JP4741205B2 - 金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム、その製造方法およびこれを利用する医薬 - Google Patents
金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム、その製造方法およびこれを利用する医薬 Download PDFInfo
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Description
本発明は、金属ポルフィリン錯体包埋リポソームに関し、更に詳細には、生体内において抗癌剤あるいは抗酸化剤として作用する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームおよびその製造方法に関する。
一般に、生体内で生成される数々の活性酸素種は炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、癌、糖尿病等多くの病態に関与しているといわれているが、通常生体では、これらの活性酸素種に対し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ等のラジカル消去酵素を備えてバランスを保っている。
しかしながら、生体内の癌細胞においてはスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２ −・）が多量に存在していることが知られており、これらの酵素活性の低下していることが伺える。
一方、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の疾病でも、その原因は、ＳＯＤ、カタラーゼ等のラジカル消去酵素のバランスが崩れ、Ｏ２ −・などの活性種が増加したことによるものとされている。
ところで、金属ポルフィリン錯体は高いＳＯＤ活性を示すことが報告されているので、このものを生体内に投与することにより、Ｏ２ −・を初めとする活性酸素種を有効に消去させ、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることが予想される。
しかし、金属ポルフィリン錯体を単独で生体内に投与することは、安全性や効果の点から問題も多く、現在まで医薬として利用するに至っていないのが実情である。
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、金属ポルフィリン錯体を安全に生体内に投与することができ、しかも金属ポルフィリン錯体の有するＳＯＤ活性を発揮させることのできる手段を提供することをその課題とするものである。
また、現在臨床的に用いられておりながら、副作用が大きな問題となっているシスプラチン（ＣＤＤＰ）やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）等の抗癌剤に代わる、癌細胞にのみ選択的に効果を示す抗癌剤や、活性酸素種が関連するといわれる、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病等の癌以外の疾患を治療する抗酸化剤の提供もその課題とする。
本発明者らは、癌細胞内に存在しているＯ２ −・をターゲットとし、金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性作用を利用してこの濃度を低下させる手段について、種々検討した結果、金属ポルフィリン錯体をリポソームに埋設することにより、優れたＳＯＤ活性を有したまま安全に体内に投与可能であり、しかも血液中滞留も可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームである。
また、本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとリポソーム形成能を有する脂質とを混合し、超音波処理することにより、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを製造することを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋リポソームの製造方法である。
更に本発明は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを有効成分として含有する医薬である。
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２ −・）をターゲットとし、これを確実に低減させることができるものである。
従って、癌細胞中のＯ２ −・を低下させて癌の治癒に優れた効果を奏することができ、しかもその効果は選択的であるので、副作用のない新たな抗癌剤として利用可能なものである。
また、本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、ＳＯＤ活性を有し、血液中滞留も可能であるという抗酸化剤として優れた効果を有するので、活性酸素のもたらす生体内障害から生体を守ることができるものである。
本明細書中において、「金属ポルフィリン包埋リポソーム」とは、金属ポルフィリン錯体が、リポソームを構成する脂質中に組み込まれ、その一部がリポソーム膜外に出ているか、あるいは全くリポソーム膜内に包含されているものを意味する。
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソームは、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックスと、リポソーム形成能を有する脂質とを含有するものである。
本発明の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム（以下、単に「Ｐｒ包埋リポソーム」ということがある）の構成成分であるカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤により形成するイオンコンプレックス（以下、単に「イオンコンプレックス」という）は、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体に界面活性剤を反応させることにより調製される。
このイオンコンプレックスを形成する成分の一つであるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体は、置換基としてカチオン性窒素原子を有する基を有するものであり、例えば、次の式（Ｉ）（II）または（III）で表すものを挙げることができる。
（式中、Ｒ１ないしＲ４は、Ｎ-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、-アルキルイミダゾリル基から選ばれる基を示し、Ｒ１１ないしＲ１６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ１７ないしＲ１８は、Ｎ-低級アルキルピリジル基、アルキルアンモニオフェニル基、Ｎ-アルキルイミダゾリル基を示し、Ｒ２１ないしＲ２６は、低級アルキル基または低級アルコキシ基を、Ｒ２７ないしＲ２８は、アルキルアンモニオフェニル基を示す）
より具体的には、上記（Ｉ）式において、基Ｒ１-Ｒ４がメチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ２ＭＰｙＰ）、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン（Ｔ４ＭＰｙＰ）；基Ｒ１-Ｒ４がエチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-エチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-エチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-エチルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がプロピルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-プロピルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-プロピルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-プロピルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がブチルピリジル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ブチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-ブチルピリジル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ブチルピリジル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がメチルアンモニオフェニル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルアンモニオフェニル）ポルフィリン；基Ｒ１-Ｒ４がメチルイミダゾリル基である、５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルイミダゾリル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（３-メチルイミダゾリル）ポルフィリン、５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルイミダゾリル）ポルフィリン等が挙げられる。
また、上式（II）式において、基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］（ＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がアンモニオフェニルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（アンモニオフェニルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がビニル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルイミダゾリルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルイミダゾリルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４、Ｒ１６がメチル、基Ｒ１３、Ｒ１５がメトキシ、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジメトキシ-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１-Ｒ１６がメチル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサメチル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］；基Ｒ１１-Ｒ１６がエチル、基Ｒ１７、Ｒ１８がメチルピリジルである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサエチル-６,７-ジ（メチルピリジルアミドエチル）ポルフィリン］等が挙げられる。
更に、上式（III）式において、基Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２６がメチル、基Ｒ２３、Ｒ２５がビニル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２４、Ｒ２６がメチル、基Ｒ２３、Ｒ２５がメトキシ、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジメトキシ-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１-Ｒ２６がメチル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサメチル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］；基Ｒ２１-Ｒ２６がエチル、基Ｒ２７、Ｒ２８がメチルアンモニオである、［１,２,３,４,５,８-ヘキサエチル-６,７-ジ（メチルアンモニオカルボニルエチル）ポルフィリン］等が挙げられる。
これらのカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体に配位する金属としては、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等が好ましい。
上記のうち、金属が配位した式（Ｉ）で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、K. Kalyanasundaram, Inorg. Chem., 23, 2453(1984)、 A. D. Adler et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 32, 2443(1970)、 T, Yonetani et al., J. Biol. Chem., 245, 2988(1970)、 P. Hambright, Inorg. Chem., 15, 2314(1976)等に記載の方法に準じて行うことができる。
また、金属が配位した式（II）および（III）で表されるカチオン化カチオン性ポルフィリン錯体の合成は、E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young, and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等に記載の方法に準じて行うことができる。
なお、上記した金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の化学構造を示せば下の化（３）：ＭＴ２ＭＰｙＰの化学構造式および化（４）：ＭＴ４ＭＰｙＰの化学構造式のとおりである。
一方、イオンコンプレックスを形成する別の成分の一つであるアニオン系界面活性剤としては、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩が好ましく、その例としては、ラウリン酸（ＬＡＳ）、ミリスチン酸（ＭＡＳ）、パルミチン酸（ＰＡＳ）、ステアリン酸（ＳＡＳ）、オレイン酸（ＯＡＳ）等の脂肪酸のアルカリ金属塩や、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸（ＳＴＳ）、ヘキサデシル硫酸（ＳＨＳ）、オクタデシル硫酸（ＳＯＳ）等のアルキル硫酸のアルカリ金属塩挙げることができる。なお、脂肪酸のアルカリ金属塩や、アルキル硫酸のアルカリ金属塩としては、ナトリウム、カリウム等が好ましい。
このイオンコンプレックスを形成するには、適当な溶媒中でカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を混合すれば良く、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤との配合比は、それらのモル比で、１：１ないし１：２０程度とすれば良い。
このようにして形成されたイオンコンプレックスは、リポソーム形成能を有する脂質（以下、「脂質類」という）と混合し、リポソームを形成させるための常法によりＰｒ包埋リポソームとすることができる。
脂質類としては、大豆レシチン（ＳＢＬ）、卵黄レシチン（ＥＹＬ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、モノオレオイル-モノアルキル-ホスファチジルコリン（ＭＯＭＡＰＣ）等を単独で含むリン脂質あるいはこれを主成分とし他の成分も含む基質（以下、「混合リン脂質」ということがある）。を挙げることができる。
混合リン脂質の調製にあたり、リン脂質と混合することのできる成分としては、オレイン酸（ＯＡＳ）等の脂肪酸、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）、Ｔｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）等の界面活性剤等を挙げることができる。
特に、ＤＭＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等のリン脂質、ＤＴＤＡＢ、ジメチルジヘキサデシルアンモニウムブロミド（ＤＨＤＡＢ）等のカチオン性界面活性剤、ＯＡＳ、ＳＡＳ等のアニオン性界面活性剤、ＴＷ６１、ＴＷ８０等のノニオン性界面活性剤を成分とする混合脂質系より得られるリポソームは、ｐＨ感受性リポソームとなる。そして、例えばこのリポソームが癌細胞内に取り込まれると、癌細胞内が低ｐＨであるため、このリポソーム集合体の崩壊が生じ、抗癌剤のより効果的な徐放が促される。このようなｐＨ感受性リポソームにイオンコンプレックスを包埋した系（Ｐｒ包埋／ｐＨ感受性リポソーム）も合成できる。
また、混合リン脂質として、リン脂質に周知のコレステロール（Ｃｈｏｌ）等を加えたものや、リン脂質にポリエチレングリコールまたはその誘導体を加えたものを挙げることができる。
上記イオンコンプレックスと脂質類からＰｒ包埋リポソーム形成させるには、まず、これら成分を適当な溶媒中に取り、これを十分混合させることが必要である。
リポソーム形成に当たっての、イオンコンプレックスと脂質類の使用量は、イオンコンプレックス１モルに対し、脂質類を１０から５００モル、特に５０から３００モルとすることが好ましい。
リポソームの形成は、既に公知の方法により行うことができ、例えば、上記両成分を揮発性溶媒中に溶解、混合した後、揮発性溶媒のみを揮散、除去し、次いでこれに適当な水性溶媒、例えば、精製水、生理食塩水等を加え、激しく攪拌したり、超音波処理すことによりＰｒ包埋リポソームとすることができる。
なお、必要により、水性溶媒に代えて医薬的に有効な成分を溶解した溶液や、ある種の培地等を使用することができ、これらを内包したＰｒ包埋リポソームを得ることもできる。
かくして得られたＰｒ包埋リポソームは、後記のようにその構造解析を蛍光スペクトルや動的光散乱測定等を用いて行った結果、図１に示すように、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分はリポソームの表面または脂質等の親水部に存在し、界面活性剤のアルキル側鎖は脂質の疎水性部に埋め込まれていることが示された。
また、リポソームの粒径は１００ｎｍ以下であり、体内に取り込まれた際、細胞に到達可能な大きさであることがわかった。
更に、後記するように、Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験を行った結果、当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体を投与した場合に比べ、Ｐｒ包埋リポソームを使用した場合の効果が優れており、この効果は、現在抗癌剤として使用されているシスプラチン（ＣＤＤＰ）やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）より格段に高いことが示された。
更にまた、Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性を評価したところ、このものは当該リポソームの原料である単純なカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体と同等のＳＯＤ活性を示すことがわかり、血中滞留型のＳＯＤ化合物になり得ることがわかった。
以上のように、本発明のＰｒ包埋リポソームは、優れた抗癌作用を有するものであり、癌治療の分野において抗癌剤として使用可能なものである。
従って、癌患者にこのＰｒ包埋リポソームを直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。
同様、本発明のＰｒ包埋リポソームは、優れた抗酸化作用を有し、活性酸素のもたらす生体内障害、例えば、炎症疾患、神経疾患、動脈硬化、糖尿病から生体を守ることができる。
従って、このものを炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿患者に、直接投与、静脈内投与、皮下投与等により投与することによって当該患者の癌を治療することができる。
以下に、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実 施 例 １
鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌを１００℃まで攪拌・加熱後、２-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌ（０.１５８ｍｏｌ）を加えた。その後、ピロール １２ｍｌ（０.１７３ｍｏｌ）を注射器で少しずつ滴下し、１００℃で１時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic type I、クロロホルム）を行い、生成物である５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.１ｇ、収率４.４％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.８２（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、７.７２〜９.１４（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.８７（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１８、５１３、５４４、５８６、６４５
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下でジメチルホルムアミド １５０ｍｌに上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン ０.２ｇ（３.２×１０−４ｍｏｌ）を加えて溶解させ、さらに、鉄 ０.２ｇと４８％臭化水素酸 ５ｍｌより得た臭化鉄（ＦｅＢｒ２）を加えて４時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。
抽出、カラムカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、前駆体の鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量０.２１ｇ、収率９４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
４０８、５１２、５６６
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）ジメチルホルムアミド ３０ｍｌ中に、上記（２）で得た鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］ ０.１ｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル ６ｍｌとを加え、１３０℃で５時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、目的物質であるＦｅＴ２ＭＰｙＰを得た（収率９１％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４０８、５８４
元素分析（％）：
Ｆｏｕｎｄ. Ｃ７５.１１、Ｈ３.９７、Ｎ１７.６６、Ｃ／Ｎ４.２５
Ｃａｌｃｄ. Ｃ７７.５８、Ｈ４.２４、Ｎ１８.１２、Ｃ／Ｎ４.２８
（４）工程（１）において、２-ピリジルカルボキシアルデヒドを４-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にして鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＭＴ４ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）も上記に準じて合成できる。
鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌを１００℃まで攪拌・加熱後、２-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌ（０.１５８ｍｏｌ）を加えた。その後、ピロール １２ｍｌ（０.１７３ｍｏｌ）を注射器で少しずつ滴下し、１００℃で１時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic type I、クロロホルム）を行い、生成物である５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.１ｇ、収率４.４％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.８２（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、７.７２〜９.１４（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.８７（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１８、５１３、５４４、５８６、６４５
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、アルゴン（Ａｒ）雰囲気下でジメチルホルムアミド １５０ｍｌに上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン ０.２ｇ（３.２×１０−４ｍｏｌ）を加えて溶解させ、さらに、鉄 ０.２ｇと４８％臭化水素酸 ５ｍｌより得た臭化鉄（ＦｅＢｒ２）を加えて４時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。
抽出、カラムカラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、前駆体の鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量０.２１ｇ、収率９４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
４０８、５１２、５６６
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）ジメチルホルムアミド ３０ｍｌ中に、上記（２）で得た鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-ピリジル）ポルフィリン］ ０.１ｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル ６ｍｌとを加え、１３０℃で５時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー（アルミナ basic typeＩ、メタノール）を行い、目的物質であるＦｅＴ２ＭＰｙＰを得た（収率９１％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４０８、５８４
元素分析（％）：
Ｆｏｕｎｄ. Ｃ７５.１１、Ｈ３.９７、Ｎ１７.６６、Ｃ／Ｎ４.２５
Ｃａｌｃｄ. Ｃ７７.５８、Ｈ４.２４、Ｎ１８.１２、Ｃ／Ｎ４.２８
（４）工程（１）において、２-ピリジルカルボキシアルデヒドを４-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にして鉄［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＦｅＭＴ４ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）も上記に準じて合成できる。
実 施 例 ２
鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］ ５００ｍｇ（８.１×１０−４ｍｏｌ）を含むテトラハイドロフラン／トリエチルアミン溶液（１０：１）１１０ｍｌを冷却し、これにクロロギ酸エチル ０.３３ｍｌ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えて９０分間反応させた。さらに、４-アミノピリジン ０.２０ｇ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えてさらに１時間反応させ、その後室温で１晩放置した。
溶媒を留去した後、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／水（９／１）］、再結晶により精製し、前駆体である鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］を得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８５、５９６、６４３
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７６７
（２）次に、上記の前駆体 ３０ｍｇ（３.９×１０−５ｍｏｌ）およびｐ-トルエンスルホン酸メチル ０.７５ｍｌをジメチルホルムアミド ２０ｍｌ中に溶解させて還流（１３０℃、５時間）した。室温まで冷却し、その後溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー［酸性アルミナ、メタノール］で精製し、目的物質であるＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８１、５７９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７９７
（３）工程（１）の鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］に代え、他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］を使用し、工程（１）および工程（２）と同様にして他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）を合成することができる。
鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］ ５００ｍｇ（８.１×１０−４ｍｏｌ）を含むテトラハイドロフラン／トリエチルアミン溶液（１０：１）１１０ｍｌを冷却し、これにクロロギ酸エチル ０.３３ｍｌ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えて９０分間反応させた。さらに、４-アミノピリジン ０.２０ｇ（２.０×１０−３ｍｏｌ）を加えてさらに１時間反応させ、その後室温で１晩放置した。
溶媒を留去した後、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／水（９／１）］、再結晶により精製し、前駆体である鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］を得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８５、５９６、６４３
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７６７
（２）次に、上記の前駆体 ３０ｍｇ（３.９×１０−５ｍｏｌ）およびｐ-トルエンスルホン酸メチル ０.７５ｍｌをジメチルホルムアミド ２０ｍｌ中に溶解させて還流（１３０℃、５時間）した。室温まで冷却し、その後溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー［酸性アルミナ、メタノール］で精製し、目的物質であるＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを得た（収量３０ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（メタノール、ｎｍ）：
３９８、４８１、５７９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７９７
（３）工程（１）の鉄［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］に代え、他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン］を使用し、工程（１）および工程（２）と同様にして他の金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）を合成することができる。
実 施 例 ３
マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌ中に４-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌを加えて加温し、１００℃になった後にピロール１２ｍｌを加えて１時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、クロロホルム）等で生成し、紫色結晶として５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.６８ｇ、収率７.０８％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.９（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、８.２〜９.１（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.９（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１７、５１３、５４６、５８９、６４１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン １００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 １００ｍｌを、アルゴン（Ａｒ）置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ３７０ｍｇを加えて、Ａｒ下で３時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、抽出、減圧乾燥等を行い、マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量８１.８ｍｇ、収率７５.２％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４７７、５７９、６１１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）次に、上記のマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］ ２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル １２ｍｌとを反応させた（１２０℃、５時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー［（１）酸性アルミナおよび（２）塩基性アルミナ、メタノール］を行い、目的物質であるＭｎＴ４ＭＰｙＰを得た（収量１５３ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４６２、５５９、６３６
（４）工程（１）において、４-ピリジルカルボキシアルデヒドを２-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にしてマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）も上記と同様にして合成できる。
マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ）の合成：
（１）プロピオン酸 ５００ｍｌ中に４-ピリジルカルボキシアルデヒド １５ｍｌを加えて加温し、１００℃になった後にピロール１２ｍｌを加えて１時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、クロロホルム）等で生成し、紫色結晶として５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリンを得た（収量１.６８ｇ、収率７.０８％）。
１Ｈ-ＮＭＲ δＨ（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
-２.９（ピロールＮＨのＨ、２Ｈ）、８.２〜９.１（ピリジンのＨ、１６Ｈ）、８.９（ピロールのＨ、８Ｈ）
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４１７、５１３、５４６、５８９、６４１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６１９、６２０
（２）次に、上記（１）で得た５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン １００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 １００ｍｌを、アルゴン（Ａｒ）置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ３７０ｍｇを加えて、Ａｒ下で３時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、抽出、減圧乾燥等を行い、マンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］を得た（収量８１.８ｍｇ、収率７５.２％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４７７、５７９、６１１
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
６７２
（３）次に、上記のマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-ピリジル）ポルフィリン］ ２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチル １２ｍｌとを反応させた（１２０℃、５時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー［（１）酸性アルミナおよび（２）塩基性アルミナ、メタノール］を行い、目的物質であるＭｎＴ４ＭＰｙＰを得た（収量１５３ｍｇ）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
４６２、５５９、６３６
（４）工程（１）において、４-ピリジルカルボキシアルデヒドを２-ピリジルカルボキシアルデヒドに変える以外は上記（１）工程ないし（３）工程と同様にしてマンガン［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ）を得た。他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）および他の金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）も上記と同様にして合成できる。
実 施 例 ４
マンガン［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）ＥＣ法［例えば、 E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等］に基づき、１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン（プロトホルフィリンＩＸ） １ｇとクロロギ酸エチル ２ｍｌをテトラヒドロフラン／トリエチルアミン（２５０／３ｍｌ）中、０℃で１時間反応させ、酸クロライド体を得た。
この酸クロライド体と４-アミノピリジン １.６８ｇを同一条件で２時間反応させ、さらに、室温で終夜反応させた。反応後、エバポレーション、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／クロロホルム（１／９）］を行い、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.４６９g、収率６８.４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４０７、５０６、５４２、５７５、６２９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７１５
（２）次に、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン ２００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 ２００ｍｌをＡｒ置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ６８６ｍｇを加えて、Ａｒ下で６時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、洗浄、減圧乾燥等を行い、マンガン［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.１０６ｍｇ、収率４５.７％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
３８７、４６５、５５７、６２１
（３）更に、上記のマンガン錯体２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチルを９ｍｌとを反応させた（１４０℃、６時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー（酸性アルミナ、メタノール）を行い、目的物質であるＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ［収量８０.５ｍｇ、収率３７.５％］を得た。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
３８９、４６７、５５６、６２２
マンガン［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の合成：
（１）ＥＣ法［例えば、 E. Tsuchida, H. Nishide, H. Yokoyama, R. Young and C. K. Chang, Chem. Lett., 1984, 991等］に基づき、１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（カルボキシルエチル）］ポルフィリン（プロトホルフィリンＩＸ） １ｇとクロロギ酸エチル ２ｍｌをテトラヒドロフラン／トリエチルアミン（２５０／３ｍｌ）中、０℃で１時間反応させ、酸クロライド体を得た。
この酸クロライド体と４-アミノピリジン １.６８ｇを同一条件で２時間反応させ、さらに、室温で終夜反応させた。反応後、エバポレーション、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／クロロホルム（１／９）］を行い、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.４６９g、収率６８.４％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
４０７、５０６、５４２、５７５、６２９
ＦＡＢ-Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ）：
７１５
（２）次に、［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリン ２００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液 ２００ｍｌをＡｒ置換した後、酢酸マンガン・四水和物 ６８６ｍｇを加えて、Ａｒ下で６時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、洗浄、減圧乾燥等を行い、マンガン［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-ピリジルアミドエチル）］ポルフィリンを得た（収量０.１０６ｍｇ、収率４５.７％）。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（クロロホルム、ｎｍ）：
３８７、４６５、５５７、６２１
（３）更に、上記のマンガン錯体２００ｍｇとｐ-トルエンスルホン酸メチルを９ｍｌとを反応させた（１４０℃、６時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー（酸性アルミナ、メタノール）を行い、目的物質であるＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ［収量８０.５ｍｇ、収率３７.５％］を得た。
ＵＶ-ｖｉｓ λｍａｘ（水、ｎｍ）：
３８９、４６７、５５６、６２２
実 施 例 ５
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その１）：
試験管に、実施例２で得たＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ １μｍｏｌおよび脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ） ２００μｍｏｌを取り、更に少量のメタノールを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 １０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（室温、１ｈｒ）および濾過滅菌（０.２２μｍφ）を行い、ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品１）を得た。
同様、実施例４で得たＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍとＤＭＰＣを用い、ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品２）を得た。
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その１）：
試験管に、実施例２で得たＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ １μｍｏｌおよび脂質であるジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ） ２００μｍｏｌを取り、更に少量のメタノールを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 １０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（室温、１ｈｒ）および濾過滅菌（０.２２μｍφ）を行い、ＦｅＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品１）を得た。
同様、実施例４で得たＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍとＤＭＰＣを用い、ＭｎＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍを包埋したＤＭＰＣリポソーム（本発明品２）を得た。
実 施 例 ６
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その２）：
（１）カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体であり、実施例１で得られたＦｅＴ２ＭＰｙＰ１.４ｍｇ（１μｍｏｌ）と、界面活性剤であるＳＡＳ０.３ｍｇ（１μｍｏｌ）を試験管に取り、これに溶媒としてメタノール５ｍｌを加えて混合し、イオンコンプレックス１（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ）を調製した。
また、上記のＳＡＳ １μｍｏｌに代え、ＳＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）およびＯＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）を用い、それぞれイオンコンプレックス２（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）およびイオンコンプレックス３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ）を得た。
同様に、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体として、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（モル比１：１）、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（モル比１：１）を用い、界面活性剤として、ＳＡＳ、ＯＡＳを用い、表１に示すようなイオンコンプレックス４-１４を調製した。
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その２）：
（１）カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体であり、実施例１で得られたＦｅＴ２ＭＰｙＰ１.４ｍｇ（１μｍｏｌ）と、界面活性剤であるＳＡＳ０.３ｍｇ（１μｍｏｌ）を試験管に取り、これに溶媒としてメタノール５ｍｌを加えて混合し、イオンコンプレックス１（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ）を調製した。
また、上記のＳＡＳ １μｍｏｌに代え、ＳＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）およびＯＡＳ １.２ｍｇ（４μｍｏｌ）を用い、それぞれイオンコンプレックス２（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）およびイオンコンプレックス３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ）を得た。
同様に、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体として、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ２ＭＰｙＰ（モル比１：１）、ＦｅＴ４ＭＰｙＰ＋ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（モル比１：１）を用い、界面活性剤として、ＳＡＳ、ＯＡＳを用い、表１に示すようなイオンコンプレックス４-１４を調製した。
（２）次に、試験管に上記のイオンコンプレックス１（１μｍｏｌ）と、脂質であるＤＭＰＣ ０.１３５ｇ（２００μｍｏｌ）を取り、溶媒として少量のクロロホルムを用いて混合した。溶媒を留去して薄膜を形成させた後、そこに生理食塩水 １０ｍｌ加え、超音波処理（Ａｒ下、氷浴中、３０Ｗ、３０ｍｉｎ、プローブ型超音波照射装置）を行った。超音波処理後、静置（室温、１ｈｒ）および濾過滅菌（０.２２μｍφ）し、Ｐｒ包埋リポソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム；本発明品３）を得た。
同様、イオンコンプレックス２とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス４とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス５とＤＭＰＣを用い、Ｐｒ包埋リポソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品４；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品５；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品６）を得た。
また、イオンコンプレックス４と卵黄レシチン（ＥＹＬ）より、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソーム（本発明品７）を得た。
同様、イオンコンプレックス２とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス４とＤＭＰＣ、イオンコンプレックス５とＤＭＰＣを用い、Ｐｒ包埋リポソーム（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品４；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品５；ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム／本発明品６）を得た。
また、イオンコンプレックス４と卵黄レシチン（ＥＹＬ）より、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソーム（本発明品７）を得た。
実 施 例 ７
Ｐｒ包埋／ｐＨ感受性リポソームの合成：
（１）ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、オレイン酸（ＯＡＳ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）、Ｔｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）等を用い、表２に示す混合脂質Ａ〜Ｄを調製した。
Ｐｒ包埋／ｐＨ感受性リポソームの合成：
（１）ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、オレイン酸（ＯＡＳ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）、Ｔｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）等を用い、表２に示す混合脂質Ａ〜Ｄを調製した。
（２）表２に示す混合脂質ＡないしＤ、２０２μｍｏｌと、実施例６で得たイオンコンプレックス１ １μｍｏｌとを用い、ｐＨ感受性Ｐｒ包埋リポソーム（本発明品８〜１１）を実施例６（２）と同様にして調製した。
実 施 例 ８
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その４）：
表１に示すイオンコンプレックス３ １μｍｏｌと、 表２に示す脂質Ａ、ＢおよびＤ ２００μｍｏｌを、表３に示す組み合わせて用い、以下実施例６（２）と同様にしてｐＨ感受性Ｐｒ包埋リポソーム（本発明品１２〜１４）調製した。
Ｐｒ包埋リポソームの合成（その４）：
表１に示すイオンコンプレックス３ １μｍｏｌと、 表２に示す脂質Ａ、ＢおよびＤ ２００μｍｏｌを、表３に示す組み合わせて用い、以下実施例６（２）と同様にしてｐＨ感受性Ｐｒ包埋リポソーム（本発明品１２〜１４）調製した。
実 施 例 ９
Ｐｒ包埋リポソームの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察：
Ｐｒ包埋リポソームの形態、粒径等を評価するため、凍結割断レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察（ＪＥＯＬ、ＪＥＭ-１２００ＥＸ）を行った。実施例６で得たＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）のＴＥＭ観察より、粒径が１００ｎｍ以下の二分子膜小胞体であるリポソームが形成されていることがわかり、さらに、精査すると２０〜３０ｎｍ程度および５０〜６０ｎｍｍｉｎ程度の平均粒径といった２つの粒径分布を有する二分子膜小胞体（リポソーム）が観測された。
Ｐｒ包埋リポソームの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察：
Ｐｒ包埋リポソームの形態、粒径等を評価するため、凍結割断レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察（ＪＥＯＬ、ＪＥＭ-１２００ＥＸ）を行った。実施例６で得たＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）のＴＥＭ観察より、粒径が１００ｎｍ以下の二分子膜小胞体であるリポソームが形成されていることがわかり、さらに、精査すると２０〜３０ｎｍ程度および５０〜６０ｎｍｍｉｎ程度の平均粒径といった２つの粒径分布を有する二分子膜小胞体（リポソーム）が観測された。
実 施 例 １０
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームの粒径および粒径分布を測定するため動的光散乱測定（ Nicomp 370、Particle Sizing System）を行った。例えば、実施例９に従い合成したＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）の動的光散乱測定より、体積分布では平均粒径２４.６ｎｍのものが６１.２％、５８.４ｎｍのものが３８.８％の２種類存在していた（数分布では平均粒径２３.２ｎｍのものが９４.５％、５２.５ｎｍのものが５.５％）。この結果はＴＥＭ観察による粒径分布の結果と対応した。
また、実施例５ないし６で合成したＰｒ包埋リポソームの動的光散乱測定結果を表４に示す。
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームの粒径および粒径分布を測定するため動的光散乱測定（ Nicomp 370、Particle Sizing System）を行った。例えば、実施例９に従い合成したＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）の動的光散乱測定より、体積分布では平均粒径２４.６ｎｍのものが６１.２％、５８.４ｎｍのものが３８.８％の２種類存在していた（数分布では平均粒径２３.２ｎｍのものが９４.５％、５２.５ｎｍのものが５.５％）。この結果はＴＥＭ観察による粒径分布の結果と対応した。
また、実施例５ないし６で合成したＰｒ包埋リポソームの動的光散乱測定結果を表４に示す。
表４より、どのＰｒ包埋リポソームの平均粒径も１００ｎｍ以下であり、体内に投与した場合毛細血管内皮を越えて目的の細胞に到達可能であることが明らかとなった。
実 施 例 １１
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その２）：
実施例１０と同様にして、実施例６に従い合成したＭｎＴ４ＭＰｙＰ-１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品６）について動的光散乱測定を行った。
この結果、本発明品５の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.８％で、残りは平均粒径１７３ｎｍのものが０.２％程度）、本発明品６の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.７％で、残りは平均粒径１７１ｎｍのものが０.３％程度）であり、いずれもその平均粒径１００ｎｍ以下であって生体内投与しても問題の無い大きさであった。
Ｐｒ包埋リポソームの動的光散乱測定（その２）：
実施例１０と同様にして、実施例６に従い合成したＭｎＴ４ＭＰｙＰ-１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品６）について動的光散乱測定を行った。
この結果、本発明品５の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.８％で、残りは平均粒径１７３ｎｍのものが０.２％程度）、本発明品６の平均粒径は２９ｎｍ（分布割合が９９.７％で、残りは平均粒径１７１ｎｍのものが０.３％程度）であり、いずれもその平均粒径１００ｎｍ以下であって生体内投与しても問題の無い大きさであった。
実 施 例 １２
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定：
（１）Ｐｒ包埋リポソームにおいて、包埋したポルフィリン錯体がリポソーム内のどの位置に存在しているかを評価するため、Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣ）を行った。
この測定においては、金属ポルフィリン錯体は一般に蛍光消光するため、金属ポルフィリン錯体に代え、金属挿入を行っていないカチオン化カチオン性金属フリーポルフィリン錯体（以下、「金属フリー錯体」という）を実施例１、２等に準じて合成し、これを蛍光プローブとして用いた。また、金属フリー錯体包埋リポソームの合成は実施例５〜６に準じて行った。（以下、金属フリー錯体の略号としては、Ｍの代わりにカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体の略号中のＭを、Ｈ２に代えて示す。例えば、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）の金属フリー錯体はＨ２Ｔ２ＭＰｙＰと、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の金属フリー体ではＨ２Ｔ４ＭＰｙＰと示す。）
上記のようにして、調製したカチオン化カチオン性金属フリー錯体包埋リポソーム、例えば、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＨ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ 含有各種溶液におけるＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトル測定（励起波長４５６ｎｍ、測定波長範囲５００〜８００ｎｍ）を行ったところ、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム水溶液では６４２ｎｍにピークを有する蛍光スペクトル（６４２ｎｍでの相対蛍光強度４３％）が得られ、メタノール（４７％）、エタノール（５４％）、プロパノール（５４％）、ブタノール（５５％）、エチレングリコール（６３％）等の各種溶媒中でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルも同様のスペクトル波形および強度であった。しかし、水でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは６４２ｎｍ付近のピークがブロードし、強度も大きく低下した（１１％）。
これより、リポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。また、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの結果も同様であった。
一方、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは、６５０ｎｍ付近にピークを示し、そのピーク強度は水およびメタノール中でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光強度の中間であった（蛍光強度 水＜包埋リポソーム溶液＜メタノール）。これより、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液のＨ２Ｔ４ＭＰｙＰは水環境に存在するものよりもやや非極性な（やや疎水的な）環境に存在すると判断される。
（２）次に、リポソームの二分子膜親水部付近に存在して二分子膜の極性、流動性等の指標となる蛍光プローブである８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を用いた蛍光スペクトル測定を行った。まず、メタノール、メタノール／クロロホルムおよびＡＮＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ポルフィリン錯体は包埋されていない）溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルは、どれも４８５ｎｍ（励起波長３８５ｎｍ）にピークを示す類似のスペクトルとなった。次に、ポルフィリン錯体とＡＮＳを一緒に包埋したＤＭＰＣリポソーム溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルを測定したところ、４８５ｎｍではなく４５０および５００ｎｍの２つのピークを示し、これら２つのピーク蛍光強度も４８５ｎｍでのそれに比べて減少した。この付近にポルフィリン錯体のＳｏｒｅｔ帯の吸収ピークが存在することより、ＡＮＳとポルフィリン錯体の相互作用が生じたと考えられ、ポルフィリン錯体はＡＮＳ近傍に存在すると考えられる。これらのことよりリポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定：
（１）Ｐｒ包埋リポソームにおいて、包埋したポルフィリン錯体がリポソーム内のどの位置に存在しているかを評価するため、Ｐｒ包埋リポソームの蛍光スペクトル測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣ）を行った。
この測定においては、金属ポルフィリン錯体は一般に蛍光消光するため、金属ポルフィリン錯体に代え、金属挿入を行っていないカチオン化カチオン性金属フリーポルフィリン錯体（以下、「金属フリー錯体」という）を実施例１、２等に準じて合成し、これを蛍光プローブとして用いた。また、金属フリー錯体包埋リポソームの合成は実施例５〜６に準じて行った。（以下、金属フリー錯体の略号としては、Ｍの代わりにカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体の略号中のＭを、Ｈ２に代えて示す。例えば、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）の金属フリー錯体はＨ２Ｔ２ＭＰｙＰと、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の金属フリー体ではＨ２Ｔ４ＭＰｙＰと示す。）
上記のようにして、調製したカチオン化カチオン性金属フリー錯体包埋リポソーム、例えば、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＨ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ 含有各種溶液におけるＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトル測定（励起波長４５６ｎｍ、測定波長範囲５００〜８００ｎｍ）を行ったところ、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム水溶液では６４２ｎｍにピークを有する蛍光スペクトル（６４２ｎｍでの相対蛍光強度４３％）が得られ、メタノール（４７％）、エタノール（５４％）、プロパノール（５４％）、ブタノール（５５％）、エチレングリコール（６３％）等の各種溶媒中でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルも同様のスペクトル波形および強度であった。しかし、水でのＨ２Ｔ２ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは６４２ｎｍ付近のピークがブロードし、強度も大きく低下した（１１％）。
これより、リポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。また、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、Ｈ２Ｔ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの結果も同様であった。
一方、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは、６５０ｎｍ付近にピークを示し、そのピーク強度は水およびメタノール中でのＨ２Ｔ４ＭＰｙＰの蛍光強度の中間であった（蛍光強度 水＜包埋リポソーム溶液＜メタノール）。これより、Ｈ２Ｔ４ＭＰｙＰ-４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム溶液のＨ２Ｔ４ＭＰｙＰは水環境に存在するものよりもやや非極性な（やや疎水的な）環境に存在すると判断される。
（２）次に、リポソームの二分子膜親水部付近に存在して二分子膜の極性、流動性等の指標となる蛍光プローブである８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を用いた蛍光スペクトル測定を行った。まず、メタノール、メタノール／クロロホルムおよびＡＮＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ポルフィリン錯体は包埋されていない）溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルは、どれも４８５ｎｍ（励起波長３８５ｎｍ）にピークを示す類似のスペクトルとなった。次に、ポルフィリン錯体とＡＮＳを一緒に包埋したＤＭＰＣリポソーム溶液中でのＡＮＳの蛍光スペクトルを測定したところ、４８５ｎｍではなく４５０および５００ｎｍの２つのピークを示し、これら２つのピーク蛍光強度も４８５ｎｍでのそれに比べて減少した。この付近にポルフィリン錯体のＳｏｒｅｔ帯の吸収ピークが存在することより、ＡＮＳとポルフィリン錯体の相互作用が生じたと考えられ、ポルフィリン錯体はＡＮＳ近傍に存在すると考えられる。これらのことよりリポソームに包埋されたＨ２Ｔ２ＭＰｙＰは上記のアルコール類と類似の極性環境に存在し、二分子膜の親水部付近に存在すると考えられる。
実 施 例 １３
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その１）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在する８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ、５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜の相転移温度（Ｔｃ＝２３℃）付近で蛍光偏光度の減少がみられた。これに対し、ＡＮＳを含有した本発明品３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、上記のブランクと同様にＴｃ付近で蛍光偏光度の減少が見られたが、その減少の度合いは小さいものであった。この度合いの低下はＦｅＴ２ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。また、ｐＨ感受性ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでの結果も同様であった。
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その１）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在する８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ、５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜の相転移温度（Ｔｃ＝２３℃）付近で蛍光偏光度の減少がみられた。これに対し、ＡＮＳを含有した本発明品３（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係では、上記のブランクと同様にＴｃ付近で蛍光偏光度の減少が見られたが、その減少の度合いは小さいものであった。この度合いの低下はＦｅＴ２ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。また、ｐＨ感受性ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでの結果も同様であった。
実 施 例 １４
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その２）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在するＡＮＳ（５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係（逆シグモイダル曲線）より、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜のゲル-液晶相転移温度（Ｔｃ）は約２３℃となった。ＡＮＳを含有した本発明品５（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係は、上記のブランクに比べやや低温側に移行し、縦軸の偏光度もゲル領域で減少した。これらのことは、ＭｎＴ４ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣとの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
Ｐｒ包埋リポソームの蛍光偏光解消測定（その２）：
蛍光プローブとして二分子膜の親水部近傍に存在するＡＮＳ（５０μＭ）を用いたＰｒ包埋リポソームにおける蛍光偏光解消測定（島津製作所、ＲＦ-５３００ＰＣおよびＲＦ-５４０／５０００用偏光測定付属装置；測定温度範囲５〜４５℃、励起波３８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を行った。
ＡＮＳを含有したＤＭＰＣリポソーム（ブランク） の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係（逆シグモイダル曲線）より、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜のゲル-液晶相転移温度（Ｔｃ）は約２３℃となった。ＡＮＳを含有した本発明品５（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム）の蛍光偏光解消測定の温度-偏光度の関係は、上記のブランクに比べやや低温側に移行し、縦軸の偏光度もゲル領域で減少した。これらのことは、ＭｎＴ４ＭＰｙＰとＳＡＳのイオンコンプレックスとＤＭＰＣとの相互作用に基づくものであり、当該イオンコンプレックスがＤＭＰＣリポソーム二分子膜中に存在することを裏付けている。
実 施 例 １５
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その１）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム系（本発明品４、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、参照試料としては、対応するカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）を用いた。また、細胞としては、マウス肺ガン癌細胞［Lewis Lung Carcinoma(LLC)、理研ジーンバンク）を用いた。
試験は、１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地で、マウス肺ガン癌細胞を培養し、次いで細胞数計測および細胞濃度調製を行った細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加え（１００μｌ／ｗｅｌｌ、細胞数１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、二酸化炭素インキュベーター（ＣＯ２５％）内で２４時間培養した。ウェルプレート内の培地を除去後、予め調製しておいた各濃度の試料溶液を添加し（１００ｌ／ｗｅｌｌ、試料濃度０〜１００μＭ）、さらにＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。
濾過滅菌したアラマー・ブルー溶液を、１０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、さらに５時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定（測定波長５７０ｎｍおよび参照波長６００ｎｍ）を行った。
この結果、図２のように本発明のＰｒ包埋リポソーム（リポソーム系）はカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系に比べてより良い抗癌特性を示した。
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その１）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム系（本発明品４、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、参照試料としては、対応するカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ）を用いた。また、細胞としては、マウス肺ガン癌細胞［Lewis Lung Carcinoma(LLC)、理研ジーンバンク）を用いた。
試験は、１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地で、マウス肺ガン癌細胞を培養し、次いで細胞数計測および細胞濃度調製を行った細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加え（１００μｌ／ｗｅｌｌ、細胞数１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、二酸化炭素インキュベーター（ＣＯ２５％）内で２４時間培養した。ウェルプレート内の培地を除去後、予め調製しておいた各濃度の試料溶液を添加し（１００ｌ／ｗｅｌｌ、試料濃度０〜１００μＭ）、さらにＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。
濾過滅菌したアラマー・ブルー溶液を、１０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、さらに５時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定（測定波長５７０ｎｍおよび参照波長６００ｎｍ）を行った。
この結果、図２のように本発明のＰｒ包埋リポソーム（リポソーム系）はカチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）およびイオンコンプレックス系に比べてより良い抗癌特性を示した。
実 施 例 １６
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その２）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
本試験の試験試料としては、各種のＰｒ包埋リポソーム（金属ポルフィリン錯体濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を用い、参照試料としては、上記Ｐｒ包埋リポソームの成分である金属ポルフィリン錯体（濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）およびリポソーム（濃度、２５００、５０００、１００００、２００００μＭ）を用いた。（どちらもＰｒ包埋リポソームの濃度に対応させた。）
また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）等を用いた。実施例１５と同様に試験したところ、次のような結果が得られた。
まず、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ２ＭＰｙＰを用いた系での結果は、図３および図４に示されるが、図３からは、参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、イオンコンプレックスであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ並びに公知の抗癌剤であるＣＤＤＰおよびＭＭＣのどれもが、添加濃度の増大と共にＬＬＣの細胞生存率の低下が見られ、特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度２５μＭ以上におけるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳのＬＬＣ細胞生存率はＣＤＤＰおよびＭＭＣのそれらに比べ低くかった示される。一方図４からは、試験試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品３）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）が高い殺細胞作用を有し、これは参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳイオンコンプレックス、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳイオンコンプレックス、ＣＤＤＰおよびＭＭＣよりも優れたものであった。
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その２）：
本発明のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
本試験の試験試料としては、各種のＰｒ包埋リポソーム（金属ポルフィリン錯体濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を用い、参照試料としては、上記Ｐｒ包埋リポソームの成分である金属ポルフィリン錯体（濃度０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）およびリポソーム（濃度、２５００、５０００、１００００、２００００μＭ）を用いた。（どちらもＰｒ包埋リポソームの濃度に対応させた。）
また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）等を用いた。実施例１５と同様に試験したところ、次のような結果が得られた。
まず、金属ポルフィリン錯体としてＦｅＴ２ＭＰｙＰを用いた系での結果は、図３および図４に示されるが、図３からは、参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、イオンコンプレックスであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ並びに公知の抗癌剤であるＣＤＤＰおよびＭＭＣのどれもが、添加濃度の増大と共にＬＬＣの細胞生存率の低下が見られ、特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ濃度２５μＭ以上におけるＦｅＴ２ＭＰｙＰ、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳのＬＬＣ細胞生存率はＣＤＤＰおよびＭＭＣのそれらに比べ低くかった示される。一方図４からは、試験試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品３）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）が高い殺細胞作用を有し、これは参照試料であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳイオンコンプレックス、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳイオンコンプレックス、ＣＤＤＰおよびＭＭＣよりも優れたものであった。
これら、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのどちらでも、添加濃度の増大と共にＬＬＣ細胞生存率の低下が見られ、添加濃度２５μＭ以上で細胞生存率０％となっていた。
このように、Ｐｒ包埋リポソームであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームは、金属ポルフィリンのイオンコンプレックス、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体および現在使用されている抗癌剤と比べ、最も効果的な抗癌特性を示している（例えば、添加濃度５０μＭにおいて抗癌特性は現在使用されている抗癌剤＜イオンコンプレックス＜カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体＜Ｐｒ包埋リポソームの順に増大している）。これより、Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤であるといえる。
このように、Ｐｒ包埋リポソームであるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームは、金属ポルフィリンのイオンコンプレックス、カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体および現在使用されている抗癌剤と比べ、最も効果的な抗癌特性を示している（例えば、添加濃度５０μＭにおいて抗癌特性は現在使用されている抗癌剤＜イオンコンプレックス＜カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体＜Ｐｒ包埋リポソームの順に増大している）。これより、Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤であるといえる。
実 施 例 １７
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その３）：
ｐＨ感受性のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ｐＨ感受性であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質４リポソーム（本発明品１４）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）（濃度：０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）を用いた。
この結果を図５に示すが、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームが最も効果的な抗癌特性を示し、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームがこれに次ぐものであった（例えば、添加濃度１２.５μＭにおいて抗癌特性はＣＤＤＰおよびＭＭＣ＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの順に増大している）。
特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでは、１２.５μＭといった低濃度添加でも細胞生存率がほぼ０％となっていることから、本発明のカチオン化カチオン性Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤として利用可能であることが見い出された。
Ｐｒ包埋リポソームの抗癌特性試験（その３）：
ｐＨ感受性のＰｒ包埋リポソームの抗癌特性を、実施例１５と同様、アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ）法を用いた殺細胞試験（細胞死試験）により調べた。
試験試料としては、ｐＨ感受性であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質４リポソーム（本発明品１４）およびＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品４）（濃度：０、１２.５、２５、５０、１００μＭ）を、また、比較試料としては、現在用いられている抗癌剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ、濃度０、１０、２０、４０、８０μＭ）およびマイトマイシンＣ（ＭＣＣ、濃度０、７.５、１５、３０、６０μＭ）を用いた。
この結果を図５に示すが、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームが最も効果的な抗癌特性を示し、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームがこれに次ぐものであった（例えば、添加濃度１２.５μＭにおいて抗癌特性はＣＤＤＰおよびＭＭＣ＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム＜ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームの順に増大している）。
特に、ＦｅＴ２ＭＰｙＰ＋４ＯＡＳ包埋混合脂質Ｄリポソームでは、１２.５μＭといった低濃度添加でも細胞生存率がほぼ０％となっていることから、本発明のカチオン化カチオン性Ｐｒ包埋リポソームは優れた抗癌剤として利用可能であることが見い出された。
実 施 例 １８
金属ポルフィリン錯体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の相互作用：
一般に、大過剰の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下において、低分子の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、Ｈ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易いことが報告されている［ R. F. Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979）］。ここで、低分子系金属ポルフィリンであるＭｎＴ４ＭＰｙＰ、リポソーム（高分子）系であるＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびマンガン［５,１０,１５,２０-テトラ（３-フリル）ポルフィリン］［ＭｎＴ３ＦｕＰ］包埋ＤＭＰＣリポソーム１）（比較品）とＨ２Ｏ２の相互作用をＵＶ-ｖｉｓ測定より検討した。すなわち、Ｈ２Ｏ２との相互作用および分解に基づくポルフィリン錯体Ｓｏｒｅｔ帯吸収ピーク（４６３ｎｍ）の減衰曲線測定およびその減衰曲線からの半減期（ｔ１／２）の算出より評価した。なお、参考として銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ-ＳＯＤ）の結果も合わせて示す。なお、Ｈ２Ｏ２濃度は金属ポルフィリン錯体濃度に対して大過剰の１０００倍とした。 これらの結果を表５に示す。
１）疎水性マンガンポルフィリン錯体が、ＤＭＰＣリポソームの二分子膜疎水部（二分子膜内部）に包埋されたもの。
金属ポルフィリン錯体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の相互作用：
一般に、大過剰の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下において、低分子の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、Ｈ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易いことが報告されている［ R. F. Pasternack and B. Halliwell, J. Am. Chem. Soc., 101, 1026 (1979）］。ここで、低分子系金属ポルフィリンであるＭｎＴ４ＭＰｙＰ、リポソーム（高分子）系であるＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（本発明品５）およびマンガン［５,１０,１５,２０-テトラ（３-フリル）ポルフィリン］［ＭｎＴ３ＦｕＰ］包埋ＤＭＰＣリポソーム１）（比較品）とＨ２Ｏ２の相互作用をＵＶ-ｖｉｓ測定より検討した。すなわち、Ｈ２Ｏ２との相互作用および分解に基づくポルフィリン錯体Ｓｏｒｅｔ帯吸収ピーク（４６３ｎｍ）の減衰曲線測定およびその減衰曲線からの半減期（ｔ１／２）の算出より評価した。なお、参考として銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ-ＳＯＤ）の結果も合わせて示す。なお、Ｈ２Ｏ２濃度は金属ポルフィリン錯体濃度に対して大過剰の１０００倍とした。 これらの結果を表５に示す。
１）疎水性マンガンポルフィリン錯体が、ＤＭＰＣリポソームの二分子膜疎水部（二分子膜内部）に包埋されたもの。
これより、ｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ-ＳＯＤ＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＝ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム＜ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームの順に増加した。ＭｎＴ４ＭＰｙＰは低分子系のためポルフィリン環が露出してＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易く、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームは高分子系のためポルフィリン環が露出しておらずＨ２Ｏ２と頻度高く相互作用しないので分解し難い。しかしながら、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２はほぼＭｎＴ４ＭＰｙＰのそれに類似し、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２の１／１０であった。これは、ＤＭＰＣリポソーム二分子膜中のＭｎＴ４ＭＰｙＰおよびＭｎＴ３ＦｕＰの包埋部位が異なるためと考えられ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰはリポソーム二分子膜中の親水部（または表層近傍）に、および、ＭｎＴ３ＦｕＰはその疎水部に存在するためと考えられる。この結果は、実施例１２および１４の結果と対応している。また、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ-ＳＯＤのそれに比べて大きく、Ｃｕ／Ｚｎ-ＳＯＤに比べてＨ２Ｏ２耐性を有することも示唆された。
実 施 例 １９
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をマッコード、フライドビッチらおよびバトラーらのチトクロームｃ法により評価した［(1) J. M. Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969) および (2) J. Butler, W. H. Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)］。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で０〜１０００μＭのＰｒ包埋リポソーム溶液（Ａ溶液）を５水準以上調製した。次に、０.３ｍＭキサンチン水溶液、６０μＭチトクロームｃ水溶液およびｐＨ７.８、３０ｍＭリン酸緩衝水溶液を各２０ｍｌ取り、さらに、純水２４ｍｌを加えて混合溶液（Ｂ溶液）を得た。このＢ溶液 ２.１ｍｌにＡ溶液 ０.３ｍｌと純水 ０.２ｍｌを加えて放置（２５℃、１０ｍｉｎ）した。放置後の混合溶液に７μｇ／ｍｌカタラーゼ水溶液 ０.１ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）水溶液 ０.３ｍｌをすばやく混合して５５０ｎｍ（フェロチトクロームｃ生成に基づく吸収ピーク）におけるＵＶ-ｖｉｓの経時測定を行った（最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体０〜１００μＭ、キサンチン０.０５ｍＭ、ＸＯＤ２.５Ｕ／ｍｌ、チトクロームｃ１０μＭおよびカタラーゼ０.２３μｇ／ｍｌである。）。また、Ｐｒ包埋リポソーム無添加系（ブランク）でも同様に測定した。これらＵＶ-ｖｉｓの経時測定における「時間-５５０ｎｍでの吸光度」の関係よりＰｒ包埋リポソーム無添加系および添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度（ｖｉおよびｖｏ）を求め、さらに、下式から阻害率（ＩＣ）を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-ＩＣ」の関係よりＩＣ＝５０％おける金属ポルフィリン濃度（ＩＣ５０）を求めてこれをＳＯＤ活性の指標とした（ＩＣ５０が小さいほど高いＳＯＤ活性を示す）。なお、参照として対応するイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
阻害率（ＩＣ）＝１-（ｖｉ／ｖｏ）
ｖｏ：Ｐｒ包埋リポソーム無添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
ｖｉ：Ｐｒ包埋リポソーム添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
表６に各種金属ポルフィリン錯体系のＩＣ５０を示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのＩＣ５０はフライドビッチらの文献値を示した［ I. Batinic-Haberle, L. Benov, and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)］。
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その１）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をマッコード、フライドビッチらおよびバトラーらのチトクロームｃ法により評価した［(1) J. M. Mccord and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969) および (2) J. Butler, W. H. Kopenol, E. Margoliash, J. Biol. Chem., 257, 10747 (1982)］。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で０〜１０００μＭのＰｒ包埋リポソーム溶液（Ａ溶液）を５水準以上調製した。次に、０.３ｍＭキサンチン水溶液、６０μＭチトクロームｃ水溶液およびｐＨ７.８、３０ｍＭリン酸緩衝水溶液を各２０ｍｌ取り、さらに、純水２４ｍｌを加えて混合溶液（Ｂ溶液）を得た。このＢ溶液 ２.１ｍｌにＡ溶液 ０.３ｍｌと純水 ０.２ｍｌを加えて放置（２５℃、１０ｍｉｎ）した。放置後の混合溶液に７μｇ／ｍｌカタラーゼ水溶液 ０.１ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）水溶液 ０.３ｍｌをすばやく混合して５５０ｎｍ（フェロチトクロームｃ生成に基づく吸収ピーク）におけるＵＶ-ｖｉｓの経時測定を行った（最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体０〜１００μＭ、キサンチン０.０５ｍＭ、ＸＯＤ２.５Ｕ／ｍｌ、チトクロームｃ１０μＭおよびカタラーゼ０.２３μｇ／ｍｌである。）。また、Ｐｒ包埋リポソーム無添加系（ブランク）でも同様に測定した。これらＵＶ-ｖｉｓの経時測定における「時間-５５０ｎｍでの吸光度」の関係よりＰｒ包埋リポソーム無添加系および添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度（ｖｉおよびｖｏ）を求め、さらに、下式から阻害率（ＩＣ）を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-ＩＣ」の関係よりＩＣ＝５０％おける金属ポルフィリン濃度（ＩＣ５０）を求めてこれをＳＯＤ活性の指標とした（ＩＣ５０が小さいほど高いＳＯＤ活性を示す）。なお、参照として対応するイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
阻害率（ＩＣ）＝１-（ｖｉ／ｖｏ）
ｖｏ：Ｐｒ包埋リポソーム無添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
ｖｉ：Ｐｒ包埋リポソーム添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度
表６に各種金属ポルフィリン錯体系のＩＣ５０を示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのＩＣ５０はフライドビッチらの文献値を示した［ I. Batinic-Haberle, L. Benov, and I. Fridovich, J. Biol. Chem., 273, 24251 (1998)］。
この結果より、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームのＩＣ５０は低分子系［ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（文献値）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ］のそれらと類似となり、効果的なＳＯＤ活性を示していた。
実 施 例 ２０
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その２）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をリレイ（Ｒｉｌｅｙ）らのストップドフロー法により評価した［ D. P. Riley, W. L. Rivers, and R. H. Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)］。具体的には下記のように行った。３６℃において,Ｏ２ −・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のＰｒ包埋リポソームを含む６０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液（ｐＨ８.１）を急速混合し、Ｏ２ −・に基づく２４５ｎｍの吸光度の減衰（Ｏ２ −・消失反応の減衰曲線）を経時的に測定した。この減衰曲線より「ｌｎ（吸光度）-時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-見かけの速度定数」関係の傾きよりＯ２ −・消失反応の速度定数（ｋｃａｔ）を求めた。 なお、参照としてイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
表７に各種金属ポルフィリン錯体系のｋｃａｔを示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔはオオセ、カワカミらの文献値で示した［ T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 (2001)］。
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その２）：
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２ −・消去活性）をリレイ（Ｒｉｌｅｙ）らのストップドフロー法により評価した［ D. P. Riley, W. L. Rivers, and R. H. Weiss, Anal. Biochem., 196, 344 (1991)］。具体的には下記のように行った。３６℃において,Ｏ２ −・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のＰｒ包埋リポソームを含む６０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液（ｐＨ８.１）を急速混合し、Ｏ２ −・に基づく２４５ｎｍの吸光度の減衰（Ｏ２ −・消失反応の減衰曲線）を経時的に測定した。この減衰曲線より「ｌｎ（吸光度）-時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度-見かけの速度定数」関係の傾きよりＯ２ −・消失反応の速度定数（ｋｃａｔ）を求めた。 なお、参照としてイオンコンプレックス（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ等）についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
表７に各種金属ポルフィリン錯体系のｋｃａｔを示す。なお、ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔはオオセ、カワカミらの文献値で示した［ T. Ohse, S. Nagaoka, Y. Arakawa, H. Kawakami, and K. Nakamura, J. Inorg. Biochem., 85, 201 (2001)］。
この結果、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソームおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソームのｋｃａｔは低分子系［ＭｎＴ４ＭＰｙＰ（文献値）、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳおよびＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ］のそれらと近く、効果的なＳＯＤ活性を示していた。
実 施 例 ２１
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その３）：
Ｐｒ包埋リポソームを代表とする各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の比較を行った。試料としてＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系）、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰを用い、チトクロームｃ法およびストップドフロー法より評価した。なお、試料調製および測定は実施例１９および２０と同様である。
表８に各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の指標であるｋｃａｔおよびＩＣ５０を示す。
Ｐｒ包埋リポソームのＳＯＤ活性評価（その３）：
Ｐｒ包埋リポソームを代表とする各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の比較を行った。試料としてＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系）、ＭｎＴ３ＦｕＰ包埋ＤＭＰＣリポソーム（ＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系）およびＭｎＴ４ＭＰｙＰを用い、チトクロームｃ法およびストップドフロー法より評価した。なお、試料調製および測定は実施例１９および２０と同様である。
表８に各種金属ポルフィリン錯体のＳＯＤ活性の指標であるｋｃａｔおよびＩＣ５０を示す。
ＭｎＴ４ＭＰｙＰのｋｃａｔおよびＩＣ５０は表６および同表で示した文献値と一致し、本評価の妥当性を示している。さらに、ｋｃａｔはＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系＜ＭｎＴ４ＭＰｙＰの順に増加、かつ、ＩＣ５０はｋｃａｔはＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系＞ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系＞ＭｎＴ４ＭＰｙＰの順に減少しており、これら２つの評価法は対応している。また、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系のｋｃａｔおよびＩＣ５０がＭｎＴ４ＭＰｙＰのそれらに類似し、ＭｎＴ３ＦｕＰ／リポソーム系のそれらに類似しないという結果は、実施例１６、１７および１８の結果に対応している。いづれにせよ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ／リポソーム系（ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋４ＳＡＳ包埋ＤＭＰＣリポソーム、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＋１ＳＡＳ包埋ＥＹＬリポソーム等）は、効果的なＳＯＤ活性を示し、有効な抗酸化剤となりうることを示している。
Claims (15)
- カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれていることを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、次式（Ｉ）、（II）または（III）
で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。 - カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（２-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、金属［５,１０,１５,２０-テトラキス（４-メチルピリジル）ポルフィリン］（ＭＴ４ＭＰｙＰ）または金属［［１,３,５,８-テトラメチル-２,４-ジビニル-６,７-ジ（４-メチルピリジルアミドエチル）］ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ-ＤＭＰｙＡｍ）の１種または２種以上であり、当該錯体の金属部分（Ｍ）が、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）またはイリジウム（Ｉｒ）であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- アニオン系界面活性剤が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸若しくはオクタデシル硫酸またはそれらの塩であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- リポソーム形成能を有する脂質が、リン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- リポソーム形成能を有する脂質が、大豆レシチン（ＳＢＬ）、卵黄レシチン（ＥＹＬ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびモノオレオイル-モノアルキル-ホスファチジルコリン（ＭＯＭＡＰＣ）から選ばれるリン脂質の１種または２種以上であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- リポソーム形成能を有する脂質が、リン脂質とコレステロールの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- リポソーム形成能を有する脂質が、リン脂質とポリエチレングリコールまたはその誘導体との混合物であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- リポソーム形成能を有する脂質が、リン脂質とＯＡＳ、ジメチルジテトラデシルアンモニウムブロミド（ＤＴＤＡＢ）、Ｔｗｅｅｎ-６１（ＴＷ６１）またはＴｗｅｅｎ-８０（ＴＷ８０）から選ばれる界面活性剤との混合物であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- 粒径が１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の金属ポルフィリン錯体包埋リポソーム。
- カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とアニオン系界面活性剤を反応させてイオンコンプレックスを形成させ、次いで、このイオンコンプレックスとリポソーム形成能を有する脂質とを混合し、超音波処理することにより、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを製造することを特徴とする金属ポルフィリン錯体包埋リポソームの製造方法。
- カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体とリポソーム形成能を有する脂質とを含有する金属ポルフィリン錯体包埋リポソームであって、前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体が、アニオン系界面活性剤とイオンコンプレックスを形成している状態で存在するとともに前記カチオン化カチオン性金属ポルフィリン錯体部分が前記リポソームの表面または前記脂質の親水部に存在し、前記アニオン系界面活性剤のアルキル側鎖は前記脂質の疎水性部に埋め込まれている金属ポルフィリン錯体包埋リポソームを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
- 抗癌剤であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬。
- 抗酸化剤であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬。
- 炎症疾患、神経疾患、動脈硬化または糖尿病の治療用薬剤であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬。
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