的な配列を有
する第三のオリゴヌクレオチドを添加し、前記ＨＩＶ−
１由来のＲＮＡを特定配列の５’末端領域で切断（リボ
ヌクレエースＨによる）して核酸増幅初期の鋳型とする
ことを含み、第一のプライマーとして、配列番号１から
配列番号７のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利
用され、（１）第二のプライマーとして、配列番号８か
らなるオリゴヌクレオチドを利用した場合には、第三の
オリゴヌクレオチドとして、配列番号２１と配列番号２
２のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、
（２）第二のプライマーとして、配列番号９からなるオ
リゴヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌ
クレオチドとして、配列番号２２から配列番号２６のい
ずれかからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（３）
第二のプライマーとして、配列番号１０からなるオリゴ
ヌクレオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレ
オチドとして、配列番号２２から配列番号２８のいずれ
かからなるオリゴヌクレオチドが利用され、（４）第二
のプライマーとして、配列番号１１からなるオリゴヌク
レオチドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチ
ドとして、配列番号２２から配列番号２９のいずれかか
らなるオリゴヌクレオチドが利用され、（５）第二のプ
ライマーとして、配列番号１２からなるオリゴヌクレオ
チドを利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドと
して、配列番号２２から配列番号２９のいずれかからな
るオリゴヌクレオチドが利用され、（６）第二のプライ
マーとして、配列番号１３からなるオリゴヌクレオチド
を利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとし
て、配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなる
オリゴヌクレオチドが利用され、（７）第二のプライマ
ーとして、配列番号１４からなるオリゴヌクレオチドを
利用した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、
配列番号２３から配列番号３０のいずれかからなるオリ
ゴヌクレオチドが利用され、（８）第二のプライマーと
して、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドを利用
した場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号２４から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌ
クレオチドが利用され、（９）第二のプライマーとし
て、配列番号１６からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２５から配列番号３０のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１０）第二のプライマーとし
て、配列番号１７からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号２７から配列番号３１のいずれかからなるオリゴヌク
レオチドが利用され、（１１）第二のプライマーとし
て、配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３１と配列番号３２のいずれかからなるオリゴヌクレ
オチドが利用され、（１２）第二のプライマーとして、
配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドを利用した場
合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番号３
２と配列番号３３のいずれかからなるオリゴヌクレオチ
ドが利用され、又は、（１３）第二のプライマーとし
て、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドを利用し
た場合には、第三のオリゴヌクレオチドとして、配列番
号３３からなるオリゴヌクレオチドが利用される、こと
を特徴とする、請求項１に記載の増幅工程。 - 【請求項３】請求項１、２のいずれかの増幅工程を、増
幅により生じるＲＮＡ転写産物に特異的に結合可能であ
り、かつ、インターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチドプローブ（ただし、前記該標識され
たオリゴヌクレオチドは、前記第一のプライマーおよび
第二のプライマーとは異なる配列である）存在下で実施
し、反応液の蛍光特性の変化を測定することを特徴とす
る、ＨＩＶ−１の検出工程。 - 【請求項４】前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記
ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合する
ように設計され、複合体を形成していない場合と比較し
て蛍光特性が変化するものであることを特徴とする、請
求項第３に記載の検出工程。 - 【請求項５】前記オリゴヌクレオチドプローブの配列
が、配列番号３４の配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的
な配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する、請求項第４に記載の検出工程。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001129210A JP4701532B2 (ja) | 2001-04-26 | 2001-04-26 | Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法 |
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