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JP4591074B2 - 加熱処理を施した脱水素酵素 - Google Patents

加熱処理を施した脱水素酵素 Download PDF

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Description

本発明は、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)(以下PQQGDHとも略記する。)の製造法及びそれを用いたグルコースセンサーに関する。本発明のPQQGDHは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
酵素としてのPQQGDHは、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが注目されている。
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) NCIMB11517株が、PQQ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し,遺伝子のクローニングならびに発現系を構築した(特許文献1参照)。
しかしながら、PQQGDHのさらなる生産性の向上が工業生産上望まれていた。
特開平11−243949号公報
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、PQQGDHの生産性向上を課題としてその改良に関するものである。
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究したところ、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことにより、生産時における全GDH酵素タンパク質中におけるホロ型PQQGDHの割合を向上させることができ、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
[項1]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合を向上させる方法
[項2]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項3]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、項2記載の、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合が向上したPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項4]
PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、項2記載のホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
[項5]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
[項6]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
[項7]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
[項8]
項2記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
である。
本発明によるホロ型PQQGDHとしての生産性の向上は製造コストの低減をもたらす。さらに、ホロ型PQQGDHの割合が向上することにより、活性型のPQQGDHを得るためにPQQを添加しホロ化する必要性もなくなることも、製造コストの低減をもたらす。これらは、PQQGDHを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。
またホロ型PQQGDHの割合が向上することによりPQQGDHの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上するので、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少も可能にする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するPQQGDHとは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、D−グルコースを酸化してD−グルコノ−1,5−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素(EC1.1.5.2(旧EC1.1.99.17))であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
なお、現時点において、PQQGDHのクローニングは、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,170,2121(1988)およびMol.Gen.Genet.,217,430(1989))、エシェリヒア・コり(Escherichia coli)(A.M.Cleton−Jansenら、J.Bacteriol.,172,6308(1990))、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)(Mol.Gen.Genet.,229,206(1991))、及び特許文献1で報告されているアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumanni) NCIMB11517より実施されている。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性PQQGDHを選択することが好ましい。
アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517株は、以前、Acinetobacter calcoaceticusに分類されていた。
上記のAcinetobacter属由来PQQGDHのアミノ酸配列は、好ましくはAcinetobacter calcoaceticusまたはAcinetobacter baumannii由来PQQGDHのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号1である。配列番号1で示される野生型PQQGDHタンパク質及び配列番号2で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517株を起源とするものであり、特開平11−243949号公報に開示されている。なお、上記および配列番号1において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を1として番号付けされている。
例えば、配列番号1のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は92.3%(シグナル配列含む)となり、非常に類似しているので、配列番号1におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。これらのPQQGDHも本発明で使用するPQQGDHとして好ましいものとして例示される。
本発明で使用するPQQGDHは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合にはpBluescript,pUC18などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル(例えば、コンピテントハイJM109;東洋紡績製)を用いても良い。
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、PCR法の利用により、PQQGDH遺伝子を含むDNA断片を得ることも可能である。
本発明において、PQQGDHをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスNCIMB11517 の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてDNAを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両DNAの平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、PQQを補欠分子族とするGDHをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからGDHをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスNCIMB11517 の染色体DNAは、具体的には以下のようにして採取される。
該遺伝子供与微生物を例えば1〜3日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりPQQを補欠分子族とするGDH遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム(SDS)等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
上記のようにして得られた溶菌物からDNAを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
微生物から分離、精製されたDNAを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはLambda gt10 、Lambda gt11 などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19 、pBluescript などが例示される。
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したGDHをコードする遺伝子供与体である微生物DNAの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物DNAの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物DNA断片とベクターDNA断片とを結合させる方法は、公知のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物DNA断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なDNAリガーゼの使用により微生物DNA断片とベクターDNA断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のDNAリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリW3110 、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101 、エシェリヒア・コリJM109 、エシェリヒア・コリDH5 αなどを用いることができる。
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のGDHを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするDNAを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとPQQの添加によりGDH活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつGDHを生成する微生物を選択すればよい。
上記の方法により得られたPQQを補欠分子族とするGDH遺伝子の塩基配列は、Science ,第214巻,1205(1981)に記載されたジデオキシ法により解読した。また、GDHのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
上記のようにして、一度選択されたPQQを補欠分子族とするGDH遺伝子を保有する組換えベクターより、PQQ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、GDH遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法によりGDH遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるPQQ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
PQQ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター(Acetobacter )属やグルコノバクター(Gluconobacter )属の酢酸菌、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、RSF1010 由来のベクターもしくはとその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、pKT240、pMMB24等(M.M.Bagdasarian ら,Gene,26,273(1983))、pCN40 、pCN60 等(C.C.Nieto ら,Gene,87,145(1990))やpTS1137(遺伝子組換え実用化技術技術,第4集,p73から85,昭和58年,(株)サイレンスフォーラム発行)等を挙げることができる。また、pME290等(Y.Itohら、Gene,36,27(1985))、pNI111、pNI20C(N.Itohら,J.Biochem.,110,614(1991))も利用できる。
アシネトバクター属細菌では、pWM43 等(W.Minas ら,Appl.Environ.Microbiol. ,59,2807(1993))、pKT230、pWH1266 等(M.Hungerら,Gene,87,45(1990))がベクターとして利用可能である。
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、PQQGDHタンパク質を生産し得るが、培地中に有機溶媒を添加することにより、全PQQGDHタンパク質としての生産性向上及びホロ型PQQGDHタンパク質としての生産性向上、いずれも可能になる。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
本発明においてホロ型PQQGDHとはGDHタンパク質に補酵素PQQが結合したPQQGDH酵素自身及びその状態をさし、PQQの添加なしでGDH活性を有する酵素及びその状態である。一方、全PQQGDHとは、(1)ホロ型PQQGDH、(2)GDHタンパク質に補酵素PQQが結合していないアポ型PQQGDH、および、(3)さらにPQQが結合しているものの結合状態が不完全であるためにGDH活性を有しないPQQGDH、をあわせた全GDH酵素タンパク質及びその状態をさす。
本発明の請求項に記載されている「PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ」または「PQQGDH」は、蛋白質としては単一であるが、酵素−補酵素複合体としてはPQQの結合状態から見た場合上記(1)〜(3)の少なくとも1つ以上を含有する混合物を意味する。
培地の栄養源としては,微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は菌が成育し、PQQGDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなPQQ生産能を有する微生物の場合、好ましくは20〜42℃、より好ましくは30〜37℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、PQQGDHが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は6〜48時間、好ましくは16〜36時間程度である。培地のpHは菌が発育し、PQQGDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH6.0〜9.0程度、より好ましくはpH6.5〜8.0の範囲である。
培養物中のPQQGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、PQQGDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、PQQGDH含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。PQQGDHが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加してGDHを可溶化し、水溶液として分離採取する。
上記のようにして得られたPQQGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたPQQGDHを得ることができる。
例えば、セファデックス(Sephadex)ゲル(ファルマシアバイオテク)などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL−6B (ファルマシアバイオテク)、オクチルセファロースCL−6B (ファルマシアバイオテク)等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動(SDS−PAGE)的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上述した加熱処理は、全GDH酵素タンパク質に対するホロ型PQQGDHの割合を向上させる役割を果たす。外部からPQQを添加するわけでもなく、PQQGDH活性が向上する本処理は、産業用途上、極めて有用である。本現象は、推察するに、GDH酵素タンパク質発現時において、PQQと結合するものの結合状態が不完全であるために非活性型となっていたGDH酵素タンパク質が、加熱処理によるコンフォメーションの変化により、PQQとの結合状態が改善され、活性型となったと考えられる。このようにPQQと結合するものの結合状態が不完全であるために非活性型となっていたGDH酵素タンパク質が存在する可能性があるということは意外であり、驚くべき発見であった。なお、加熱処理条件としては25℃〜50℃、より好ましくは30℃〜45℃が望ましい。
なお、本加熱処理は、上述したようなPQQを産生する宿主を用いた生産にのみ有用なのではない。アポ型GDHタンパク質をホロ化し、ホロ型PQQGDHを調製する際にも有用である。例えばGDH遺伝子のクローニング後、そのままエシェリヒア・コリDH5 αなどを用いてアポ型GDHタンパク質を発現させ、PQQGDHと同様に精製後、精製されたアポ型GDHタンパク質をホロ化し、ホロ型PQQGDHを調製する例などが挙げられる。なぜなら、通常、アポ型GDHタンパク質をホロ化する際には、アポ型GDHタンパク質溶液にPQQ溶解液を添加し混合すればホロ型PQQGDHが得られるが、このような状態では上述したようなPQQと結合するものの結合状態が不完全であるために非活性型となっているGDH酵素タンパク質が数多く存在する可能性は非常に高い。このような場合においても、加熱処理によるホロ化は極めて有用であり、その効果は高い。
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはGOODの緩衝液であり、なかでも、PIPES、MESもしくはMOPS緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりPQQGDHをより安定化することができる。
PQQGDHタンパク質は、液状(水溶液、懸濁液等)、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
精製された改変タンパク質に(1)アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた1種または2種以上の化合物および(2)アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
凍結乾燥組成物中においては、PQQGDH含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約5〜50%(重量比)の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、100〜2000U/mgの範囲で好適に用いられる。
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、1〜90%(重量比)の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、GOOD緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のpHは5.0〜9.0程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは0.1%(重量比)以上、特に好ましくは0.1〜30%(重量比)の範囲で使用される。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)などが挙げられる。特にBSAが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは1〜80%(重量比)、より好ましくは5〜70%(重量比)の範囲で使用される。
組成物には、さらに他の安定化剤などをPQQGDHの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばPQQGDHを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にPQQGDHを配合する方法、あるいはPQQGDHと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、1×10−4〜1×10−2Mであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、1種または2種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、0.01〜0.2重量%であることが好ましい。
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は0.05〜0.5重量%であることが好ましい。
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のpHを5〜10とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うPQQGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うPQQGDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のPQQGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うPQQGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時に加熱処理を加えてホロ化することもできる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うPQQGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のPQQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化する。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のPQQGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、CaCl、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のPQQGDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例1 :PQQ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型PQQ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドpNPG5は、ベクターpBluescript SK(−)のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii) NCIMB11517株由来のPQQ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号2に、また該塩基配列から推定されるPQQ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。
実施例2:シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例1で得た組換えプラスミドpNPG5のDNA5μgを制限酵素BamHIおよびXHoI(東洋紡績製)で切断して、PQQ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したDNAとBamHIおよびXHoIで切断したpTS1137(1μg)とをT4DNAリガーゼ1単位で16℃、16時間反応させ、DNAを連結した。連結したDNAはエシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをpNPG6と命名した。
実施例3:シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダTE3493(微工研寄12298号)をLBG培地(LB培地+0.3%グリセロール)で30℃、16時間培養し、遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)8mlを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離(12,000rpm、10分間)により菌体を回収し、この菌体に氷冷した300mMシュークロースを含む5mMK−リン酸緩衝液(pH7.0)0.4mlを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例2で得た発現プラスミドpNPG6を0.5μg加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。100μg/mlのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
試験例1
ホロ型PQQGDHの活性測定方法
測定原理
D−グルコース+PMS+PQQGDH → D−グルコノ−1,5−ラクトン + PMS(red)
2PMS(red) + NTB → 2PMS + ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート(PMS)(red)によるニトロテトラゾリウムブルー(NTB)の還元により形成されたジホルマザンの存在は、570nmで分光光度法により測定した。
単位の定義
1単位は、以下に記載の条件下で1分当たりジホルマザンを0.5ミリモル形成させるPQQGDHの酵素量をいう。
(3)方法
試薬
A.D−グルコース溶液:0.5M(0.9g D−グルコース(分子量180.16)/10ml HO)
B.PIPES−NaOH緩衝液, pH6.5:50mM(60mLの水中に懸濁した1.51gのPIPES(分子量302.36)を、5N NaOHに溶解し、2.2mlの10% Triton X−100を加える。5N NaOHを用いて25℃でpHを6.5±0.05に調整し、水を加えて100mlとした。)
C.PMS溶液:3.0mM(9.19mgのフェナジンメトサルフェート(分子量817.65)/10mlHO)
D.NTB溶液:6.6mM(53.96mgのニトロテトラゾリウムブルー(分子量817.65)/10mlHO)
E.酵素希釈液:1mM CaCl, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSAを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した(用時調製)
1.8ml D−グルコース溶液 (A)
24.6ml PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5) (B)
2.0ml PMS溶液 (C)
1.0ml NTB溶液 (D)
Figure 0004591074
3.0mlの反応混合液を試験管(プラスチック製)に入れ、37℃で5分間予備加温した。
0.1mlの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
570nmでの水に対する吸光度の増加を37℃に維持しながら分光光度計で4〜5分間記録し、曲線の初期直線部分からの1分当たりのΔODを計算した(ODテスト)。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液(E)加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク(ΔODブランク)を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液(E)で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で0.1−0.8U/mlに希釈した(該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい)。
計算
活性を以下の式を用いて計算する:
U/ml={ΔOD/min(ΔODテスト− ΔODブランク)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)
U/mg=(U/ml)×1/C
Vt:総体積(3.1ml)
Vs:サンプル体積(1.0ml)
20.1:ジホルマザンの1/2ミリモル分子吸光係数
1.0:光路長(cm)
df:希釈係数
C:溶液中の酵素濃度(c mg/ml)
試験例2
全PQQGDHの活性測定方法
試験例1において、酵素希釈液(E)の代わりに酵素希釈液(F):1mM CaCl, 0.1% Triton X−100, 0.1% BSA,1μM PQQを含む50mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)を用いて酵素を希釈後、同様に測定を実施した。
実施例4 PQQGDHの発現と粗酵素液の回収
25mlのGDH生産培地(1.5%グリセロール,4%酵母エキス,1.25%K2HPO4,0.23%KH2PO4,pH6.8)を500ml坂口フラスコに分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを100μg/mlになるように添加し、さらにエタノールを1%(V/V)となるように添加した。実施例3で得た形質転換体を本培地中で、33℃、24時間培養後、遠心分離(12000rpm、5分間)により菌体を回収した。該菌体を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例1,2に従いPQQGDH活性を測定した。
ホロ型PQQGDHの発現量の割合は、単位液量あたりに発現したホロ型PQQGDH活性(U/ml)を全PQQGDH活性(U/ml)で割ることで算出した。測定結果を表2に示す。
Figure 0004591074
実施例5 PQQGDHの精製と加熱処理によるホロ型PQQGDHの割合向上の確認
実施例4の粗酵素液を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で緩衝化したHiTrap−SP(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、樹脂にGDHタンパク質を吸着させた。カラム樹脂量の2倍量の20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で樹脂を洗浄した後、同じく2倍量の0.3MNaClの入った20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて樹脂からGDHタンパク質を溶出し、溶出画分を回収した。次いで10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)中で透析し、脱塩した後に、終濃度が1mMになるように塩化カルシウムを添加した。
以下、本透析液を2分して、(A)加熱処理を施した後に精製酵素標品を得る方法、(B)加熱処理を実施せずに精製酵素標品を得る方法、それぞれで精製を実施した。
(A)加熱処理を施した後に精製酵素標品を得る方法
透析液の半量を35℃で管理された温水につけ、16時間加熱処理を実施した。遠心分離による除濁後、10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)で緩衝化したHiTrap−DEAE(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、非吸着画分を回収することにより、精製酵素標品を得た。
(B)加熱処理を実施せずに精製酵素標品を得る方法
残りの透析液を10mM PIPES−NaOH緩衝液(pH6.5)で緩衝化したHiTrap−DEAE(アマシャム−ファルマシア)イオン交換カラムクロマトグラフィーにチャージし、非吸着画分を回収することにより、精製酵素標品を得た。
(A)(B)それぞれより得られた各標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示した。
実施例4と同様にして各酵素液のホロ型PQQGDHの割合を求めた。測定結果を表3に記載する。
Figure 0004591074
まず、透析液を加熱処理することにより、ホロ型PQQGDHの割合が著しく向上していることが確認出来た。仮に粗酵素液の段階でGDHタンパク質に非結合のPQQが存在するとしても、PQQは低分子であるため、遊離のPQQは透析により除去される。よって、加熱処理によりホロ型PQQGDHの割合が向上した結果は、GDHタンパク質と結合はしているものの、結合状態が不完全であるために非活性型となっていたGDH酵素タンパク質が存在していたことを意味する。また、それらが加熱処理によるコンフォメーションの変化により、PQQとの結合状態が改善され、活性型となったということも強く示唆する。
また、この活性型への変化、言い換えればコンフォメーションの変化は、加熱処理液(A)とさらに精製を継続した精製酵素標品(A)とでホロ型PQQGDHの割合が変化しないことから、1過性のものではなく、恒常的なものであることがわかる。
さらに、精製酵素標品(B)の結果から明らかなように、単に精製を継続するだけではホロ型PQQGDHの割合が向上しないことから、結合状態が不完全であるために非活性型となっているGDH酵素タンパク質を活性型にするためには加熱処理が必要であること
が分かる。
結合状態が不完全なGDH酵素タンパク質が存在するという事実、また加熱処理を施すだけで活性型へと変換可能であるという事実は、本当に意外であり、また驚きであった。加熱処理を実施することにより、全体の1割以上にもなるこのようなGDH酵素タンパク質を有用に利用することが可能になることから、産業上有用な手段であると判断した。
本発明によれば、ホロ型PQQGDHとしての生産性の向上を図ることができ、PQQGDHを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。一方、ホロ型PQQGDHの割合が向上することによりPQQGDHの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上する。グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少を可能にすることから、用途上、好ましいPQQGDHである。

Claims (5)

  1. 以下の(1)または(2)のいずれかに記載のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有する水溶液に加熱処理を施すことを特徴とする、全PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質に対するホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法
    (1)アシネトバクター・カルコアセティカスまたはアシネトバクター・バウマンニ由来のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
    (2)(1)において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失・置換もしくは付加され、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
  2. 請求項記載の方法で製造された全PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質に対するホロ型PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの割合が90%以上であるPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
  3. 請求項記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
  4. 請求項記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
  5. 請求項記載の方法で製造されたPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
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