JP4554939B2 - ナノ構造化基体の光学的画像化 - Google Patents

Description

本発明は一般に、ナノ構造化基体上で生じる現象を画像化する方法及び装置に関し、特に、ナノ構造化基体を用いてサンプル中の分析物の存在を検出する方法に関する。

サンプル中の生物学的物質及び化合物の存在を検出する方法は、分析化学及び生化学分野における絶え間無く行われている開発領域である。現在、サンプル中の標的化学種又は分析物の存在を検出する数種類の検定法が存在する。かかる方法としては、放射性同位元素標識免疫測定法（ラジオイムノアッセイ：ＲＩＡ）や酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。これについては、クビー・ジェイ（Kuby, J.）著，「イムノロジー（Immunology）」，ダブリュ・エイチ・フリーマンアンドカンパニー（W.H. Freeman and Company），，ニューヨーク州ニューヨーク（New York, New York），１９９１年，ｐ．１４７−１５０を参照されたい。ＥＬＩＳＡ及び他のイムノソルベント検定法は、簡単且つ広く用いられている方法であるが、幾つかの欠点がある。例えば、標識される抗体は、特に放射性標識を必要とする検定法に関しては高価である場合が多い。加うるに、放射性標識は、放射性物質としての特別な取扱いを必要とする。さらに、化合物の標識付けは、分析物に対する抗体の結合親和力を変更する場合がある。

たんぱく質及び配位子の結合の直接的な検出も又、表面プラズモン反射光測定法（ＳＰＲ）を用いて調査されている。これについては、シュミット・エフ・ジェイ（Schmitt, F.-J.），ハウスリング・エル（Haussling, L.），リングスドルフ・エイチ（Ringsdorf, H.），ノール・ダブリュ（Knoll, W.）著，「シン・ソリッド・フィルムズ（Thin Solid Films）」，２１０／２１１，１９９２年，ｐｚ８１５及びハウスリング・エル（Haussling, L.），リングスドルフ・エイチ（Ringsdorf, H.）著，「ラングミュア（Langmuir）」，７，１９９１年，ｐ．１８３７を参照されたい。ＳＰＲは、エバネッセント電磁波により励起された薄い金属表面の近くにおける流体の屈折率の変化に敏感である。共鳴角度又は信号の強度の増大を吟味することにより配位子へのたんぱく質の結合を検出できる。この方法を用いる典型的な角度分解能は、０．００５°であり、これによりＳＰＲにより吸収されたフィルム厚さのサブオングストロームレベルの変化の検出が可能になる。しかしながら、共鳴角の変化が結合によるものであって、バルク溶液の屈折率の変化ではないようにするよう注意を払う必要がある。熱的に安定な環境は、流体の屈折率に対する共鳴角の依存性に起因して必要である。水に関して２５℃から２６℃への温度の上昇は、０．０００１だけの屈折率の変化に相当する。この増大の結果として、共鳴角が約０．０１５°変化し又はたんぱく質層の観察高さがほぼ０．２ｎｍ変化する。この温度の安定性に関する要件は、ＳＰＲを大抵の現場用途について不適当なものにする。加うるに、センサ表面上又はその近くへの分子の非特異的吸着は、信号の誤った変化の原因となる場合がある。

配位子への特定のたんぱく質の結合の光学的検出を可能にする多孔性シリコン支持体を利用する方法も又開示された。これについては、リン・ブイ（Lin, V.），モテッシャレイ・ケイ（Motesharei, K.），ダンチル・ケイ・エス（Danchil, K. S.），セーラー・エム・ジェイ（Sailor, M. J.），ガディリ・エム・アール（Ghadiri, M. R.）著，「サイエンス（Science）」，２７８，１９９７年，ｐ．８４０及びダンチル・ケイ・エス（Danchil, K. S.），グレイナー・デー・ピー（Greiner, D. P.），セーラー・エム・ジェイ（Sailor, M. J.）著，“J. Am. Chem. Soc”，１２１，１９９９年，ｐ．７９２５を参照されたい。多孔性領域は典型的には、深さが１〜５μｍであり、面積が数平方マイクロメートルから数平方ミリメートルである。ビオチン化表面へのストレプトアビジンの結合は当初、多孔性支持体の屈折率を減少させることが判明したが、後になって、これは正確に言えば表面酸化によるものであった。

また、受容体−配位子相互作用の検出のための重合多層組立体の使用が開示された。これについては、チャリッチ・デー・エイチ（Charych, D. H.），ナジー・ジェイ・オー（Nagy, J. O.），スピーバック・ダブリュ（Spevak, W.），ベナルスキー・エム・デー（Bednarski, M. D.）著，「サイエンス（Science）」，２６１，１９９３年，ｐ．５８５及びパン・ジェイ・ジェイ（Pan, J. J.），チャリッチ・デー（Charych, D.）著，「ラングミュア（Langmuir）」，１３，１９９７年，ｐ．１３６５を参照されたい。ラングミュア・ブロジェット法により被着されたポリジアセチレン多層フィルムは、ポリマーバックボーンの共形的変化に起因して色を青色から赤色に変える。この反応は、配位子を多層に取り付けることにより制御でき、たんぱく質の検出に利用できる。

最近、結晶を利用する幾つかの検定装置が開示された。例えば、最近、ガラス上に斜めに被着された異方性金膜上に支持されたオクタンチオール及びビオチンを含む混合自己組織化単一層（ＳＡＭ）を用いる液晶検定装置が報告されている。これについては、グプタ・ブイ・ケイ（Gupta, V. K.），スカイフ・ジェイ・ジェイ（Skaife, J. J.），ダブロフスキー・ティー・ビー（Dubrovsky, T. B.），アボット・エヌ・エル（Abbott N. L.）著，「サイエンス（Science）」，２７９，１９９８年，ｐ．２０７７−２０７９を参照されたい。加うるに、国際公開第ＷＯ９９／６３３２９号パンフレットは、基体に取り付けられたＳＡＭ及びＳＡＭにより繋留された液晶層を用いる検定装置を開示している。国際公開第ＷＯ０１／６１３５７号パンフレットは、液晶及び溝であるのがよい窪みを有する検出領域を備えた基体を用いて病原体を検出する方法を開示している。病原体、例えばウイルス又は細菌を結合させる結合剤、例えば免疫グロブリンと関連して遮断材料、例えばウシの血清アルブミンを用いるのがよい。液晶は、病原体がサンプル中に存在しているかどうかを判定するために用いられる。

上述の従来型検定法は標的化学種の存在を検出する上では非常に良好に働くが、これら方法は、費用が高くつく場合が多く、通常計器類及び熟練者を必要とする。これにより、かかる方法は現場で利用するのが困難になる。かくして、使用しやすく且つ遠隔地においてサンプルの評価を可能にする検定装置及びシステムが要望されている。
サンプル中の分析物の存在を検出するために用いることができる便利な方法が要望されている。また、基体の表面上で生じる現象を画像化するために用いることができる方法が要望されている。

本発明は、表面上で生じる現象を画像化する装置及び方法を提供する。また、本発明はサンプル中の分析物の存在を検出する方法及び装置を提供する。
本発明の第１の特徴は、基体の表面上で生じる現象を画像化する方法を提供する。この方法は、流体を基体の頂面に接触させる段階及び流体が基体の頂面に接触した後、液晶の不在において基体を偏光を通して観察することにより基体の頂面上で生じる現象を画像化する段階を有する。基体の頂面は、異方性トポグラフィーを有し、偏光の波長は、基体の頂面の異方性トポグラフィーよりも大きい。

表面現象を画像化する方法の一実施形態では、基体の頂面は、複数の溝を備え、溝の幅は、１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、その深さは、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。かかる実施形態では、溝相互間離隔距離は、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。かかる実施形態では、サンプルを照明するのに用いられる光の波長は、溝の寸法よりも大きい。基体の頂面上で生じる現象を画像化する方法の別の実施形態では、基体の頂面の溝の幅は、１０ｎｍ〜４００ｎｍである。更に別の実施形態では、基体の頂面の溝の深さは、１０ｎｍ〜４００ｎｍである。更に別の実施形態では、基体の頂面の溝相互間離隔距離は、１０ｎｍ〜４００ｎｍである。幾つかの実施形態では、溝は、互いに平行であるのがよい。

本発明は更に、ポリマーから成る基体の表面上で生じる現象を画像化する方法を提供する。他の実施形態では、基体は、ポリウレタンから成る。さらに別の実施形態では、基体は、支持体、例えばガラススライダ又はガラスプレートを有する。
基体の表面上で生じる現象を画像化する方法の他の実施形態では、基体の頂面は、金属、例えば金又は銀で被覆される。かかる幾つかの実施形態では、基体の表面に被着された金属の厚さは、１ｎｍ〜５００ｎｍであり、他の実施形態では、金属の厚さは、５ｎｍ〜３００ｎｍである。さらに別のかかる実施形態では、基体は、金又は銀の下に位置するチタンの層を更に有する。

基体の表面上で生じる現象を画像化する幾つかの方法では、流体が基体の頂面に接触した後に偏光子及び検光子を用いて基体を観察する。他の実施形態では、基体を、偏光子及び交差形態から交差形態の１０°以内の形態までの範囲にわたるよう構成された検光子を用いて観察する。他の実施形態では、基体を偏光子及び検光子を用いて観察し、この場合、検光子は、交差形態から交差形態の２°以内の形態の範囲にわたるよう構成される。さらに別のかかる実施形態では、検光子は、交差形態から交差形態の１°以内の形態の範囲にわたるよう構成される。更に別の実施形態では、検光子は、交差形態を基準に０．５°から交差形態を基準に５°までの範囲にわたるよう構成されている。幾つかの実施形態では、流体が基体の頂面に接触した後、偏光顕微鏡を用いて基体を観察する。

本発明は又、サンプル中の分析物の存在を判定する方法を提供する。この方法は、分析物を結合させる基体の頂面の第１の部分にサンプルを接触させる段階、基体をサンプルに接触させた後、基体を液晶の不在において偏光を通して視認する段階、及びサンプルと接触した頂面の第１の部分がサンプルと接触する前の見え方とは異なるように見えるかどうかを確認することにより分析物がサンプル中に存在しているかどうかを判定する段階を有する。偏光の波長は、基体の頂面の異方性トポグラフィーよりも大きい。サンプルとの接触前後における頂面の第１の部分の外観の差は、サンプル中の分析物の存在を指示している。幾つかの実施形態では、この方法は、偏光を通して基体を視認する前にサンプルを基体の頂面から取り除く段階を更に有する。他の実施形態では、基体の頂面は、複数の溝を備え、溝の幅は、１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、その深さは、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。かかる実施形態では、溝相互間離隔距離は、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。

サンプル中の分析物の存在を判定する一実施形態では、基体は、ポリマー、例えばポリウレタンを有する。かかる一実施形態では、ポリマーは、成形ポリマー、例えば成形ポリウレタンである。幾つかの実施形態では、基体は、ガラス支持体を有する。
サンプル中の分析物の存在を判定する別の実施形態では、 基体の頂面の第１の部分は、分析物を結合させる受容体分子を有する。更に別の実施形態では、基体は、ポリマーの頂面に被着された金属を有し、受容体分子は、金属の頂面上の有機硫黄化合物から形成された自己組織化単一層上に被着されている。かかる幾つかの実施形態では、金属は、銀又は金であり、金属被膜の厚さは、２ｎｍ〜４００ｎｍ、５ｎｍ〜２００ｎｍ、又は１０ｎｍ〜１００ｎｍである。他の実施形態では、有機硫黄化合物は、化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_mＣＯ₂Ｈ又はＨＳ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃を有する化合物又はこれらの混合物であり、これら化学式において、ｍ及びｎは、値が６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８の整数である。さらに別の実施形態では、有機硫黄化合物は、化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_mＣＯ₂Ｈの化合物であり、この化学式においてｍは、上述した値を持つ整数である。さらに別の実施形態では、有機硫黄化合物は、ヒドロキシを末端基とする有機硫黄化合物、例えばアルコール又はエチレングリコールを末端基とする有機硫黄化合物である。さらに別の実施形態では、金属、例えば金又は銀が付着増進材料、例えばチタンの層の頂部に被着される。

サンプル中の分析物の存在を判定する方法の他の実施形態では、基体は、遮断層を有する。かかる幾つかの実施形態では、遮断層は、アルブミン、例えばウシの血清アルブミンである。
サンプル中の分析物の存在を判定する方法の更に別の実施形態では、基体の頂面に設けられた溝は、幅が１０ｎｍ〜４００ｎｍ、深さが１０ｎｍ〜４００ｎｍである。溝相互間の離隔距離は、１０ｎｍ〜４００ｎｍである。かかる幾つかの実施形態では、溝は互いに平行である。基体の頂面が溝を備えている幾つかの実施形態では、この方法は、基体の頂面の溝を通ってサンプルを流す段階を含む。

幾つかの実施形態では、分析物は、分子、イオン、生物学的実体、たんぱく質、たんぱく質の組み合わせ、ウイルス、原核生物、真核生物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡのフラグメント、ＲＮＡのフラグメント又はペプチドである。サンプル中の分析物の存在を判定する方法の他の実施形態では、分析物は、たんぱく質、ウイルス、細菌、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡのフラグメント、ＲＮＡのフラグメント又はペプチドである。
サンプル中の分析物の存在を判定する方法の更に別の実施形態では、受容体化学種は、ペプチド、ポリペプチド、ＲＮＡのフラグメント、ＤＮＡのフラグメント、ビオチン、アビジン、糖、多糖、免疫グロブリン、免疫グロブリンのフラグメント又は金属錯体、例えばＮｉ（ＩＩ）ニトリロトリアセテートである。

サンプル中の分析物の存在を判定する方法の更に別の実施形態では、サンプルと接触した頂面の第１の部分がサンプルと接触する前の見え方とは異なるように見えるかどうかを確認する段階は、サンプルと接触した頂面の第１の部分とサンプルに接触しなかった頂面の第２の部分を比較する段階を含む。
サンプル中の分析物の存在を判定する方法の更に別の実施形態では、基体の頂面の第１の部分は、第１の受容体分子を有し、基体の頂面の第２の部分は、第２の受容体分子を有する。かかる実施形態では、第１の受容体分子は、第１の分析物化学種に結合し、第２の受容体分子は、第１の分析物化学種とは異なる第２の分析物化学種に結合する。かかる幾つかの実施形態では、基体の頂面は、複数の互いに異なる受容体分子を有する。

サンプル中の分析物の存在を判定する方法の更に別の実施形態では、サンプルは、基体の頂面の第１の部分に連続して接触する流動中の流れであり、基体は、流動中の流れを連続的にモニタするために用いられる。

本発明は、別の特徴では、サンプル中の分析物の存在を判定する方法を提供する。この方法は、分析物を結合させる基体の頂面の第１の部分にサンプルを接触させる段階を有し、基体の頂面は、異方性トポグラフィー及び金属被膜を有し、この方法は、サンプルが基体に接触する前後において、基体に波長が６００ｎｍ〜８５０ｎｍの光を照射する段階、サンプルが基体に接触する前に、基体を通って伝送された光の第１の吸収度測定値を得る段階、サンプルが基体に接触した後に、基体を通って伝送された光の第２の吸収度測定値を得る段階、及び第１の吸収度測定値と第２の吸収度測定値との間に差があるかどうかを判定する段階を有する。基体の頂面の異方性トポグラフィーは、６００ｎｍよりも小さい。第１の吸収度測定値と第２の吸収度測定値の差は、サンプル中の分析物の存在を指示する。

吸収度測定値を得る段階を含む一実施形態では、基体の頂面は、複数の溝を備える。溝は、幅が１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、深さが１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。かかる実施形態では、溝相互間離隔距離は、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。かかる他の実施形態では、基体の頂面に設けられた溝は、幅が１０ｎｍ〜４００ｎｍ、深さが１０ｎｍ〜４００ｎｍ、溝相互間離隔距離が１０ｎｍ〜４００ｎｍである。幾つかの実施形態では、溝は、互いに平行である。更に別の実施形態では、基体に偏光を照射し、この偏光は、一実施形態では、溝に垂直である。
吸収度測定値を得る段階を含む他の実施形態では、金属被膜の金属は、銀又は金を含む。

吸収度測定値を得る段階を含む更に他の実施形態では、金属被膜の厚さは、５ｎｍ〜３００ｎｍ、３０ｎｍ〜１２０ｎｍ又は５０ｎｍ〜７０ｎｍである。
吸収度測定値を得る段階を含む更に他の実施形態では、基体の頂面は、分析物に結合する受容体分子を更に有する。更に別の実施形態では、基体の頂面は、遮断層、例えば一実施形態では、血清アルブミン、例えばウシの血清アルブミンを有する。
本発明の別の目的、特徴及び利点は、添付の図面と関連して以下の詳細な説明を読むと明らかになろう。

（発明の詳細な説明）
「ＡＦＭ」という用語は、原子間力顕微鏡を意味している。
「ＳＷＧ」という用語は、副波長格子を意味している。
「ＢＳＡ」という用語は、ウシの血清アルブミンを意味している。
「ＰＢＳ」という用語は、燐酸緩衝生理食塩水を意味している。
「ＳＡＭ」という用語は、自己組織化単一層を意味している。
本明細書に記載する全ての範囲は、その範囲の限度内に含まれる全てのコンビネーション及びサブコンビネーションを含む。例えば、約５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲は、５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲、１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲、１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲、５ｎｍ〜５０ｎｍの範囲、約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲、１２ｎｍ〜４７ｎｍの範囲、５ｎｍ〜４７ｎｍの範囲、１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲、２０ｎｍ〜９０ｎｍの範囲、及び５ｎｍ及び約５ｎｍの測定値、１０ｎｍ及び約１０ｎｍの測定値、２０ｎｍ及び約２０ｎｍの測定値、１２ｎｍ及び約１２ｎｍの測定値、４７ｎｍ及び約４７ｎｍの測定値、５０ｎｍ及び約５０ｎｍの測定値、６０ｎｍ及び約６０ｎｍの測定値、７０ｎｍ及び約７０ｎｍの測定値、１００ｎｍ及び約１００ｎｍの測定値、１５０ｎｍ及び約１５０ｎｍの測定値等を含む。さらに、当業者であれば理解されるように、一覧表示した全ての範囲は、その範囲を少なくとも互いに等しい１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０等に分割されることを十分に説明して可能にするものとして容易に理解できる。非限定的な例として、本明細書に記載する範囲の各々を下方の１／３、中間の１／３及び上方の１／３に容易に分割でき、又下半分及び上半分に分割できる。

数と関連として本明細書において用いられる「約」という用語は、その数の約９０％〜１１０％の範囲を意味している。例えば、約５０ｎｍの幅は、約４５ｎｍ〜５５ｎｍの幅を意味している。
異方性材料の副波長格子（ＳＷＧ）は、形状複屈折と呼ばれる異方性を備えている。これについては、ボーン・エム（Born, M），ウォルフ・イー（Wolf, E.）著，「プリンシパルス・オブ・オプティクス：エレクトロマグネティック・セオリー・オブ・プロパゲーション・インタファーレンス・アンド・ディフラクション・オブ・ライト（Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation, Interference and Diffraction of Light）」，ケンブリッジ ユニバーシティー プレス（Cambridge University Press），１９９９年及びヤルビ・エー（Yariv, A.），イェー・ピー（Yeh, P.）著，「エレクトロマグネティック・プロパゲーション・イン・ペリオディック・ストラティフィード・メディア（Electromagnetic propagation in Periodic Stratified media），ＩＩ. バイアフリーゲンス・フェーズ・マッチング・アンド・エックス−レイ・レーザーズ（Birefringence, Phase Matching, and X-ray Lasers）」，６７，J. Opt. Soc. Am，１９７７年，ｐ．４３８を参照されたい。ＳＷＧの光学的性質は、格子の構造及び格子構造を構成する材料（基体及び充填材料）の屈折率で決まる。ナノメートルレベルの溝を有する構造、例えばＳＷＧは、改良型リソグラフィ法を用いて日常的に製作されており、かかる方法としては、次のモローの文献によって記載されているｅ−ビームライティングが挙げられるがこれには、限定されない。モロー・エム・ダブリュ（Moreau, M. W.）著，「セミコンダクター・リソグラフィー：プリンシプルズ・アンド・マテリアルズ（Semiconductor
Lithography: Principles and Materials）」，ニューヨーク州ニューヨーク（New York, New York），プレナム・プレス（Plenum Press），１９８８年を参照されたい。ポリマー材料を用いる硬質ＳＷＧのレプリカ成形により、硬質ＳＷＧから転写されたＳＷＧ構造を有するポリマーレプリカの早期形成が可能になる。これについては、シーア・ワイ・エヌ（Xia Y. N.），ホワイトサイズ・ジー・エム（Whitesides, G. M.）著，「ソフト・リソグラフィー（Soft Lithography）」，３７，Angew. Chem. Int. Ed.，１９９８年，ｐ．５５１−５７５を参照されたい。

驚くべきことに且つ予測しなかったことには、ナノ構造化基体、例えばＳＷＧを利用すると、偏光顕微鏡を用いて種々の表面現象を視覚化できる。かかる現象を視覚化するのに液晶を使用できるが、必要なものは何も無い。かかる表面現象の非限定的な例は、表面全体にわたって広がった液体の一滴中のバルク液体に先立って前進する前躯体液体薄膜の画像化である。また、金属、例えば金又は銀で被覆された基体を利用しても、偏光顕微鏡を用い又は光が基体を通って伝送されているときに表面プラズモン吸着の測定及び比較により表面現象を視覚化できる。かかる金属化基体は、例えば非機能化アルカンチオール及び機能化アルカンチオール、例えばωを末端基とするアルカンチオールのような材料からつくられたＳＡＭを更に有するのがよい。また、金属で被覆され、ＳＡＭを構成するＳＷＧを用いてもかかる改質ナノ構造化基体の表面上で生じる現象を視覚化できる。例えば上述したようなナノ構造化基体は、特定の分析物化学種を結合する受容体化学種を頂面上に更に有するのがよい。加うるに、かかる基体は、基体の頂面上の非特異的吸着を阻止する遮断層を有するのがよい。かかる基体により、分析物化学種、例えばたんぱく質と画像化されるべきナノ構造化基体の表面上の相補受容体化学種との結合が可能になる。したがって、かかる基体は、サンプル中の分析物の存在を検出する有用な装置となる。

一般的に、本発明は、ナノ構造化基体の表面上で生じる現象を画像化する装置及び方法を提供する。本発明は又、ナノ構造化基体を用いてサンプル中の分析物の存在を検出する方法及び装置を提供する。
ナノ構造化基体の光学的性質は、表面上で生じる現象を画像化するために使用できるコントラストを高める広く有用な機構を提供する。ナノ構造化基体のナノメートルレベルのトポグラフィーは、光の複屈折又は光学的に異方性の媒質により垂直の振動方向をもって伝搬する２つの波の状態への光の分解を生じさせる。ナノ構造化基体の表面上のトポグラフィーへの任意の物質、例えば液体、生体分子及びウイルス（しかしこれらには限定されない）の侵入により、複屈折が変更されると共に偏光子及び検光子を用いた場合に画像化されて検出される表面上の物質の配置及び存在が可能になる。

基体の表面上で生じる現象を画像化する第１の方法は、流体、例えば液体を基体の頂面に接触させる段階と、次に例えば偏光子及び検光子を用いて基体を偏光で観察する段階とを有する。基体の表面上で生じる現象を画像化する幾つかの方法においては、流体を基体の頂面に接触させた後、偏光子及び検光子を用いて基体を観察する。例えば、偏光子及び検光子を利用する本発明の方法を用いて流体、例えばヘキサデカンのような有機化合物の液滴の広がりを画像化することができる。幾つかの実施形態においては、偏光子及び検光子を用いて基体が観察され、この場合、検光子は、交差形態（この場合、偏光子と検光子のなす角度は９０°である）から交差形態の１０°以内の形態の範囲にわたるよう、即ち、検光子と偏光子のなす角度が８０°〜１００°であるように構成されている。他の実施形態では、基体は、偏光子及び検光子を用いて観察され、この場合、検光子は、交差形態から交差形態の２°以外の形態にわたるよう、即ち、検光子と偏光子のなす角度が８８°〜９２°であるよう構成される。さらに別のかかる実施形態では、検光子は、交差形態から交差形態の１°以内の形態の範囲にわたるよう、即ち、検光子と偏光子のなす角度が８９°〜９１°であるよう構成される。さらに別の実施形態では、検光子は、交差形態の０．５°以内の形態から交差形態の５°以内の形態の範囲にわたるよう、即ち、検光子と偏光子のなす角度が９０．５°〜９５°、又は８５°〜８９．５°であるように構成される。幾つかの実施形態では、基体は、流体が基体の頂面に接触した後、偏光顕微鏡を用いて観察される。基体は又、これが偏光子と検光子との間で回転している間に観察できる。

基体の頂面は、一方位角方向におけるトポグラフィー又は表面特頂部が１以上の他の方位角方向のものとは異なる異方性トポグラフィー又は表面を呈している。異方性トポグラフィーは、例えば金属化基体上での光の吸収が表面プラズモン現象で決まる場合、例えば形状複屈折又はダイクロイズム（二色性）のような光学的な性質を生じさせる（図７参照）。本発明の幾つかの特徴では、基体は、異方性トポグラフィーをもたらすナノテキスチャード頂面を有する。かかる一実施形態では、適当な基体は、複数の溝、例えば、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ及び図３ＢのＡＦＭ画像に示された溝を備えた頂面を有する基体である。一般的に、かかる実施形態において異方性トポグラフィーをもたらす溝又は他の特頂部の寸法形状は、画像化の際に用いられる光の波長と比べて小さいことが必要である。表面現象を画像化し、分析物を検出するために用いられる光は、代表的には可視光であるが、長い波長の光、例えば赤外光又は短い波長の光、例えば紫外光も又使用できる。かくして、適当な基体の溝の幅は代表的には、１ｎｍ〜１，０００ｎｍである。本発明の種々の実施形態では、溝の幅は、２ｎｍ〜８００ｎｍ、１０ｎｍ〜６００ｎｍ、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、２０ｎｍ〜４００ｎｍ、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。適当な溝付き基体の溝の深さは代表的には、１ｎｍ〜５，０００ｎｍである。本発明の種々の実施形態では、溝の深さは、２ｎｍ〜８００ｎｍ、１０ｎｍ〜６００ｎｍ、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、２０ｎｍ〜４００ｎｍ、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。適当な溝付き基体の溝は代表的には、溝相互間の距離が１ｎｍ〜５，０００ｎｍであるように隆起条によって分離されている。本発明の種々の実施形態では、溝付き頂面を備えた基体の溝相互間の距離は、２ｎｍ〜８００ｎｍ、１０ｎｍ〜６００ｎｍ、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、２０ｎｍ〜４００ｎｍ、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。基体の溝、例えば上述した溝は、本発明の一実施形態では互いに平行である。幾つかのかかる実施形態では、溝は、矩形又は正方形であるのがよい。他の実施形態では、溝は、弧状構造を有し、楕円形又は円形の窪みを構成できるよう湾曲したものであってもよい。さらに他のかかる実施形態では、溝は、正弦波形状であってもよい。他の実施形態では、基体の頂面は、基体の頂面から上方に突き出ていて、異方性トポグラフィーをもたらす寸法形状を備えた複数の湾曲した又は互いに平行な隆起条を有する。かかる実施形態としては、基体の頂面が楕円形又は円形の突起又は互いに平行な突起を有する実施形態が挙げられ、互いに平行な突起は、整列状態のロッドを用いて形成できる。さらに別の実施形態では、基体の頂面は、異方性トポグラフィーを基体表面に与える異方性粒子を有してもよい。

溝の幅よりも大きな寸法を持つ分析物は、溝付き基体の頂面の溝に嵌まり込まず又はこれに侵入できないであろう。このために、本発明の溝付きの基体は、種々の分析物の寸法を定めるために使用できる。かくして、種々の溝幅を持つ一連の基体を用いると、本発明の一実施形態において特定の分析物化学種の特定の寸法を定めることができる。また、溝付き基体の溝を用いると、以下に説明するようにサンプルを基体の頂面の特定の溝に投与することができる。

本発明の実施に用いるのに適した基体は、多くの材料で作ることができる。かかる材料の例としては、金属、例えば金、銀、銅及びニッケル（これらには限定されない）、有機ガラス及びポリマーが挙げられる。一実施形態では、ポリマーが本発明の基体に用いるのに特に適している。適当なポリマーの例としては、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン及びポリイミドが挙げられるが、これらには限定されない。本発明の一実施形態では、基体は、レプリカ成形法を用いて成形され又は形成できるポリウレタンで作られる。一実施形態では、基体は、支持体、例えばガラススライダ又はプレート上にポリマー、例えばポリウレタンを被着させたものから成る。他の実施形態では、基体は、容易に変形可能な材料で作られる。かかる実施形態では、基体の機械的変形により、容易に視覚化されるリターデーションの変化が生じる。基体の変形をもたらす機械的応力は、結合事象、例えば基体への細胞の結合を含むのがよい。また、基体は、種々の溶液に晒されると膨潤し又は収縮する材料、例えばポリマー又はヒドロゲルで作ってもよい。例えば、基体が、有機蒸気の吸収の際に膨潤するポリ（ジメチルシロキサン）で形成できる。

種々の製造方法を用いて基体を製造できる。適当な一方法では、従来型微細加工法を用いて金型を例えばシリコン加工物内で形成し、この場合、シリコン加工物には液体ポリマーが塗布されており、後でこれを凝固させる。また、コンパクトディスクやホログラフィック格子の製作の際に用いられる機械的エンボス加工と類似したポリマーの機械的エンボス加工を利用するのがよい。高温硬質マスターをそのガラス転移温度の近くまで加熱されたポリマーシートの状態にプレス加工し、マスターのレリーフをポリマーに転写する。かかる方法では、ポリマーを代表的には、そのガラス転移温度以下に冷却し、その後マスターを取り外す。基体は又、光重合法を用いても作製できる。また、適当な基体をマスターから形成するのに、レプリカ成形法を用いてもよく、或る幾つかの実施形態では、基体は、ガラス支持体上に作製された成形ポリウレタンレプリカであるようにする。基体を作製する一方法では、シリコン又は他のマスターを用いてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又は他のエラストマーレプリカを形成する。好ましくは弗素化シラン、例えばトリデカフロロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチルトリクロロシランのような弗素含有化合物を、エラストマーレプリカの製作に先立ってシリコンマスターの表面に塗布し、エラストマーレプリカの取り出しが容易であるようにする。次に、好ましくはエラストマーレプリカを熱硬化性材料、例えばエポキシド（これには限定されない）又はより好ましくは紫外線硬化性材料、例えばポリウレタン、ポリシアノアクリレート又はポリスチレン（これらには限定されない）からレプリカを形成するマスターとして用いる。ポリウレタンは、かかるポリマーレプリカを形成する際に用いるのに特に適した材料である。

基体の頂面は、無機材料の被膜を有するのがよい。適当な無機材料としては、シリコン酸化物、金属酸化物、金属及びこれらの組み合わせが挙げられる。無機材料、例えば金属を真空蒸着法を用いてポリマーレプリカに塗布するのがよい。銀及び金は、被覆基体を製造する際に用いるのに特に適した金属の例である。金属被覆ナノ構造化基体では、基体の金属被膜の厚さは代表的には、２ｎｍ〜５００ｎｍ、２ｎｍ〜４００ｎｍ、５ｎｍ〜２００ｎｍ、又は１０ｎｍ〜１００ｎｍである。斜めに被着した金又は銀表面は、基体の頂面に被着されたチタン又は他の付着増進材料の表面上に位置するのがよい。付着増進材料、例えばチタンを用いると、金属、例えば金又は銀をその頂部に被着する際に良好な付着性が得られる。しかしながら、チタン又は他の付着増進材料を用いることは、本発明の金属被覆基体を作製する上で必要ではない。付着増進材料を用いる場合、この材料は代表的には、１ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜３０ｎｍ又は３ｎｍ〜１０ｎｍの厚さで存在する。幾つかの実施形態では、約３ｎｍのＴｉをナノ構造化頂面を有するポリマーの頂面に被着させる。次に、金をＴｉの頂部に被着させて金厚さが１２ｎｍ〜４７ｎｍ、チタン厚さが約３ｎｍの金被覆ナノ構造化基体を得る。

金属被膜、例えば金又は銀被膜を有する基体を種々の化合物で処理するのがよく、これら化合物は、金属の表面上に化学吸着される。例えば、有機硫黄化合物、例えばスルフドリル（−ＳＨ）又はジスルフィド族を持つ化合物が金属、例えば金又は銀の表面に結合し、ＳＡＭを形成する。これにより、基体の表面を改質する簡単な方法が提供される。適当な有機硫黄化合物としては、非機能的アルカンチオール、例えば化学式ＨＳ−Ｘ−Ｙを持つ化合物が挙げられ、ここでＸは、スペーサ基又は群であり、Ｙは、例えばアルキル又はアリール基のような基である。かかる有機硫黄化合物では、Ｘは、スペーサ基又は群、例えば置換又は非置換アルキル鎖、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アルキルアリール鎖、ペルフルオロアルキル鎖又はペルフルオロアリール基である。

また、かかるアルカンチオールに対応したジスルフィドを用いても金属表面は処理してＳＡＭを形成することができる。非機能的アルカンチオールの例としては、ＨＳ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃が挙げられ、ここでｎは、値が６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６、１７又は１８の整数である。他の適当な有機硫黄化合物としては、化学式ＨＳ−Ｘ−Ｚの化合物が挙げられ、ここで、Ｘは、例えば上述したようなスペーサ基又は群であり、Ｚは、官能基、例えば−ＣＯ₂Ｈ、−ＯＨ、−ＣＦ₃、−ＳＯ₃Ｈ、−（Ｎ（アルキル）₃）⁺、−ＮＨ₂、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_qＯＨ、アルコキシ基、アリロキシ基、アルデヒド基、ケトン基、スルフドリル基、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物基、置換又は非置換フェロセン基、アルケン基、エポキシド又はエポキシ基、ジエン基、ビオチン、糖、低分子量受容体、例えばベンゼンスルホルアミド基、キノン又は重合のための開始剤部位であり、上記において、ｑは、１，２，３，４，５，６，７，８，９又は１０から選択された整数である。かかる適当な有機硫黄化合物の例としては、ωを末端基とするアルカンチオール、例えば化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_mＣＯ₂Ｈを有する化合物が挙げられ、ここでｍは、値が６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８の整数である。他のかかる適当な有機硫黄化合物の例としては、ヒドロキシを末端基とする化合物、例えば化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_mＯＨのアルコール（これらには限定されない）、エチレングリコールを末端基とする化合物、例えば化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_pＯ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_rＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨの化合物（これらには限定されない）が挙げられ、ここでｍは、上述の値であり、ｐは、値が２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６の整数であり、ｒは、値が０，１，２，３，４，５又は６である。他のかかる適当な有機硫黄化合物の例としては、アルコキシリ及びアリロキシを末端基とする化合物、例えば化学式ＨＳ−Ｘ−Ｏ−Ｗの化合物が挙げられ、ここで、Ｘは、例えば上述したようなスペーサ基又は群であり、Ｗは、アルキル基又はアリール基である。アルコキシ及びアリロキシを末端基とする有機硫黄化合物の例としては、化学式ＨＳ（ＣＨ₂）_mＯ−Ｗの化合物及びＨＳ（ＣＨ₂）_pＯ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_rＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−Ｗ、の化合物が挙げられ、上式において、ｍ、ｐ及びｒは、上述した値であり、Ｗは、１〜６個の炭素原子を有するアリール基又はアルキル基である。

また、金属化基体を有機硫黄化合物の混合物で処理すると、混合ＳＡＭ基体が得られる。種々の他の化合物が本発明の基体の金属の表面に結合することになろう。かかる化合物の化学式は、Ｒ¹−Ｖ−Ｒ²であり、この式において、Ｖは、金属の表面に化学吸着する基であり、Ｒ¹及びＲ²は、アルコール、アミン、ホスホネート及びカルボン酸基から選択される。かかる化合物では、Ｖは、脂肪鎖、エチレングリコール又はアミド、エステル又はエーテル結合から選択したものであるのがよい。種々の化合物、例えば、シラン（これには限定されない）を用いても、以下に説明するように基体の表面を機能化し又は活性化させることができる。かかる化合物により、受容体を本発明で用いられる基体の頂面に取り付ける簡単な方法が得られる。頂面上に有機硫黄化合物を有する基体を作製するには、スルフドリル又はジスルフィド基を有する有機硫黄化合物を含む溶液中に金属化基体を浸漬するのがよい。変形例として、有機硫黄化合物又は有機硫黄化合物の混合物を含む溶液の基体を表面上に滴下し又は注いでもよく、或いは基体の金属化頂面に接触させてもよい。変形例として、有機硫黄化合物又は有機硫黄化合物の混合物を真空蒸着法を用いて蒸気として基体の金属頂面に被着させてもよい。有機硫黄化合物のスルフドリル（−ＳＨ）基は、基体の金属に結合し、それにより有機硫黄化合物を基体の表面上に不動化又は固定化する。幾つかの実施形態では、有機硫黄化合物は、アルコール、例えばエタノール又はメタノール中に存在する。ただし、他の液体も又本発明に従って用いることができる。

一般に、サンプル中の分析物の存在を検出する際に用いられる基体は、分析物が露光時に結合される表面を有する。基体の頂面は、分析物化学種の非特異的吸着可能に設計されたものであるのがよい。例えば、基体の頂面は、疎水性表面及び帯電した分析物化学種を引き付けるよう水溶液中に正又は負に帯電した群を提供する化学種を有するのがよい。種々の実施形態では、サンプル中の分析物の存在を検出する際に用いられる基体は、分析物に特異的に結合し又は相互作用する受容体化学種を有する。適当な受容体化学種の例としては、ペプチド及びポリペプチドを含む種々の生体分子認識剤、ＲＮＡ及びＤＮＡオリゴマ又はフラグメント、ビオチン、アビジン、単糖類、二糖類及び多糖類を含む糖、抗生物質、ＦＡＢ及び抗生物質のＦＡＢフラグメント又は他のフラグメント、例えば免疫グロブリン（これには限定されない）、例えばＩｇＧ（これには限定されない）及び基体の表面につながれた小分子（例えば、薬剤）（薬剤研究用の小分子／たんぱく質−ウイルス相互反応のスクリーニングを可能にする）が挙げられる。また、基体の頂面は、ウイルスを結合させる配位子（リガンド）又は共有結合により結合剤（例えば、−ＳＨ基）を取り付けるために用いることができる反応成分を含むポリマー材料、例えば機能性ポリマーを更に有するのがよい。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む免疫グロブリン及び免疫グロブリンのフラグメントは、適当な受容体化学種であり、ＩｇＧ及びＩｇＧのフラグメントは、受容体化学種として特に適している。受容体は又、原核生物及び有核生物に結合してこれらの存在状態及び挙動（形状、移動性、付着性及び増殖性）を変更することができる。例えば、適当な受容体は、細胞表面上のインテグリンに結合し、かくして表面への細胞付着性を促進し、次いで増殖性を促進するＲＧＤトリペプチドを含むのがよい。

加うるに、ナノ構造化基体の頂面をウイルス、細菌及び生体分子が受容体化学種と相補しない場合、表面へのこれらの非特異的吸着を阻止する遮断層として働く材料の層で被覆し又は覆うのがよい。例示の遮断層材料は、アルブミンフィルム、例えばウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）のフィルムを構成する。遮断層を他の動物に由来するアルブミンから作ってもよく、又は例えばポリ（エチレンオキシド）のような材料を基体の表面上に不動化し又は固定化することにより作ってもよい。また、両性イオン性ポリマーを用いて非特異的吸着性を減少させてもよい。基体それ自体の材料は又、非特異性吸着を阻止するよう選択できる。別の非限定的な例としては、オリゴエチレングリコールストランドを用いて基体のポリマーを誘導体化し、それにより非特異性吸着を阻止してもよい。本発明の一特徴によれば、遮断層中又は遮断層上の基体の表面上の受容体化学種は、検出されるべき分析物に特異的に結合する。例えばＢＳＡのような受容体化学種は、遮断層と受容体化学種の両方として作用できる。例えば、ＢＳＡは、例えば抗ヤギＩｇＧのような化学種の非特異的吸着を妨げるが、抗ＢＳＡ・ＩｇＧの特異的受容体である。遮断層及び受容体化学種の適正な選択により、本発明の基体は、サンプル中の多種多様な特定の分析物の検出に用いることができる。

化合物を固体の表面上に不動化し又は固定化する種々の手順を用いて受容体化学種を基体の表面上に不動化し又は固定化することができる。一方法では、受容体を基体の表面上に物理的に吸着させる。これは、受容体がたんぱく質である場合特に適している。次に、遮断層をアルブミン、例えばＢＳＡの溶液又は粉末ミルクの溶液中に浸漬することにより追加することができる。また、受容体をチオール又はシランの化学的性質を利用することにより基体の表面に共有結合により結合し又は連結してもよい。例えば、金属被覆基体、例えば金被覆基体を用いる場合、たんぱく質の第一アミンを金属の表面に結合された酸を末端基とするアルカンチオールのカルボン酸基に共有結合として結合するのがよい。変形例として、ジチオールのスルフドリル基をヘテロ二官能価架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（これには限定されない）と組み合わせて用いてたんぱく質の第一アミン基への共有結合を形成してもよい。次に、表面をアルブミン溶液、例えばＢＳＡ溶液又は粉末ミルクの溶液中に浸漬することにより遮断するのがよい。受容体が小さな分子、例えばＮｉ（ＩＩ）ニトリロトリアセテートである場合、これを化学的に改質して金に直接結合するチオール基を含むようにするのがよい。表面をエチレングリコールを末端基とするアルカンチオールの同時吸着により遮断してもよい。基体表面上への受容体の不動化の別の方法では、種々のシラン化学的性質を利用することができる。第一アミン、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン（これには限定されない）を、活性化剤、例えばジスクシンイミジルスベレート（これには限定されない）の使用により活性化し、次にたんぱく質受容体の第一アミンと反応させてもよい。当業者には明らかなように、受容体を表面上に不動化し、遮断層を有する基体を作製するのに用いることができる他の多くの手法がある。

一実施形態では、金被覆ポリウレタンレプリカの頂面を有機硫黄化合物、例えば１ｍＭヘキサデカンチオールを含有したエタノールの液滴を含む溶剤に接触させることにより非特異性結合を促進する表面を作製することができる。液滴を周囲温度で５分間頂面に接触させ、次に多量のエタノールで表面から洗い落とすのがよい。次に、レプリカを不活性ガス、例えば窒素の流れ中で乾燥させるのがよい。その結果得られたレプリカ基体の表面は、高い疎水性を示し、多種多様なたんぱく質を非特異的に吸着する。

分析物がサンプル中に存在するかどうかを判定する方法は、サンプルを本発明の基体の頂面の第１の部分に接触させる段階を含む。基体の頂面は、分析物に結合する第１の部分を有している。任意的に、頂面は、１つの特定の分析物又は１クラスの分析物と相互作用する受容体化学種を有する。代表的には、サンプルを約０．００１時間〜約１０時間の期間にわたり基体の頂面に接触させる。サンプルは、基体に連続的に接触する流れであるのがよく、したがって基体を例えば水の品質管理のような用途に用いることができるようになる。サンプルが基体に接触する時間は、サンプル中の分析物の濃度に応じて様々であろう。分析物の濃度がミリモル（ｍＭ）又はモル（Ｍ）範囲にあれば、短い接触時間（数秒〜数分間）で恐らくは十分である。接触時間は又、幾分かは表面への分析物の物質移動の仕組みで決まる。例えば、微小流体チャネルを用いることにより又は攪拌により、或いは超音波処理により対流を強制して行わせる場合、必要な結合時間を表面への送達が純粋に拡散方式である状況と比較して減少させることができる。また、定数又は時間を適用し、金属被覆ナノ構造化基体に対する電位を空間的に変えることにより結合時間を早めることができる。印加した電位により、帯電化学種の移動が生じ、例えば誘電泳動力により溶液中の化学種に作用する力が生じ、或いは電気運動現象、例えば電気浸透により液体中に対流が生じる。対流又は物質移動のための助けを用いず、分析物の濃度がフェムトモル（ｆＭ）範囲にある場合、標的化学種又は１クラスの化学種の存在を検出するためには基体を何時間にもわたって流れに接触させる必要のある場合がある。当業者であれば認識されるように、磁気ビーズを用いても基体のナノ構造化表面への標的分析物の送達を加速させることができる。

一実施形態では、分析されるべきサンプルを基体の溝に沿って流すことによりこれを溝付き基体に接触させるのがよい。かかる実施形態では、平らな頂部プレートを基体の頂面上に配置して基体の溝内又は溝を通るサンプルの流れを閉じ込めるのがよいが、このようにするかどうかは任意である。かかる実施形態は、分析物を基体の検出部にもたらすためにナノ流体送達方式を有効に用いている。

適当な量の分析（もし存在していれば）が受容体化学種又は基体の頂面に結合されるようにするためにサンプルが適当な期間にわたって基体の頂面に接触した後、代表的にはサンプルを基体の頂面から取り除く。サンプルを画像化に先立って基体から取り除くことは常に必要であるというわけではない。或る場合には、サンプルを画像化プロセス中、基体と接触状態にしておくことが望ましい。サンプルを取り除く場合、第２の流体を用いてサンプルを基体から移動させることによりサンプルを取り除くことができる。この方法を用いてサンプルを取り除く際、液体を用いてサンプルを移動させるのがよく、或いは変形例として流体例えば空気又は窒素ガスを用いてサンプルを移動させてもよい。また、振動を用いて又は機械的な力をサンプルに加えることによりサンプルを取り除いてもよい。例えば、基体を傾けてサンプルが重力の影響下で流れ去るようにすることによってサンプルを基体から取り除くことができる。基体の頂面からのサンプルの取り除きに続き、基体を代表的には、１以上の溶液、例えば脱イオン水又は他の水溶液、或いは有機液体、例えばメタノール又はエタノールのようなアルコール（これには限定されない）で濯ぎ洗いする。濯ぎ洗い後、基体を一般に、視覚化に先立って乾燥させる。ただし、本発明に従って変更を用いると濡れた基体も視認できる。蒸発法又はガス、例えば窒素、空気又はアルゴンの流れをサンプル上に流すことにより基体を乾燥させてもよい。

基体の頂面からのサンプルの取り除き及び任意的に基体を濯ぎ洗いして乾燥させた後、一実施形態では、偏光を通して基体を視認する。例えば、交差偏光子を用いる偏光顕微鏡により基体を視認するのがよい。サンプルと接触状態にあった基体の部分の光学的外観とサンプルに接触していなかった基体の別の部分とを比較することによりサンプル中に分析物が存在していたかどうかを確認することができる。２つの部分の光学的外観の差により、サンプルが基体の受容体に結合した分析物を含んでいるらしいことがわかる。変形例として、分析物の存在を、分析物に結合していない基体上の「対照領域」を組み込むことにより確認してもよい。かかる領域の一例としては、受容体化学種を含まない領域が挙げられる。対照領域の外観と分析物結合領域を比較することにより、分析物が存在しているかどうかが明らかになろう。別の変形例としての方法では、サンプルとの接触前及び接触後における表面の絶対強度の測定をサンプルが存在しているかどうかの判定の際に利用してもよい。幾つかの実施形態では、基体に結合された分析物よりも屈折率が著しく異なる液体を画像強調流体として利用することができる。画像強調流体が存在することにより、標的化学種を含む表面の領域の外観とそうではない領域との光学的コントラストが最大になる。好ましい画像強調流体として、空気又は窒素が挙げられるが、この能力では液体を用いてもよい。

本発明の基体は、サンプル中の２以上の分析物又は２以上のクラスの分析物を検出するよう設計されたものであるのがよい。例えば、第１の分析物化学種を結合できる第１の受容体分子が、基体の第１の部分の頂面上に存在し、第２の別の分析物化学種を結合できる別の第２の受容体分子が、基体の第２の部分の頂面上に存在するのがよい。これと同様に、複数の種々の受容体分子が、本発明の基体の頂面上の複数の互いに異なる部分中に存在して複数の互いに異なる分析物を本発明の方法を用いてサンプル中に検出できるようにすることができる。液体の小滴を表面の別々の領域に送る従来型スポッティング法を用いて多数の受容体を基体上に配置するのがよい。変形例として、ホトリソグラフィー法、例えばＤＮＡのアレイを表面上に調製するのに用いられるホトリソグラフィー法を用いて受容体を表面上にパターン付けしてもよい。変形例として、微小流体チャネルをレプリカの表面に接触させ、これらを用いて受容体を表面の空間的に別々の領域に送ってもよい。

金属被覆基体を可変電圧及び周波数電源を含む外部電気回路に接続するのがよい。基体を対向電極として役立つ第２の電極と共に電解液中に浸漬させるのがよい。対向電極と金属被覆基体の電位差の印加により、溶液中に電解が生じる。この電解は、溶液内の帯電分子に加わる力を生じさせ、それによりこれら帯電分子が、金属被覆基体の表面に向かって移動するようになる。電解が電子電解であれば、移動は、電気泳動の結果として生じることになる。しかしながら、たとえ非帯電物体であっても、誘電力を電解によって及ぼすことができる。電解中に勾配が存在していると、誘電泳動により、標的化学種が電極に向かって移動することができる。この移動は、電解の周波数を変えることにより操作できる。ＤＮＡを含む溶液中で金属被覆基体に正の電位を印加すると、その結果としてＤＮＡが金属被覆基体に向かって移動するようになる。溶液中に溶解したたんぱく質のｐＨよりも低いｐＨの溶液中で金属被覆基体に負の電位を印加すると、その結果として、たんぱく質が金属被覆基体に向かって移動することになる。

また、本発明の基体を通って伝送される光の吸収度（吸光度）の変化を利用するとサンプル中の分析物の存在を検出することができる。吸収度のかかる変化は、表面プラズモン吸収現象に起因している場合がある。吸収度を用いる種々の方法を利用すると、分析物化学種がサンプル中に存在しているかどうかを判定することができる。サンプル中の分析物の存在を検出する一方法としては、サンプルを分析物に結合した基体の頂面の第１の部分に接触させる方法が挙げられる。吸収度の測定値、例えば表面プラズモン吸収度を用いる方法で利用される基体の頂面は、上述したような異方性トポグラフィー及び金属被膜、例えば銀又は金被膜を有することが必要である。かかる方法に用いられる基体の頂面の異方性トポグラフィーは一般に、基体を照射するのに用いられる光の波長よりも短いことが必要であり、一般に６００ｎｍ未満である。かかる用途における金属被膜の厚さは代表的には、種々の実施形態において５ｎｍ〜３００ｎｍ、３０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜７０ｎｍである。サンプルが基体に接触する前後において、波長が５００ｎｍ〜８５０ｎｍ、より好ましくは６００ｎｍ〜８５０ｎｍの光を含む光で基体を照射する。光は、一成分として波長が５００ｎｍ〜８５０ｎｍ又は６００ｎｍ〜８５０ｎｍの光を含む限り他の波長を含んでもよい。サンプルが基体に接触する前に基体を通って伝送された光の第１の吸収度の測定値を取る（図７参照）。サンプルが基体に接触した後に基体を通って伝送された光の第２の吸収度測定値を取る。第１の吸収度測定値と第２の吸収度測定値の比較により、測定値相互間に差があるかどうかを判定することができる。第１の吸収度測定値と第２の吸収度測定値の差により、サンプル中に分析物が存在していることが分かる。というのは、分析物が基体の頂面上に存在していると、基体を通って伝送された光の吸収度が変化するからである。光のリターデーションを用いてサンプル中の分析物の存在を検出する実施形態の場合と同様、基体の頂面は、分析物に結合する受容体分子を有し、更に、遮断層、例えば上述したような遮断層を更に有するのがよい。

吸収度測定値を用いる分析物の存在の検出法の一実施形態では、基体は、基体の頂面が幅１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、深さが１ｎｍ〜５００ｎｍ、相互離隔距離が１ｎｍ〜５，０００ｎｍの複数の溝を備えた溝付き基体である。他の実施形態では、溝の幅は、幅が１０ｎｍ〜４００ｎｍ、深さが１０ｎｍ〜４００ｎｍ、相互離隔距離が１０ｎｍ〜４００ｎｍである。溝は湾曲していてもよいが、一実施形態では互いに平行である。本発明の実施の際に偏光されない光を用いることが可能であるが、一実施形態では、これは表面プラズモン吸収を最大にすることが判明しているので基体の頂面に設けられた溝の方向に好ましく
はより垂直である偏光で基体を照射する（図７参照）。

実験例
材 料
フィッシャー・サイエンティフィック社（ペンシルベニア州ピッツバーグ所在）から得られるフィッシャーのFinest, Premium Gradeガラス顕微鏡スライダを用いて基体を製造した。ガラススライダを「ピラニア溶液」（７０％Ｈ₂ＳＯ₄／３０％Ｈ₂Ｏ₂）で処理することにより使用前にクリーニングした。「ピラニア溶液」は、極度の注意を持って取り扱うことが必要である。というのは、このピラニア溶液は、有機物質と激しく反応し、閉鎖容器内に貯蔵してはならないからである。「ピラニア溶液」中において８０℃で１時間かけてクリーニングした後、スライダを脱イオン水で十分に濯ぎ洗いし、窒素の流れの下で乾燥させた。使用に先立って、清浄なガラススライダを少なくとも３時間、１２０℃に加熱されたオーブン内に貯蔵した。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ，Sylgard（登録商標）１８４，ダウ・コーニング・カンパニー（ミシガン州ミッドランド所在））及びポリウレタン（ＰＵ，ＮＯＡ６１，ノーランド・プロダクツ・インコーポレイテッド（ニュージャージー州ニューブランスウィック所在））をポリマーレプリカの形成に当たり熱硬化性又は紫外線硬化性ポリマーとして用いた。ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ，ＩｇＧ無し，凍結乾燥粉末）をシグマ社（ミズーリ州セントルイス所在）から得て受け取ったままの状態で用いた。抗ＢＳＡ・ＩｇＧ及び抗ヤギＩｇＧも又シグマ社から入手した。ヘキサデカンをアルドリッチ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー所在）から入手した。トリデカフロロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチルトリクロロシランをゲレスト社（ペンシルベニア州トューリータウン所在）から入手した。ＢＤＨ製のネマチック結晶４−シアノ−４′−ペンチルビフェニル（５ＣＢ）をＥＭインダストリーズ社（ニューヨーク州ホーソーン所在）から購入した。

マスター及びポリウレタンレプリカナノ構造化基体の作製
レプリカ成形のためのマスター基体として、ｅ−ビームライティング及びエッチングによりパターン化シリコンウェーハ（２００ｎｍパターン及び５０ｎｍ深さ）を作製した。ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）プレポリマーを成形する前に、元のシリコンマスターを弗素化シラン蒸気に当てることによりシラン処理してＰＤＭＳがシリコンマスターの表面にくっ付かないようにした。これは、グローブボックス（モデルＣＣ−４０，バキューム・アトモスフェアーズ・カンパニー（カリフォルニア州ホーソーン所在））を用いて窒素化で達成された。先ず最初に、清浄なシリコンマスターを乾燥機内に設けられた支持体に取り付け、重鉱物油に溶解させた弗素化シラン（トリデカフロロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチルトリクロロシラン）の３％（ｖ／ｖ）溶液の上方約２ｃｍのところに面を下にして吊り下げた。次に、真空ポンプを用いて乾燥機の内圧を約０．１トルの圧力に調整した。約６時間後、乾燥機を窒素で満たし、サンプルを取り出した。弗素化ＳＡＭの存在を、基準シリコンウェーハ上のウェーハ水の接触角の測定により確認した。ラメ−ハートモデル１００接触角ゴニオメータ（ニュージャージー州マウンテンレイク所在）を用いて接触角を測定した。弗素化シリコンウェーハ上における水の測定接触角は、１１０°以上であった。

図８は、ＰＤＭＳマスターを上述したように作製されたシリコンマスターから形成するために用いられる手順を概略的に示している。図８は又、ＰＤＭＳマスターをどのように用いれば基体が種々のポリマーから作られるかを示している。シリコンマスターからのマスターの形成の際にエラストマーを用いた。というのは、エラストマーは、比較的広い面積にわたって表面と共形的な接触をすることができ、しかも、剛性マスターから容易に離脱させることができるからである（約２１．６ダイン／ｃｍという低い界面自由エネルギ）。ＰＤＭＳの液体プレポリマーと硬化剤の混合物（重量で１０対１）をプラスチック製ペトリ皿に入れられたシリコンマスターのパターン付け及び弗素化表面上に注ぐことによりエラストマーＰＤＭＳレプリカを作製した。混合及び注ぎ出し手順の結果として生じたＰＤＭＳプレポリマー／硬化剤混合物中の同伴気泡を除去するため、ペトリ皿を室温で約３０分間真空オーブン内に配置した。次に、プレポリマー混合物を真空オーブン内に入れて１日間６０℃で硬化させた。硬化後、ＰＤＭＳレプリカをシリコンマスターから優しく剥ぎ取った。最後に、硬化したＰＤＭＳレプリカをエタノールで濯ぎ洗いし、窒素のガス状流れ下で乾燥させた。

エラストマーＰＤＭＳマスターからのポリウレタンレプリカの形成
エラストマーマスターを用いる複製は、マスターとレプリカの分離のしやすさを高め、分離中における構造を保護し、そして複製工程中に生じる場合のあるマスターの損傷を最小限に抑えることが判明した。レプリカをポリウレタンをもたらすＵＶ硬化性プレポリマーで前処理するため、先ず最初に、ＰＤＭＳマスターをガラス基体上に置き、厚さ約１００μｍのスペーサフィルム（デュポン・フィルムズ社，デラウェアー州ウィルミントン所在）を用いてガラス基体とＰＤＭＳマスターとの隙間を維持した。注入器を用いて、液体ＵＶ硬化性プレポリマーをＰＤＭＳマスターとガラス基体との間に注入し、次にこれを毛管作用の力で高温プレート（約６０℃）上に装着した。これらプレポリマーを窒素の流れ下で２時間かけてＵＶ光（３６５ｎｍ，ＵＶ架橋剤，スペクトロニクス・カンパニー，ニューヨーク州ウエストベリー所在）で硬化させ、オーブン内において６０℃で１晩熟成させた。ＰＤＭＳマスターをレプリカの表面から剥ぎ取った後、ＰＤＭＳマスターをエタノールで洗浄した。単一のＰＤＭＳマスターを用いて原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）、光学顕微鏡及び液晶の整列によって確認できるように複製されたポリマーパターン中にそれほど変化を生じさせないで１１個以上のポリマーレプリカを作製することができる。

金属化ナノ構造化基体及びＳＡＭを備えた金属化基体の形成
上述したように形成したポリウレタンレプリカを電子ビーム蒸発器（ニュージャージー州テックバック社）内の平床上に取り付けた。蒸発器を０．００００００１トルの圧力まで排気した。平床を次に行うチタンの被着及び次の金の被着中、周転円運動的に回転させた。蒸発器内に設置された水晶微量てんびんを用いて金属の厚さを測定した。
金属被覆基体を有機硫黄化合物の１ｍＭエタノール溶液中で１時間浸漬することによりカルボン酸を末端基とするアルカンチオールでＨＳ（ＣＨ₂）₁₀ＣＯＯＨで機能化した。基体を取り出し、エタノールで濯ぎ洗いし、次に窒素の流れ下で乾燥させた。

ＡＦＭを用いたナノ構造化基体の画像化
接触モード又はタッピングモードで動作するInstruments Nanoscope IIIブランドのディジタルマルチモード走査プローブ顕微鏡（カリフォルニア州サンタバーバラ所在）を用いてポリウレタンレプリカナノ構造化基体のＡＦＭ画像を得た。窒化シリコンで作られた片持ちばり（ばね定数：０．０６Ｎ／ｍ）を用いてサンプルを周囲条件下において、１本の線に付き５１２個のサンプルポイントで１．０Ｈｚの走査速度で画像化した。

上述したようなレプリカ成形法を利用してポリウレタンＳＷＧをガラス支持体上に作製した。ＳＷＧ構造の全体的な形態学的特徴を変更しないで金属、例えば金又は銀の薄い層を用いてナノ構造化基体の異方性光学的性質を変えた。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ及び図３Ｂに示すように接触モードＡＦＭを用いてポリウレタンレプリカナノ構造化基体及びその金めっき表面（ｅ−ビーム蒸発器を用いて金を厚さ５０ｎｍまで被着させた）の構造を評価した。ＡＦＭ画像により、ＳＷＧの全体的構造は金層又はその下に位置する付着増進チタン層の追加によりそれほど偏光されていなかったことがわかった。図１Ｂに示す金被膜の施されていないポリウレタンレプリカの矩形の溝はチタン及び次に金を図２Ｂ（３ｎｍＴｉ上に１２ｎｍＡｕ）及び図３Ｂ（３ｎｍＴｉ上に４７ｎｍＡｕ）に示すように表面上に被着させたので幾分滑らかになったが、基体の全体的な形態学的特徴はそれほど改変されなかった。接触モードＡＦＭを用いて画像化した構造と炭素ナノチューブプローブを用いた非接触モード走査法を用いて得た画像と比較すると、溝の形状、溝の深さ又は溝の幅に関しそれほどの差は観察されなかった。

顕微鏡を用いたナノ構造化基体の画像化
Olympus（登録商標）ＢＸ−６０ブランドの偏光顕微鏡（日本国東京都所在）を用いてポリマーポリウレタンレプリカナノ構造化基体及び基体を通って伝送された光によって形成された光学的テキスチャ（異方性組織）を観察した。ナノ構造化基体の光学的外観の画像を偏光顕微鏡に取り付けられたOlympus（登録商標）Ｃ−２０２０ブランドのＣＣＤカメラ（オリンパス・アメリカ・インコーポレイテッド（ニューヨーク州メルビル所在））で捕捉した。ポリウレタンレプリカの観察のため口径がｆ１１、シャッター速度が１／６秒の高品質モード（１６００×１２００画素の解像力）を用いて画像を得た（顕微鏡セッティング：最大強度の１００％の光源及び１００％開き口径）が、これに対し、ポリマーレプリカから作製された光学セルを観察するために１／３２０秒のシャッター速度を用いた（顕微鏡セッティング：最大強度の５０％の光源及び５０％開き口径）。

ナノ構造化基体の表面上のヘキサデカンの分析
Olympus（登録商標）ＢＸ６０ブランドの偏光顕微鏡（オリンパス（日本国東京都所在））の回転ステージ上に取り付けられた基体上にヘキサデカンの液滴を付着させた。図４Ａ〜図４Ｈに示すようにOlympus（登録商標）Ｃ−２０２０ブランドのＣＣＤカメラ（オリンパス・アメリカ・インコーポレイテッド（ニューヨーク州メルビル所在））を用いてヘキサデカンの液滴の画像を記録した。

ガラス支持体上に形成されたポリウレタンレプリカナノ構造化基体は、光学的に透明である。したがって、光学顕微鏡を用いると、複製された溝付き構造の領域全体にわたり（寸法が１．８ｍｍ×１．８ｍｍ）にわたりこれらポリマーレプリカの表面を分析することができる。溝付き領域を溝の方向が図４Ａに示すように偏光子のうちの１つに対して平行であった場合、非パターン化領域から識別することができなかった。しかしながら、偏光は、ポリマーレプリカの回転時に、溝付き領域を通って伝送された。溝付きパターンの方向が偏光子のうちの１つの方向に対し約４５°回転させた場合（図４Ｂ）最高透過率が達成された。これとは対照的に、溝が設けられていない領域は等方性なので、ポリマーレプリカを交差偏光し相互間で回転させたときに生じるこれら領域を通って伝送される光の量には差が無い。

上述したように、金属、例えば金又は銀の薄膜を頂面に被着させ、次にこの上にＳＡＭを形成することによりナノ構造化基体を改質することができる。例えば、金属の一様且つ薄い層（３ｎｍＴｉ上の１２ｎｍＡｕ）をｅ−ビーム蒸発器を用いてポリウレタンレプリカナノ構造化基体の表面上に被着させた。図４Ｃに示すように偏光顕微鏡を用いて異方性特頂部を依然として容易に観察した。ただし、金めっきレプリカの異方性は、これに対応した非被覆ポリウレタンレプリカ（図４Ｂ）の異方性よりも低かった。

疎水性ＳＡＭを含むナノ構造化基体を、金めっき基体とＨＳ（ＣＨ₂）₁₀ＣＯＯＨのエタノール溶液との接触により金めっきポリウレタンレプリカナノ構造化基体上に形成した。交差偏光子を用いた光学顕微鏡によって視認したＳＡＭ含有金めっきポリウレタンレプリカの光学的外観が図４Ｄに示されている。頂面の右側部分上に載っているヘキサデカンの液滴は、ＳＡＭ含有金めっきナノ構造化基体の頂面上で容易に画像化できる。図４Ｅに示すように、炭化水素の液滴は、ナノ構造化基体上での観察が容易であった。交差偏光子に関する検光子の僅かな回転（１°の変化）は、図４Ｆに示すように表面上のヘキサデカンの液滴により生じる光学画像のコントラストを劇的に増強させた。等方性媒質（即ち、溝が設けられていない領域）中における検光子を通る単色光の伝送は交差偏光子相互間で最小なので、溝付き領域と溝が設けられていない領域との間の通過溝の強度の差は、レプリカの溝方向を交差偏光子のうちの１つに関し４５°回転させると最大になる。しかしながら、白色光を用いた場合、異方性媒質（即ち、溝付きパターン）を通る光の通過により生じるリターデーション色の変化は、溝が設けられていない領域の画像からのその画像の識別性を高めた。換言すると、検光子を僅かに回転させることにより（１°未満〜約２°）リターデーション色を調整すると、たとえ溝付き領域と溝が設けられていない領域との通過溝強度のパーセント表示の差が交差偏光子と比べて減少しても、増大した異方性画像の光学的コントラストが増大した（図４Ｅ及び図４Ｆ参照）。

上述すると共に図４Ｄ〜図４Ｇに示すように、ヘキサデカンの液滴は、ナノ構造化基体の溝付き領域内で画像化するのが容易であった。しかしながら、ヘキサデカンは、溝が設けられていない領域では検出できなかった。というのは、ヘキサデカン（ｎ＝１．４３４０）は、溝付き部分の場合とは異なりナノ構造化基体の溝が設けられていない部分の空気（ｎ＝１）に置き換わらなかったからである。したがって、溝が設けられていない領域の光学的性質の変化は結果として生じず、これに対し、溝のある領域では実質的な変化が生じた。

ＳＡＭ含有金めっきポリウレタンレプリカの溝付き領域上のバルクヘキサデカン液滴の画像は、図４Ｇの右側に色の濃い領域で示されている。色を見ると、バルクヘキサデカン液体の色の濃い領域は、桃色であった。色の濃いヘキサデカン液滴領域の直ぐ左の色の薄い領域は、細い境界線を表している。色の薄い領域は、淡い黄色であり、淡い黄色の領域の左側の領域は、淡い青色であり、それにより、淡い黄色の領域と淡い青色の領域の差を色で容易に視覚化できる。ヘキサデカンの液滴をナノ構造化基体の溝付き表面上に載せると、ヘキサデカンの細い境界線（淡い領域）の優先的な流れに続き、溝の方向にヘキサデカンのバルク流れ（色の濃い領域）が生じた。基体表面のナノレベルの溝が粗い表面の細い溝によりチャネル流を引き起こすのと同一の仕方で液体の流れを誘起させ、色の薄い領域により表された改良型の薄い層は、前躯体フィルムの存在に該当すると仮定される。固体の基体上の液滴の湿潤プロセスにおける前躯体フィルムの役割は、広がり（Spreading）における顕著な現象であると考えられた。他者による偏光解析法による測定の示すところによれば、広がっていく液滴は、一連の互いに別々の分子層として進む。これについては、ヘスロット・エフ（Heslot, F.），フレイシー・エヌ（Fraysse, N），キャザバット・エー・エム（Cazabat, A. M.）著，「モレクラー・レイヤリング・イン・ザ・スピーディング・オブ・ウェッティング・リキッド・ドロップス（Molecular Layering in the Spreading of Wetting Liquid Drops），３３８，ネーチャー（Nature），１９８９年，ｐ．６４０−６４２を参照されたい。推論により限定するわけではないが、ヘキサデカンの前進する薄い前躯体フィルムは、ナノ構造化基体の溝を不完全に充填し、それにより、溝が完全にヘキサデカンで満たされるバルクヘキサデカンと比べて異なるリターデーションを生じさせているという仮説が挙げられる。リターデーションの差は、図４の色の濃い領域及び色の薄い領域により表されたバルク液体の領域と改良型前躯体フィルムとの光学テキスチャの外観の差を説明している。交差偏光子を取り外すと、前躯体フィルムが観察されたという証拠は無かった（図４Ｈ参照）。さらに、交差偏光子が存在していない場合、バルクヘキサデカンの境界が図４Ｈに示すようにほんの僅かに観察された。

金のリターデーション効果
金属化ナノ構造化基体の異方性に対し金属、例えば金がどのような役割を果たしているかを判定するために、リターデーションをポリウレタンナノ構造化基体表面上に被着された厚さの関数として測定した（図５）。白色光源を偏光光学顕微鏡（干渉フィルタは、６３２．８ｎｍ、最大半減時における全幅は、１０ｎｍ）で濾波するブレース・ケーラーの補償板（測定範囲：０〜１／３０λ）を用いてリターデーションを判定した。たとえＡＦＭ分析によりＳＷＧの表面形態学的特徴がレプリカを金及びチタンで被覆することにより（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ及び図３Ｂ参照）それほど改変されなかったことが分かっても、光学的性質の複雑な傾向は、金層の厚さで決まることが判明した。例えば、約２７ｎｍ以下の金の薄い層は、リターデーションの減少を引き起こし、約２７ｎｍ以上の厚さの金のフィルムは、結果的にリターデーションを増大させた（図５参照）。

金属下の表面プラズモン効果
金属、例えば金又は銀が金属化ナノ構造化基体の異方性に果たす役割を一段と調査するために、基体の光吸収度を光の偏光及び波長の関数として測定した。基体の吸収度スペクトルをＵＶ−ＶＩＳスペクトロメータ（Cary 1E，ヴァリアン・インコーポレイテッド，アリゾナ州テンプ所在）を用いて得た。トポグラフィー的に模様付けされた領域は小さい（１．８ｍｍ×１．８ｍｍ）なので、ガラススライダを収容したサンプルホルダーに、光を透過するための小さな穴（１ｍｍ×１ｍｍ）を除いてアルミニウム箔で完全に巻き、ポリマー基体のトポグラフィー的に模様付けされた領域又は滑らかな領域をScotch（登録商標）ブランドの粘着テープを用いてサンプルホルダーの小さな透明な穴に固定した。二色性シート偏光子（メルズ・グリオット社，カリフォルニア州アービン所在）をスペクトロメータの光源の前に配置することにより偏光を得た。図７に示すように、金属化金頂面を含む平らな基体を用いた場合、全ての偏光を含む光を用いた場合に測定可能なプラズモン吸光度（７００〜７５０ｎｍあたりのピーク）は観察されなかった。非金属化ポリウレタンレプリカを用いた場合、入射光（溝に平行又は垂直）の偏光のいずれについてもプラズモン吸収は生じなかった。これとは対照的に、ポリウレタンレプリカを厚さ１５ｎｍ以上の金で被覆した場合、約７５０ｎｍにおけるプラズモン吸収度ピークの外観は、溝に垂直な偏光平面を持つ偏光を用いた場合明白であった。図７に示すように、基体の金属化頂面の金属の厚さが増大すると、プラズモン吸収は、短い波長（約７００ｎｍ）に移動した。

表面プラズモン吸収法を用いる分析物の検出
上述したように作製した金めっき（３ｎｍＴｉ上の５０ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカをＢＳＡの溶液中に浸漬した。基体を２時間、ビオチン化ＢＳＡの１ｍｇ／ｍｌ燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬することによりビオチン化ＢＳＡを基体に被着させた。次に、基体をＰＢＳで濯ぎ洗いした。次に、抗ＢＳＡ・ＩｇＧ（ＰＢＳ中において２μＭ）の液滴をＢＳＡ被覆レプリカの一部上に被着し、２時間かけて培養し、次に脱イオン水で濯ぎ洗いし、そして窒素のガス状流れ下で乾燥させた。抗ヤギＩｇＧ（ＰＢＳ中において２μＭ）の第２の液滴をレプリカの他方の側部上で２時間培養した。次に、基体を偏光顕微鏡上に載せ、検光子を光路から外した状態で伝送中に視認した。入射光の波長は７００ｎｍであり、白色光を干渉フィルタに通すことによりこの入射光を得た。レプリカの光学的外観を入射光の偏光の関数として観察した。入射光の偏光がレプリカの溝に垂直であるとき、トポグラフィーを備えたレプリカの領域は、トポグラフィーを備えていないレプリカの領域よりも濃かった（偏光の高い吸収度）。これとは対照的に、入射光の偏光がレプリカの溝に平行な場合、トポグラフィーを備えたレプリカの領域は、トポグラフィーを備えていない周りの領域よりも色が薄かった。光の入射偏光に対するコントラストの依存性は、プラズモン吸収の存在と一致している。加うるに、波長が６３３ｎｍの光で見て、偏光及びトポグラフィーに対する上述の吸収の依存性は観察されなかった（６３３ｎｍにおけるプラズモン吸収はゼロであった）。溝に垂直な偏光を持つ光を用いて抗ＢＳＡ・ＩｇＧと接触した基体の領域を検査すると、これら領域は、抗ＢＳＡ・ＩｇＧと接触せず、これを支持していない領域よりも明るいことが判明した。このコントラストは、入射光の偏光が溝に平行であり（プラズモン吸着度はゼロ）又は入射光の波長が６３３ｎｍであるとき（プラズモン吸着度はゼロ）実質的に失われた。

ＢＳＡ被覆ナノ構造化基体の作製及び基体と抗ＢＳＡ・ＩｇＧ及び
抗ヤギＩｇＧの相互作用
基体を２時間、ビオチン化ＢＳＡの１ｍｇ／ｍｌ燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬することによりビオチン化ＢＳＡを基体に被着させた。次に、基体をＰＢＳで濯ぎ洗いした。次に、抗ＢＳＡ・ＩｇＧ（ＰＢＳ中において２マイクロモル）の液滴をＢＳＡ被覆レプリカの一部上に被着し、２時間かけて培養し、次に脱イオン水で濯ぎ洗いし、そして窒素のガス状流れ下で乾燥させた。抗ヤギＩｇＧ（ＰＢＳ中において２マイクロモル）の第２の液滴をレプリカの他方の側部上で２時間培養した。

上述したように、第２の材料、例えば金又はチタンを含むナノ構造化基体の被膜は、偏光を通して画像化されたガラス上のポリウレタンで作られたナノ構造化基体の光学的性質を変化させた。他の被覆材料は、これと同様な変化を生じさせた。例えば、受容体化学種を担持した基体の表面上への分析物の結合は、基体の光学的性質の変化を生じさせた。このために、受容体分子を含むナノ構造化基体を用いると、視覚化のために液晶を用いる必要無く、サンプル中の受容体に結合する分析物の存在を検出することができる。光学顕微鏡を用いて交差偏光子を介して視認したＢＳＡ被覆金属化（３ｎｍＴｉ上の４７ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカナノ構造化基体の光学的外観が、図６Ａに示されている。金属化（３ｎｍＴｉ上の４７ｎｍＡｕ）ポリマーレプリカをＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２時間培養することによりＢＳＡ被覆基体を作製した。金の被膜が一様且つ平らであると仮定して得た偏光解析的測定値は、ＢＳＡの吸収により生じた約２．６±０．１ｎｍの厚さの増大を示した。抗ＢＳＡ・ＩｇＧ（２μＭ）ＰＢＳ溶液の液滴を上述したように作製したＢＳＡ被覆基体の一部上に置いた。抗ＢＳＡ・ＩｇＧ溶液の液滴は、交差偏光子を用いて顕微鏡により視認した状態で図６Ｂに示されている。基体に２時間接触した後、抗ＢＳＡ・ＩｇＧ溶液を除去し、基体を脱イオン水で濯ぎ洗いし、そして窒素の流れ下で乾燥させた。図６Ｃは、この手順を実施した後において交差偏光子を用いて顕微鏡により視認した基体の光学的外観を示している。抗ＢＳＡ・ＩｇＧと接触した基体の部分は、白黒画像中の基体の明るい部分により指示されるように明白であった。これら領域の差は、色において見るとより明白であった。

抗ＢＳＡ・ＩｇＧと先に接触し、図６Ｃに画像化されたＢＳＡ被覆金属化（３ｎｍＴｉ上の４７ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカナノ構造化基体を次に抗ヤギＩｇＧと接触させて基体がＢＳＡに結合しなかったたんぱく質について光学的性質の変化を示したかどうかを判定した。抗ヤギＩｇＧ（２μＭ）ＰＢＳ溶液の液滴を抗ＢＳＡ・ＩｇＧと接触しなかった領域でＢＳＡ被覆基体上に置いた。抗ヤギＩｇＧ溶液の液滴は、交差偏光子を用いて顕微鏡により視認した状態で図６Ｄに示されている。基体に２時間接触させた後、抗ヤギＩｇＧ溶液を除去し、基体を脱イオン水で濯ぎ洗いし、そして窒素の流れ下で乾燥させた。図６Ｅは、抗ヤギＩｇＧを除去し、基体を濯ぎ洗いして乾燥させた後において交差偏光子を用いて顕微鏡により視認した状態の基体の光学的外観を示している。図６Ｅに示すように、非特異的抗ヤギＩｇＧとの接触に起因して光学的画像にはそれほどの変化は生じなかった。これら結果により、ＢＳＡは抗ヤギＩｇＧに結合せず、この物質に対して遮断層として働き、他方抗ＢＳＡ・ＩｇＧに対しては受容体化学種として作用したことが分かる。

偏光解析法による厚さの測定は、ＢＳＡ被覆ナノ構造化基体表面上への特異的（抗ＢＳＡ・ＩｇＧ）及び非特異的（抗ヤギＩｇＧ）ＩｇＧの結合に関する間接的な情報を提供した。基体を２時間、ビオチン化ＢＳＡの１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ中に浸漬することによりビオチン化ＢＳＡを基体に被着させた。次に、基体をＰＢＳで濯ぎ洗いした。次に、抗ＢＳＡ・ＩｇＧ（ＰＢＳ中において２マイクロモル）の液滴をＢＳＡ被覆レプリカの一部上に被着し、２時間かけて培養し、次に脱イオン水で濯ぎ洗いし、そして窒素のガス状流れ下で乾燥させた。抗ヤギＩｇＧ（ＰＢＳ中において２マイクロモル）の第２の液滴をレプリカの他方の側部上で２時間培養した。抗ＢＳＡ・ＩｇＧによる特異的な結合の結果として、予想されたように約７．５ｎｍ±０．５ｎｍの偏光解析的厚さの大幅な増加が生じた。これとは正反対に、抗ヤギＩｇＧによる非特異的な結合の結果として、約０．８ｎｍ±０．２ｎｍの偏光解析的厚さの僅かな増大しか生じなかった。捕捉された画像の走査は、コントラスト及びブライトネス（明るさ）を図形処理プログラムを用いて偏光することによって達成され、向上した画像は、抗ＢＳＡ・ＩｇＧによる特異的結合を示す光学的解像力の向上をもたらした。これらの結果により、特異的受容体分子を備えたナノ構造化基体を現場検定及び生物検定で用いると特定のサンプル中の分析物の存在を確認できることが分かる。追加の工程、例えば補助抗体又は蛍光標識を必要としないで受容体への分析物の結合により生じる光学画像の変化を直接観察することができる。さらに、視覚化プロセスで液晶を用いる必要無く分析物の存在及び表面現象の検出を観察することができる。

ＢＳＡ遮断層及び異なる受容体化学種を備えたナノ構造化基体の作製
金被覆基体をアミノプロピルメルカプタンのエタノール溶液（１ｍＭ）中に１時間浸漬し、エタノールで濯ぎ洗いし、次に乾燥させる。結果的に得られる基体をジスクシンイミジルスベレートの１ｍＭジメチルスルホキシド溶液中に２時間浸漬することにより表面を活性化させる。次に、活性化した表面を抗Ｒａｓ・ＩｇＧのＰＢＳ溶液（１０マイクロモル）の液滴に４時間接触させる。次に、結果的に得られる表面をＰＢＳ中で濯ぎ洗いし、ＢＳＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液中に完全に浸漬する。溶液中のＲａｓの存在を検出するため、Ｒａｓ物質を溶液中に６時間浸漬する。基体を取り出し、ＰＢＳ中で濯ぎ洗いし、水中で濯ぎ洗いし、次に窒素の流れ下で乾燥させる。次に、基体を偏光顕微鏡内に置く。基体をＣＣＤカメラを用いて画像化する。抗Ｒａｓ・ＩｇＧに接触した表面の領域とその周りの領域との光学的コントラストは、サンプル中にＲａｓが存在していることを指示している。

形状複屈折は、等方性材料のＳＷＧ構造により得られる。ポリウレタンレプリカナノ構造化基体が追加の光学的性質、例えば物質の異方性により生じる複屈折を備えているかどうかを判定するため、ポリウレタン基体の光学的外観を観察した。この場合、ポリウレタンレプリカのＳＷＧ表面をネマチック結晶（等方性４−シアノ−４′−ペンチルビフェニル，（５ＣＢ））の薄膜で被覆した。５ＣＢはその等方性の相（約４０℃）では約１．５８の屈折率を有しているので、これをポリウレタンの屈折率（約１．５６）にマッチさせることができる。ポリウレタンレプリカ中に異方性の消失が、ＳＷＧ表面を等方性５ＣＢで充填することにより生じた。これら結果は、ポリウレタンレプリカの異方性画像がＳＷＧ構造にのみ起因して生じる形状複屈折に起因して得られたことを指示している。
本発明は、例示のために本明細書に記載した実施形態には限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲に属するかかる全ての形態を含むものである。

ガラス基体上のポリウレタンレプリカのＳＷＧ（副波長格子）構造の２次元ＡＦＭ（接触モード）走査画像を示す図である。 図１Ａの白線に対応した図１Ａの走査ＡＦＭ画像の断面プロフィールを示す図である。 ガラス基体上の被覆（３ｎｍＴｉ上の１２ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカのＳＷＧ構造の２次元ＡＦＭ（接触モード）走査画像を示す図である。 図２Ａの白線に対応した図２Ａの走査ＡＦＭ画像の断面プロフィールを示す図である。 ガラス基体上の被覆（３ｎｍＴｉ上の４７ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカのＳＷＧ構造の２次元ＡＦＭ（接触モード）走査画像を示す図である。 図３Ａの白線に対応した図３Ａの走査ＡＦＭ画像の断面プロフィールを示す図である。 交差偏光子付きの顕微鏡によって得たガラス基体上のポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、走査画像中の白の矢印が、レプリカ表面の溝の方向を示している図である。 レプリカを交差偏光子のうちの１つに対して４５°回転させた状態で交差偏光子付き顕微鏡によって得た図４Ａのポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、白色の矢印がレプリカ表面の溝の方向を示している図である。 検光子を偏光子のうちの１つに対して９０°回転させた状態で交差偏光子付き顕微鏡によって得た被覆（３ｎｍＴｉ上の１２ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、白の矢印がレプリカ表面の溝の方向を示す図である。 検光子を偏光子のうちの１つに対して９０°回転させた状態で交差偏光子付き顕微鏡によって得たＨＳ（ＣＨ₂）₁₁ＣＯＯＨから形成された自己組織化単一層が表面上に被着された被覆（３ｎｍＴｉ上の１２ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 検光子を偏光子のうちの１つに対して９０°回転させた状態で交差偏光子付き顕微鏡によって取ったＨＳ（ＣＨ₂）₁₁ＣＯＯＨから形成した自己組織化単一層が表面上に被着され、ヘキサデカンの液滴が表面上に置かれた被覆（３ｎｍＴｉ上の１２ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 検光子を偏光子のうちの１つに対して９１°回転させた状態のヘキサデカン付きの図４ＥのＳＡＭ含有被覆ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 図４Ｆに示す正方形の領域の５倍の拡大図である。 交差偏光子無しで視認した図４Ｇに示す領域に対応したＳＡＭ含有被覆ポリウレタンレプリカの光学的外観の５倍の拡大図である。 白色光を干渉フィルタで濾波することにより得られた通過光の波長が６３３ｎｍであるレプリカ表面上の金層の厚さの関数として補償子（黒丸）を用いることにより測定されたガラス基体上の金被覆ポリウレタンレプリカ（３ｎｍＴｉ付き）のリターデーションのグラフ図である。 ２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨは７．４）中で２時間かけて培養した後の交差偏光子付き顕微鏡によって見たガラス基体上の被覆（３ｎｍＴｉ上の４７ｎｍＡｕ）ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 図６ＡのＢＳＡ及びＡｕ／Ｔｉ被覆ポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、表面上に位置する２μＭ抗ＢＳＡ・ＩｇＧ燐酸緩衝生理食塩水の液滴を示す図である。 抗ＢＳＡ・ＩｇＧの液滴を除去し、レプリカを脱イオン水で濯ぎ洗いし、そしてレプリカを窒素で乾燥させた後の図６Ｂに示すレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 図６Ｃのポリウレタンレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、図６Ｃに示すレプリカの表面上に位置する２μＭ抗ヤギＩｇＧ燐酸緩衝生理食塩水の液滴を示す図である。 抗ヤギＩｇＧの液滴を除去し、レプリカを脱イオン水で濯ぎ洗いし、そしてレプリカを窒素で乾燥させた後の図６Ｄに示すレプリカの光学的外観の走査画像を示す図であり、抗ヤギＩｇＧ溶液の液滴が除去後２時間にわたりレプリカの表面上に残されたことを説明する図である。 画像のコントラスト及びブライトネスを調整することによりコントラストを増強させた後の図６Ｅに示すレプリカの光学的外観の走査画像を示す図である。 偏光した又は偏光しなかった光を用いた場合の波長の関数として測定された金被覆ポリウレタンレプリカの吸光度のグラフ図である。 ポリマー基体をシリコンマスターからどのようにして形成するかを示す略図である。

Claims (9)

1. 基体の表面上で生じる現象を画像化する方法であって、
   （ａ）流体を基体の頂面に接触させる段階を有し、基体の頂面は、異方性トポグラフィーを有し、かつ基体の頂面は、複数の溝を備え、溝は、幅が１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、深さが１ｎｍ〜５，０００ｎｍ、溝相互間離隔距離が１ｎｍ〜５，０００ｎｍであり、
   （ｂ）流体が基体の頂面に接触した後、液晶の不在において基体を入射し伝送された偏光を通して観察することにより基体の頂面上で生じる現象を画像化する段階を有し、偏光の波長は、基体の頂面に形成された溝の幅及び溝相互間離隔距離の少なくとも一方よりも大きく、
   基体は、偏向子及び検光子を使用して結像することを特徴とする方法。
2. 基体の頂面の溝の幅は、１０ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 基体の頂面の溝の深さは、１０ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 基体の頂面の溝相互間離隔距離は、１０ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 基体の頂面は、金又は銀の金属によって被着され、基体の頂面に被着された金属の厚さは、１ｎｍ〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 偏光子及び検光子が、交差形態から交差形態の１０°以内の形態までの範囲にわたるよう構成されたことを特徴とする請求項１記載の方法。
7. 基体の表面上で生じる現象を画像化する方法であって、
   （ａ）流体を基体の頂面に接触させる段階を有し、基体の頂面は、異方性トポグラフィーを有し、かつ基体の頂面は、複数の溝を備え、溝は、幅が１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、深さが１ｎｍ〜５，０００ｎｍ、溝相互間離隔距離が１ｎｍ〜５，０００ｎｍであり、
   （ｂ）流体が基体の頂面に接触した前後、液晶の不在において基体を観察することにより伝送された光の偏光の変化を観察し、
   偏光の波長が、基体の頂面に形成された溝の幅及び溝相互間離隔距離の少なくとも一方よりも大きく、
   基体は、偏向子及び検光子を使用して結像することを特徴とする方法。
8. 光の偏光の変化の観察が、交差形態から交差形態の１０°以内の形態までの範囲にわたるよう構成された偏光子及び検光子によって行われることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 検光子は、交差形態を基準に０．５°から交差形態を基準に５°までの範囲にわたるよう構成されていることを特徴とする請求項８記載の方法。

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