JP4436110B2

JP4436110B2 - 光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法

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Publication number: JP4436110B2
Application number: JP2003378660A
Authority: JP
Inventors: 徹哉石井; 弘嗣判谷; 一喜山本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2010-03-24
Anticipated expiration: 2023-11-07
Also published as: JP2005140683A

Description

本発明は、光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法に関し、詳
細には、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと被測定物質を
結合させ、該被測定物質と第１の特異的結合メンバーと結合させた特異的結合物を導波路
の表面に固定し、導波路の光線入射側縁面に光線を照射し、入射された励起光線により発
生したエバネッセント波成分により、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱され
た蛍光又は散乱光を測定して特異的結合物を測定し、ひいては流体試料中の被測定物質を
測定する光学的測定装置及光学的測定方法に関する。

従来から、光源からの光線を光導波路を通して全反射させながら伝播させ、抗原抗体反
応により光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質をエバネッセント波成分により励起し
、これにより生じる蛍光の強度を測定することにより間接的に免疫反応の程度を測定する
蛍光免疫測定装置の研究が行われている。

測定感度、測定精度の優れた蛍光免疫測定装置として、導入された励起光を全反射させ
ながら伝播させる光導波路の表面において抗原抗体反応を行なわせ、さらに蛍光物質で標
識された物質を反応させ、上記励起光のエバネッセント波成分により励起される蛍光物質
が発する蛍光を光導波路に導入し、全反射させながら伝播させ、光導波路から出射される
蛍光に基づいて免疫反応の程度を測定する蛍光免疫測定装置において、６５０ｎｍ近傍に
吸収のピークがある蛍光物質を用い、６３５ｎｍ近傍の波長の光を励起光として採用した
ことを特徴とする蛍光免疫測定装置が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開平７−６３７５６号公報

しかしながら、上記の蛍光免疫測定装置においては、照射する光線は特定波長のレーザ
光線を特定の角度（導波路内で全反射する角度）で照射しなければならず、白熱電球、キ
セノンランプ等の普通の光源を使用することができないので、装置が大型化し、コストが
高く且つ測定が困難であった。

又、従来は、高感度、高精度の分析を行おうとするとＢ／Ｆ分離が必要であったが、Ｂ
／Ｆ分離の工程は煩雑な処理が必要であるため、高速で短時間で分析を行うことが出来な
かった

本発明の目的は、上記欠点に鑑み、任意の光源を使用して導波路の光入射側縁面に光線
を照射し、全反射しない励起光線を導波路内で減衰消滅させ、全反射する励起光線のみを
導波路内を反応部まで伝播させ、この励起光線により反応部において発生したエバネッセ
ント波成分により、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光
を受光素子で測定することにより、特異的結合物をＢ／Ｆ分離を行わず、高速で感度及び
精度よく測定しうる光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法を提
供することにある。

請求項１記載の光学的測定装置は、流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置
であって、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結合した被
測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバー
が、一表面に固定されている反応部と、光線入射側縁面を有する透明な導波路（Ａ）の他
表面に透明な中間層（Ｂ）及び光吸収層（Ｃ）が順次積層されており、導波路（Ａ）の屈
折率をｎ_w、中間層（Ｂ）の屈折率をｎ_m、流体試料の屈折率をｎ_sとすると、各屈折率
が下記式（１）を満足することを特徴とする。
ｎ_w＞ｎ_m≧ｎ_s ・・・（１）

上記導波路（Ａ）は、一側面が光線入射側縁面となされ、光源から光線入射側縁面に入
射された励起光線が全反射しながら一表面に形成されている反応部まで伝播するのである
から、光学的に透明な材料からなるフィルム、シート状物又は板状体である。

上記光学的に透明な材料としては、例えば、ガラス、石英、アクリル系樹脂、フッ素樹
脂、ポリカーボネート樹脂、芳香族ポリエステル樹脂、ポリアリレート樹脂、エポキシ樹
脂、シリコン樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリイミド樹脂及びそのフッ素化物等が挙げら
れ、ガラス、石英、アクリル系樹脂、ポリカーボネート樹脂及びポリスチレン系樹脂が好
ましい。

上記アクリル系樹脂としては、例えば、ポリメチルメタアクリレート（屈折率＝１．４
９０）、ポリベンジルメタクリレート（屈折率＝１．５６８）、ポリフェニルメタクリレ
ート（屈折率＝１．５７１）、ポリ１−フェニルエチルメタクリレート（屈折率＝１．５
４９）、ポリシクロヘキシルメタクリレート（屈折率＝１．５０７）、メチルメタアクリ
レート−ベンジルメタクリレート共重合体、メチルメタアクリレート−フェニルメタクリ
レート共重合体、メチルメタアクリレート−１，１，２−トリフルオロエチルメタクリレ
ート共重合体、メチルメタアクリレート−スチレン共重合体等が挙げられる。

導波路（Ａ）の屈折率ｎ_wは流体試料の屈折率ｎ_sより大きくなければならず、流体試
料が水溶液の場合、水の屈折率は１．３３であるから、ｎ_w＞１．３３であり、好ましく
は、ｎ_w＞１．４９である。

導波路（Ａ）の厚みは、一般に５μｍ〜２ｍｍが好ましく、より好ましくは０．１〜１
ｍｍである。光源の大きさは導波路の厚みと同等程度が好ましく、光源が導波路より大き
い場合は、レンズ等によって導波路の厚みと同等程度に集光して用いても良い。

上記反応部には、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結
合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合
メンバーが固定されている。

上記第１の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質により異なるが、例えば、酵
素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポ
ンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、糖鎖、糖タン
パク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1 種もしくはこれらの混合物等が挙げ
られる。

上記第１の特異的結合メンバーを反応部に固定する方法は、従来公知の任意の方法が採
用されてよく、例えば、反応部表面に上記第１の特異的結合メンバーと共有結合しうる反
応基を有する合成樹脂の層を被覆し、上記第１の特異的結合メンバーと共有結合させる方
法、タンパク質等の上記第１の特異的結合メンバーが吸着しうる化合物層を反応部表面に
被覆し、上記第１の特異的結合メンバーを吸着させる方法等が挙げられる。

上記蛍光標識は、光線の照射を受けた際に光線を変換することにより蛍光を発生する物
質であり、例えば、光線の照射を受けた際に蛍光を発生する化合物、この蛍光を発生する
化合物を含有する合成樹脂粒子等が挙げられる。

上記蛍光を発生する化合物としては、例えば、フルオレインイソチオシアネート、フル
オレセイン、フルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（（（４−（
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）４−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−イ
ンダセン−３−イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエ
ステル、４−アセトアミド−４’−イソシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、
７−アミノ−４−メチルクマリン、7-アミノ-4- トリメチルクマリン、Ｎ−（４−アニリ
ノ−１−ナフチル）マレイミド、ダンシルクロライド、４’６−ジアミジノ−２−フェニ
ルインドール、５−（４，６−ジクロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン、４
，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、エオシンイソチオシ
アネート、エリトロシンＢ、フルオレサミン、フルオレセイン−５（６）−カルボキシア
ミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５−イソチオシアネート（ｉｓ
ｏｔｈｉｏｓｙａｎａｎｔｅ）ジアセテート、４−メチルウンベリフェロン、ｏ−フタル
ジアルデヒド、ＱＦＩＴＣ、ローダミンＢイソチオシアネート、硫酸ローダミン１０１酸
クロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、２’，７’−ジフルオロフル
オレセイン、シアニン系色素、ローダミン、希土類金属錯体等が挙げられ、発光寿命の長
い希土類金属錯体が好適に使用される。

上記希土類金属錯体を構成する希土類金属としては、例えば、スカンジウム、イットリ
ウム、及び、ランタン、セリウム、プラセオジウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウ
ム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウ
ム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム等のランタノイド族金属等が挙げられ、サマ
リウム、ユウロピウム、テルビウム及びジスプロシウムが好適に使用される。

上記希土類金属と共に希土類金属錯体を構成するリガンドとしては、希土類金属と反応
して蛍光を発生する希土類金属錯体を構成しうるものであれば、特に限定されず、例えば
、エチレンジアミン四酢酸類、４，７−ビス−（クロロスルフォフェニル）−１，１０−
フェナントロリン−２，９−ジカルボキシリックアシッド、４，４’−ビス−１”，１”
，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”
−イル）−クロロスルホ−ｏ−テルフェニル、ヘキサフルオロアセチルアセトン、トリフ
ェニルホスフィンオキシド、ジフェニルスルホキシド、１，１０−フェナントロリン等が
挙げられる。

上記蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子は、蛍光を発生する化合物を流体試
料に溶解した場合に比較し、発生する蛍光の強度が流体試料中の共存物質によって低下さ
れることが少ないので好ましい。

上記蛍光を発生する化合物を合成樹脂粒子に含有させる方法は従来公知の任意の方法が
採用されてよく、例えば、蛍光を発生する化合物の存在下で重合性モノマーを乳化重合、
懸濁重合等の重合方法で重合する方法が挙げられる。

上記重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−ビニルト
ルエン、ｍ−ビニルトルエン、ｐ−ビニルトルエン等の芳香族ビニル化合物；メチル（メ
タ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、
ｉ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メ
タ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）ア
クリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等のアクリレート類；（メタ）アクリ
ロニトリル、シアン化ビニリデン等のシアン化ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン、フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化
合物；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステルなどが挙げられる。

上記重合性モノマーは、これらの重合性モノマーを重合する際に一般に共重合されてい
る単官能性モノマーや多官能性モノマーが共重合されてよく、単官能性モノマーとしては
、例えば、（メタ）アクリル酸、無水マレイン酸、グリシジルアクリレート等が挙げられ
、多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、（ポリ）エチレングリコール
ジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリ
メチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

上記合成樹脂粒子中の蛍光を発生する化合物の含有量は、少なくなると蛍光の発生量が
少なくなり測定感度が低下し、多くなると蛍光を発生する化合物を溶解しているのと同様
になるので、合成樹脂粒子中５〜８０重量％が好ましく、より好ましくは１５〜６０重量
％である。

上記合成樹脂粒子は大きくなるとさはなるべく小さいのが好ましく、１０μｍ以下が好
ましく、より好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは３０ｎｍ〜２００
ｎｍである。

このような粒子径の小さい合成樹脂粒子を合成するには、重合性モノマーの微小液滴を
作製し重合すればよく、例えば、重合性モノマーと乳化剤、分散剤、重合開始剤等の必要
成分との混合液をホモジナイザー、マイクロミキサー、マイクロチャンネル等に供給して
微小液滴を作製し常法に従って重合すればよい。

上記光散乱標識は、光線の照射を受けた際に光線を散乱しうる化合物又は微粒子であり
、例えば、金，銀など金属のコロイド微粒子凝集体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅなどのカルコゲナ
イト微粒子、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリ（メタ）アクリル樹脂など
のポリマー微粒子、シリカゲル、アルミナ、酸化チタンなどの無機酸化物微粒子、これら
の２種以上の組合せによるコアシェル微粒子等が挙げられる。又、上記ポリマー微粒子及
び無機酸化物微粒子は、染色されていてもよいし、蛍光分子や金属ナノ粒子が分散されて
いてもよい。

上記光散乱標識粒子の大きさは、特に限定されるものではないが、一般に１０ｎｍ〜１
０μｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは７０〜２００ｎ
ｍである。

上記第２の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質に特異的に結合しうるもので
あり、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーの間に被測定物質をサンド
ウィッチすることができるものである。

従って、第２の特異的結合メンバーとしては、被測定物質及び第１の特異的結合メンバ
ーに対応して異なるが、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセ
プター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡ
の分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた１
種もしくはこれらの混合物等が挙げられる。

従って、免疫測定方法の場合には、被測定物質が抗体又は抗原であり、第１の特異的結
合メンバーと第２の特異的結合メンバーとしては、それに特異的に反応する抗原又は抗体
が使用される。

光源から光線入射側縁面に入射された励起光線が導波路（Ａ）内を全反射しながら一表
面に形成されている反応部まで伝播する間に全反射しない励起光線を減衰消滅するのであ
るから、励起光線は反応部に伝播するまでに導波路（Ａ）内でなるべく多く反射するのが
好ましい。

従って、上記反応部から光線入射側縁面までの距離は、励起光線が導波路（Ａ）内を全
反射して伝播する１往復の距離の２倍以上であることが好ましく、より好ましくは２０倍
以上である。

上記透明な中間層（Ｂ）は、導波路（Ａ）の他表面に積層され、導波路（Ａ）を伝播し
てくる励起光線のうち全反射しない励起光線が入光する層であるから、透明で屈折率ｎ_m
が下記式（１）を満足する必要がある。
ｎ_w＞ｎ_m≧ｎ_s ・・・（１）

即ち、中間層（Ｂ）の屈折率ｎ_mが、導波路（Ａ）の屈折率ｎ_wより大きくなると、導
波路（Ａ）に導入された励起光線の全てが導波路（Ａ）内を全反射せず、中間層（Ｂ）に
入射するようになり、又、流体試料の屈折率ｎ_sが導波路（Ａ）の屈折率ｎ_wより大きく
なると、反応部において励起光線が流体試料に漏れ出し、漏れ出した励起光線により流体
試料中の浮遊蛍光標識又は光散乱標識が変換又は散乱され、蛍光又は散乱光が発生するか
らである。

更に、流体試料の屈折率ｎ_sが中間層（Ｂ）の屈折率ｎ_mより大きくなると、導波路（
Ａ）と中間層（Ｂ）との間では全反射しているけれども、導波路（Ａ）と流体試料との間
では全反射せず、導波路（Ａ）から流体試料に漏れ出す励起光線が存在することになり、
漏れ出した励起光線により流体試料中の浮遊蛍光標識又は光散乱標識が変換又は散乱され
、蛍光又は散乱光が発生するからである。

上記透明な中間層（Ｂ）を構成する材料としては、フッ素化エポキシ系樹脂、フッ素化
アクリル系樹脂、水等が挙げられ、流体試料の屈折率ｎ_sと中間層（Ｂ）の屈折率ｎ_mが
同一であると、流体試料が供給された反応部において、導波路（Ａ）内で全反射しない光
線が全て中間層（Ｂ）に吸収できるので流体試料の屈折率ｎ_sとほぼ同一の屈折率を有す
る物質が好ましく、流体試料の屈折率ｎ_sの１０％以内の屈折率を有する物質が好ましい
。

中間層（Ｂ）の厚みは特に限定されるものではないが、薄くなると水等の液体を導入し
にくくなり、厚くなると導波路（Ａ）と光吸収層（Ｃ）との積層が困難になるので、０．
６〜１０００μｍが好ましい。

上記光吸収層（Ｃ）は、中間層（Ｂ）に入光してきた励起光線を吸光する層であり、吸
光することにより、導波路（Ａ）内の全反射しない励起光線が減衰消滅されるのであれば
よく、例えば、表面あるいは内部全体に着色された、特に、カーボン等の黒色の顔料で着
色された金属あるいは合成樹脂の層が好ましい。

上記合成樹脂としては、例えば、オレフィン系樹脂、塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン
系樹脂、アクリル系樹脂、ＡＢＳ樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエ
ステル系樹脂、ポリアリレート系樹脂、エポキシ系樹脂、シリコン系樹脂、ポリイミド系
樹脂等の熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂及び光硬化性樹脂が挙げられる。

着色は、上記合成樹脂に着色剤を練りこんでもよいし、合成樹脂層の表面に着色剤層を
積層してもよく、該着色剤としては、例えば、アゾ系、フタロシアニン系、スレン系、染
料レーキ系等の有機系着色剤；カーボンブラック、酸化物系、クロム酸モリブデン系、硫
化物・セレン化物系、フェロシアン化物等の無機系着色剤が挙げられ、カーボンブラック
が好ましい。

請求項６記載の特異的結合物の光学的測定方法は、蛍光標識又は光散乱標識が結合され
た第２の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む流体試料を、請求項１〜５項のいずれ
か１項記載の光学的測定装置の反応部に供給し、被測定物質を介して、蛍光標識又は光散
乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、反応部に固定された第１の特異的結合
メンバーとを結合させ、特異的結合物を形成した後、光線入射側縁面に光線を照射し、入
射された励起光線を導波路（Ａ）内を全反射して反応部まで伝播させ、この励起光線によ
り反応部において発生したエバネッセント波成分により、蛍光標識又は光散乱標識によっ
て変換又は散乱された蛍光又は散乱光を受光素子で測定することを特徴とする。

次に、請求項６記載の特異的結合物の光学的測定方法を図面を参照して説明する。図１
は、光学的測定装置をもちいて特異的結合物の光学的測定方法の１例を示す模式図であり
、図２は、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物
質被測定物質と、第１の特異的結合メンバーが結合した特異的結合物が反応部表面に固定
されている状態を示す模式図である。

図中１は光学的測定装置であり、光線入射側縁面１１を有する透明な導波路（Ａ）と透
明な中間層（Ｂ）及び光吸収層（Ｃ）が積層されて形成されている。導波路（Ａ）の光線
入射側縁面１１と対向面付近の一表面１２に第１の特異的結合メンバー５が固定された反
応部１３が形成されている。１５はスペーサーであり、導波路（Ａ）の他表面１４の端部
と光吸収層（Ｃ）の端部を接着し、水１６が注入されて中間層（Ｂ）が形成されている。

上記特異的結合物の光学的測定方法において、最初の工程は、蛍光標識又は光散乱標識
が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む流体試料を、請求項１〜５
項のいずれか１項記載の光学的測定装置の反応部に供給し、被測定物質を介して、蛍光標
識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、反応部に固定された第１の
特異的結合メンバーとを結合させ、特異的結合物を形成する工程である。

即ち、流体試料２に含まれる被測定物質６よりも多量の、蛍光標識又は光散乱標識８が
結合された第２の特異的結合メンバー７と、被測定物質６を含む流体試料を反応部１３に
供給すると、被測定物質６は、蛍光標識又は光散乱標識８が結合された第２の特異的結合
メンバー７と特異的に結合するとともに、反応部１３に固定された第１の特異的結合メン
バー５とも特異的に結合し、蛍光標識又は光散乱標識８が結合された第２の特異的結合メ
ンバー７と被測定物質６と第１の特異的結合メンバー５が結合した特異的結合物９が形成
される。

そして、第１の特異的結合メンバー５は反応部１３に固定されているので、特異的結合
物９は反応部１３に固定されている。又、過剰の蛍光標識又は光散乱標識８が結合された
第２の特異的結合メンバー７は流体試料２中に浮遊している。

次に、光源３から光線入射側縁面１１に励起光線を照射し、導波路（Ａ）内を全反射し
ながら伝播し、反応部１３に到達した励起光線により反応部１３表面に形成されたエバネ
ッセント波成分により、反応部１３に固定された特異的結合物９中の蛍光標識又は光散乱
標識８によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を受光素子４で測定する。尚、３１は
スリットであり、光源３からの励起光線が光線入射側縁面１１だけに照射されるように設
置されている。

即ち、光源３から矢印Ｄのように光線入射側縁面１１に光線を照射すると、浅い角度を
有する励起光線は、光線Ｅで示したように、導波路（Ａ）を全反射しながら伝播し、反応
部１３に到達する。反応部１３に到達した励起光線は、反応部１３表面にエバネッセント
場を形成し、反応部１３表面に形成されたエバネッセント波成分により、反応部１３に固
定された特異的結合物９中の蛍光標識又は光散乱標識８によって変換又は散乱された蛍光
又は散乱光が発生する。

この場合、流体試料２中の浮遊している蛍光標識又は光散乱標識８は、反応部１３表面
から離れており、エバネッセント波成分は届かないので蛍光又は散乱光は発生しない。

従って、反応部１３で発生した蛍光又は散乱光Ｇを受光素子４で受光し、電気的処理に
より測定することにより特異的結合物９を測定することができる。又、出光した光線を蛍
光又は散乱光を選択的に透過するフィルターを介して受光してもよい。

一方、深い角度を有する励起光線は、光線Ｆで示したように、導波路（Ａ）を通り、導
波路（Ａ）の他表面１４から中間層（Ｂ）に入射し、光吸収層（Ｃ）で一部吸収されると
共に一部反射される。反射された光線Ｆは、再度導波路（Ａ）に入射し、導波路（Ａ）の
一表面１２で反射され導波路（Ａ）の他表面１４から中間層（Ｂ）に入射し、光吸収層（
Ｃ）で一部吸収されると共に一部反射される。光線Ｆは、上記反射及び光吸収が繰り返さ
れ、減衰して消滅してしまう。

上記光源としては、公知の任意の光源が使用可能であり、例えば、レーザー、発光ダイ
オード、フラッシュランプ、アーク灯、白熱電球、蛍光灯、キセノンランプ、水銀灯等が
挙げられ、光線も任意の光線が使用可能であり、例えば、可視光線、紫外線、赤外線等が
挙げられる。

上記受光素子としては、光線を感知しうる任意の計測装置が使用可能であるが、一般に
フォトダイオード、ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラが好適に使用される。

本発明の光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法の構成は上述
の通りであるから、任意の光源を使用して容易に照射することができ、導波路内を全反射
しない励起光線は導波路を伝播する際に減衰消滅され反応部まで到達せず、導波路内を全
反射する励起光線だけが反応部に到達するので、導波路に固定された特異的結合物に存在
する蛍光標識又は光分散標識によって変換又は散乱された蛍光又は分散光しか発生せず、
特異的結合物をＢ／Ｆ分離を行わず、高速で、感度及び精度よく測定することができる。

又、導波路（Ａ）の光線入射側縁面に入射する励起光線の入射角は浅い方が好ましく、
導波路を薄くすることができ、光学的測定装置は薄肉化が可能であり、測定する光線は明
るくなり測定感度が優れている。従って、流体試料中の被測定物質を感度及び精度よく測
定することができる。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。

（実施例１）
ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃに対する
モノクロール抗体の作製
ヒトヘモグロビンとヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃをフロイントコンプリートアジュバ
ントに充分に分散させた溶液（２０μｇ／ｍｌ）１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに２週
間置きに４回免疫した。

免疫終了の２週間後に、免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓を摘出し、１０６個の脾
細胞を得た。得られた脾細胞をミエローマ細胞とＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の存
在下で融合させ培養した。増殖した細胞の上澄みを採取しＥＬＩＳＡ法により各抗体の有
無を調査した。

各抗体が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、各抗体を産生している細胞を確認した
。この細胞を大量に培養し、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔に注射し、２週間後から３日おきに
腹水を採取してヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンＡ
１ｃに対するモノクロール抗体を得た。

蛍光合成樹脂粒子の作製
ガラス製重合器に、水８０重量部とドデシルスルホン酸ナトリウム１．５重量部を供給
し、攪拌してドデシルスルホン酸ナトリウムを溶解した後、スチレン２０重量部、希土類
金属錯体（ユウロピウムに配位したヘキサフルオロアセチルアセトン・トリオクチルフ
ォスフィンオキシド配位子錯体）４重量部及びアゾビスイソブチロニトリル０，１５重量
部を供給し、冷却しながらホモジナイザーで高速分散し、乳化液を得た。

得られた乳化液をホモジナイザーで高速分散しながら、窒素置換し、温水で８０℃まで
昇温し、８０℃で８時間重合して、体積平均粒子径が１２０ｎｍの蛍光合成樹脂粒子を得
た。

抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の作製
０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）に抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体を溶
解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を得た。

上記の得られた蛍光合成樹脂粒子を０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）で３回洗
浄した後、蛍光合成樹脂粒子濃度が１．０重量％になるように０．０５Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ８．６）に分散し、得られた分散液１ｍｌに対し、得られた抗体溶液０．５ｍｌを
添加し、３５℃で１時間攪拌混合した。

次に、牛血清アルブミンの１．０重量％リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加
し、常温で１時間攪拌混合した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１時間）し、リン酸食
塩緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。この遠心分離及び洗浄を３回行った後、得られた抗
ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体吸着蛍光合成樹脂粒子に２ｍｌのリン酸食塩緩衝液（
ｐＨ７．２）を添加し、超音波ホジナイザーで攪拌し、抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ
抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を得た。

反応部の作製
導波路（Ａ）として、長さ１０ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ１００μｍの透明ポリメチルメタ
クリレートシートを使用し、ポリメチルメタクリレートシート（導波路（Ａ））の反応部
１３の位置を蒸留水で洗浄した後、ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体及びヒト
グリコヘモグロビンＡ１ｃに対するモノクロール抗体を、濃度が１ｍｇ／ｍｌになるよう
に０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した緩衝液を、注射針で反応部１３表
面に供給し、３０℃で１時間静置した。

次に、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、牛血清アルブミンの１
．０重量％リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を供給し、３０℃で１時間静置することによ
り、上記モノクロール抗体で被覆されていない反応部１３表面を被覆した。

次いで、再度、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で被覆してポリメチルメタクリレートシート（導波路（Ａ）
）上に反応部１３を形成した。

光学的測定装置の作製
導波路（Ａ）として、上記反応部１３が作製された透明ポリメチルメタクリレートシー
トを使用し、光吸収層（Ｃ）としてＡＢＳ樹脂とカーボンブラックよりなる、長さ１０ｍ
ｍ、幅３ｍｍ、厚さ１００μｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シートを使用した。

図１に示したように、厚さ０．３ｍｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シート（光吸収層（Ｃ））の
一面の周囲に厚さ０．５ｍｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シートよりなるスペーサー１５を貼付し
、その上にポリメチルメタクリレートシート（導波路（Ａ））を貼付し、両者によって形
成された空間に注射器で水１６を注入して中間層（Ｂ）を形成して光学的測定装置を作製
した。

測定用血液試料の作製
被験者の血液を採取後、直ちに全血１ｍｌ当りフッ化ナトリウム（血液抗凝固剤）１０
ｍｇ添加し、次いで、血液３μｌを溶血試薬を添加し１５０倍に希釈して、希釈血液試料
を得た。

尚、溶血試薬は、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｃ社製、商品名「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」）を０．１重量％
と除去試薬としてテトラポリリン酸０．１重量％を溶解してなる０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を使用した。

得られた血液試料をＡ１ｃ専用測定装置（液体クロマトグラフィ、京都第一科学社製、
商品名「Ｈｉ−ＡｕｔｏＡ１ｃＨＡ−８１２１」に供給し、ヒトグリコヘモグロビンＡ１
ｃ濃度を測定し、その結果に基づいて、血液試料に、更に、上記溶血試薬を添加しヒトグ
リコヘモグロビンＡ１ｃ濃度３％、５％、１０％及び１２％の測定用血液試料を作製した
。

測定
得られた測定用血液試料に、過剰の抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体吸着蛍光合成
樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を供給、混合した後、５分間静置し、得られた混合液５
０ｍｌを光学的測定装置の反応部１３に供給した。

光源３としてフィラメント径が１ｍｍのキセノンランプを使用して０．１Ｊ／Ｆｌａｓ
ｈの光線を２０００回／秒の間隔で１０００回照射し、受光素子４としてフォトダイオー
ドを使用し、反応部２から出光してきた波長６５０ｎｍ付近の光線の強度を測定した。

得られた光線強度とヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ濃度をグラフにプロットしたところ
直線のグラフが得られ、上記光学的測定装置でヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定
することができることが分かった。

光学的測定装置をもちいて特異的結合物の光学的測定方法の１例を示す模式図である。蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物質と、第１の特異的結合メンバーが結合した特異的結合物が反応部表面に固定されている状態を示す模式図である。

符号の説明

１光学的測定装置
Ａ導波路
Ｂ中間層
Ｃ光吸収層
２流体試料
３光源
４受光素子
５第１の特異的結合メンバー
６被測定物質
７第２の特異的結合メンバー
８蛍光標識又は光散乱標識
９特異的結合物
１１光線入射側縁面
１３反応部

Claims

流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置であって、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバーが固定されている反応部を一表面に有し、かつ、一側面に光線入射側縁面を有する透明な導波路（Ａ）、導波路（Ａ）の他表面に透明な中間層（Ｂ）及び光吸収層（Ｃ）が順次積層されており、導波路（Ａ）の屈折率をｎ_w、中間層（Ｂ）の屈折率をｎ_m、流体試料の屈折率をｎ_sとすると、各屈折率が下記式（１）を満足することを特徴とする光学的測定装置。
ｎ_w＞ｎ_m≧ｎ_s ・・・（１）
導波路（Ａ）が、ガラス、石英、アクリル系樹脂、ポリカーボネート樹脂及びポリスチ
レン系樹脂よりなる群から選ばれた材料よりなることを特徴とする請求項１記載の光学的
測定装置。
中間層（Ｂ）が、流体試料の屈折率をｎ_sとほぼ同一の屈折率を有する物質であること
を特徴とする請求項１又は２記載の光学的測定装置。
光吸収層（Ｃ）が、黒色の層であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の光学的
測定装置。
導波路（Ａ）の光線入射側縁面から反応部までの距離が、入射された励起光線が導波路
（Ａ）内を全反射して伝播する１往復の距離の２倍以上であることを特徴とする請求項１
〜４のいずれか１項記載の光学的測定装置。
蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む
流体試料を、請求項１〜５項のいずれか１項記載の光学的測定装置の反応部に供給し、被
測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、
反応部に固定された第１の特異的結合メンバーとを結合させ、特異的結合物を形成した後
、光線入射側縁面に光線を照射し、入射された励起光線を導波路（Ａ）内を全反射して反
応部まで伝播させ、この励起光線により反応部において発生したエバネッセント波成分に
より、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を受光素子で
測定することを特徴とする特異的結合物の光学的測定方法。
被測定物質が抗体又は抗原であり、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メン
バーはそれに特異的に結合する抗原又は抗体であることを特徴とする請求項６記載の特異
的結合物の光学的測定方法。
蛍光標識が、希土類金属錯体であることを特徴とする請求項６又は７記載の特異的結合
物の光学的測定方法。
蛍光標識が、蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子であることを特徴とする請
求項６、７又は８記載の特異的結合物の光学的測定方法。