JP4591074B2 - 加熱処理を施した脱水素酵素 - Google Patents
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Description
しかしながら、PQQGDHのさらなる生産性の向上が工業生産上望まれていた。
[項1]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合を向上させる方法
[項2]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項3]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、項2記載の、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合が向上したPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項4]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、項2記載のホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項5]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
[項6]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
[項7]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
[項8]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
である。
なお、現時点において、PQQGDHのクローニングは、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,170,2121(1988)およびMol.Gen.Genet.,217,430(1989))、エシェリヒア・コり(Escherichia coli)(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,172,6308(1990))、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)(Mol.Gen.Genet.,229,206(1991))、及び特許文献1で報告されているアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumanni) NCIMB11517より実施されている。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性PQQGDHを選択することが好ましい。
アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517株は、以前、Acinetobacter calcoaceticusに分類されていた。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うPQQGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うPQQGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のPQQGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うPQQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時に加熱処理を加えてホロ化することもできる。
本発明はまた、本発明に従うPQQGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化する。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のPQQGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
実施例1 :PQQ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型PQQ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドpNPG5は、ベクターpBluescript SK(−)のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) NCIMB11517株由来のPQQ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号2に、また該塩基配列から推定されるPQQ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。
実施例1で得た組換えプラスミドpNPG5のDNA5μgを制限酵素BamHIおよびXHoI(東洋紡績製)で切断して、PQQ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したDNAとBamHIおよびXHoIで切断したpTS1137(1μg)とをT4DNAリガーゼ1単位で16℃、16時間反応させ、DNAを連結した。連結したDNAはエシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをpNPG6と命名した。
シュードモナス・プチダTE3493(微工研寄12298号)をLBG培地(LB培地+0.3%グリセロール)で30℃、16時間培養し、遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)8mlを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)0.4mlを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例2で得た発現プラスミドpNPG6を0.5μg加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。100μg/mlのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ホロ型PQQGDHの活性測定方法
測定原理
D−グルコース+PMS+PQQGDH → D−グルコノ−1,5−ラクトン + PMS(red)
2PMS(red) + NTB → 2PMS + ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート(PMS)(red)によるニトロテトラゾリウムブルー(NTB)の還元により形成されたジホルマザンの存在は、570nmで分光光度法により測定した。
単位の定義
1単位は、以下に記載の条件下で1分当たりジホルマザンを0.5ミリモル形成させるPQQGDHの酵素量をいう。
(3)方法
試薬
A.D−グルコース溶液:0.5M(0.9g D−グルコース(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES−NaOH緩衝液, pH6.5:50mM(60mLの水中に懸濁した1.51gのPIPES(分子量302.36)を、5N NaOHに溶解し、2.2mlの10% Triton X−100を加える。5N NaOHを用いて25℃でpHを6.5±0.05に調整し、水を加えて100mlとした。)
C.PMS溶液:3.0mM(9.19mgのフェナジンメトサルフェート(分子量817.65)/10mlH2O)
D.NTB溶液:6.6mM(53.96mgのニトロテトラゾリウムブルー(分子量817.65)/10mlH2O)
E.酵素希釈液:1mM CaCl2, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSAを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)
1.8ml D−グルコース溶液 (A)
24.6ml PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5) (B)
2.0ml PMS溶液 (C)
1.0ml NTB溶液 (D)
0.1mlの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
570nmでの水に対する吸光度の増加を37℃に維持しながら分光光度計で4〜5分間記録し、曲線の初期直線部分からの1分当たりのΔODを計算した(ODテスト)。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(E)加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク(ΔODブランク)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液(E)で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で0.1−0.8U/mlに希釈した(該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい)。
計算
活性を以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODテスト− ΔODブランク)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.1ml)
Vs:サンプル体積(1.0ml)
20.1:ジホルマザンの1/2ミリモル分子吸光係数
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶液中の酵素濃度(c mg/ml)
全PQQGDHの活性測定方法
試験例1において、酵素希釈液(E)の代わりに酵素希釈液(F):1mM CaCl2, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSA,1μM PQQを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)を用いて酵素を希釈後、同様に測定を実施した。
25mlのGDH生産培地(1.5%グリセロール,4%酵母エキス,1.25%K2HPO4,0.23%KH2PO4,pH6.8)を500ml坂口フラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを100μg/mlになるように添加し、さらにエタノールを1%(V/V)となるように添加した。実施例3で得た形質転換体を本培地中で、33℃、24時間培養後、遠心分離(12000rpm、5分間)により菌体を回収した。該菌体を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例1,2に従いPQQGDH活性を測定した。
ホロ型PQQGDHの発現量の割合は、単位液量あたりに発現したホロ型PQQGDH活性(U/ml)を全PQQGDH活性(U/ml)で割ることで算出した。測定結果を表2に示す。
実施例4の粗酵素液を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で緩衝化したHiTrap−SP(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、樹脂にGDHタンパク質を吸着させた。カラム樹脂量の2倍量の20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で樹脂を洗浄した後、同じく2倍量の0.3MNaClの入った20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて樹脂からGDHタンパク質を溶出し、溶出画分を回収した。次いで10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)中で透析し、脱塩した後に、終濃度が1mMになるように塩化カルシウムを添加した。
以下、本透析液を2分して、(A)加熱処理を施した後に精製酵素標品を得る方法、(B)加熱処理を実施せずに精製酵素標品を得る方法、それぞれで精製を実施した。
(A)加熱処理を施した後に精製酵素標品を得る方法
透析液の半量を35℃で管理された温水につけ、16時間加熱処理を実施した。遠心分離による除濁後、10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)で緩衝化したHiTrap−DEAE(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、非吸着画分を回収することにより、精製酵素標品を得た。
(B)加熱処理を実施せずに精製酵素標品を得る方法
残りの透析液を10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)で緩衝化したHiTrap−DEAE(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、非吸着画分を回収することにより、精製酵素標品を得た。
(A)(B)それぞれより得られた各標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示した。
実施例4と同様にして各酵素液のホロ型PQQGDHの割合を求めた。測定結果を表3に記載する。
また、この活性型への変化、言い換えればコンフォメーションの変化は、加熱処理液(A)とさらに精製を継続した精製酵素標品(A)とでホロ型PQQGDHの割合が変化しないことから、1過性のものではなく、恒常的なものであることがわかる。
さらに、精製酵素標品(B)の結果から明らかなように、単に精製を継続するだけではホロ型PQQGDHの割合が向上しないことから、結合状態が不完全であるために非活性型となっているGDH酵素タンパク質を活性型にするためには加熱処理が必要であること
が分かる。
結合状態が不完全なGDH酵素タンパク質が存在するという事実、また加熱処理を施すだけで活性型へと変換可能であるという事実は、本当に意外であり、また驚きであった。加熱処理を実施することにより、全体の1割以上にもなるこのようなGDH酵素タンパク質を有用に利用することが可能になることから、産業上有用な手段であると判断した。
Claims (5)
- 以下の(1)または(2)のいずれかに記載のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、全PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質に対するホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
(1)アシネトバクター・カルコアセティカスまたはアシネトバクター・バウマンニ由来のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
(2)(1)において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失・置換もしくは付加され、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 - 請求項1記載の方法で製造された全PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質に対するホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
- 請求項1記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
- 請求項1記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
- 請求項1記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
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