KR100883079B1 - 플랫폼, 플랫폼을 가지는 장치, 및 플랫폼을 사용하는 방법 - Google Patents
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Abstract
샘플 분석에서 사용하기 위한 센서 플랫폼은 굴절률(n1)의 기판(30) 및 기판상에 굴절률(n2)의 얇은 광학적 투명층(32)을 포함하고, (n2)는 (n1)보다 크다. 플랫폼은 각각 하나이상의 캡쳐 요소에 대해 하나이상의 센싱 지역을 한정하는, 주기적 홈(31, 33) 형태의 하나 또는 복수개의 파형 구조체를 갖는다. 홈들은 간섭성 광이 플랫폼에 입사될 때, 그것이 개별 빔 또는 전달된 빔의 감소 및 입사광의 비정상적인 고반사의 유발을 일으키는 회절 차원으로 회절되어 각 센싱 지역의 표면에 강화된 이버네센트 필드를 만들도록 형상화, 치수화 및 배향된다. 공명 조건에서 이 필드의 진폭은 선행기술 플랫폼의 필드보다 대략 100 배 차원으로 커서, 플랫폼상의 샘플로부터 생성된 발광 강도는 100의 인자로 증가된다. 또한 플랫폼을 갖는 장치 및 플랫폼을 사용하는 방법이 개시된다.
Description
본 발명은 일반적으로 샘플 분석 분야에 관한 것이고, 특히, 배타적인 것은 아니지만, 예를 들면 DNA, 단백질, 펩타이드 및 항체 칩 기술로서 일반적으로 알려진 친화성 센싱 분야에서 적용을 갖는다. 본 발명의 일 태양은 샘플들을 분석하는데 사용될 수 있는 센서 플랫폼에 관한 것이다. 본 발명의 다른 태양은 센서 플랫폼을 이용하는 장치에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 태양은 플랫폼을 이용하는 샘플 분석 방법에 관한 것이다.
샘플들의 2차원적 배열들을 분석하는 기술이 알려져 있다. 이러한 기술의 하나가 ELISA 분석이라고 알려져 있으며, 항체와 항원사이의 강한 생화학적 반응에 기초를 둔다. 특별한 모노 또는 폴리클로날 항체들은 기판 상에 고정화되고, 상보적인 종(species)들과 반응한다. 형광체 표지된 마커가 첨가되어 효소-결합된 항체들을 통해 활성화되고, 샘플들은 형광을 유도하기 위하여 빛에 조사된다. 형광이 검출되며, 형광의 강도는 친화성 반응(affinity reaction)의 지표이다.
또 다른 알려진 기술은 WO98/27430에 기술된 것이다. 여기에서, 많은 수의 상이한 종들이 하나의 기판상에 하나의 배열 내에서 고정된다. 종들은 기판상에 포토리쏘그래픽(photolithographical) 수단에 의해 고정된다. 형광체 표지된 마커들이 종들에 첨가된다. 하나의 샘플이 제공되어 고정된 종들과 반응되고, 전체 칩은 초점이 맞춰진 레이저 빔으로 스캐닝된다. 대안적으로는, 하나의 샘플이 제공되어 형광체 표지된 마커들을 통해 개질되고, 고정된 종들과 반응되며, 전체 칩은 초점이 맞춰진 레이저 빔으로 스캐닝된다. 형광 시그날들은 광 검출기에 의해 검출되고, 2D 패턴이 생성된다. 개별 샘플들 사이의 이러한 패턴의 변화들은 유전자 발현에서의 차이점들의 표시를 나타내고, 따라서, 약리학 및 독성학에 대한 정보를 제공한다.
또 다른 알려진 기술은 이버네센트 파(evanescent wave) 센서들에 기초한 것이다. 이들은 매우 얇은 층 내에 설치되어(trapped), 실제 물리적 센서 외측으로 미소한 거리만큼 연장되는 소위 이버네센트 전자기 필드들을 형성하는 간섭성(coherent) 레이저 광을 이용한다. 이 필드는 센서의 표면에 부착된 분자들과 상호작용을 할 수 있다. 이러한 이버네센트 여기(excitation) 또는 상호작용은 도파관에 매우 인접한 영역, 일반적으로 가시광에 대하여 표면으로부터 0.5 마이크론으로 제한된다. 이버네센트 필드들은 공간적으로 제한된 상태로 유지되고, 이들의 저장된 에너지를 다른 영역들로 전달하지 않는다. 레이저 광과 분자들의 상호작용은 복수개의 상이한 방법들로 사용될 수 있다. 이들은,
(1) 이버네센트 필드에 의해 유도된 발광 검출,
(2) 샘플의 분자들이 캡쳐 분자들(capture molecules)과 결합될 때 일어나는 굴절률 변화들의 검출,
(3) 표면 플라즈몬 공명의 검출을 포함한다.
이버네센트 필드를 사용하는 하나의 특별한 센서는 평면 도파관 센서라고 알려져 있다. 평면 도파관 센서는 평면 기판의 위에 얇은 도파관 층이 형성된 평면 기판을 포함한다. 도파관층의 일부는 격자를 구비하되, 레이저 광은 격자로 입사되고, 격자로부터 나아감으로써 격자로부터 떨어진 센싱 영역까지 도파관층을 통해 전파된다. 도파관 센서는 질량 민감 모드(mass sensitive mode, 상기 2, 3 참조)로 사용될 수 있거나, 발광 여기 및 검출(상기 1 참조)을 조합하여 우수한 감도로 사용될 수 있다. 캡쳐 분자들은 센싱 지역에 고정되고, 이어서 분석물(샘플)은 유사한 친화성(경쟁)을 가진, 첨가된 표지된 분자들의 존재 하에서 센싱 지역/캡쳐 분자들과 접촉하게 된다. 대안적으로는, 분석물 분자들은 고정된 캡쳐 분자들과 결합될 수 있고, 형광 표지들은 더 표지된 종들과 캡쳐된(captured) 분석물 분자들과의 반응에 의해 나타난다. 도파관층으로 나아간 레이저 광은 형광체들의 이버네센트 여기를 일으키고, 이어서 이는 분석물의 정량화를 가능하게 한다. 방출된 형광이 검출되고, 형광의 강도는 분석물과 고정된 캡펴 분자들에 존재하는 친화성 파트너들 사이에서 일어나는 상호반응의 지수를 제공한다. 이런 유형의 장치에서, 레이저 방사는 비교적 먼 거리에 걸쳐 도파관 내로 전파되고, 결합 격자 및 센싱 지역들은 기하학적으로 분리된다는 것이 주목되어야 한다(참조, WO 95/33197 및 WO 95/33198).
EP-0 455 067 A2에는 굴절률 변화들의 검출 원리를 이용한 평면 도파관 센서가 기술되어 있다. 전체 플랫폼에 걸쳐 형성된 얕은 플랫폼 홈들은 편광된 간섭성 광을 투명한 도파관층 내로 연결하고, 여기서, 상기 광은 일정 거리를 지나 외부로 연결된다. 외부로 연결되는 빔(beam)의 각도는, 분석물 분자들이 캡쳐 분자들에 결합하는 때에 변화된다.
굴절률형의 또 다른 예가 US-A-5738825에 주어진다. 플랫폼은 마이크로티터(microtiter) 플레이트의 웰(well)들에 접촉해 있는 개별 격자들을 포함한다.
EP 178 083은, 들어오는 광자들의 에너지가 표면 플라즈몬 파로서 전기에너지로 변환되는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonnance, SPR)을 개시한다. 센서 구조는 본 발명의 플랫폼과 대조적으로 금속층을 필요로 하며, 임계 각도에서 반사된 광의 양은, 반사된 강도가 거의 100%에 이르는 본 발명과는 대조적으로, 0 또는 대략 0이다.
상기 기술들 모두는 다양한 단점들 겪는다. 일부는 매우 느린데, 그 이유는 각 샘플이 개별적으로 여기되어야만 하기 때문이다. 평면 도파관과 같은 다른 것들은 한번에 하나 이상의 샘플의 여기를 허용하나, 전적으로 신뢰할 만한 결과들을 제공하지 않는데, 그 이유는 다른 캡쳐 요소들간의 형광 크로스토크(fluorescence crosstalk)와 도파관들의 손실에 기인한 국부적으로 변화하는 여기 광 강도와 격자 결합 효율의 변화에 기인한 연결된 파워의 국부적 변화 때문이다.
본 발명은 복수개의 샘플들이 매우 민감하고, 신뢰할 만하고, 정량적인 방법으로 동시에 분석되도록 하는 기술에 관한 것이다.
평면 도파관 센서들과 대조적으로, 본 발명은 어떤 발광 크로스토크도 나타내지 않고, 국소적 광 강도들은 잘 정의된다. 본 발명은 진정한 다중송신을 허용한다. 즉, 트랜스듀서는 (평판 도파관의 경우처럼) 적층 구조를 요구하지 않고, 유니버설 플랫폼으로서 보여질 수 있고, 여기에서, 필요에 따라, 인식 요소들(recognition elements)의 크기 및 수가 칩 구조에 변화를 요구하지 않는, 기술적으로 가능한 범위 내에서 변경될 수 있다(파형(corrugated) 지역들 및 센싱 지역들은 평판 도파관들의 경우에서와 같이 분리되지 않는다). 또한, 본 발명은 선행 에피형광(epifluororescence) 기술들과 비교해서 약 100배 강한 발광 강도를 전달한다. 실험 준비(experimental set-up)가 매우 간단하고, 단지 입사하는 광 빔의 각도의 간단한 조정만을 요구한다. 본 발명에서 기술된 트랜스듀서들은 종래의 형광 현미경들, 공초점의 현미경들, 및 레이저 스캐너들에 쉽게 장착될 수 있다. 더 나아가, (반치폭(Full Width at Half Maximum)으로 정의된; FWHM) 넓은 공명 폭, 및 수직 또는 수직에 가까운 입사에서의 공명 위치를 갖는 트랜스듀서들에 대하여, 각도 조정은 구식이다.
플랫폼의 제조 공정은 비교적 간단하고(싸고), 기존 시스템들(즉, 형광 스캐너, 현미경, 형광 마이크로티터 플레이트 리더 등)의 성능은 각 기구의 적당한 변형에 의해 쉽게 증가될 수 있다.
본 발명의 제 1 태양에 따르면, 굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 기판의 표면에 형성된 얇은 광학적 투명층을 포함하는 샘플 분석에서 사용하기 위한 플랫폼이 제공되되, 상기 플랫폼은 내부에 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 정의하는 주기적인 홈들을 포함하는 하나 또는 복수개의 파형(corrugated) 구조체들을 가지며(incorporating), 각 센싱 지역 또는 각 센싱 영역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 위한 것이고, 상기 홈들은
a) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 광(coherent light)이, 전달된 빔을 감소시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있거나;
b) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 및 선형 편광된 광이, 전달된 빔을 거의 전체적으로 소멸시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있도록 형상화, 치수화 및 배향된다.
본 발명의 제 2 태양에 따르면, 굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 기판의 표면에 형성된 얇은 광학적 투명층을 포함하는 플랫폼이 제공되되, 상기 플랫폼은 투명층에 실질적으로 전 플랫폼에 걸쳐 파형 구조체 또는 플랫폼에 배열된 복수개의 별개의 파형 구조체들을 갖고, 상기 구조체들은 홈들이 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 나타내는, 모노- 또는 복수개의 회절적인, 실질적으로 평행한 주기적 홈들을 포함한다. 여기에서,
(a) 홈들의 깊이는 3 nm 내지 광학적 투명층의 두께까지의 범위이고,
(b) 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm의 범위이며,
(c) 파형 구조체의 피치(pitch)는 200 내지 1000 nm의 범위이고,
(d) 광학적 투명층의 두께에 대한 홈의 깊이의 비는 0.02 내지 1이며,
(e) 홈들의 피치에 대한 홈의 폭의 비는 0.2 내지 0.8의 범위에 있다. 배열은 사용할 때 홈들이
a) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 광이, 전달된 빔을 감소시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있거나;
b) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 및 선형 편광된 광이, 전달된 빔을 거의 전체적으로 소멸시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있도록 형상화, 치수화 및 배향된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 배향(orientation)은 선형 편광된 광의 전기필드 벡터가 홈들에 평행하거나 수직인 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 바, 간섭성 광(coherent light)은 방사의 간섭 길이, 즉 입사하는 빔이 한정된 상(phase) 관계를 갖는 공간 범위가 플랫폼의 두께에 비해 큰 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이버네센트 필드는 입사 빔의 파장 치수들 내에서(1㎛ 미만) 기하급수적으로 약화된다.
본 발명의 중요한 태양은 소위 이버네센트 공명이 생성될 수 있는 플랫폼의 사용이다. 비정상적 반사(anormal reflection)는 선행기술, 예를 들어 Applied Optics, Vol. 32, No 14, 10 May 1993, pages 2606 to 2613에서 SS Wang 및 R Magnusson에 의해 "Theory and applications of guided mode resonnance filter"라고 명명된 논문 및 Pure & Applied Optics 5, (1996) pages 453-469에서 O.Parriaux et al.에 의해 "Coupling gratings as waveguide functional elements"라고 명명된 논문에서 이론적으로 기술되었던 현상이다. 이들 논문들에서 설명된 것처럼, 공명 현상은, 회절 격자의 홈들이 충분한 깊이를 갖고, 파형 구조체에 입사하는 방사(radiation)가 특별한 각도일 때, 반사된 파와 전달된 파 사이의 광학적 에너지가 거의 100% 스위칭이 되는 평면 유전체 층 회절 격자들에서 일어날 수 있다. 본 발명에서, 이러한 현상은 플랫폼의 센싱 지역에서 이용되며, 센싱 지역은 충분한 깊이의 회절 홈들을 포함하고, 이버네센트 공명이 상기 센싱 지역에서 일어나도록 하는 각도로 플랫폼의 센싱 지역에 빛이 입사되도록 유도된다. 이는 검사 중인 샘플들을 여기시키는 데에 사용되는 향상된 이버네센트 필드를 센싱 지역에서 생성한다. 상기 언급된 100% 스위칭은 평행 빔과 선형 편광된 간섭성 광과 함께 발생하며, 또한 향상된 이버네센트 필드의 효과는 비-평행 초점 레이저 빔의 비-편광된 광에 의해서도 달성될 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
공명 조건들에서, 개별 빔들은, 전달된 빔이 소멸되고(파괴적 간섭), 반사된 빔은, 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 구조적으로 일으키며 간섭하는 방법으로 간섭한다.
상기 언급된 파형 층 구조체에 대한 적절한 파라미터를 선택하는 것에 의해, 여기 에너지(excited energy)는 매우 국소화되어 유지된다. 이러한 구조체들은 문헌에서 광자 밴드 갭 구조체들, 전자 방사가 어느 방향으로도 전파할 수 없도록 하는 굴절률의 주기적 공간적 변화들을 갖는 물질들로서 기술되어 있다. 광자 밴드 갭 구조체는 고도로 국소화된 모드들이 나타나게 한다(예를 들어, Physical Review Letters, Vol. 79, No 9, pages 1585-87(1997)에 있는 C. Adlard, E.R. Pike and S. Sarkar의 "Localisation of One Photon States"라고 명명된 논문). 이러한 구조체들은 ㎛ 규모로의 모드 국소화에 상응하는 매우 큰 전달 손실을 보인다.
본 발명의 플랫폼은 예를 들어 유리 또는 중합체로부터 구성된 광학적 패시브(passive) 플랫폼들과 대조적으로, 광학적 액티브인 것으로 간주될 수 있다. 여기서, 광학적 액티브는 에너지 제한에 의해 여기 빔(excitation beam)의 전자기 필드를 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명의 플랫폼은 예를 들어 유리 또는 중합체로부터 구성된 광학적 패시브(passive) 플랫폼들과 대조적으로, 광학적 액티브인 것으로 간주될 수 있다. 여기서, 광학적 액티브는 에너지 제한에 의해 여기 빔(excitation beam)의 전자기 필드를 증가시키는 것을 의미한다.
플랫폼의 기판은 유리, SiO2, 석영, Si와 같은 무기 물질들로부터 형성될 수 있다. 대안적으로는, 기판은 유기 물질들, 예를 들면 중합체들, 바람직하게는 폴리카보네이트(PC), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리이미드(PI), 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌(PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리우레탄(PU)로부터 형성될 수 있다. 이들 유기 물질들은 특히 현장 치료(point-of-care) 및 개인화된 의학적 적용에 특히 바람직하며, 그 이유는 유리가 이러한 환경에서 허용되지 않기 때문이다. 플라스틱 기판들은 유리보다 훨씬 더 쉽게 구성(엠보싱; embossed) 될 수 있다. 한 예에서, 기판은 유리로부터 형성된다.
광학적 투명층은 무기 물질로 형성될 수도 있다. 대안적으로는, 광학적 투명층은 유기 물질로부터 형성될 수 있다. 한 예에서, 광학적 투명층은 금속 산화물, 예를 들어 Ta2O5, TiO2, Nb2O5, ZrO2, ZnO 또는 HfO2이다. 광학적 투명층은 비금속성이다.
대안적으로는, 광학적 투명층은 유기 물질, 예를 들어 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리프로필렌(PP), PS, PMMA, 폴리아크릴 산, 폴리아크릴 에테르, 폴리티오에테르, 폴리(페닐렌설파이드), 및 이들의 유도체들로 만들어질 수 있다(예를 들어 S.S. Hardecker et al., J. of Polymer Science B: Polymer Physics, Vol. 31, 1951-63, 1993).
회절 홈들의 깊이는 3 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 10 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지, 예를 들어 30 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지일 수 있다. 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm, 예를 들어 50 내지 300 nm, 바람직하게는 50-200 nm 범위이며, 파형 구조체의 피치는 200 내지 1000 nm, 예를 들어 200 내지 500 nm, 바람직하게는 250-500 nm범위 일 수 있으며, 광학적 투명층의 두께에 대한 홈의 깊이의 비는 0.02 내지 1, 예를 들어 0.25 내지 1, 바람직하게는 0.3 내지 0.7 일 수 있으며, 홈들의 피치(듀티 사이클; duty-cycle)에 대한 홈들의 폭의 비는 0.2 내지 0.8, 예를 들어 0.4 내지 0.6의 범위일 수 있다.
홈들은 일반적으로 단면이 직사각형일 수 있다. 대안적으로는, 홈들은 싸인파 형태(sinusoidal) 또는 톱니 단면 형상일 수 있다. 표면 구조체는 일반적으로 대칭 형상일 수 있다. 바람직한 형상들은 직사각형, 싸인파 형태, 및 사다리꼴 단면들을 포함한다. 대안적으로는, 홈들은 톱니 단면 형상(블레이징된 격자; blazed grating) 또는 다른 비대칭 형상일 수 있다. 또 다른 태양에서, 홈 깊이는 예를 들어 주기적 변조(modulations)로 변할 수 있다.
플랫폼은 정사각형 또는 직사각형일 수 있고, 홈들은 표면을 덮도록 플랫폼을 따라 선형으로 연장될 수 있다. 대안적으로는, 플랫폼은 디스크형일 수 있으며, 홈들은 원형 또는 선형일 수 있다.
홈들은 기판의 표면에 형성될 수 있다. 대안적으로는, 홈들은 광학적 투명층의 표면에 형성될 수 있다. 또 대안적으로는, 홈들은 중간면인 기판의 표면과 광학적 투명층의 표면 모두에 형성될 수 있다.
단일 센싱 지역의 파형 표면은 하나의 특정 여기 파장 및 하나의 특정한 형태의 편광에 대해 최적화될 수 있다. 적절한 수단, 예를 들어 서로 평행이거나 수직인 몇개의 주기적인 구조체들을 중첩시키는 것에 의해, 플랫폼의 복수개의 파장 사용("멀티컬러" 적용들)에 적절한, 주기적인 표면 릴리프(relief)들이 얻어질 수 있다. 대안적으로는, 한 플랫폼 상의 개별 센싱 지역들이 상이한 파장들 및/또는 편광 배향들에 대하여 최적화될 수 있다.
광학적 투명층의 표면은 각각 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 가질 수 있는, 하나 또는 복수개의 파형(corrugated) 센싱 지역들을 포함할 수 있다.
각 캡쳐 요소는 친화성 반응들을 할 수 있는 개별 캡쳐 분자 및/또는 캡쳐 분자들의 혼합물들을 포함할 수 있다. 개별 캡쳐 요소의 형상은 직사각형, 원형, 타원형, 또는 다른 형상일 수 있다. 개별 캡쳐 요소의 면적은 1㎛2 내지 10 mm2, 예를 들어 20㎛2 내지 1 mm2 및 바람직하게는 100 ㎛2 내지 1mm2이다. 캡쳐 요소들은 규칙적인 2차원 배열로 배열될 수 있다. 캡쳐 요소들의 중심 대 중심(ctc) 거리는 1 ㎛ 내지 1 mm, 예를 들어 5 ㎛ 내지 1 mm, 바람직하게는 10 ㎛ 내지 1 mm일 수 있다.
센싱 지역당 캡쳐 요소들의 수는 1 내지 1,000,000, 바람직하게는 1 내지 100,000이다. 또 다른 태양에서, 플랫폼 상에 고정되는 캡쳐 요소들의 수는 제한되지 않고, 예를 들어 유전자수, DNA 배열 순서, DNA 모티프(motifs), DNA 마이크로 새틀라이트(satelites), 단일 염기 변형(SNPs), 관심의 대상이 되는 종 또는 유기체의 게놈을 구성하는 단백질 또는 세포 단편, 또는 그들의 선택 또는 조합에 대응될 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명의 플랫폼은 두 개 이상의 종들, 예를 들어 마우스(mouse) 및 래트(rat)의 게놈들을 포함할 수 있다.
센싱 지역당 캡쳐 요소들의 수는 1 내지 1,000,000, 바람직하게는 1 내지 100,000이다. 또 다른 태양에서, 플랫폼 상에 고정되는 캡쳐 요소들의 수는 제한되지 않고, 예를 들어 유전자수, DNA 배열 순서, DNA 모티프(motifs), DNA 마이크로 새틀라이트(satelites), 단일 염기 변형(SNPs), 관심의 대상이 되는 종 또는 유기체의 게놈을 구성하는 단백질 또는 세포 단편, 또는 그들의 선택 또는 조합에 대응될 수 있다. 다른 태양에서, 본 발명의 플랫폼은 두 개 이상의 종들, 예를 들어 마우스(mouse) 및 래트(rat)의 게놈들을 포함할 수 있다.
플랫폼은 캡쳐 분자들의 고정을 가능하게 하기 위하여 광학적 투명층의 표면에 위치된 접착 촉진층을 포함할 수 있다. 또한 접착 촉진층은 분석 및 검출 효능을 더 증가시키기 위한 미세다공성 층(세라믹, 유리, Si), 또는 캡쳐 요소 고정화 및 샘플 분석을 수행하기 위한 매질로서 사용될 수 있음에 따라 분석 및 검출 효능을 더 증가시키거나, 겔 전기 영동의 센싱에서 분석물 혼합물의 분리를 가능하게 하는 겔층들을 포함할 수 있다. 플랫폼은 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들과 함께 형성될 수 있되, 각각이 자신의 회절 홈들을 갖는다.
본 발명의 플랫폼의 특징은 광학적 투명층에 들어가는 광 에너지가 파형 플랫폼의 성질에 기인하여 즉각적으로 층으로부터 회절된다는 것이다. 따라서, 도파는 발생되지 않거나, 무시할 정도로 발생된다. 일반적으로 전파 거리는 100㎛ 이하, 바람직하게는 10㎛ 이하이다. 이는 매우 놀라울 정도로 짧은 거리이다. 전파 거리는 방사선 에너지가 1/e로 감소되는 거리이다.
본 발명의 제 3 태양은 상기 제 1 또는 제 2 태양에 따른 플랫폼, 광 빔을 발생시키고 상기 빔을 유도함으로써, 상기 플랫폼 내에서 이버네센트 공진을 발생시켜 상기 플랫폼의 센싱 지역 내에서 향상된 이버네센트 필드를 형성하도록 하는 각도를 가지고 상기 빔이 상기 플랫폼으로 입사되도록 하는 광 발생 수단, 및 상기 플랫폼의 상기 센싱 지역에 위치된 물질의 특성을 검출하는 검출 수단을 포함하는 샘플 분석용 장치를 제공한다. 공명 조건을 만드는데 적절한 각도들의 범위는 플랫폼상의 입사광에 대한 총 반사 각도에 의해 제한된다. 바람직한 각도들은 45°미만, 예를 들어 30°이하, 예를 들어 20° 내지 10° 또는 그 미만, 예를 들어 0.1°내지 9.9°이다. 각도는 수직 입사이거나 수직 입사에 가까울 수 있다. 광 발생 수단은 간섭성 레이저 빔을 방출하기 위한 레이저를 포함할 수 있다. 다른 적절한 광원들은 방출 램프들 또는 저압 램프들, 예를 들어 Hg 또는 Xe (여기에서, 방출된 스펙트럼 라인들은 충분한 간섭 길이를 갖는다), 및 발광 다이오드(LED)를 포함한다. 또한, 장치는 레이저 빔이 각도 θ로 플랫폼에 입사하도록 레이저 빔을 유도하기 위한 광학적 요소들, 및 간섭성 빔의 편광 평면을 형성하는, 예를 들어 선형 편광된 광을 전달하기에 적합한 요소들도 포함할 수 있다. 각도 θ는 식 sin θ=n-λ/Λ(여기에서, Λ는 회절 홈들의 피치, λ는 입사광의 파장, n은 광학적 투명층의 유효 굴절률)에 의해 정의될 수 있다.
사용될 수 있는 레이저들의 예들은 가스 레이저, 고체 상태 레이저, 색소(dye) 레이저, 반도체 레이저이다. 필요에 따라, 방출 파장은 비선형 광학 요소들에 의해 2배로 될 수 있다. 특히, 적절한 레이저는 275 내지 753 nm의 파장에서 방출하는, 아르곤 이온 레이저, 크립톤 이온 레이저, 아르곤/크립톤 이온 레이저, 및 헬륨/네온 레이저이다. 매우 적절한 것은 작은 치수들 및 저전력 소비를 하는 반도체 물질의 주파수 2배된 다이오드 레이저 또는 다이오드 레이저이다.
여기(excitation)의 또다른 적절한 형태는 플랫폼상의 인식 요소들을 개별적으로 여기시킬 수 있는 VCSEL(수직 공동 표면 발광 레이저)를 이용하는 것이다.
검출 수단은 형광과 같은 발광을 검출하도록 배열될 수 있다. 친화성 파트너들은, 분석물 분자들이 캡쳐 분자들과 결합할 때 형광 공명 에너지 전이(FRET)가 발생할 수 있는 방식으로 표지화될 수 있다. 최대 발광 강도는 층 시스템의 굴절률 값들 및 이에 상응하는 Fresnel 계수들에 따라 가장 높은 비정상적 반사의 위치에 대하여 약간 이동될 수 있다.
샘플들은 비희석되거나 첨가된 용매들과 함께 사용될 수 있다. 적절한 용매들은 물, 수성 버퍼 용액들, 단백질 용액들, 천연 또는 인공 올리고머 또는 중합체 용액들, 및 유기 용매들을 포함한다. 적절한 유기 용매들은 알콜, 케톤, 에스테르, 지방족 탄화수소, 알데히드, 아세토니트릴 또는 니트릴을 포함한다.
가용화제 또는 첨가제가 포함될 수 있고, 유기 또는 무기 화합물, 또는 생화학적 시약, 예를 들어 디에틸피로카보네이트, 페놀, 포름아미드, SSC(소듐 시트레이트/염화 나트륨), SDS(소듐도데실설페이트), 버퍼제, 효소, 역전사효소, RNA분해효소, 유기 또는 무기 중합체일 수 있다.
샘플은 또한 사용된 용매들에 불용성인 구성원들, 예를 들어 색소 입자, 분산제, 및 천연 및 합성 올리고머 또는 중합체를 포함할 수 있다.
마커들로서 사용된 발광 염료들은 화학적으로 또는 물리적으로, 예를 들어 정전기적으로 분석물 용액에 존재하는 하나 또는 복수개의 친화성 결합 파트너들(또는 그의 유도체들)에 결합할 수 있고/있거나, 플랫폼에 부착될 수 있다. 친화성 반응에 포함되는, 합성 올리고머 또는 중합체 뿐만 아니라 자연 발생되는 올리고머 또는 중합체, 예를 들어 DNA, RNA, 당류, 단백질, 또는 펩타이드의 경우에, 삽입 색소(intercalating dye)도 또한 적절하다. 발광체는 비오틴/아비딘 결합과 같은 생물학적 상호작용 또는 HIS-tag 결합과 같은 금속 복합체 형성을 통해 분석물 용액 중에 존재하는 친화성 파트너들에 결합될 수 있다.
하나 또는 복수개의 발광 표지들은, 하나 또는 복수개의 친화성 결합 파트너들의 존재를 정량적으로 결정하기 위하여, 분석물 용액 중에 존재하는 친화성 파트너들, 플랫폼에 고정된 캡쳐 요소들, 또는 분석물 용액 중에 존재하는 친화성 파트너들 및 플랫폼에 고정된 캡쳐 요소들 모두에 부착될 수 있다. 발광 마커들의 분광학적 성질들은 회르스터 에너지 전이 또는 광유도된 전자 전달을 위한 조건들과 일치되도록 선택될 수 있다. 이어서, 어셉터들 및 도너들의 거리 및 농도 의존적인 발광이 분석물 분자들의 정량화를 위해 사용될 수 있다.
친화성 결합 파트너들의 정량화는 친화성 반응들에 포함된 분자들에 결합된 도너들 및 어셉터들 사이의 분자간 및/또는 분자내 상호작용에 기초할 수 있다. 친화성 반응시 도너와 어셉터 사이의 거리를 변화시키는, 친화성 결합 파트너들에 공유적으로 결합된 발광 도너들 및 어셉터들의 분자내 어셈블리들, 분자 비컨들(Molecular Beacons)(S. Tyagi et al., Nature Biotechnology 1996, 14, 303-308)도 또한 분석물 용액에 대한 캡쳐 분자들 또는 첨가제들로서 사용될 수 있다. 또한, pH 및 잠재적으로 민감한 발광체들 또는 효소 활성에 민감한 발광체들, 예를 들어 형광 유도체들의 효소 매개된 구성과 같은 것이 사용될 수 있다.
트랜스플루오로스피어(Transfluorospheres) 또는 그의 유도체들이 형광 표지화를 위해 사용될 수 있고, 화학-발광 또는 전자-발광 분자들이 마커들로서 사용될 수 있다. 폴리페닐 및 헤테로방향족 화합물, 스틸벤, 쿠마린, 잔틴 염료, 메틴 염료, 옥사진 염료, 로다민, 플루오레세인, 쿠마린, 스틸벤, 피렌, 페릴렌, 시아닌, 옥사시아닌, 프탈로시아닌, 포르피린, 나프탈로프시아닌, 아조벤젠 유도체, 디스티릴 비페닐, 전이 금속 복합체, 예를 들어 폴리피리딜/루테늄 복합체, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 클로라이드, 트리스(1,10-펜안트롤린)루테늄 클로라이드, 트리스(4,7-디페닐-1,10-펜아트롤린)루테늄 클로라이드 및 폴리피리딜/페나진/루테늄 복합체, 예를 들어 옥타에틸-플라티늄-포르피린, 유로피움 및 테르비움 복합체의 유도체들과 같은 하나 이상의 친화성 파트너들에 부착되기 위하여 기능화되거나, 개질된, 400 nm 내지 1200 nm 범위에서의 발광을 하는 발광 화합물들이 발광 마커들로서 사용될 수 있다.
혈액 또는 혈청의 분석용으로 적절한 것은 400 nm 내지 1000 nm 범위에서 흡수 및 방출 파장을 갖는 염료들이다. 더 나아가, 두 개 및 세 개의 광자 여기에 적절한 발광체들이 사용될 수 있다.
본 발명에서 적절한 염료는 공유결합을 위한 작용기, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트와 같은 플루오레세인 유도체들을 포함할 수 있다. Amersham Life Science, Inc. Texas. and Molecular Probes Inc.로부터 시판되는 기능성 형광 염료들도 또한 적절하다.
다른 적절한 염료들은 RNA 또는 DNA 가닥에 효소적으로 혼입될 수 있는 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP)로 개질된 염료들을 포함한다. 더 적절한 염료들은 Quantum Dot Particles 또는 Beads(Quantum Dot Cooperation, Palo Alto, CA) 또는 그의 유도체들 또는 하나의 동일하게 정의된 파장에서 여기될 수 있는 전이 금속 복합체들의 유도체들을 포함하며, 유도체들은 구별가능한 파장들에서 형광 발광을 나타낸다.
분석물들은 직접적으로 결합된 발광 마커들을 통하거나, 또는 첨가된 발광 표시된 종들과의 경쟁에 의해, 또는 하나 및/또는 복수개의 분석물 종들 및/또는 캡쳐 요소들에 결합된 마커들로서 사용되는, 발광 도너들 및 발광/전자 어셉터들의 농도-, 거리-, pH-, 전위- 또는 산화 환원-의존적 상호작용에 의해 간접적으로 검출될 수 있다. 도너의 발광 및/또는 퀀처의 발광은 분석물들의 정량화를 위해 측정할 수 있다.
동일한 방법으로, 친화성 파트너들은, 분석물 분자들이 캡쳐 분자들에 결합될 때, 전자 전달 또는 광유도된 전자 전달이 형광의 퀀칭을 유발시키는 방법으로 표지화될 수 있다.
발광을 위한 적절한 검출기들은 CCD-카메라들, 광전자 증배관(photomultiplier tube), 애벌란시 광다이오드, 광다이오드, 복합(hybrid) 광전자 증배관을 포함한다.
검출 수단은 굴절률에서의 추가적인 변화들을 추가적으로 검출하도록 배열될 수 있다.
입사 빔은 하나의 공통적인 플랫폼에 센싱 지역 또는 모든 센싱 지역들을 조사(illuminate)하도록 배열될 수 있다. 대안적으로는, 빔은 분석하려는 센싱 지역의 작은 서브-지역만 조사하도록 배열될 수 있고, 빔 및/또는 플랫폼은 플랫폼의 센싱 지역을 스캐닝하기 위하여 상대적인 이동을 할 수 있도록 배열될 수 있다.
따라서, 검출 수단은 단일 노출 단계에서 전 센싱 지역의 발광 시그날 강도들을 얻는 적절한 방법으로 배열될 수 있다. 대안적으로는, 검출 및/또는 여기 수단은, 센싱 지역들을 단계적으로 스캐닝하도록 배열될 수 있다.
장치는 샘플이 센싱 지역과 접촉하도록 플랫폼의 센싱 지역에 대응되는 위치를 위한 카트리지를 포함할 수 있다. 카트리지는 소규모 포맷에서, 샘플 제공, 희석, 농축, 혼합, 생물/화학적 반응, 분리를 수행하기 위하여 수단을 더 포함할 수 있다(참조, WO 97/02357). 장치는 검사하려는 복수개의 샘플들을 포함하기 위한 마이크로티터 형태의 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 제 4 태양은 샘플을 상기 제 1 또는 제 2 태양에 따라 플랫폼의 센싱 지역과 접촉시키는 단계, 이버네센트 공명이 플랫폼의 센싱 지역에서 일어나도록 플랫폼을 광 빔으로 조사하는 단계, 및 센싱 지역으로부터 발산하는 방사선을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 검사 중인 샘플들에 형광 유도 물질을 첨가하는 단계, 향상된 이버네센트 필드에 의한 샘플들의 여기에 의해 상기 샘플들에 유도된 형광을 센싱하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 본 방법은 형광 유도 또는 퀀칭 물질을 검사 중인 샘플들에 첨가하는 단계 및/또는 검사 중인 샘플들을 형광 또는 퀀칭 유도체들로 전달하는 단계, 및 향상된 이버네센트 필드에 의한 여기에 의해 센싱 플랫폼에 결합된 상기 샘플들에 의해 유도된 형광을 센싱하는 단계를 포함할 수 있다.
각 센싱 지역 또는 센싱 영역이 하나 이상의 형태의 캡쳐 요소 또는 캡쳐 분자를 부착시킨 센서 플랫폼을 제공하는 것이 신규하고, 발명적인 개념이라고 믿어진다. 이 개념은 플랫폼이 이버네센트 공명 모드 또는 도파와 같은 보다 종래적인 모드를 위해 설계되었든지 간에 적용된다. 따라서, 본 발명의 다른 태양에 따라, 샘플 분석에서 사용하기 위한 플랫폼이 제공되되, 상기 플랫폼은 하나 이상의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 가지며, 각각은 플랫폼이 간섭성 광으로 조사되었을 때, 친화성 반응의 지수를 제공하도록 상호반응할 수 있는 캡쳐 요소 또는 캡쳐 요소들을 수용하기 위한 것이며, 각 캡쳐 요소는 두 개 이상의 형태의 캡쳐 분자를 포함한다.
본 발명은 특히 첨부된 도면을 참고로 하여 단지 예로서 기술된다.
도 1은 본 발명에 따른 플랫폼의 광학적 파라미터 및 이버네센트 공명 조건을 분석하기 위한 품질 조절 장치의 개략적인 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 센서 플랫폼을 개략적인 도면이다.
도 3은 플랫폼과 관련하여 이버네센트 필드 프로파일을 도시하는 개략적인 도면이다.
도 4a 및 4b는 칩 카트리지를 도시하는 개략적인 도면들이다.
도 5는 본 발명의 한 예에서의 배열 레이 아웃을 도시한다.
도 6은 본 발명의 한 예에 따라 형광을 측정하는데 사용되는 레이 아웃을 개략적으로 도시한다.
도 7은 선행기술과 본 발명에 의해 얻어진 결과들을 비교하는 도면이다.
도 8은 플랫폼의 대안적인 형태를 도시한다.
도 9a 내지 도 9c는 실험예 5에서 기술된 공명 조건 하에서 본 발명의 플랫폼을 사용하여 30 pm PM 분석물, 재생(regeneration), 및 30 pM MM분석물의 인큐베이션후 얻어진 형광 영상을 도시한다.
도 10은 실험예 6에서 기술된 바와 같은 에피형광 및 공명 조건 하에서 본 발명의 플랫폼을 사용하여 얻어진 형광 영상 및 데이터를 도시한다.
본 발명은 샘플들 중에서 여기된 발광을 측정하는 면에서 기술될 것이다. 이 측정은 본 발명의 일 태양을 구성하는 센서 플랫폼의 사용을 포함하나, 이러한 플랫폼의 사용은, 기술된 특별한 적용으로 반드시 제한되는 것은 아니라는 것이 이해될 것이다. 플랫폼을 상세히 기술하기 전에, 플랫폼이 샘플들의 발광을 측정하는 데에 사용될 수 있는 일반적인 방법의 측면에서 기술될 것이다.
다음은 기술에서 사용될 용어의 정의이다.
플랫폼: 하나 또는 복수개의 센싱 지역들을 포함하는 전체 트랜스듀서/칩.
센싱 지역: 공명 효과에 의해 이버네센트 필드를 형성할 수 있고, 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 포함하는 전체 파형 지역.
캡쳐 요소: 하나 또는 다양한 캡쳐 분자들의 종들(species)을 포함하는 개별 센싱 지점(spot)
캡쳐 분자: 친화성 반응을 할 수 있는 개별 분자.
캡쳐 분자: 친화성 반응을 할 수 있는 개별 분자.
하기 실험예들에서, 모든 온도들은 섭씨이고, 교정되지 않는다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 태양에 따른 플랫폼이 "10"으로서 도시되고, 레이저(11)로부터 간섭성 광을 수신할 수 있으며, 레이저 광은 확장되고 평행한 빔(16)을 생산하는 한 세트의 렌즈들(12, 14)에 의해 확장되고, 편광기(18; polariser)에 의해 편광화된다. 이후에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 플랫폼(10)은 캡쳐 분자들이 부착된 센싱 지역을 갖는다. 광의 파장은 일반적으로 UV 내지 NIR 범위, 바람직하게는 350 nm 내지 1000 nm범위이다.
장치는 또한 플랫폼(10)을 통해 전달된 광을 검출할 수 있는 검출기(20), 반사된 광을 검출하는 CCD 카메라(21) 및 데이터 처리 유니트(22)를 포함한다.
장치의 사용에서, 고도의 평행하고, 확장된, 간섭된, 선형적으로 편광된 레이저 빔(16)이 플랫폼(10)의 센싱 지역에 입사되도록 하며, 플랫폼을 통해 전달된 광은 검출기(20)에 의해 센싱되고, 반사된 광은 CCD 카메라(21)에 의해 기록된다. 확장된 여기 빔의 직경은 플랫폼(10)의 크기보다 크다. 플랫폼 상에서 빔의 입사 각도는, 검출기(20)가 플랫폼을 통해 전달된 어떤 광도 효과적으로 검출하지 않을 때까지 플랫폼의 회전에 의하여 조정된다. 이는 이버네센트 공명이 플랫폼의 센싱 지역에서 일어나는 공명 위치의 존재를 나타낸다. 이러한 조건에서, 카메라(21)에 의해 기록된 반사된 광의 강도는 최대에 이르고, 카메라로부터의 데이터는 처리를 위해 데이터 처리 유니트(22)에 의해 획득된다.
도면들의 도 2를 참조하면, 플랫폼(10)의 실시예는 상부 표면에 복수개의 홈들(31)이 에칭된 유리 기판(30)을 포함한다. 광학적으로 투명한 금속 산화물 층(32)이 기판(30)의 상부 표면에 증착되고, 그 층(32)은 또한 그 내부에 홈들(33)을 갖는다. 기판(30)은 예를 들어 Schott에 의해 제조된 유리 AF45와 같은 유리로부터 형성될 수 있으며, 일반적으로 0.5 mm-1.0 mm의 두께를 갖는다. 다른 유기 또는 무기 물질들이 광학적으로 투명하다면 기판용으로 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
광학적 투명층은 633㎚의 파장에서 약 2.2의 높은 굴절율, 즉 기판의 굴절율보다 현저하게 큰 굴절율을 갖는 Ta2O5와 같은 유전성 투명 금속 산화 필름이다. 이 층의 두께는 일반적으로 50 내지 200㎚이거나 이보다 큰 범위, 예를 들어 50 내지 300㎚의 범위일 것이다. 파형 구조체들(31 및 33)은 200 내지 1,000㎚, 예를 들어 200 내지 500㎚, 일반적으로 250 내지 500㎚범위의 피치를 갖는다. 파형 구조체들/회절 홈들의 깊이는 3㎚ 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위, 바람직하게는 10㎚부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위 내에 있을 수 있다. 금속산화물은 Ta2O5,TiO2,Nb2O5,ZrO2,ZnO 또는 HfO2와 같은 복수개의 예들 중 어떤 것일 수 있다.
도 2에 도시된 플랫폼에서, 편광된 레이저 광의 평행 빔이 특정 입사각으로 플랫폼 상에 입사될 때, 비정상적 반사로 알려진 효과가 층(32) 내에서 발생한다. 이 효과가 발생할 때, 실질적으로 광은 플랫폼(10)을 통하여 전달되지 않으며, 모든 광은 층(32) 내에서 효과적으로 반사되어 간섭성(coherent) 레이저 광은 매우 얇은 금속 산화물 층(32)에 갇히게 된다. 그 결과로 생긴 고 레이저 필드는 층(32)의 표면 또는 층에 매우 인접하에 있는 형광성 물질을 미세하게 여기시키는 이버네센트 필드(evanescent field)를 생성하며 층(32)으로부터 부분적으로 누설된다. 특정 깊이 또는 그 이상의 깊이를 갖는 회절 홈들(31, 33)이 사용될 때에만 이러한 공명(resonance) 조건이 달성될 수 있다는 것을 주목해야 하며, 바람직한 파장 범위 내에서의 어떠한 전자기 방사의 도파(waveguiding)도 금속 산화층(32) 내에서 효과적으로 발생되지 않도록 하기 위하여 이러한 파형 구조체의 방사 손실이 매우 크다는 것도 또한 주목해야 한다. 홈들의 깊이가 적어도 10㎚이어야 하나 이버네센트 공명은 더 얕은 홈들로도 나타나기 시작한다. 그러나, 만일 검사될 샘플이 공명이 형성된 층(32) 근처에 있다면, 향상된 이버네센트 필드가 샘플 내의 형광과 같은 발광(luminescence)을 자극하기 위하여 사용될 수 있다.
본 플랫폼의 중요한 특징은 공명 위치에서 이러한 이버네센트 필드의 진폭(amplitude)이 종래 기술의 장치(오프-공명 상태에 대응하는 에피플루어렌스(epifluorescence))의 진폭보다 약 100배 정도 현저하게 크다는 것이다.
이것은 샘플들로부터 생성될 수 있는 발광, 예를 들어 형광의 강도도 또한 100의 계수만큼 증가한다는 것을 의미한다. 플랫폼의 기능은 광을 회절시키는 볼륨 격자(volume grating)로서 작동하는 회절 구조체의 면에서 관측될 수 있으며, 회절 빔들은, 제 1 계면으로부터 반사된 광과 층(32)의 상부 표면인 상부 계면으로부터 반사된 광이 반사 최대값을 발생시키는 것을 구조적으로 간섭하는 공명 조건을 생성하는 것을 간섭한다. 공명 조건들에서, 레이저 에너지는 실질적으로 얇은 층(32)의 두께에 갇히게 되며, 그로 인하여 전기장의 강도를 증가시킨다. 주어진 레이저 파장 및 파형 구조체의 피치로 인하여, 공명은 각도에 좌우된다. 각도 의존적인 공명은 일반적으로 0.1°, 바람직하게는 0.5° 이상, 예를 들어 1.0°이상의 반치폭(FWHM)을 갖는다. 이러한 공명 폭은 홈들의 깊이, 파형 구조체의 듀티 사이클(duty cycle) 및 형상에 좌우된다. 도파관 격자(waveguide grating)의 커플링(coupling) 작용과 비교하면, 상기 설명된 공명의 FWHM은 그 수십배 정도 더 크다.
적절한 종래 기술들에 의하여 회절 홈들(31, 33)이 플랫폼 상에 형성될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이를 달성하기 위한 한 방법은 사진 기술(photographical technique)에 의하여 홈들을 식각(etch)하는 것이다. 이 방법에서, 포토레지스트 성분은 약 1㎛의 두께까지 기판의 표면 상에 침착되며, 그 후 홈 구조에 대응하는 주기적인 구조체는 2개의 빔 간섭계/홀로그래피(interferometry/holography)에 의하거나 위상 마스크의 사용에 의하여 레지스트(resist)에 새겨지며, 그 후 레지스트는 아르곤 가스를 이용한 반응성 이온 식각 기술로 식각되고, 마지막으로 잔류 포토레지스트 물질은 표면으로부터 제거된다. 이 기술은 홈들(31)과 홈들(33) 모두를 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 파형 구조체들을 만드는(incorporating) 다른 방법은 엠보싱(embossing), 전자 빔 새김(writting), 레이저 제거(ablation), LIGA 공정을 포함한다.
도 6에 도시된 바와 같은 측정에 사용할 수 있도록 도 2를 참고로 하여 설명된 형태의 플랫폼을 제공하기 위하여, 복수개의 공정들이 뒤따라야 한다.
제 1 단계는 플랫폼 표면으로부터 이물질들을 제거하기 위하여 플랫폼을 세정하는 것이다. 세정 공정은 복수개의 수단들, 예를 들어 자외선 세정제에 의하여, 플라즈마 세정에 의하여 또는 산(acid), 염기(bases), 용제(solvent), 가스 및 액체와 같은 물질들을 이용한 화학 세정에 의하여 이루어질 수 있다.
플랫폼이 세정되면, 다음 단계는 금속 산화층 표면에 접착 촉진제 층을 부착하는 것이다. 플랫폼 상에 증착될 캡쳐 요소(capture elements)들이 금속 산화층 자체에 쉽게 접착될 수 없기 때문에 이러한 층이 플랫폼에 부착된다. 이러한 층이 형성될 수 있는 몇몇 방법들이 존재한다. 한 방법은 실란(silane) 분자의 망상 조직(network)의 층을 형성하는 것이며, 다른 방법은 자기 조립된 단일층들(self-assembled monolayers; SAM)로서 알려진 것을 이용하는 것이다. 이 방법들은 본 기술분야의 숙련된 자들에게 명백하게 될 공지된 기술들이다. 예를 들어 액상(liquid phase) 또는 기상(gas phase)을 포함할 수 있는 실란화는 1976년 엘 보크사니이, 오 리아든, 이 코바츠, 콜로이드 및 인터페이스 사이언스 6 95-237에 설명되어 있다. 자기-조립된 단일층들의 형성은 예를 들어 1991년 아카데믹 프레스 인크. 아브라함 울만의 "극히 얇은 유기 필름" 내에 설명되어 있다. 더욱이,
- 반응성 그룹들을 가진 칩 표면 및 적절한 연결자(linker)들을 이용한 캡쳐 분자들의 화학적 변형(유. 마스코스 및 이. 엠. 서던, 핵산 연구 1992년 20권 1679-84),
- 광회복성 연결자들/그룹들을 가지는 표면과 캡쳐 분자들의 변형(WO98/27430 및 WO91/16425),
- 쿨롱 상호 작용(coulmbic interaction)을 통한 고정화(EP 0 472 990 A2),
- 킬레이트 반응(chelating reaction)에서의 태그(tags; 예를 들어 단백질-태그, HIS-태그)를 통한 연결,
- 그리고 예를 들어, 효소학 아카데믹 프레스, 뉴욕, 클라우스 모스바처(이디.) 137권, "고정화된 효소 및 세포들" 1988 내의 방법 내에 기재된 다양한 다른 방법들.
- 캡쳐 분자들 또는 유도된 캡쳐 분자들의 직접 연결, 또는 화학적 연결자들 또는 광화학적 연결자들을 통한 캡쳐 분자들 또는 유도된 캡쳐 분자들의 간접 연결을 가능하게 하는, 기능성/반응성 그룹들을 포함하는 접착 촉진층들의 플라즈마 유도된 고정화/발생
과 같은 캡쳐 요소들의 고정을 위해 이용 가능한 방법들이 더 있다.
과 같은 캡쳐 요소들의 고정을 위해 이용 가능한 방법들이 더 있다.
예를 들어, 접착 촉진층은 3-(글리시독시프로필)트리메톡시실란(GOPTS)을 이용한 실란화에 의하여 제조될 수 있다. 아민(amines)과 같은 친핵성(nucleophilic) 그룹을 함유한 혼합물들은 실란의 에폭시 작용기와 반응할 수 있어 공유적으로 고정화된다. 따라서, 예를 들어 항체가 아미노 산으로 이루어져 있기 때문에 이러한 실란화는 복수개의 아미노 그룹을 함유한 항체의 고정화에 사용될 수 있다. 더욱이, 응용예 4(SNP 판별)에 도시된 바와 같이 이들 캡쳐 분자들을 플랫폼에 공유적으로 부착하기 위하여 캡쳐 분자와 같은 DNA/RNA/PNA 가닥들(strands)은 아미노 그룹들을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이 예에서, 아미노 작용기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 플랫폼의 표면에서 공유적으로 고정되었다. 그러나, 다른 형태의 캡쳐 분자는 이 목적을 위하여 변형될 수 있다.
또한, 접착 촉진층은 추가로 표면 성질을 변경하기 위하여 화학적으로 개질될 수 있다. 예를 들어 GOPTS-실란화 플랫폼을 플랫폼의 소수성/친수성 밸런스를 조작하기 위하여, 즉 플랫폼의 접촉 각을 변화시키기 위하여 기능화되고, 포화 또는 불포화 유기/헤테로-유기/무기 분자/유도체와 반응시킬 수 있다. 또한, 이온성 또는 잠재적으로 이온성인 화합물을 플랫폼의 표면에 양 또는 음전하를 생성시키기 위하여 사용될 수 있다. 캡쳐 분자는 공유적으로 또는 물리흡착에 의해 또는 하전된 쿨롱의(coulombic) 상호작용에 의해 또는 그들의 혼합에 의해 이러한 개질된 표면/플랫폼에 결합될 수 있다. 이는 하기 적용 실험예에서 입증되고, 여기서, 3-아미노-1-프로판올은 DNA/RNA/PNA 캡쳐 분자를 고정화시키기 위하여 제 2 반응 단계에서 GOPTS-실란화 플랫폼의 표면 특성을 개질시키기 위하여 사용된다. 이 실험예에서, 플랫폼의 표면에 도입된 질소(아민 그룹)는 양성자에 의해 4급화되고, DNA(폴리전해물 성질)의 음전하와 상호작용하는 양전하를 제공한다. 3-아미노-1-프로판올대신에, 또한 아민의 다른 유도체, 예를 들어, 지방족 아민, 또는 측쇄 지방족 아민, 또는 방향족 또는 비-방향족 사이클릭 구조 또는 헤테로-원자를 함유하는 아민, 또는 작용기를 함유하는 아민, 또는 그들의 조합물을 함유하는 아민이 캡쳐 분자, 예를 들어 DNA/RNA/PNA 가닥의 고정화를 위해 사용될 수 있다.
플랫폼을 보다 소수성으로 만드는 탄화수소를 제공하는 기능화된 유기 분자가 사용될 수 있거나, 플랫폼을 보다 친수성으로 만들기 위해 극성 그룹이 사용될 수 있거나, 이온 그룹, 또는 잠재적인 이온 그룹이 전하를 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 그의 유도체가 플랫폼이 친수성이 되게 하는데에 사용될 수 있으며, 이는 단백질이 플랫폼/표면에 비-특이적 흡착하는 것을 방지한다.
추가의 반응 단계를 위한 앵커 그룹으로 작용할 수 있는 반응성 또는 광반응성 그룹이 플랫폼의 표면에 부착될 수 있다.
항체의 고정화에 적절한 접착 향상 층으로서 SAM이 플랫폼을 양친매성(amphiphilic) 알킬포스페이트(예를 들어, 스테아릴 포스페이트)로 처리하여 수득될 수 있다. 포스페이트 헤드 그룹은 플랫폼의 표면의 하이드록시 그룹과 반응하여, 양친매성 알킬포스페이트의 정렬된 모노층을 형성한다. 소수성 알킬 쇄는 플랫폼의 표면을 소수성으로 만들고, 따라서 실험예 6의 적용예(다중 면역 분석)에 나타난 바와 같은 항체의 물리흡착을 가능하게 한다.
SAM은 예를 들어 DNA/RNA/PNA 가닥 경우 다른 캡쳐 분자를 고정화하는데에 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, 예를 들어 양친매성 포스페이트/아민 그룹 또는 에폭시 그룹으로 개질된 포스페이트가 또한 사용될 수 있다. 캡쳐 분자는 직접적으로 SAM, 예를 들어 아민-개질된 SAM에, 또는 플랫폼이 아민의 유기 유도체, 예를 들어 지방족 아민, 또는 측쇄 지방족 아민 또는 방향족 또는 비-방향족 사이클릭 구조를 갖는 아민, 또는 헤테로 원자를 갖는 아민, 또는 작용기를 갖는 아민, 또는 이들의 조합물을 갖는 아민, 또는 다른 유기, 헤테로-유기, 및/또는 무기 분자(예를 들어 에폭시 개질된 SAM)와 반응한 후 결합할 수 있다.
흡착 향상 층은 표면 특성, 예를 들어 소수성, 접촉 각도, 전하 밀도를 조작하기 위해 다층으로 구성될 수 있다. 또한, 상기 언급된 어느 방법으로 플랫폼에 부착된 층은 다음의, 연속된 층에 요구되거나, 캡쳐 분자 또는 유도화된 캡쳐 분자의 결합에 요구되는 화학적 작용성을 제공하거나 도입할 수 있다. 화학적 링커 분자들 또는 광화학적 링커 분자들의 부착은 캡쳐 분자를 플랫폼에 부착시킬 수 있는 중간층으로서 또한 볼 수 있다.
층/상이한 작용성을 갖는 분자의 이 조절된 조합은 초분자 화학(J-M. Lehn, Supermolecular chemitry-Scope and perspectives. Molecules, supermolecules, and molecular devices,(Novel Lecture, 8.12.1987), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27, 89, 1998)에 기여한다. 수득된 초분자 구조는 개별 층에 사용된 개별 분자의 작용성과는 다른 작용성을 제공한다. 본 발명의 경우, 이러한 층 시스템에 또한 발광체를 도입할 수 있고, 이는 캡쳐 분자 또는 개질된 캡쳐 분자가 플랫폼에 부착되기 전에 형광 공명 에너지 전이(FRET) 또는 광유도된 전자 전달, 또는 잠재적 민감성 발광체의 센스에서 에너지 도너(energy dorner) 또는 에너지 어셉터/퀀처(acceptor/quencher)로서 사용될 수 있다.
상술한 표면 처리 방법의 경우, 다음의 유기 또는 무기 분자 및 그의 유도체가 사용될 수 있다:
아민, 개질된 아민, 제파민, 지방족 아민, 알콜, 산, 알데히드, 케톤, 아미드, 무수물, 포스페이트, 포스포네이트, 설페이트, 설포네이트, 티올, 헤테로-원자 함유 화합물, 방향족 및 지방족 유기 기능화된 분자, 방향족 및 지방족 헤테로-유기 분자, 천연 및 인위적인 중합체, 실란, 화학적 또는 광화학적 활성 그룹으로 개질된 분자, 그의 유도체 및 열거된 종의 기능화된 , 예를 들어 오메가-기능화된 유도체.
원칙적으로, 하나 또는 다층으로 구성되는 층 구조의 형성을 위해, 특별한 물리적 또는 전자 화학 성질(예를 들어, 전하)을 갖는 화학 반응성 그룹 및/또는 화학 그룹이 상술한 표면 처리를 한 사용된 분자에 요구된다.
화학적/광화학적 상호반응(예를 들어, 친핵성/친전자성 치환, 라디칼 반응, 축합, 유기/헤테로-유기/무기 카보닐 유도체, 또는 광유도된 반응, 루이스 산/염기 개념), 및/또는
물리적/전기 화학적 상호반응(예를 들어, 쿨롱-상호반응, 소수성/친수성 상호반응) 및/또는
생물학적 상호반응(예를 들어, 항원/항체, 혼성화, 스트렙타비딘/아비딘-비오틴 상호 반응, 작용제/길항제 상호 반응), 및/또는
광화학적/광물리적 상호 반응이 이러한 층 시스템/접착 촉진층에 혼입된 분자/성분들 사이의 커플링에 이용될 수 있다.
접착 촉진은 미세다공성 층 또는 겔을 플랫폼의 표면에 침착시킴으로써 또한 달성할 수 있고, 캡쳐 요소의 침착을 용이하게 하는 미세다공성 층 또는 겔의 표면 특성/작용성은 원하는 인큐베이션 시간을 단축시키고 추후 측정의 민감도를 향상시킨다. 미세다공성 층은 중합체, 단량체, 분자 어셈블리 및 초 분자 어셈블리와 같은 유기 화합물을 포함할 수 있거나, 이는 유리, 석영, 세라믹, 실리콘 및 반도체와 같은 무기 화합물을 포함할 수 있다.
접착 촉진층은 실란화, 예를 들어 3-(글리시독시프로필)트리메톡실란(GOPTS)를 사용하여 제조될 수 있다. 접착 촉진층은 표면 성질을 변경하기 위하여 추가로 화학적으로 개질될 수 있다. 예를 들어, GOPTS-실란화 플랫폼을 플랫폼의 소수성/친수성 균형을 조작하여, 플랫폼의 접촉 각을 변경시키기 위하여 기능화된 포화 또는 불포화 유기 분자와 반응시킬 수 있다.
일단 접착 촉진층이 플랫폼에 형성되면, 추가의 세정 단계 또는 단계들이 이러한 층의 제조에 사용되는 과량의 화학물질을 제거하기 위하여 필요할 수 있다. 세정후, 플랫폼은 캡쳐 요소를 받을 준비가 된다.
캡쳐 또는 인식 요소의 2차원적 어레이가 플랫폼에 미리 침착된 접착 촉진층의 3-D 표면에 형성된다. 캡쳐 요소의 어레이는 다양한 방법으로 침착될 수 있다. 캡쳐 요소를 침착시키는 데에 사용될 수 있는 기술은 압전(piezoelectric) 액추에이터, 전자기 액추에이터, 압력/솔레노이드 밸브 액추에이터 또는 다른 포스(force) 트랜스듀서를 갖는 잉크 제트 프린터; 열전기 액추에이터를 사용하는 버블 제트 프린터; 핀 툴-스포터(pin tool-spotters); WO90/03382 또는 WO92/10092에 기술된 바와 같은 온-칩 합성(On-chip synthesis; WO98/27430에 기술된 바와 같은 대규모의 고정화 중합체 합성(VLSIPS); 접착 촉진층의 표면에 고정된 특별한 설계 광반응성 그룹의 광활성화/광탈보호; 미세 접촉 프린팅; 미세접촉 라이팅(writing) 펜; 드로잉 펜 또는 패드 트랜스퍼/캡쳐 요소의 스탬핑; PMMA 마스터와 같은 중합체로부터 캐스팅하여, 예를 들어 PDMS(폴리디메톡시실란)을 사용하여 또는 미세기계적 또는 기계적 수단에 의해 만들어진, 또는 캡쳐 요소(capture elements)의 국소적 전달을 위한 에칭 기술에 의해 만들어진 미세플류딕(microfluidics) 채널 및 플로우셀; 포토어블레이션에 의한 캡쳐 요소의 구성; 또는 앞서 언급된 기술의 하나 또는 다른 광고정화 기술을 사용하여 캡쳐 요소를 겔 패드에 침착하는 것을 포함한다.
플랫폼에 침착될 수 있는 캡쳐 또는 인식 요소는 많고, 변화될 수 있다. 일반적으로 말해서, 사용되는 캡쳐 분자는 친화성 반응을 할 수 있어야 한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 인식 또는 캡쳐 분자의 예는 다음과 같다:
뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드( 및 그의 화학적 유도체)
DNA(이중 가닥 또는 단일 가닥) a) 선형( 및 그의 화학적 유도체)
b) 환형( 플라스미드, 코스미
드, BACs, YACs)
총 RNA, 메신저 RNA, cRNA, 미토콘드리얼 RNA, 인공 RNA, 아프타머
PNA(펩타이드 핵산), 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 조작된 항체, 항원, 합텐, 항체 FAB 서브유니트(필요하다면 개질), 단백질, 개질된 단백질, 효소, 효소 코팩터 또는 억제제, 단백질 복합체, 렉틴, 히스티딘 표지된 단백질, 히스티딘-태그 성분용 킬레이터(HIS-태그), 태그된 단백질, 인공 항체, 분자 임프린트(imprints), 플라스티바디, 막 수용체, 완전 세포, 세포 단편 및 세포 서브 구조, 시냅스, 작용제/길항제, 세포, 세포 기관(organelles), 마이크로좀, 벤조디아제핀, 프로스타글란딘, 항생제, 약제, 대사체, 약제 대사체, 천연 생성물, 탄수화물 및 유도체, 천연 및 인공 리간드, 스테로이드, 호르몬, 펩타이드, 천연 또는 인공 중합체, 분자 프로브, 천연 및 인공 수용체 및 그의 화학적 유도체, 킬레이팅제, 크라운 에테르, 리간드, 초분자 어셈블리, 인디케이터(pH, 전위, 막 전위, 산화환원 전위), 조직 샘플(조직 마이크로 어레이).
캡쳐 분자의 활성도 또는 밀도가 다양한 방법으로 최적화될 수 있다. 캡쳐 요소가 침착된 플랫폼은 프린트된 유전자좌(loci)를 재 수화(rehydrate)하기 위하여 한정된 기간 동안 포화수증기 분위기에서 배양될 수 있다. 이는 캡쳐 분자의 밀도를 최적화하고, 즉, 단위 면적당 이용될 수 있는 결합 부위를 증가시킨다. 이어서, 배양된 칩을 한정된 기간동안, 즉 cDNA 캡쳐 분자 경우 80℃에서 1분동안 베이킹(baked) 시킬 수 있다. 과량의 비결합된 물질에 의한 캡쳐 요소의 교차 오염을 피하기 위하여 플랫폼을 소량의 순수 물 또는 어떤 다른 적절한 액체 또는 용액으로 습식에 의해 세척할 수 있다. 이들 과정후, 제조된 플랫폼을 사용할 때 까지 데시케이터안에 저장할 수 있다. 칩을 사용하기 전, 0.1 내지 10 ml 혼성화 버퍼 또는 다른 적절한 용액/액체로 세척하는 추가의 과정이 건조된 캡쳐 요소를 재활성화/재 수화하기 위해, 그리고 과량의 비결합된 캡쳐 요소/버퍼 잔류물을 추가로 제거하기 위하여 요구될 수 있다. DNA 캡쳐 분자 경우, 세척 과정은 50 내지 85℃의 온도에서 수행될 때 가장 효과적임이 밝혀졌다.
칩 취급을 위한 공정 단계는 예를 들어, 미국 미시간 게노믹 솔루션 인크.사의 GeneTAC 혼성화 스테이션과 같은 혼성화 스테이션을 이용함으로서 자동화될 수 있다.
설명될 특정 측정 기술은 발광, 특히 형광을 수반하는 것이다. 측정 수행 동안에, 검사될 샘플은 캡쳐 요소들이 제공된 플랫폼의 센싱 영역 상에 위치한다. 형광을 얻기 위하여 측정이 진행되기 전에 형광체가 시스템에 첨가된다. 형광체를 플랫폼 상의 캡쳐 요소들에 부착하는 것이 가능할지라도, 형광체가 예를 들어 표지된 친화성 파트너들과 같은 샘플에 첨가될 수 있다. 측정은 표지된 캡쳐 분자들을 포함하는 캡쳐 요소들로부터 그리고/또는 표지된 친화성 파트너들로부터의 형광성 발산이 검사 중인 분석물 또는 샘플과의 상호 작용에 의하여 변경된다는 사실에 기초한다. 상이한 여기 및 발산 파장의 표지들이 사용될 수 있으며, 하나 또는 복수개의 상이한 표지들이 있고, 표지 1은 제어 실험을 위한 것이며, 표지 2는 실험을 위한 것이다.
도 3은 공명 위치에서의 이버네센트 필드의 에너지 프로필과 금속 산화층(32)의 표면을 지나 어떻게 연장되어 센싱 영역의 표면 근처의 형광체, 예를 들어 캡쳐 분자들에 부착된 형광체들 또는 캡쳐 분자들(38)에 결합된 분자들에 부착된 형광체들을 여기시킬 수 있는가를 개략적으로 도시한다. 이버네센트 필드는 약 1미크론 내에서 0으로 기하급수적으로 감소한다.
분석을 수행하는데 있어서, 하나 또는 복수개의 측정들이 이루어진다는 것이 이해될 것이다. 샘플이 캡쳐 요소들과 접촉하기 전에, 하나의 측정은 기초 측정이 될 수 있다. 제 2 측정은 샘플이 캡쳐 요소들과 접촉 상태에 들어감과 동시에 또는 그 후에 이루어질 수 있다. 복수개의 샘플들, 예를 들어, 유전자 발현 실험들에서의 "제어" 및 "처리된" 샘플의 비교를 위하여, 적용예 2 내에서 설명된 바와 같은 "제어" 실험 후에 칩은 재생될 수 있으며, "처리된" 샘플이 칩에 부착된 후/동시에 다른 기초 측정 및 측정이 등록될 수 있다. 친화성 파트너들의 반응 운동 에너지와 관련한 정보를 얻기 위하여, 완전한 측정 세트가 배양 시간 및/또는 세척 후 시간의 함수로서 기록될 수 있다. 이러한 측정을 위한 일반적인 장치가 도 6에 도시된다. 도 2에 도시된 플랫폼은 이버네센트 공명이 이루어지는 각도에 따라 조정되며, 플랫폼의 표면으로부터 발산된 형광의 측정은 CCD 카메라(66)를 이용하여 이루어진다. 이것은 플랫폼 상에 증착된 캡쳐 요소들의 배열 상의 각 위치로부터 발산된 형광의 입사를 제공한다. 이것은 검사 중의 캡쳐 요소들과 샘플 간에 나타나는 반응들의 친화성을 추론하기 위하여 분석될 수 있다.
도 6에 도시된 바와 같은 장치는 전체 발광, 예를 들어, 형광, 측정 동안에 어떠한 이동 부품들의 필요없이 하나의 사진(shot)에서 전체 플랫폼의 이미지를 캡쳐한다. 이러한 비 스캐닝 장치는 매우 간단하고 저가일 수 있으며, 특히 현장 치료 제품(point-of care application) 또는 휴대용 시스템에 적합하다. 다른 일반적인 장치는 광학 요소들에 의하여 간섭성 레이저 광을 마이크로미터 규격으로 낮추어 제한하며, 그로 인하여 초점 내의 전기장이 증가되며 센싱 지역 또는 센싱 지역들을 스캐닝한다.
본 기술을 이용하여 광범위한 다양한 샘플들이 분석될 수 있다. 샘플은 일반적으로 분석될 전체 용액이 되도록 선택되며, 이것은 검출되는 하나 또는 많은 물질들을 포함할 수 있다. 샘플은 순수화 및 처리된 조직의 용액, 또는 진단 목적을 위한 샘플을 포함하는, 조직현미경 검사(biospy) 및 시험검사 연구 및 개발로부터 얻어진 다른 물질들일 수 있다. 샘플은 또한 계란 난황과 같은 생물학적 매체, 혈액, 혈청 및 소변과 같은 신체 분비액 및 그 성분일 수 있다. 샘플은 또한 표층수, 용액 또는 토양 또는 식물의 일부와 같은 자연 또는 합성 매체로부터의 추출물, 생물학적으로 처리한 액체 또는 합성 액체일 수 있다.
측정을 실행하기 위하여, 샘플은 도면의 도 4a 및 도 4b에 도시된 형태의 샘플 셀(cell) 내에 도입될 수 있다. 이 셀은 PMMA와 같은 중합체로부터 만들어진 하우징(41)을 포함한다. 이 중합체는 플랫폼의 규격들에 대응하는 규격들을 갖는 중앙 격실(44)을 정의하도록 가공된다. 오-링(47)에 의하여 그 엣지 주변이 실링된 챔버(46)를 정의하도록 격실(44) 내에 다른 함몰부가 형성된다. 챔버(46)는 그 상부 및 하부가 개방되어 있다. 분석될 용액이 흐름 라인(45)을 통하여 오-링(47) 내의 챔버(46) 내로 유입된다. 흐름 라인(45) 내에서의 흐름은 밸브들(43)에 의하여 제어될 수 있다. 셀의 상부를 밀폐하기 위하여 셀은, 하우징(41) 위에 위치하여 하우징에 고정될 수 있는 커버(49)를 포함한다. 커버(49)는 격실(46) 상에 위치한 윈도우(50)를 포함하며, 그로 인하여 커버를 통해 셀(46) 내로 통과하는 방사를 허용한다.
셀의 사용에서, 하우징(41)은 플랫폼의 표면 상에 형성된 캡쳐 요소들을 갖는 플랫폼의 표면에 대응되게 위치하여 리드(49; lid)가 표면으로부터 이격되도록 한다. 이는 격실(46)을 플랫폼의 센싱 지역과 연통되도록 한다. 그 후 검사될 샘플은 흐름 라인(45)을 통하여 격실(46) 내로 공급되어 플랫폼의 표면 상의 캡쳐 요소들과 접촉 상태가 된다. 그 후 다양한 캡쳐 포인트들에서 야기된 형광의 측정이 전에 설명한 바와 같이 실행된다.
도 8은 플랫폼의 가능한 대안적인 형태를 도시한다.
센싱 요소들은 다양한 방법들, 예를 들어 사각형, 원형, 육각형(hexagonal-centric), 타원형, 선형 또는 미로형으로 배열될 수 있다. 센싱 지역은 사각형, 원형 또는 어떠한 다른 형태일 수 있다. 홈들은 등거리 선형 또는 등거리 원형으로 배열될 수 있으며, 또는 이러한 구조체들의 부분들에 대응할 수 있다.
플랫폼은 사각형 또는 디스크형 또는 어떤 다른 형태일 수 있다. 플랫폼은 하나 또는 복수개의 센싱 지역들을 포함할 수 있으며, 각 센싱 지역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 포함할 수 있으며, 각 캡쳐 요소는 하나 또는 복수개의 표지된 또는 비표지된 캡쳐 분자들을 포함할 수 있다.
개별 마이크로티터 웰들 내에서 하나 또는 복수개의 분석을 수행하기 위하여 플랫폼은 미이크로티터형 플레이트/장치에 적합할 수도 있다. 각 마이크로티터 플레이트의 규격들에 관계없이, 이는 96, 384, 1536 또는 더 많은 수의 웰들의 모든 플레이트 형태들을 위하여 이루어질 수 있다.
다음은 플랫폼의 특정한 예이다.
1. 3-D 플랫폼의 물리적 성능: 비정상적 반사
1a. 플랫폼 1
유전자 칩 트랜스듀서 플랫폼은 0.7 mm 두께의 평면, 투명한 기판(Schott에 의한 유리 AF45)을 포함한다. 기판에 주기적인 표면 구조체가 포토리소그래피컬 수단에 의해 에칭된다(포토레지스트의 침착, <1 ㎛; 두 개의 빔 간섭법/레이저 사진술 어느 것에 의한 레지스트에 주기적인 구조체의 라이팅(writing); 레지스트를 Ar 가스를 이용한 반응성 이온 에칭에 의해 에칭; 잔류 포토레지스트의 박리).
표면 구조체의 형상들은 싸인 곡선(sinusodial)에 가깝다. 단일 구조체의 폭(피치)는 360 nm이다. 홈들의 깊이는 대략 38 nm이다.
균질하게 구성된 유리 표면의 상부에, 633 nm 파장에서 대략 2.2의 높은 굴절률을 갖는 유전체 투명 금속 산화물 필름(Ta2O5)이 침착된다. 공정은 이온 도금 공정에 의한 것이다. 층 두께는 130 nm이다. 유리 표면의 주된 구조/구성은 매우 강력하고 이방성(anisotropic) 침착 공정으로 인하여 금속 산화물층의 상부로 전사된다.
매우 평행하고, 확장된 간섭성 레이저 빔이, 소위 공명 위치에 상응하는, 다른 각도들 θ로 트랜스듀서로 유도될 때, 거의 모든 광은 트랜스듀서 플랫폼에 의해 반사되고, 0.차 전달 강도는 1% 미만(임의의 각도에서의 90-95%와 비교됨)으로 감소된다.
거의 모든 광이 반사되는 공명 조건의 폭 △θ는 파장 λ(633 nm, 고정됨) 및 방사 손실 계수(α)에 비례한다. 방사 손실 계수는 파형 구조체의, 격자 홈들의 깊이, 형상 및 듀티 사이클에 의해 좌우되며, 홈 깊이들이 증가함에 따라 거의 2차곡선으로 증가한다. 본 경우(레이저 파장 633 nm, 130 nm 금속 산화물층, 38 nm 홈 깊이)에 대하여, 방사 손실은 대략 2000/cm이다. 즉, 주기적 구조체에 의해 플랫폼으로부터 회절되기 전에, 이러한 층 시스템에서의 유도된 레이저 빔의 전파 거리는 1/2000cm = 5㎛이다. 이는 매우 짧은 거리이다. 그러므로, 이들 조건들 하에서는 어떤 도파(waveguiding)도 일어나지 않는다. 플랫폼 규격들을 세밀화함으로서 전파 거리를 더 감소시킬 수 있다.
공명 효과를 특성화하기 위하여, 평행 빔의 강도(TE 편광화)가 4 mm 직경 지역에 대하여 100μW로 조정된다(power meter Newport NRC 1835). 플랫폼의 수직과 입사 빔 사이의 각은 비정상적 반사의 중심 위치로부터 1 내지 2도 회전된다(공명조건). 중심 위치는 2.5°이다. 이어서 플랫폼은 5/1000°단계로 회전되고(Newport NRC 콘트롤러 PM 500), 전달된 빔의 파워의 변화가 모니터된다. 공명 각도에서, 본래 전달된 빔의 1% 미만(<1μW)이 검출기에 도달된다. 입사 레이저 빔의 파워는 완전히 반사된다(거울같이 반사된 빔: 대략 100%).
비정상적 반사에 대한 반치폭(FWHM)은 본 경우 0.9°이다. 전체 트랜스듀서 표면(18 mm x 18 mm)에 대한 반사의 균일성은 90%보다 양호하다.
1b 플랫폼 2
표면 구조체의 형상들은 직사각형에 가깝다. 단일 구조체의 폭(피치)은 360 nm이다. 홈들의 깊이는 대략 52 nm이다. 균일하게 구성된 유리 표면의 상부에 633 nm 파장에서 대략 2.15의 높은 굴절률을 갖는 유전체 투명 금속 산화물 필름(Ta205)이 침착된다. 공정은 스퍼터링(sputtering)에 의해 진행된다. 층 두께는 150 nm이다. 유리 표면의 주된 구조/구성은 매우 강력하고 이방성(anisotropic) 침착 방법에 의해 금속 산화물층의 상부로 전사된다.
매우 평행한, 확장된, 간섭성 레이저 빔이, 공명 위치에 상응하는, 다른 각도들 θ로 트랜스듀서로 유도될 때, 거의 모든 광은 트랜스듀서 플랫폼에 의해 반사되고, 0.차 전달 강도는 1% 미만(임의의 각에서의 90-95%에 비교됨)으로 감소된다.
거의 모든 광이 반사되는 공명 조건의 폭 △θ는 방사 손실 계수(α)에 비례한다. 본 경우(레이저 파장 633 nm, 150 nm 금속 산화물층, 52 nm 홈 깊이)에 대하여, 방사 손실은 대략 2000/cm보다 크다. 즉, 주기적 구조체에 의해 플랫폼으로부터 회절되기 전에, 이러한 층 시스템으로 들어간 광의 전파 거리는 1/2000= 5㎛이다. 그러므로, 이들 조건들 하에서는 어떤 도파도 일어나지 않는다.
공명 효과를 특성화하기 위하여, 평행 빔의 강도(TE 편광화)가 4 mm 직경 지역에 대하여 600μW로 조정된다(power meter Newport NRC 1835). 플랫폼의 수직과 입사 빔 사이의 각도는 수직 입사로부터 4도 회전된다. 이어서 플랫폼은 5/1000°단계로 회전되고(Newport NRC 콘트롤러 PM 500), 전달된 빔의 파워의 변화가 모니터된다. 공명 각도에서, 본래 전달된 빔의 0.5% 미만(<3μW)이 검출기에 도달된다. 입사 레이저 빔의 파워는 완전히 반사된다(거울같이 반사된 빔: 대략 100%).
플랫폼 1에 비해서 보다 깊은 홈들에 따른 플랫폼 2의 공명 폭의 넓힘에 기인하여 + 1 및 -1 회절 차수의 공명 곡선들은 수직 입사에 정확히 위치하는 단일의 매우 넓은 공명을 생성하면서 오버랩된다. 비정상적 반사에 대한 공명의 반치폭(FWHM)은 본 경우에서 4.2°이다. 전체 트랜스듀서 표면(18 mm x 18 mm)에 대한 반사의 균일성은 95%보다 양호하다.
2. 유전자 발현 분석을 위한 실험예
a) 제조
도 2를 참고로 하여 기술된 형태의 센서 플랫폼들(치수 18x18 mm2)을 각각 15분 동안 클로로포름(FLUKA, "puriss")중에서 먼저 2회 초음파처리하고, 이어서 이소프로판올(Merck, "Uvasol")중에서 2회 초음파 처리하였다. 이어서 플랫폼을 진공에서 건조시키고, UV 클리너에서 30분 세정하였다(Boeckel industries Inc, 모델 135500). O-크실렌을 75℃(교반하면서)로 가열하였고, 0.2% v/v N-에틸디이소프로필아민(Fluka, "purum") 뿐만 아니라 2% v/v 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란(Fluka, "purum")을 가열된 용매(교반하면서)에 첨가하였다. 플랫폼들을 선반에 탑재시키고, 75℃(교반하면서)에서 용액 중에 7시간 동안(교반하면서) 배양했다. 이어서, 플랫폼들을 각각 15분 동안 새로운 아세토니트릴(Fluka, "HPLC 급)중에서 3회 초음파 처리하였다. 이어서, 플랫폼들을 아세토니트릴 중의 2% v/v 3-아미노-1-프로판올(Fluka, "purum")의 용액중에서 15분동안 초음파 처리하고, 동일한 용액중에서 실온에서(교반하면서) 밤새 배양했다. 다음날, 플랫폼들을 먼저 새로운 이소프로판올(Fluka, "HPLC 급")중에서 15분 동안 3회 초음파처리하고, 이어서 새로운 메탄올(Merck, "Uvasol")중에서 15분 동안 3회 초음파 처리하였다. 마지막으로, 플랫폼들을 진공에서 건조시키고 저장하였다.
b) 인식 요소들의 고정(immobilization)
10개의 상이한 cDNA(각 cDNA는 10회 복제물: CYP450 1A1, CYP 450 2B1 EST., CYP 450 2B1, CYP 450 3A1 인간, CYP 450 3A2, CYP 450 4A1, β-액틴, GAPDH, 외부 표준물)로 구성된 어레이들을 잉크-제트 프린터(Microdrop GmbH, Norderstedt, Germany)로 플랫폼 상에 프린트하였다. cDNA 용액의 농도는 50 ng/μL이었다. 직경(10 잉크-제트 방울들/위치)은 약 250㎛ 이고, 스폿들의 피치는 약 500 ㎛ 이었다. 그러므로, 10 x 10 어레이들의 전체 치수는 약 5x5 mm2이었다. 고정된 cDNA 스폿의 설계 및 배정이 도 5에 개략적으로 도시된다. 어레이들은 치수들(18x18mm2)을 갖는 플랫폼들의 중심에 프린트되었다. 이어서, 플랫폼들을 밀페된 용기에서, 포화 수증기 분위기에서 밤새 배양시켰다. 다음날, 배양된 칩들을 한정된 기간동안, 즉 80℃에서 1 분간 베이킹할 수 있다. 이어서, 플랫폼에 탈이온수를 넘치게하고, 질소 흐름으로 건조시켰다.
c) 검출 기구
사용된 검출 기구가 도 6에 개략적으로 도시된다. 여기 레이저(61; HeNe 레이저, 633 nm, 1.3 mW) 및 20x 빔 익스팬더(64; expender))를 고니오미터(63; goniometer)에 결합하여 탑재하였다. 이색성의(dichroic) 거울(68)에 의해 확장된 레이저 빔이 플랫폼(67)을 향하도록 유도되었다. 레이저 빔에 대한 회전 중심은 플랫폼(67)의 금속 산화물층의 평면에 있다. 플랫폼 표면으로부터 방출되는 형광은 이색성의 거울(68)을 통해 모아졌다. 추가적인 형광 필터들(65)이 여기 광으로부터의 형광(69)을 분리하기 위하여 사용되었다. Nikon Noct 렌즈(개구수(Numerical Apeture) 1.2)가 장치된 냉각된 CCD(Astrocam EEV 30/11) 카메라를 표면 플랫폼들로부터의 형광 영상을 측정하기 위하여 사용하였다. 고니오미터는 플랫폼의 표면의 수직에 대한, 입사된 확장 레이저 빔의 각도를 조정하는 것을 가능하게 한다. 이버네센트 공명 조건 하에서 형광 영상들이 얻어진다(즉, 입사 확장된 레이저 빔이 플랫폼을 통해 전달된 광이 최소를 나타내는 각도로 조정되었다).
(d) 칩 카트리지
플랫폼을 도 4에 개략적으로 나타낸 PMMA/중합체로 만들어진 특별히 설계된 카트리지(41)에 탑재하였다. 함몰부(44; depression)는 (18x18x0.7mm3)의 치수를 갖고, 인큐베이션 챔버(46)는 0.2 mm 깊이이다. 인큐베이션 챔버중의 용액은 PMMA로 드릴된(drilled) 0.5 mm 직경의 유동 채널(45)을 통해 교환되었다. 카트리지의 내용물은 유입구/출구(42)를 통해 교환되었다. 플랫폼을 센싱 지역이 인큐베이션 챔버쪽으로 향하게 하여 카트리지의 상응하는 함몰부에 위치시켰다. 커버(49)를 고정하고 씰링을 대비하여 플랫폼을 가압하였다. 커버에 있는 밀링된/미세 가공된 창(window; 50)을 여기 광으로 조사하고, 플랫폼 표면의 형광 영상을 얻는 것을 가능하게 한다. 카트리지의 밸브 대 밸브 부피는 약 14μL 이었다.
e) 변성 유니트
열전기 요소를 유동 카트리지 내의 플랫폼의 변성(79℃), 배양(42℃), 재생(79℃) 및 세척(42℃)을 위한 온도를 조절하기 위하여 사용하였다.
f) 샘플 제조
2개 그룹(각 3 마리의 래트)을 본 연구를 위해 사용하였다. 한 그룹(처리된)을 체중 kg당 염수(0.9% w/v NaCl)중의 80mg 페노바르비탈, 소듐염으로 처리하고, 제 2 그룹(대조군)은 0.9% NaCl로만 처리하였다. 4일동안 하루 한번씩 처리를 하였다. 4일 종료시, 실험 동물로부터 취득한 간 샘플을 액체 질소에서 급히 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
이어서, 총 RNA/mRNA를 분리하고, 제 1 가닥 cDNA로 역전사에 의해 표지화시키고(표지된 데옥시뉴클레오타이드의 혼입, 대조군 및 처리군용 동일하거나 상이한 형광체 라벨), 정제하며, 20 μL 혼성화 버퍼에 용해시켰다.
g) 분석 공정
Cavro 스테퍼 주사기를 카트리지에 버퍼 및 용액을 펌핑/아스피레이팅하기위하여 사용하였다. 하기 단계를 래트에서 CYP 450 유도를 측정하기 위하여 실행하였다:
1) 79℃에서 1 ml 혼성화 버퍼(HB)로 79℃에서 30분간 예비-세척, HB와 접촉하고 있는 플랫폼의 백그라운드 1을 측정.
2) "대조군" 샘플을 카트리지에 주입, 79℃에서 30분 변성, 이어서 42℃에서 밤새 인큐베이션.
3) 42℃에서 1 mL HB로 10분 사후 세척, HB와 접촉하고 있는 플랫폼의 "대조군" 강도의 측정.
4) 재생: 1 mL 혼성화 버퍼(HB)로 79℃에서 30분 세척, HB와 접촉하고 있는 플렛폼의 백그라운드 2의 측정.
5) "처리된" 샘플을 카트리지에 주사, 79℃에서 30분 변성, 이어서 42℃에서 밤새 인큐베이션.
6) 42℃에서 1 mL HB로 10분 사후 세척, HB와 접촉하고 있는 플랫폼의 "처리 군" 강도의 측정.
모든 형광 영상을 이버네센트 공명 조건하에서 측정하였다.
h) 데이터 처리
모든 스폿의 순수 강도(처리군-백그라운드 1 및 처리군-백그라운드 2)를 계산하고, 처리된 데이터 세트의 모든 강도를 외부 표준물의 강도의 도움으로 표준화하였다. 각각의 유전자사이의 발현 비(배 변화, fold change)를 배 변화=표준화된 것/처리된 것/대조군의 디비젼(division)으로 계산하였다.
각 10개 복제물의 평균 값을 계산하였다.
i) 결과
이버네센트 공명 조건하에서 측정된 ER-칩은 일반적으로 100 배 강한 강도 및 개선된 시그날/백그라운드 비를 보였다.
배 변화에 대한 평균 값을 하기 표에 요약한다:
3. 향상된 증폭을 예시하는 실험예
플랫폼을 제조하고, 기술된 실험예에 따라 처리하였다. 이어서 샘플 2와 함게 인큐베이션하고, 도 6을 참고로 하여 위에서 설명된 CCD 카메라 검출 기구로 2개의 영상을 얻었다. 제 1 영상은 이버네센트 공명을 위한 조건으로 조정함이 없이 에피형광(epifluorescence) 방식으로 얻었다(도 7a에서의 "에피형광"). 제 2 영상은 이버네센트 공명 조건(도 7b에서의 "ER 향상)하에서 얻었다. 즉, 입사 레이저 빔의 각도를 칩을 통해 전달된 광이 최소를 나타낼 때 까지 표면 법선에 대해 조정하였다. 영상 특성(네트 시그날)은 ER-증강에 의해 측정된 강도가 통상적인 에피형광에 의해 얻어진 강도보다 약 100배 강하다는 것을 나타낸다.
상술한 실험예에서, 단일 샘플 셀(41)은 샘플을 플랫폼의 센싱 지역과 접촉시키는데에 사용한다. 마이크로티터형 샘플 용기가 복수개의 센싱 지역을 갖는 플랫폼을 보충하여 사용되어 복수개의 샘플을 측정하고, 이에 의해 측정 효율을 개선하는 것을 가능하게 된다는 것이 이해될 것이다.
4. 단일 뉴크레오타이드 폴리몰피즘(SNP)의 분별을 위한 올리고뉴클레오타이드 마이크로칩
a. 칩 제조
도 2를 참고로 하여 설명된 유형의 센서 플렛폼(치수 18x18 mm2) 각각 15분동안 클로로포름(FLUKA, "puriss")에서 먼저 2회 초음파처리하고, 이어서 이소프로판올(Merck, "Uvasol")중에서 2회 초음파 처리하였다. 이어서 플랫폼을 진공에서 건조시키고, UV 클리너에서 30분 세정하였다(Boeckel industries Inc, 모델 135500). O-크실렌을 75℃(교반하면서)로 가열하고, 2% v/v 3-글리시독시프로필 트리메톡시실란(Fluka, "purum") 및 0.2% v/v N-에틸디이소프로필아민(Fluka, "purum")을 가열된 용매(교반하면서)에 첨가하였다. 플랫폼을 선반에 탑재시키고, 75℃(교반하면서)의 용액중에서 7시간동안(교반하면서) 인큐베이션했다. 이어서, 플랫폼을 각각 15분동안 새로운 아세토니트릴(Fluka, "HPLC 급")에서 3회 초음파 처리하였다. 마지막으로, 플랫폼을 진공하에서 건조시키고 저장하였다.
b. 캡쳐 요소의 고정
두 개의 상이한 아미노-개질된 올리고뉴클레오타이드(캡쳐 프로브)를 체커보드형 설계(5x5 스폿)중에서 실란화된 플랫폼에 프린트하였다. GMS 417 환-핀 배열기를 프린팅을 위하여 사용하였다(Genetic Microsystems, Boston, MA). 캡쳐 분자로서 사용된 올리고뉴클레오타이드의 농도는 100 nmol/ml이다. 스폿의 직경은 125 마이크로미터이고, 중심 대 중심 거리는 500 마이크로미터이다. 2개의 올리고뉴클레오타이드를 cPM("캡쳐 완전 매치") 및 cMM("캡쳐 미스매치")이라고 부르고, 오직 한 염기에서만 다르다:
cPM:3'CACAATTCCACA5'-NH2
cMM:3'CACAACTCCACA5'-NH2
cPM 및 cMM은 올리고뉴클레오타이드가 에폭시-기능화된 플랫폼에 공유결합 시킬 수 있는 5' 말단의 아미노 그룹으로 표지화했다. 배열은 치수(18x18 mm2)의 플랫폼의 중심에 프린트된다. 이어서, 플랫폼을 포화 수증기 분위기에서 밀폐된 용기에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 칩을 건조시키고, 1 ml의 50% 우레아 수용액으로 세척했다. 대안적으로는, 수성 소 혈청 알부민 용액(BSA, 1 mg/ml)을 사용하였다. 블로킹후, 칩에 탈이온수를 흘러넘치게 하고, 이어서 질소 흐름으로 건조시켰다.
c. 검출 기구
선행 실험예에서 기술된 CCD 기구를 사용하였다.
d. 칩 카트리지
선행 실험예에서 기술된 카트리지를 사용하였다.
e. 분석물/샘플
고정화된 캡쳐 올리고뉴클레오타이드 cPM 및 cMM에 상보성인 서열을 갖는 PM("완전한 매치") 및 MM("미스매치")라고 불리는 두 개의 Cy5-표지된 올리고뉴클레오타이드를 분석물로서 사용하였다:
PM: Cy5-5'GTGTTAAGGTGT3'
MM: Cy5-5'GTGTTGAGGTGT3'
분석물 용액의 농도는 각각 30 pM이었다.
f. 분석 과정
플랫폼을 세척사이에 1 분간 지연을 두면서 혼성화 버퍼(HB) 1 ml로 2회 세척하였다. 이어서 약 15 마이크로티터 PM 분석물 용액(30 pM)을 유동 카트리지에 주입하였다. 30분 동안 인큐베이션후, 플랫폼을 1 ml의 HB로 세척하고, 형광 영상(도 9a의 "PM")을 칩의 공명 위치에서 얻었다. 이어서 결합된 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 주입사이에 2분간 지연을 두어 2x1 ml의 50% 우레아 수용액을 주입하여 제거하였다(스트립트, stripped). 추가의 2분후, 칩을 주입사이에 2분간의 지연을 두면서 2x1 ml HB를 주입하여 세척하고, 형광 영상("도 9b에서의 "재생")을 칩의 공명 위치에서 얻었다. 마지막으로, 대략 30분의 인큐베이션후, 플랫폼을 1 ml의 HB로 다시 세척하고, 형광 영상(도 9c의 "MM")을 칩의 공명 위치에서 얻었다. 모든 단계는 실온에서 수행하였다.
g. 데이터 처리
캡쳐 스폿의 2개의 상이한 그룹(cPM 및 cMM)의 평균 강도를 양 실험(30 pM PM 분석물 및 30 pM MM 분석물의 인큐베이션)에 대해 계산하였다. 또한 평균 강도 cPM-cMM의 차이 및 비 cPM/cMM를 계산하였다.
h. 결과
계산된 모든 데이터를 하기 표에 요약하였다. 한 염기(SNP)에서만 차이가 있는 두 개의 올리고뉴크레오타이드 분석물, Cy-5 표지된 PM 및 Cy-5 표지된 MM은 얻어진 데이터로부터 분명히 구별될 수 있다.
5. 항체 면역 분석에 대한 실험예
1차 항체를 센서 플랫폼의 표면에 공간적으로 분해하여 고정화시켰다(예를 들어 체커보드 패턴). 검출하려는 항원 및 발광-표지된 2차 항체(검출하려는 개별 항원의 제 2 에피토프를 검출하기 위하여 사용된)의 결합은 이어서 먼저 다양한 농도의 다양한 항원을 함유하는 분석물과, 이어서 발광 표지된 2차 항체와 배양함으로써 달성한다.
대안적으로는, 항원(분석물) 및 발광-표지된 제 2 항체를 예비 인큐베이션 단계에서 혼합할 수 있고, 이는 발광 표지된 제 2 항체와 항원의 복합화를 허용한다. 이 예비-인큐베이션 단계후, 센서 플랫폼 표면을 혼합물과 함께 인큐베이션한다.
표면에 결합된 발광 표지된-면역 복합체를 ER-셋업으로 정량화했다(적절한 버퍼로 예비-세척, PBS, 및 필요한 경우 사후 세척을 한다.)
6. 다중 면역 분석용 단백질-마이크로 칩
a. 칩 제조
상기된 유형의 센서 플랫폼(18x18 mm2)을 각각 15분동안 클로로포름에서(FLUKA, "purriss") 2회 초음파 처리하고, 이어서 이소프로판올에서(Merck, "Uvasol") 2회 초음파 처리했다. 플랫폼을 진공에서 건조시키고 30분 동안 세정했다(Boeckel Industries Inc, model 135500). 칩을 작은 용기에 위치시키고, 프로판올중의 0.5 mMolar 옥타데실포스페이트 용액중에 저장하였다. 이어서, 과량의 알킬 포스페이트를 제거하기 위하여 칩을 5 ml 이소프로판올로 세척하고, 질소 흐름에서 건조시켰다. 이 과정은 플랫폼의 표면에 알킬포스페이트의 자가-회합된-단일층(Self-Assembled-Monolayer)을 만든다. 이 접착 증진층은 플랫폼을 소수성(약 100°의 접촉 각도)으로 만들고 소수성 상호반응에 의해 플랫폼에 단백질의 흡착을 가능하게 하였다.
b. 캡쳐 요소의 고정
두 개의 상이한 모노클로날 항체, 항-인간 코리노닉 고나도트로핀(anti-human Chorinonic Gonadotropin(항-hCG) 및 항-인터루킨6(항-IL6)을 체커보드-형 설계로 포화수증기 분위기에서 소수성 플랫폼에 프린트하였다(4x4 배열, 각 항체에 대해 8개 스폿). 캡쳐 항체 용액의 농도는 각각 400 및 100 마이크로그람/ml이었다. 스폿의 직경은 150 마이크로미터이었고, 중심 대 중심의 거리는 320 마이크로미터이었다. 프린트된 배열을 포화 수증기 분위기에서 밀페된 용기에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 칩을 건조시키고, 10% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 5% 자당 및 0.02 % 소듐 아지드를 함유하는 10 ml 인산 완충 식염수(PBS) 용액으로 흘러넘치게 하였다. 이 세척 단계는 칩의 소수성 표면을 BSA의 흡착에 의해 블로킹시키고, 캡쳐 요소가 고정화된 후, 표면을 보다 친수성으로 만든다. 결과로서, 블로킹 과정은 백그라운드 형광의 증가를 일으킬 수 있는 플랫폼에 대한 단백질의 비-특이적 결합을 방지한다. 블로킹후, 칩을 탈이온 수로 넘치게 하고 질소 흐름으로 건조시켰다. 플랫폼을 사용때 까지 냉장고에 저장하였다.
c. 검출 기구
실험예 2에 기술된 CCD 기구를 사용하였다.
d. 칩 카트리지
실험예 2에서 기술된 카트리지를 사용하였다.
e. 분석물/샘플
3개의 분석물 용액을 제조하였다:
I) 항원, 500 ng/ml Cy-5 표지된 IL6을 함유하는 용액
II) 항원, 50 ng/ml Cy-5 표지된 인간 코리오닉 고나도트로핀(hCG)을 함유하는 용액
III) 50 ng/ml IL6 및 Cy5로 표지된 100 ng/ml의 폴리클로날 항-IL6 항체를 함유하는 예비 배양된 혼합물(1시간). 1% BSA를 함유하는 PBS pH 7.0을 분석용 용매로서 사용한다.
f. 분석 처리
3개의 플랫폼(6b하에서 기술된 것처럼)을 플랫폼을 카트리지에 탑재하고, 1% BSA를 함유하는 pH 7.0인 PBS 1ml 로 세척하여 분석물 인큐베이션(참조, e.)용으로 제조하였다. 이어서, 분석물 용액 I), II) 및 III)의 약 15 마이크로리터를 유동 카트리지에 주입하였다. 인큐베이션 시간은 I) 및 II) 경우 각각 2시간이었다. 분석물 III) 경우, 인큐베이션 시간은 12시간이었다. 분석물을 인큐베이션한 후, 플랫폼을 1% BSA를 함유하는 pH 7.0인 PBS 1ml 로 세척하였다. 형광 영상을 오프(off)-공명 조건(에피-공명, 공명 각으로부터 약 7°떨어진)하에서 및 각 칩에 대한 공명 조건(공명, 접선에 대하여 약 2.5°의 입사광)하에서 얻었다. 얻어진 영상들 및 데이터는 도 10에 있다. 모든 단계는 실온에서 수행되었다.
g. 데이터 처리
스폿의 평균 강도 및 백그라운드를 Imagene Array software (Biodiscovery, Los Angels, CA)의 도움으로 계산하였다. 도 10에서의 스폿 평균은 관심의 대상이 되는 각각의 캡쳐 요소의 백그라운드 보정된 평균 강도를 나타낸다. 또한, 노이즈(noise)는 형광 영상으로부터 백그라운드의 표준 편차로 계산하였다. 그러므로, 도 10에서의 시그날/노이즈는 백그라운드 표준 편차에 대한 스폿 수단의 비에 상응한다.
h. 결과
계산된 모든 데이터가 도 1a에 요약되어 있다. 에피형광 방식 및 공명 조건에서 얻어진 영상 및 데이터가 도 10에 요약되어 있다. 줄 I) 및 II)는 면역화된 모노클로날 캡쳐 항체 및 표지된 항원(각각 Cy5-표지된 IL6 및 hCG)사이의 면역반응의 결과를 보여준다. 줄(III)은 고정화된 모노클로날 항체(항-IL6)와 IL6 항원 및 IL6에 대한 CY5-표지된 2차 폴리클로날 항체사이의 샌드위치형 면역 반응에 상응한다. 줄 I)의 결과 경우, 시그날 강도는 에피 형광 방식에서의 46 계수에서 플랫폼의 공명 방식에서의 1100 계수까지 증가된다. 이는 스폿 평균 값과 관련하여 약 24의 향상 인자에 상응한다. 시그날/노이즈 비는 10의 인자에 상응하게 7.0(에피 형광)로부터 69.2(공명)로 개선된다. 줄 II)의 결과 경우, 시그날 강도는 에피 형광에서 32 계수로부터 플랫폼의 공명 방식에서의 646 계수로 증가한다. 이는 스폿 평균값과 관련하여 약 20의 증강 인자에 상응한다. 시그날/노이즈 비는 15의 인자에 상응하게 5.0(에피 형광)으로부터 75.1(공명)으로 개선된다. 줄 III)의 결과 경우, 시그날 강도는 에피 형광에서 25 계수로부터 플랫폼의 공명 방식에서의 296 계수로 증가한다. 이는 스폿 평균값과 관련하여 약 12의 증강 인자에 상응한다. 시그날/노이즈 비는 12의 인자에 상응하게 3.80(에피 형광)으로부터 44.1(공명)로 개선된다. 모든 3개 분석에 대한 스폿 평균 및 시그날/노이즈 값은 비공명 방식(에피 형광)에서의 같은 칩에 비교하여 공명 방식의 칩 경우 적어도 1차원 크기로 높다. 줄 I) 및 줄 II)의 형광 영상은 상보성이다(체커보드-설계). 사용된 모든 칩은 같은 세트의 캡쳐 요소, 즉 모노클로날 항-hCH 및 모노클로날 항-IL6를 갖는다.
기술된 구체예에 대한 많은 대안들이 가능하다는 것이 이해될 것이다.
본 플랫폼의 또 다른 특징은 데이터의 보다 큰 세트가 평행하게 얻어지는 것을 가능하게 한다는 것이다. 또한 이는 수회 사용될 수 있다. 고정화된 친화성 복합체는 실질적으로 완전히 결합 능력을 유지하면서 유기 용매 및/또는 차오트로픽(chaotropic) 시약(염 용액)을 사용하여 상승된 온도에서 재생될 수 있다.
상기 기술에서, 센싱 지역의 전 지역이 조사된다. 비-확장된 초점이 맞춰진 빔과 함께 레이저를 사용하고, 센싱 지역을 스캐닝하는 것이 가능하여 말단 캡쳐 요소가 여기되도록 하는 것이 가능하다. 이 배열은 CCD 카메라보다 값싼 광탐지기, 예를 들어 포토멀티플리어를 사용하는 것을 가능하게 하거나, 아발라시 포토다이오드가 사용될 수 있다. 또한, 이 장치는 레이저 에너지가 보다 제한된다는 사실에 기인하여 감도를 더 향상시킨다.
현미경 슬라이드로서 사용하도록 본 발명에 따른 플랫폼을 설계하는 것이 또 한 가능하여 플랫폼을 형광 현미경과 함게 사용하는 것을 가능하게 한다.
플랫폼은 또한 WO97/02357에 기술된 바와 같은 대규모 마이크로플류딕(microfluidic) 시스템과 사용하도록 설계될 수 있다.
상기 기술에서, 플랫폼의 사용은 형광을 여기하고 센싱하는 적용에서 기술되어 왔다. 친화성 반응이 발광의 변화에 의해 탐지되는 장치에서 플랫폼이 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 또한 친화성 반응이 굴절률에서의 변화에 의해 검출되는 배열에서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 플랫폼은 하기의 것이 비배타적 목록인 많은 적용에서 사용될 수 있다.
-유전자 발현
-게놈믹스(genomics)
-파마코게놈믹스(Pharmacogenomics)
-톡시코게노믹스(Toxicogenomics)
-톡시코프로테오믹스(Toxicoproteomics)
-유전학
-약물유전학
-독성유전학
-엑손/인트론 발현 특성화
-인간 백혈구 항원(HLA) 유형
-스플라이싱 변이체의 분석
-프로테오믹스(칩상의 단백질 분석)
-환자 모니터링(약물, 대사, 및 마커)
-현장 치료(Point-of-care), "개인화된 약제"
-진단학
-일반적으로 프로테오믹스 또는 2d 분리용 칩상 2d 겔
-SNP (단일 뉴클레오타이드 폴리몰피즘), 미니-씨컨싱 (mini-sequencing)
-고효율 검색 (High Throughput Screening)
-조합 화학 (Combinatorial Chemistry)
-단백질-단백질 상호작용
-분자 상호작용
-칩-기초 단백질-항체 및 펩타이드 상호작용
-녹색 형광 단백질(GFP)
-인-시츄 하이브리디세이션 (in-situ hybridisation)
-공초점의 현미경학
-형광 상호관계 스펙트로스코피(FCS)
-통상적인 현미경학
-MALDI-TOF MS
Claims (48)
- 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법에 있어서,샘플을 센서 플랫폼의 센싱 지역과 접촉시키되, 상기 플랫폼은 굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, 및 (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 상기 기판의 일 표면에 형성된 얇고 비금속성인 광학적 투명층을 포함하며, 상기 플랫폼은 내부에 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 정의하는 주기적인 홈들을 포함하는 하나 또는 복수개의 파형(corrugated) 구조체들을 가지며(incorporating), 각 센싱 지역 또는 각 센싱 영역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 위한 것이고, 상기 홈들은a) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 광(coherent light)이, 전달된 빔을 감소시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있거나,b) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 및 선형 편광된 광이, 전달된 빔을 소멸시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있도록 형상화, 치수화 및 배향된 단계;광 빔으로 플랫폼을 조사하여 플랫폼의 센싱 지역 내에 이버네센트 공진을 발생시키는 단계; 및센싱 지역으로부터 발산되는 방사를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 파형 구조체들은 단일 또는 복수개의 회절성을 갖는 평행한 주기적인 홈들을 포함하며, 상기 홈들은 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 나타내는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,(a) 홈들의 깊이는 3 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위이고,(b) 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm 내의 범위이며,(c) 파형 구조체의 피치는 200 내지 1000 nm 내의 범위이고,(d) 광학적 투명층의 두께에 대한 홈의 깊이의 비는 0.02 내지 1 범위이며,(e) 홈들의 피치에 대한 홈의 폭의 비율은 0.2 내지 0.8의 범위인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 플랫폼의 기판이 무기 물질로 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 기판이 유기 물질로 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 기판이 유리, SiO2, 석영, Si, 또는 이들의 조합으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 기판이 유기 중합체로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 광학적 투명층이 무기 물질로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 광학적 투명층이 유기 물질로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 광학적 투명층이 Ta2O5, TiO2, Nb2O5, ZrO2, ZnO, HfO2, 또는 이들의 조합으로 이루어진 금속 산화물인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 9 항에 있어서, 광학적 투명층이 폴리아미드, 폴리이미드, PP, PS, PMMA, 폴리아크릴 산, 폴리아크릴 에스테르, 폴리티오에테르, 폴리(페닐렌설파이드) 및 그의 유도체, 또는 이들의 조합으로부터 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 회절을 위한 상기 홈의 깊이는 3 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm이며, 회절을 위한 상기 홈들의 피치는 200 내지 1000 nm이며, 광학적 투명층의 두께에 대한 홈의 깊이의 비는 0.02 대 1이며, 홈들의 피치에 대한 홈의 폭의 비는 0.2 내지 0.8이어서 매우 짧은 전파 거리를 생성시키는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 홈들은 단면이 직사각형인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 홈들은 단면이 싸인파 형태(sinusoidal), 사다리꼴 또는 톱니형인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 플랫폼이 정사각형 또는 직사각형이고, 상기 홈이 상기 플랫폼을 따라 선형으로 연장되는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 플랫폼이 디스크형이고, 상기 홈들이 환형 또는 선형인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 홈들이 기판의 표면에 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 홈들이 광학적 투명층의 표면에 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 홈들이 기판의 표면과 광학적 투명층의 표면 모두에 형성된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 센싱 지역들의 파형 표면이 특정 여기 파장, 특정한 형태의 편광화, 또는 특정 여기 파장 및 특정한 형태의 편광화를 위해 최적화된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 센싱 지역들의 파형 표면이 상이한 파장, 편광 배향, 또는 상이한 파장 및 편광 배향에 대해 최적화된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 광학적 투명층의 표면은 하나 또는 복수개의 센싱 지역들을 포함하되, 각 센싱 지역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 23 항에 있어서, 각 캡쳐 요소가 친화성 반응(affinity reaction)들이 가능한, 개별 캡쳐 분자, 캡쳐 분자들의 혼합물들, 또는 개별 캡쳐 분자 및 캡쳐 분자들의 혼합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 캡쳐 요소들이 이차원적 어레이로 배열된 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 24 항에 있어서, 캡쳐 분자들의 고정이 가능하도록 하기 위하여 상기 플랫폼은 광학적 투명층의 표면에 위치된 접착 촉진층을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 26 항에 있어서, 결과적인 접착 촉진 층 시스템의 모든 기능적 성질들을 조작하기 위하여 접착 촉진층은, 부가적 화학적, 물리적, 분광학적, 광물리학적, 광화학적, 생물학적, 또는 생화학적 성질을 제공하는, 무기 분자, 유기 분자, 무기 분자 및 유기 분자, 또는 이들의 유도체로 구성된, 하나 또는 복수개의 층들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 플랫폼이 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 갖고 형성되며, 각 센싱 지역 또는 센싱 영역은 회절을 위한 홈들 또는 샘플들의 다중 칼러 여기 및 검출에 적절한 복수개의 겹쳐진 홈들을 갖는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 플랫폼 상에 고정되는 캡쳐 요소들의 수 또는 상기 캡쳐 요소에 포함되는 캡쳐 분자들의 수는 제한되지 않고, 유전자수, DNA 배열 순서, DNA 모티프(motifs), DNA 마이크로 새틀라이트(satelites), 단일 염기 변형, 관심의 대상이 되는 종 또는 유기체의 게놈을 구성하는 단백질 또는 세포 단편, 또는 그들의 선택 또는 조합에 상응하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 캡쳐 요소, 캡쳐 요소들, 또는 상기 캡쳐 요소에 포함되는 캡쳐 분자들이 다음 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법:뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 화학적 유도체,선형 DNA 또는 그의 화학적 유도체,환형 DNA,총 RNA, 메신저 RNA, cRNA, 미토콘드리얼 RNA, 인공 RNA, 아프타머,PNA(펩타이드 핵산), 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 조작된 항체, 항원, 합텐, 항체 FAB 서브유니트, 단백질, 개질된 단백질, 효소, 효소 코팩터 또는 억제제, 단백질 복합체, 렉틴, 히스티딘 표지된 단백질, 히스티딘-태그(HIS-태그) 성분용 킬레이터, 태그된 단백질, 인공 항체, 분자 임프린트(imprints), 플라스티바디, 막 수용체, 완전 세포, 세포 단편 및 세포 서브 구조, 시냅스, 작용제, 길항제, 세포, 세포 기관(organelles), 마이크로좀, 벤조디아제핀, 프로스타글란딘, 항생제, 약제, 대사체, 약제 대사체, 천연 생성물, 탄수화물 및 유도체, 천연 및 인공 리간드, 스테로이드, 호르몬, 펩타이드, 천연 또는 인공 중합체, 분자 프로브, 천연 및 인공 수용체 및 그의 화학적 유도체, 킬레이팅제, 크라운 에테르, 리간드, 초분자 어셈블리, pH, 전위, 막 전위 또는 산화환원 전위를 위한 인디케이터, 조직 샘플.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 검사 중인 샘플들에 형광 유도 물질을 첨가하는 단계 및 향상된 이버네센트 필드에 의한 샘플들의 여기에 의해 상기 샘플들 내에 유도된 형광을 센싱하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 31 항에 있어서, 상기 형광 유도 물질이 형광 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 형광 마커가 폴리페닐 및 헤테로방향족 화합물, 스틸벤, 쿠마린, 잔틴 염료, 메틴 염료, 옥사진 염료, 로다민, 플루오레세인, 쿠마린, 스틸벤, 피렌, 페릴렌, 시아닌, 옥사시아닌, 프탈로시아닌, 포르피린, 나프탈로프시아닌, 아조벤젠 유도체, 디스티릴 비페닐, 전이 금속 복합체, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 클로라이드, 트리스(1,10-펜안트롤린)루테늄 클로라이드, 트리스(4,7-디페닐-1,10-펜아트롤린)루테늄 클로라이드 및 폴리피리딜/페나진/루테늄 복합체, 유로피움 및 테르비움 복합체, 퀀텀 도트 입자 또는 비드, 또는 이들의 유도체들을 포함하는, 하나 이상의 친화성 파트너들에 부착되도록 기능화되고, 개질된 400 nm 내지 1200 nm 범위에서 발광하는, 발광 화합물 또는 발광 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,-유전자 발현-게놈믹스(genomics)-파마코게놈믹스(Pharmacogenomics)-톡시코게노믹스(Toxicogenomics)-톡시코프로테오믹스(Toxicoproteomics)-유전학-약물유전학-독성유전학-엑손 또는 인트론 발현 특성화-인간 백혈구 항원(HLA) 유형-스플라이싱 변이체의 분석-프로테오믹스(칩상의 단백질 분석)-환자 모니터링(약물, 대사, 및 마커)-현장 치료(Point-of-care), "개인화된 약제"-진단학-프로테오믹스를 위한 칩상 2d 겔-SNP (단일 뉴클레오타이드 폴리몰피즘), 미니-씨컨싱 (mini-sequencing)-고효율 검색 (High Throughput Screening)-조합 화학 (Combinatorial Chemistry)-단백질-단백질 상호작용-분자 상호작용-칩-기초 단백질-항체 및 펩타이드 상호작용-녹색 형광 단백질(GFP)-인-시츄 하이브리디세이션 (in-situ hybridisation)-공초점의 현미경학-형광 상호관계 스펙트로스코피(FCS)-통상적인 현미경학-MALDI-TOF MS 중의 어느 하나 이상에서 사용되는 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
- 샘플 분석 장치에 있어서,플랫폼을 포함하되, 상기 플랫폼은 굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, 및 (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 상기 기판의 일 표면에 형성된 얇고 비금속성인 광학적 투명층을 포함하며, 상기 플랫폼은 내부에 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 정의하는 주기적인 홈들을 포함하는 하나 또는 복수개의 파형(corrugated) 구조체들을 가지며(incorporating), 각 센싱 지역 또는 각 센싱 영역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 위한 것이고, 상기 홈들은a) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 광(coherent light)이, 전달된 빔을 감소시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있거나,b) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 및 선형 편광된 광이, 전달된 빔을 소멸시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절될 수 있도록 형상화, 치수화 및 배향된 것을 특징으로 하는 플랫폼;광 빔을 발생시키고, 상기 빔을 유도함으로써, 상기 플랫폼 내에서 이버네센트 공진을 발생시켜 상기 플랫폼의 센싱 지역 내에서 향상된 공진 필드를 형성하도록 하는 각도를 가지고 상기 빔이 상기 플랫폼으로 입사되도록 하는 광 발생 수단; 및상기 플랫폼의 상기 센싱 지역에 배치되거나 상기 센싱 지역에 인접하게 배치된 물질의 특성을 검출하는 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항에 있어서, 상기 광 발생 수단은 간섭성 레이저 빔을 방출하기 위한 레이저를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항에 있어서, 상기 광 발생 수단은 Hg 램프, Xe 램프, 방전 램프 또는 저압 램프인 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 36 항에 있어서, 레이저 빔이 각 θ로 플랫폼에 입사하도록 레이저 빔을 유도하기 위한 광학적 요소들을 포함하되, 각도 θ는 식 sin θ=n-λ/Λ (여기서, Λ는 회절을 위한 상기 홈들의 피치, λ는 광의 파장, n은 광학적 투명층의 유효 굴절률)에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 수단은 형광, 인광, 화학-발광 또는 전자 광을 검출하도록 배열된 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 수단은 굴절률에서의 변화를 검출하도록 배열된 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 입사 빔이 모든 센싱 지역 또는 각 센싱 지역을 조사하도록 배열된 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석될 센싱 지역의 서브 지역을 조사하도록 빔이 배열되고, 플랫폼의 센싱 지역에 걸쳐 스캐닝을 달성하기 위해 빔과 플랫폼이 상대적인 운동을 할 수 있도록 빔과 플랫폼이 배열된 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 센싱 지역과 접촉시키도록 플랫폼의 센싱 지역에 대응하는 위치를 위한 카트리지를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 검사될 복수개의 샘플들을 포함하기 위한 마이크로티터 형태의 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 분석 장치.
- 플랫폼에 있어서,굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, 및 (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 상기 기판의 일 표면에 형성된 얇고 비금속성인 광학적 투명층을 포함하며, 상기 플랫폼은 상기 광학적 투명층 내에 전체 플랫폼에 걸쳐 파형(corrugated) 구조체를 가지거나 상기 플랫폼 상에 배열된 복수개의 분리된 파형 구조체들을 가지고, 상기 구조체들은 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 나타내는 하나 또는 복수개의 평행한 주기적인 홈들을 포함하되,(a) 홈들의 깊이는 3 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위이고,(b) 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm 의 범위이며,(c) 파형 구조체의 피치는 200 내지 1000 nm 의 범위이고,(d) 광학적 투명층의 두께에 대한 홈의 깊이의 비는 0.02 내지 1의 범위이며,(e) 홈들의 피치에 대한 홈의 폭의 비는 0.2 내지 0.8의 범위인 것을 특징으로 하는 플랫폼.
- 샘플 분석에 사용되기 위한 플랫폼에 있어서,굴절률(n1)을 갖는 광학적으로 투명한 기판, 및 (n1)보다 큰 굴절률(n2)을 가지며 상기 기판의 일 표면에 형성된 얇고 비금속성인 광학적 투명층을 포함하며, 상기 플랫폼은 내부에 하나 또는 복수개의 센싱 지역들 또는 센싱 영역들을 정의하는 주기적인 홈들을 포함하는 하나 또는 복수개의 파형(corrugated) 구조체들을 가지며(incorporating), 각 센싱 지역 또는 각 센싱 영역은 하나 또는 복수개의 캡쳐 요소들을 위한 것이고, 상기 홈들은a) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 광(coherent light)이, 전달된 빔을 감소시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절되거나,b) 상기 플랫폼에 입사하는 간섭성 및 선형 편광된 광이, 전달된 빔을 소멸시키고 입사광이 많은 양으로 비정상적 반사가 되는 것을 유발시킴으로써 향상된 이버네센트 필드를 하나 또는 복수개의 센싱 지역들의 표면에 형성하도록 간섭하는 회절 순서들 또는 개별 빔들로 회절되도록 형상화, 치수화 및 배향되되,회절을 위한 상기 홈들의 깊이는 3 nm 부터 상기 광학적 투명층의 두께까지의 범위이고, 상기 광학적 투명층의 두께는 30 내지 1000 nm의 범위이며, 회절을 위한 상기 홈들의 피치는 200 내지 1000 nm의 범위이고, 상기 광학적 투명층의 두께에 대한 상기 홈의 깊이의 비는 0.02 내지 1의 범위이며, 상기 홈들의 피치에 대한 상기 홈들의 폭의 비는 0.2 내지 0.8의 범위인 것을 특징으로 하는 플랫폼.
- 제 46 항에 있어서, 회절을 위한 상기 홈들의 깊이는 10 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위인 것을 특징으로 하는 플랫폼.
- 제 12 항에 있어서, 회절을 위한 상기 홈들의 깊이는 10 nm 부터 광학적 투명층의 두께까지의 범위인 것을 특징으로 하는, 샘플 또는 샘플들을 분석하기 위한 방법.
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